专利名称：用靶点微管蛋白纯化紫杉醇混合物中紫杉醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用紫杉醇药理作用靶点的微管蛋白，纯化紫杉醇与三尖杉宁碱(Cephalomannine)混合物中紫杉醇的方法。是属于紫杉醇的进一步纯化技术。
紫杉醇是从红豆杉属植物中分离出来的一种二萜类化合物，具有广泛的抗癌活性，于1992年首先经美国FDA(Food and Drug Administration)批准用于治疗卵巢癌和乳腺癌，目前还在进行治疗其它癌症如肺癌、结肠癌的临床试验。
从红豆杉植物的枝、茎、叶中提取的紫杉醇混合物，是指主要含有紫杉醇与三尖杉宁碱的产物，为获得纯品紫杉醇，需要进一步纯化，将紫杉醇与三尖杉宁碱分开，但是由于三尖杉宁碱的结构和物性与紫杉醇具有极其相似性，它们的分离工作非常困难。目前有关的分离方法见如下文献1、文献“J.Nat.Prod.，1984，47(1)131-137”报道中指出，被富集紫杉醇与三尖杉宁碱共存，最后用HPLC分离紫杉醇与三尖杉宁碱。
2、文献“J.Nat.Prod.，1992，55(252)259”报道中指出，在氧化锇存在条件下，催化氧化三尖杉宁碱侧键双键，得到二醇，然后用层析法和重结晶方法与紫杉醇分离。
3、文献“US Patent 5，334，732和5，336，648”报道中指出，用臭氧氧化三尖杉宁碱侧链的方法。
4、专利“CN11824A”报道中指出，通过溴化不饱和侧链紫杉醇尤其是三尖杉宁碱，然后层析分离并从极性和非极性溶剂混合物中结晶出紫杉醇。
本发明的目的，在于提供一种用靶点微管蛋白纯化紫杉醇混合物中紫杉醇的方法。该方法具有过程简单，获取的产品纯度高的特点。
为达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。利用紫杉醇的药理作用靶点微管蛋白为分离介质，及紫杉醇和微管蛋白两者之间可逆特异性结合作用，将紫杉醇混合物溶解于有机溶剂，微管蛋白混合于由磷酸钠、谷氨酸钠、乙二胺四乙酸及二硫苏糖醇组成的缓冲液水相中，然后将上述的有机相液与缓冲液水相相混合，搅拌、静置后分层，取出的水相液加入新鲜的有机溶剂和解离剂，搅拌、静置后，取出有机相液，经过蒸发、溶解去残、结晶、过滤后处理便可得纯度达98.5％的紫杉醇，其特征在于紫杉醇混合物的有机溶剂与新鲜有机溶剂为二氯甲烷；解离剂为氯化钙和氯化镁。
下面对本发明加以详细说明。
紫杉醇的药理作用机理是催化微管蛋白聚合成微管并结合到微管上稳定和抑制微管解聚，这样对于迅速分裂的癌细胞，紫杉醇阻滞其有丝分裂纺锤体，使癌细胞停止在G2期和M期直至死亡。利用微管蛋白聚合-解聚这一个可逆过程，在一定的条件下，使紫杉醇被聚合的微管“吸附”，然后在另外的条件下使微管解聚成二聚体的形式，使结合的紫杉醇“脱附”到溶剂中，整个过程通过紫杉醇的相转移来实现。最后通过重结晶等方法得到高纯度的紫杉醇，从而使紫杉醇与其它不与微管作用的组分分离，达到纯化目的。本发明所用的紫杉醇药理作用靶点微管蛋白是参照文献(Farrell K W，Wilson L.Biochemistry，1984，233714)自牛脑制得。本发明的实施，主要技术是选择紫杉醇混合物的溶解剂和紫杉醇-微管蛋白的复合物的解离剂。紫杉醇混合物溶解剂的选择，要求对紫杉醇的溶解度大，与水不互溶，为此经过大量的重复性的实验，最后选择最为适宜的二氯甲烷。解离剂是用于解离紫杉醇-微管蛋白复合物，要求它既具有上述解离作用又能溶于水。通过实验，确定氯化镁和氯化钙最为适宜。
本发明具体操作时，注意掌握有机溶剂和缓冲液的加入量，它们的加入量一方面要与紫杉醇混合物的总量相匹配，又要做到与紫杉醇的量相匹配，这样有利产物的后处理及减少工作量，降低制备成本。本发明对紫杉醇分析为高效液相色谱法，采用外标法定量。
本发明具有制备过程简单，产品纯度高的特点。
下面再以实施例对本发明加以进一步说明。
实例一将含有58.2％紫杉醇和39.8％三尖杉宁碱的混合物50mg加入到100ml二氯甲烷中于30℃下溶解，并与150ml微管蛋白含量为1.5mg/ml缓冲液(20mM磷酸钠+100mM谷氨酸钠+1mM乙二胺四乙酸+1mM二硫苏糖醇)混合，静置30分钟后，两相分层。用分液漏斗分出水相，再向水相中分别加入新鲜的二氯甲烷50ml和5mg氯化镁并冷却至5℃，保持30分钟。然后将水相与有机相分开，将有机相蒸发至干得残余物，再用30ml丙酮-己烷(1∶1)溶解残余物，放置在冰箱中结晶并过滤得到含量为98.3％的紫杉醇23.6mg。
实例二将含有65.6％紫杉醇和30.2％三尖杉宁碱的混合物30mg加入到100ml二氯甲烷中于25℃下溶解，并与150ml微管蛋白含量为1.5mg/ml缓冲液(20mM磷酸钠+100mM谷氨酸钠+1mM乙二胺四乙酸+1mM二硫苏糖醇)混合，静置30分钟后，两相分层。用分液漏斗分出水相，再向水相中分别加入新鲜的二氯甲烷50ml和5mg氯化钙并冷却至5℃，保持30分钟。然后将水相与有机相分开，将有机相蒸发至干得残余物，再用30ml丙酮-己烷(1∶1)溶解残余物，放置在冰箱中结晶并过滤得到含量为98.5％的紫杉醇18.1mg。
实例三将含有36.8％紫杉醇和55.1％三尖杉宁碱的混合物60mg加入到100ml二氯甲烷中于25℃下溶解，并与150ml微管蛋白含量为1.5mg/ml缓冲液(20mM磷酸钠+100mM谷氨酸钠+lmM乙二胺四乙酸+1mM二硫苏糖醇)混合，静置30分钟后，两相分层。用分液漏斗分出水相，再向水相中分别加入新鲜的二氯甲烷50ml和5mg氯化钙并冷却至5℃，保持30分钟。然后将水相与有机相分开，将有机相蒸发至干得残余物，再用30ml丙酮-己烷(1∶1)溶解残余物，放置在冰箱中结晶并过滤得到含量为98.1％的紫杉醇20.3mg。
权利要求
1.一种用靶点微管蛋白纯化紫杉醇混合物中紫杉醇的方法，它是利用紫杉醇的药理作用靶点微管蛋白为分离介质，及紫杉醇和微管蛋白两者之间可逆特异性结合作用，将紫杉醇混合物溶解于有机溶剂，微管蛋白混合于由磷酸钠、谷氨酸钠、乙二胺四乙酸及二硫苏糖醇组成的缓冲液水相中，然后将上述的有机相液与缓冲液水相相混合，搅拌、静置后分层，取出的水相液中加入新鲜的有机溶剂和解离剂，搅拌、静置后，取出有机相液，经过蒸发、溶解去残、结晶、过滤后处理便可得纯度达98.5％的紫杉醇，其特征在于紫杉醇混合物的有机溶剂与新鲜有机溶剂为二氯甲烷；解离剂为氯化钙和氯化镁。
全文摘要
本发明公布了一种用靶点微管蛋白纯化紫杉醇混合物中紫杉醇的方法。该方法是利用紫杉醇的药理作用靶点微管蛋白为分离介质,及紫杉醇和微管蛋白两者之间可逆特异性结合作用,将紫杉醇混合物溶解于有机溶剂,微管蛋白混合于缓冲液水相中,然后将上述的有机相液与缓冲液水相相混合,分层后取出水相加入新鲜有机溶剂和解离剂,搅拌、静置,取出有机相经蒸发等后处理得纯度达98.5%的紫杉醇。本发明制备过程简单,产品纯度高。
文档编号C07D305/00GK1287120SQ0011775
公开日2001年3月14日 申请日期2000年6月2日 优先权日2000年6月2日
发明者韩金玉, 肖剑, 常贺英, 王 华, 李海静 申请人:天津大学