专利名称：一种从动物血液中提取高纯度铜锌超氧化物岐化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase简称SOD)的方法，特别是涉及一种从动物血液中提取高纯度铜锌超氧化物岐化酶的方法。
1969年McCord等人发现牛血红细胞中的一种淡兰色含铜蛋白具有酶活性，能催化超氧阴离子发生岐化反应，由此命名为超氧化物岐化酶。到现在，国内外研究人员对SOD的研究已经进行了几十年，发现有四类SOD存在，即Cu.Zn-SOD；Fe-SOD；Mn-SOD；在哺乳动物的细胞外液中发现的一种具有SOD活性的因子，简称Ec-SOD，即胞外SOD。
超氧化物岐化酶由于其特殊的作用，能够专一清除超氧阴离子，故凡由于超氧阴离子过多而导致的疾患，都可用SOD防治。超氧阴离子既有对物体有利的一面，也有不利的一面。它能使病毒失活，导致脂质过氧化，破坏细胞膜，杀伤细胞，以及改变关节等处润滑液的粘性。超氧阴离子与某些疾病密切相关，它能引起组织发生炎症、再灌流损伤综合症、老年性白内障、放射性膀胱炎等放射性疾病以及红斑狼疮等免疫性疾病。试验证明，给予外源性SOD可以减轻和延缓这些疾病，也可以治愈一些疾病。当机体衰老时，超氧阴离子是使细胞遭受频繁损伤的原因之一，故SOD可用于抗衰老。脂褐素(即老年色素)是细胞质不饱和脂肪酸过氧化的产物，SOD可作为化妆品的添加剂，用以防止或减少老年斑在皮肤中的产生，并同时具有防晒作用和抗炎效果。目前SOD在医药、食品、化妆品等行业有着广泛的应用。
现在，人们已经从不同的来源中提取到了SOD，有动物来源的SOD、植物来源的SOD和微生物来源的SOD。从动物来源的SOD有各种血液SOD、脏器SOD；从植物来源的SOD有大豆SOD、玉米SOD等；从微生物来源的SOD有酵母SOD等。虽然有如此多种类的SOD出现，但是真正能够达到规模化生产的非常少。
目前，经过多年的研究，国内外从动物的血液中提取SOD的方法非常多，采用得比较多的方法一般是将新鲜的动物血液离心收集血红细胞，剧烈搅拌使其溶血，溶血后加入硫酸铵进行盐析，一般都是收集50％到90％的沉淀，利用高速离心机离心去除大部分杂蛋白，再用三氯甲烷、乙醇、丙酮等有机溶剂进行沉淀，进一步除去杂蛋白，经过除盐、除去残留的硫酸铵，最后再经过柱层析系统(一般部经过两次柱层析)，才能分离得到较高比活的SOD。这种工艺比较复杂，因为使用了昂贵的柱层析系统、柱填料和高速离心机，而且，经过柱层析后，使产品的收率大大降低，这样就显著提高了产品的成本，提纯工艺的周期也很长。
本发明的目的就是提供一种生产工艺简单、生产周期短、成本低廉的从动物血液中提取高纯度铜锌超氧化物岐化酶的方法。
本方法步骤如下1、将新鲜的动物血液(猪、牛、羊、鸡等)中加入0.2-0.5％(重量比)的柠檬酸钠抗凝剂，低温(4-8℃)放置30-100分钟，待溶液分层，去掉大部分上清；2、温度梯度处理对上清液进行3-6级温度梯度处理，初级温度为40-50℃，终级温度为70-80℃，每两级间温度梯度差为5-10℃，上清液每级温度梯度处理都是先由室温迅速升温至某级温度、保持10-30分钟后再迅速降至室温，每级降温后都低速离心(4000-6000转/分钟)10-30分钟，除去沉淀；3、对上清液进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为45-70％，充分搅拌溶解，低温(4-8℃)放置12-36小时后，低速(4000-6000转/分钟)离心10-30分钟，去除沉淀；继续在上清液中加入硫酸铵使盐析液饱和度为85-95％，充分搅拌溶解，低温(4-8℃)放置12-36小时后，低速(4000-6000转/分钟)离心10-30分钟，收集沉淀(记为沉淀1)；上清液再低温(4-8℃)放置12-36小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀(记为沉淀2)；4、用浓度为0.05-0.2M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解步骤3的两组沉淀，超滤(10000M)去除硫酸铵即得比活和纯度略有不同的两组SOD酶。
以下实验数据的原料是牛血。
经试验测试表明，本发明制得的高纯度SOD酶冻干产品的存放期达到三年以上。
小白鼠喂养试验20只雌雄各半，体重18-22克，按0.5ml/10克体重，1次灌胃，观察7天，结果无一死亡，也未见精神、皮毛等异常，证明SOD无毒性或毒性极低。
SOD的紫外吸收光谱经过上海分析仪器厂730型分光光度计对SOD的紫外扫描，测得牛血Cu.Zn-SOD的最大吸收值为261nm，A261/A280＝1.34。
以上数据证明用此种方法获得的SOD酶与有关文献(McCord，J.M.&Fridovich，I.Superoside dismutase，J.Biol.Chem，1969，244，6049)报道的SOD酶相一致。
SOD的电泳测定一、琼脂糖平板凝胶电泳结果氨基黑10B染色出现二个点，活性染色出现五个明亮斑域。活性染色电泳后的凝胶平板，在严格避光的1.225×10-3mol/L四氮唑硝基蓝(NBT)溶液(内含核黄素2.8×10-5mol/L)及2.8×10-3mol/L四甲基乙二胺溶液(用PH＝7.8，3.6×10-3mol/L磷酸钾盐缓冲液配制)中浸泡15-20分钟，然后反平板置荧光箱中光照至蓝色背景与无色明亮斑域清晰可辨。
二、丙烯酰胺圆盘电泳结果氨基黑10B出现两条带，活性染色出现明显斑域。
电泳实验结果表明，本发明获得的SOD酶为电泳纯，从而达到了发明目的。
采用改良的连苯三酚法测定，具体测定方法见文献生物化学生物物理进展，1996，4，71-73。
1、温度梯度法除血红蛋白
从以上的表中可以看出，整个温度梯度处理过程中，酶的比活提高了近10倍，而酶的收率达到了96.70％(5650/5843)。
2、两级硫酸铵盐析测上清液测试结果组1一级盐析50％饱和度硫酸铵，二级盐析90％饱和度硫酸铵
组2一级盐析55％饱和度硫酸铵，二级盐析90％饱和度硫酸铵
组3一级盐析60％饱和度硫酸铵，二级盐析95％饱和度硫酸铵
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组4一级盐析65％饱和度硫酸铵，二级盐析90％饱和度硫酸铵
说明组3的杂蛋白去除得彻底，而且沉淀2的比活明显高于沉淀1，但是沉淀2的收率有沉淀1高，表面上看来在生产中容易出现矛盾，实际上，我们可以同时生产出供两种用途的SOD产品。SOD在医药行业的应用需要高纯度、高比活，而在化妆品和食品保健品行业就不需要很高比活的SOD产品，我们现在的工艺技术正好能够同时满足这两个行业的需要。
整个加热过程中酶的比活提高将近10倍，而酶的收率达到96％以上，说明这个温度梯度法除血红蛋白的效果是比较好的，比单纯地在某一温度下加热的效果要好得多。整个过程中，由于采用了温度梯度处理法及两级盐析，仅使用低速离心机(4000-6000转/分钟)即可达到去除沉淀而酶的收率高等目的。
综上所述，本发明所述的从动物血液中提取高纯度铜锌超氧化物岐化酶的制备方法具有工艺简便、周期短、成本低、酶的收率及比活高等优点。
下面结合具体实施例来进一步阐述本发明所述及的制备方法，实施例采用四级温度梯度进行去除沉淀处理；1、将新鲜的牛血10000ml中加入38g柠檬酸抗凝剂，低温4℃放置50分钟，待溶液分层，去掉大部分上清，得4500ml沉淀；2、将沉淀由室温迅速加温至50℃，保温15分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得4400ml上清液；3、上清液迅速加温至60℃，保温10分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得4300ml上清液；4、上清液迅速加温至70℃，保温10分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得4100ml上清液；5、上清液迅速加温至75℃，保温5分钟后迅速降至室温，4500转/分钟离心20分钟后去除沉淀，得4000ml上清液；6、上清液中加入硫酸铵使饱和度达60％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，低温(4℃)放置24小时，离心(4500转/分钟)20分钟，除去沉淀；7、上清液中再加入硫酸铵使饱和度达95％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，低温(4℃)放置24小时，离心(5000转/分钟)20分钟，收集沉淀(标为沉淀1)；上清液再低温(4℃)放置24小时后用G4磨砂漏斗进行抽滤，收集沉淀(标为沉淀2)；8、用0.05M磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液50ml分别溶解沉淀1和沉淀2，完全溶解后超滤(10000M)去除残留的硫酸铵，分别得到345.7mg和168mg纯度和比活略有不同的两组高纯度的SOD，实验数据同前。实施例21、新鲜的猪血10000ml中加入32g柠檬酸抗凝剂，低温6℃放置30分钟，待溶液分层，去掉大部分上清，得4700ml沉淀；2、将沉淀由室温迅速加温至55℃，保温10分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得4500ml上清液；3、上清液迅速加温至65℃，保温10分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得4350ml上清液；4、上清液迅速加温至75℃，保温8分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得4000ml上清液；5、上清液中加入硫酸铵使饱和度达55％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，低温(6℃)放置18小时，离心(4500转/分钟)15分钟，除去沉淀；6、上清液中再加入硫酸铵使饱和度达90％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，低温(6℃)放置18小时，离心(5000转/分钟)15分钟，收集沉淀(标为沉淀1)；上清液再低温(6℃)放置18小时后用G4磨砂漏斗进行抽滤，收集沉淀(标为沉淀2)；7、用0.1M的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液30ml分别溶解沉淀1和沉淀2，完全溶解后超滤(10000M)去除残留的硫酸铵，分别得到361.4mg和156.5mg纯度和比活略有不同的两组高纯度的SOD。
权利要求
一、一种从动物血液中提取高纯度铜锌超氧化物岐化酶的方法，步骤如下1.将新鲜的动物血液中加入重量比为0.2-0.5％的柠檬酸钠抗凝剂，低温4-8℃放置30-100分钟，待溶液分层，去掉大部分上清；2.温度梯度处理对上清液进行3-6级温度梯度处理，初级温度为40-50℃，终级温度为70-80℃，每两级间温度梯度差为5-10℃，上清液每级温度梯度处理都是先由室温迅速升温至某级温度、保持10-30分钟后再迅速降至室温，每级降温后都低速4000-6000转/分钟离心10-30分钟，除去沉淀；3.对上清液进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为45-70％，充分搅拌溶解，低温4-8℃放置12-36小时后，低速4000-6000转/分钟离心10-30分钟，去除沉淀；继续在上清液中加入硫酸铵使盐析液饱和度为85-95％，充分搅拌溶解，低温4-8℃放置12-36小时后，低速4000-6000转/分钟离心10-30分钟，收集沉淀，记为沉淀1；上清液再低温4-8℃放置12-36小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀，记为沉淀2；4.用浓度为0.05-0.2M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解步骤3的两组沉淀，10000M超滤去除硫酸铵即得比活和纯度略有不同的两组SOD酶。
二、如权利要求一所述的一种从动物血液中提取高纯度铜锌超氧化物岐化酶的方法，其特征在于所述的动物血液可以来自猪、牛、羊、鸡等家禽及牲畜。
全文摘要
本明涉及一种从动物血液中提取高纯度超氧化物岐化酶的方法,本方法包括如下步骤:在动物血液中加入抗凝剂,去除沉淀,对上清进行3～6级的温度梯度处理,再去除沉淀,对上清液用硫酸铵进行两级不同饱和度盐析,并对最终的沉淀用缓冲液洗脱除去残留的盐析液,最后得纯度及比活都比较高的SOD酶。本发明具有操作简单、成本低、酶的收率及比活都比较高的优点。
文档编号C07K1/30GK1274754SQ0011776
公开日2000年11月29日 申请日期2000年6月3日 优先权日2000年6月3日
发明者赵长富, 潘智勇, 刘宁, 韩素珍 申请人:吉林大学生命科学技术研究所