专利名称：高纯度高活性藻蓝蛋白的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种藻蓝蛋白的分离方法，尤其是一种从钝顶螺旋藻(Spiruina Platensis)中分离纯化高纯度高活性藻蓝蛋白的方法。
中国专利申请号94109295．X公开了一种“钝顶节旋藻藻蓝蛋白及其应用”，其工艺流程为干粉→提取→DEAE52→cellulose→盐析→透析→SephadexG75→冷冻干燥，获得作为保健食品的藻蓝蛋白，没有任何纯度和活性的要求和指标。
本发明的目的就是提供一种从钝顶螺旋藻中分离纯化获得高纯度高活性藻蓝蛋白的方法。
本发明可由如下方式来实现新鲜的钝顶螺旋藻藻泥，加入0．001～0．003M，PH=7的磷酸缓冲液(PBS)，冻融1～2次后，置于冰浴中超声破碎细胞；在4～10℃，以9000～11000转／秒离心50～70分钟，弃沉淀；取上清，加入30～60％饱和度硫酸铵在4～10℃，避光静置过夜，在4～10℃，以13000～18000转／秒离心20～40分钟，取沉淀；用0．01～0．03M，PH=7的磷酸缓冲液溶解沉淀，在4～10℃，避光静置，以0．01～0．03M，PH=7磷酸缓冲液透析，分子截留量12000Da，经快速浓缩后，上SephadexG200层析柱，用0．01～0．03M，PH=7磷酸缓冲液洗脱，收集峰值组分，上DEAE-SephadexA25柱，用0．005～0．007M，PH=7的磷酸缓冲液和0．2～0．4M，PH=7的氯化钠洗脱，收集峰值组分，上SephadexG200柱，用0．01～0．03M，PH=7的磷酸缓冲液洗脱，整个柱层析在8～10℃，避光条件下进行；取纯化的藻蓝蛋白样品检测A620nm／A280nm值，紫外可见光谱图、荧光光谱图以及PAGE电泳(呈显单一蓝色电泳条带，无其它杂蛋白)；藻蓝蛋白立即冰冻干燥，所得干粉在4～10℃避光保存。
本发明简化了分离纯化程序，易于操作，所获藻蓝蛋白的纯度和活性高，且成本较低，可作为一种荧光标记物用于免疫化学分析，可以做到双色或三色标记，具有临床应用前景，如癌细胞的早期诊断。
下面结合实施例，对本发明作进一步的描述。
实施例一采收新鲜的钝顶螺旋藻藻泥100克，避免螺旋藻采收时在自然温度下发生变质或损伤，加入0．001M，PH=7的磷酸缓冲液，冻(-20℃)融(18℃，避光)2次，置于冰浴中超声破碎细胞；在5℃，以10000转／秒离心60分钟，弃沉淀；取上清，加入60％饱和度硫酸铵在4℃，避光静置过夜，在4℃，以15000转／秒离心30分钟，取沉淀；用0．02M，PH=7的磷酸缓冲液溶解沉淀，在8℃，避光静置，以0．01M，PH=7磷酸缓冲液透析，分子截留量12000Da；经快速浓缩后，上SephadexG200层析柱，用0．01M，PH=7磷酸缓冲液洗脱，收集峰值组分，上DEAE-SephadexA25柱，用0．005M，PH=7的磷酸缓冲液和0．2M，PH=7的氯化钠洗脱，收集峰值组分SephadexG200，用0．01M，PH=7的磷酸缓冲液洗脱，整个柱层析在8℃、避光条件下进行，所得藻蓝蛋白立即冰冻干燥，所得干粉在4℃避光保存。
藻蓝蛋白产品检测主要仪器有紫外可见扫描光谱仪、紫外可见分光光度仪、荧光扫描光谱仪、电泳仪等，藻蓝蛋白的主要参数和性状(1)纯化产物呈纯天蓝色，具有红色荧光；(2)纯度比值(A620nm／A280nm)≥4；(3)紫外可见光谱在620nm处呈现主峰；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)呈显单一蓝色电泳条带；(5)荧光激发峰分别位于590nm和635nm，荧光发射峰位于650nm，均呈显主峰图谱。
本发明制备的高纯度高活性藻蓝蛋白能专一与DNA结合，在流式细胞仪检测系统中能够清晰和灵敏地显示出人体子宫颈癌细胞等超长膨大的异倍体核基因组，从而准确快速地进行癌细胞的诊断，具有临床应用前景。
权利要求
1.一种高纯度高活性藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于(1)新鲜的钝顶螺旋藻藻泥，加入0．001～0．005M，PH=7的磷酸缓冲液，冻融1～2次后，置于冰浴中超声破碎细胞；(2)在4～10℃，以9000～11000转／秒离心50～70分钟，弃沉淀；(3)取上清，加入30～60％饱和度硫酸铵在4～10℃，避光静置过夜，在4～10℃，以13000～18000转／秒离心20～40分钟，取沉淀；(4)用0．01～0．03M，PH=7的磷酸缓冲液溶解沉淀，在4～10℃，避光静置，以0．01～0．03M，PH=7磷酸缓冲液透析，分子截留量12000Da；(5)经快速浓缩后，上SephadexG200层析柱，用0．01～0．03M，PH=7磷酸缓冲液洗脱，收集峰值组分，上DEAE-SephadexA25柱，用0．005～0．007M，PH=7的磷酸缓冲液和0．2～0．4M，PH=7的氯化钠洗脱，收集峰值组分，上ScphadcxG200柱，用0．01～0．03M，PH=7的磷酸缓冲液洗脱，整个柱层析在8～10℃，避光条件下进行；(6)藻蓝蛋白立即冰冻干燥，所得干粉在4～10℃，避光保存。
2.依权利要求1所述的藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于藻蓝蛋白纯度与活性指标A620nm／A280nm≥4；
3.依权利要求1所述的藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于藻蓝蛋白荧光激发峰分别位于590nm和635nm；
4.依权利要求1所述的藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于藻蓝蛋白荧光发射峰位于650nm。
全文摘要
本发明公开了一种从钝顶螺旋藻中分离纯化活性藻蓝蛋白的方法,其工艺流程是:藻泥→提取→盐析→透析→浓缩→sephadexG200→DEAE→SephadexG25→SephadexG200→冷冻干燥。本发明简化了分离纯化程序,易于操作,所获藻蓝蛋白的纯度和活性高,且成本低,可作为一种荧光标记物用于免疫化学分析,可以做到双色或三色标记,具有临床应用前景,如癌细胞的早期诊断。
文档编号C07K1/00GK1291616SQ0011751
公开日2001年4月18日 申请日期2000年10月2日 优先权日2000年10月2日
发明者钱凯先, 李江平, 曾文辉, 丁鸣 申请人:广东梅县梅雁蓝藻有限公司