一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，包括载体，以及位于载体上的寡核苷酸探针、杂交过程阳性对照及空白的点涂层；所述杂交过程阳性对照为Biotin；所述寡核苷酸探针包括28条真菌探针，其序列如SEQ?ID?NO.2、3、8～33所示；或所述寡核苷酸探针包括35条真菌探针，其序列如SEQ?ID?NO.1～35所示。本发明的基因芯片可用于检测杨树溃疡病病原真菌，涵盖5属16种。本发明所建立的多重PCR扩增环境样本的芯片通量检测诊断杨树溃疡病技术在北京地区的杨树溃疡病的检测中得到初步应用。本发明能为建立其它有害生物的高通量检测技术、及相关生物多样性为基础的应用和研究服务。
【专利说明】一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片及其应用，属于基因芯片【技术领域】。
【背景技术】
[0002]树木溃疡病病原种类多样，寄主广泛,有性型和无性型并不是--对应关系,无性型多样，其形态特征差异小，有性型在自然界中不常发现。目前检测鉴定的方法还依赖于病原菌的分离培养，这限制了生态条件下对树木溃疡病发生、发展和防治的研究。
[0003]现有技术中的病原菌鉴定检测手段主要停留在可培养技术、形态生物学及一些生化技术和常规分子方法上，这些技术和方法只能对非常有限的种群数量进行有限的研究，难以构成病原微生物较大规模种群流行生态学的研究。基于核酸序列和PCR技术的微生物检测技术和鉴定手段发展了十多年，主要分子技术平台有:失活梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)、温度差异性凝胶电泳技术(Temperature Gradient Gel Electrophoresis, TGGE)、单链构象多态性技术(Single-strand Conformat1n Polymorphism, SSCP)、扩增片断长度多态性 AFLP 技术(Amplified Fragment Length Polymorphism)、突光原位杂交技术(Fluorescent in-situHybridizat1n, FISH) > RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、RFLP(Restrict1nFragment Length Polymorphism)等。这些技术的应用虽极大地促进了微生物生态的发展，并大大提高了判定和分析微生物种群的能力，但这种以具有遗传背景的分子标记性方法，因不同对象和生态条件而变化，存在着种群限制和较为耗时的技术规程问题。随着越来越多的微生物种和其他生物种的基因组序列的测定完成，一批以组学为基础发展起来的高通量技术和平台被建立如生物芯片技术及其平台。而且，近些年这些技术迅速地向生态学和环境科学渗透发展，促进了分子生态学和生态基因组学(ecogenomics，ecologicalgenomics)和宏基因组学(metagenomics)的快速发展。在这样一个生物分子手段与生态和环境技术逐渐结合的时代，对于植物病理学、流行学以及微生物生态相关学科而言，亟需基于更大规模生态下的微生物种群的监测、检测、鉴定和量化研究的先进技术，这一领域下的生物芯片技术和平台的应用和发展也正是在这时代背景下迅速兴起。
[0004]生物芯片是基于核酸杂交技术的微阵列技术，将含有生物信息的被称为探针的核酸序列或蛋白成分以微型点阵形式，排列在固体的基片上，来自待分析样本的核酸或蛋白(靶标)通过与其杂交、染色、扫描仪判读、结果输出分析，从而了解和反映出生物发育或在特定生态或环境下的基因表达、代谢及功能的特征。目前，根据用途、目的、探针性质以及构造生物芯片平台可以分有很多类型，如核酸芯片(基因芯片)、蛋白质芯片、抗体芯片；cDNA芯片、寡聚核苷酸芯片是、CHIP芯片；还有测序芯片、流体芯片、芯片实验(Lab on Chip)、ChIP — chip等20多种类型，而商业化了的只是几个很有名的芯片公司，如Affymetrix、Applied B1systems、Agilent、TaqMan等。这些生物芯片技术和平台中，按照用途可以简单地将他们归为表达型生物芯片和检测性生物芯片。表达型芯片是目前研究利用的主导类芯片，发展较早，应用目的主要是基因表达和转录图谱分析，目前已有很多的成熟的平台和技术，商业化的生物芯片绝大部分也是为这类目的设计的。检测性生物芯片以监测、检测、鉴定和量化为目标，应用目的如基因单碱基多态检测(SNP)，以及特定生态或环境下的生物种群属性及其功能基因的定性和定量研究。检测型芯片最近在医学临床、环境微生物检测鉴定、病虫害检疫、转基因植物检测等领域发展很快，一些专门为检测而发展起来的芯片平台也得到兴起，如ArrayTube平台技术。
[0005]ArrayTube生物芯片平台与技术是由德国Clondiag公司发展起来的可用于微生物检测和鉴定的可定制芯片体系。该平台和技术已经被欧美科学家们接受，尤其在欧洲，该平台与其它知名生物技术公司的平台一样得到较好的应用。利用该平台技术发表的科学结果在包括美国国家科学院院刊(PNAS)的许多知名期刊上发表。一些欧洲公司也以该平台和芯片生产为基础，消化研发出自己的一套检测系统，如荷兰的Check-Points BV公司，利用ArrayTube平台和技术,开发出可以用于沙门氏亚型鉴定的芯片产品:SalmonellaSerovar ArrayTM,他们希望通过这个平台能为全部的1000多个沙门氏亚型作鉴定。这生物芯片技术在病毒、细菌、真菌等微生物分型分化、个体和种群，以及致病功能基因和一些环境响应基因的鉴定、检测上都已经开展了工作和取得了相应的一些成果。ArrayTube平台技术的性能价比很高，一是分析通量上，远高于基于传统可培养技术及基于核酸和PCR方法发展出来的常规分子标记方法；二是通量处理具有即时性与平行进行的特点；三是与同类生物芯片技术相比，在芯片技术所需核心设备上，它占有非常大的优势，其它类型的生物芯片平台需要专门的芯片杂交仪和扫描仪，有的还需专门的样品制备装置，成本上百万人民币；ArrayTube生物芯片只需ArrayTube读器一台，杂交过程比常规实验室的分子杂交简单，读器成本价格不过10万人民币。ArrayTube芯片单管点阵常规密度为14x 14，管数可集成达8管，从而提高形成更高密度的ArrayTube芯片以满足更高通量目标检测的需要。初次定制单片成本也仅需300~500元人民币，续制单片成本可降至100元以内。
【发明内容】
[0006]针对上述现有技术，本发明针对我国杨树溃疡病病原真菌的的种类特点，提供了一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，以及其在检测杨树溃疡病病原真菌中的应用。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，包括载体，以及位于载体上的寡核苷酸探针、杂交过程阳性对照点及空白的点涂层；所述寡核苷酸探针包括28条真菌探针，其序列如SEQ ID N0.2、3、8~33所示，，详见表1 ;或所述寡核苷酸探针包括35条真菌探针，其序列如SEQ ID N0.1~35所示，详见表1 ;所述杂交过程阳性对照为B1tin。
[0009]表1寡核苷酸探针序列及物种信息
[0010]
【权利要求】
1.一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，其特征在于:包括载体，以及位于载体上的寡核苷酸探针、杂交过程阳性对照及空白的点涂层；所述杂交过程阳性对照为B1tin ;所述寡核苷酸探针包括28条真菌探针,其序列如SEQ ID N0.2、3、8~33所示；或所述寡核苷酸探针包括35条真菌探针，其序列如SEQ ID N0.1~35所示。
2.根据权利要求1所述的检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，其特征在于:所述载体为1.5mlEppendort离心管,芯片点制在截面了的底部内面。
3.根据权利要求1所述的检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，其特征在于:所述寡核苷酸探针、杂交过程阳性对照及空白的点涂层呈阵列式分布在载体上。
4.根据权利要求3所述的检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，其特征在于:所述载体上的阵列式分布布局为如图1所示的布局，I平方毫米面积中点阵为14X 14，图中al-al4和bl-bl4组合示表1中的芯片点阵行列，阿拉伯数字表示位于该点上的探针ID。
5.权利要求1~4中任一项所述的检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片在检测杨树溃疡病病原真菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:具体应用方式如下: (一)样品制备:提取待检测物的真菌DNA，然后利用真菌特异性引物多重PCR扩增和生物素荧光标记DNA，得标记的DNA扩增产物，用于下述杂交反应； (二)杂交反应:取上述标记的DNA扩增产物，与杂交液混合，加样于芯片的点样区，杂交反应；杂交反应后，洗去杂交液； (三)信号检测和结果分析:向芯片中加入辣根过氧化物酶，洗去未反应的辣根过氧化物酶；再加入底物四甲基对联苯二胺，则辣根过氧化物酶将底物转化成蓝色沉淀，洗去未反应的底物四甲基对联苯二胺；检测沉淀及其分布的位置，判断待检测物中是否含有杨树溃疡病病原真菌，判断依据为:若芯片上有蓝色沉淀，则待检测物中含有杨树溃疡病病原真菌，反之则无；并可根据寡核苷酸探针的阵列式分布判断出待检测物中含有哪种杨树溃疡病病原真菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述步骤(一)中，DNA提取采用常规 CTAB 法，具体为:2 X CTAB 缓冲液:2 % CTAB, 200mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，50mmol/LEDTA(pH8.0)，1.4mol/L NaCl,2% PVP,0.5% β -巯基乙醇；10XCTAB 提取液:10% CTAB,0.7mol/L NaCl，其余同CTAB缓冲液；具体方法如下: (1)取冷冻干燥菌丝0.05g放入2mL离心管，用研磨杵研磨至粉末； (2)加入lmL65°C预热的2X CTAB缓冲液和20 μ L β -巯基乙醇，放入65°C的水浴锅中水浴60min ； (3)12000r/min离心，取上清液，放入新的离心管中，加入等体积的混合液(氯仿:异戍醇=24: I,体积比),上下颠倒2~3min,混匀，12000r/min离心1min ； (4)重复步骤(3)I~2次，直到界面层的沉淀物质很少后，进入下一步骤； (5)取上清液放入新的离心管中，加入上清液1/10体积的10XCTAB缓冲液，再加入等体积的混合液(Tris饱和酚:氯仿:异戊醇=25: 24: 1，体积比)，上下颠倒，混匀2~3min, 12000r/min 离心 1min ；
(6)取上清液放入新的离心管中，加入上清液1/10体积的醋酸钠，再加入管液2~2.5倍体积的冰冻无水乙醇，沉淀DNA ；(7) lOOOOr/min 4°C离心10min，倒掉上清液，用70%酒精洗DNA 2~3次，37°C干燥至无酒精味，加入150 μ L的Elut1n buffer溶解DNA，即为标记的DNA扩增产物。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述步骤(一)中，特异性引物为ITSl/ITS4和EF1-728F/EF1-986R，反向引物5’端添加生物素标记。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述步骤(一)中，PCR扩增条件如下:反应体积 50μ L，反应组分为:5μ L 1XEx Taq buffer (Mg2+), 4 μ L dNTP Mixture(各2.5mM) ,0.25 μ L Taq 酶(5U/μ L) (TaKaRa)，2 μ L 各正反向引物(10 μ Μ)，2 μ L DNA 模板，灭菌水补足50 μ L ?’参考Fujita(2001)反应程序修改为:94°C预变性4min，94°C变性30s，55.6°C退火30s，72。。延伸lmin，31个循环，最后72°C延伸4min。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述步骤(二)、(三)具体步骤如下: (1)提前预热热混仪到55°C，加入10μ L标记的DNA扩增产物，再加入90 μ L的Cl，混匀，得杂交混合液； (2)取出管芯，加入200μ L去尚子水，用枪头混匀，不要碰到管芯底部； (3)弃去步骤(2)中的去离子水，加入10yL的Cl，55°C，550rpm羽化2min; (4)弃去步骤(3)中的Cl，将步骤(1)中的10yL杂交混合液转移到管芯中，避免泡沫，盖上盖子，55 0C，550rpm, Ih ； (5)从恒温振荡器中取出管芯，将恒温振荡器调到30°C用于HRP-连接； (6)小心打开孔盖，尽可能完全的弃去杂交液，加入200μ L的C2，小心混匀，弃去清洗液，重复两次；
(7)加入100 μ L 的 C3-C4 混合液(C3: C4 = 1:100，体积比)30°C，550rpm，1min ; (8)弃去C3-C4混合液，加入200μ L的C5，清洗，弃去C5 ;再加入200 μ L的C5，清洗，弃去C5 ； (9)加入100μ L的D1，室温放置5min,勿搅动，弃去Dl, ArrayTube 03设相分析(不能超过20min)； (10)利用IC0N0CLUST软件进行分析数据； 所述(:1、02、03、(:4、05、01的含义如下: Cl:杂交缓冲液，组成为:1 % BSA 或 1XSSPE，10mmol/L NaHPO4,0.18mol/L NaCl，lmmol/LEDTA,余量为水，pH7.4 ；其中，IXSSPE 的组成为:150mM NaCl，1mM sodiumphosphate, ImM EDTA,余量为水； C2:冲洗液I，组成为:2XSSC，0.2%十二烷基硫酸钠或0.01% Trit1n x-100，余量为水；其中，IXSSC的组成为:0.15M NaCl,0.0015M柠檬酸钠，余量为水，pH7.0 ;
C3:HRP 连接液 100，10pg/ μ I ； C4:连接缓冲液，组成 为:6XSSPE,0.05% Trit1n χ-100，余量为水；其中，6XSSPE的组成为:60mM 磷酸钠，1.08M NaCl, 6mM EDTA，余量为水，ρΗ7.4 ； C5:冲洗液 II，组成为:2XSSC,0.01% Trit1n x-100，余量为水；
Dl:Horseradish Peroxidase substrate TMB0
【文档编号】C40B40/06GK104131115SQ201410422977
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】严东辉, 张星耀, 赵文霞, 冯小慧, 李永, 贾秀贞 申请人:严东辉