专利名称：来源于谷氨酸棒状杆菌的二氢乳清酸脱氢酶的序列及其在微生物生产嘧啶和/或嘧啶 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及借助于基因操作的生物通过发酵生产嘧啶的方法。本发明包含来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的二氢乳清酸脱氢酶的序列，及其用于微生物生产嘧啶和/或嘧啶相关化合物的用途。
嘧啶的生物合成途径对于所有活的生物都是非常重要的(R.L.和Quinn，C.L.所著的关于此内容的评论文章是在枯草杆菌(编者Sonenshein，A.L.，Hoch，J.A.和Losick，R.，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.)，1993，第343-358页中发表的)。嘧啶核苷酸是嘧啶的衍生物，且，本身是DNA和RNA的活化前体，并用于许多生物合成途径中。在嘧啶核苷的胞苷，尿苷，脱氧胞苷和脱氧胸苷中，嘧啶碱基与戊糖结合，且嘧啶核苷酸是嘧啶核苷的磷酸酯。嘧啶核苷和嘧啶核苷酸及其衍生物还是合成有价值的药物，如，例如，CDP-胆碱，乳清酸或UMP(Kuninaka，A.所著的关于此内容的评论文章是在Biotechnology生物工程学第6卷(编者Rehm，H.-J.和Reed，G.)，VCH，Weinheim，Germany，1996，第561-612页中发表的)的重要起始化合物。
许多，但不是全部微生物均能够从外部供给的嘧啶核苷和嘧啶碱基从头合成它们的嘧啶核苷酸。嘧啶碱基和/或嘧啶核苷通常不存在于细胞中。然而，在某些生长条件下，它们可能过量地形成，然后分泌到培养基中。由于这个原因，微生物可用于发酵生产嘧啶核苷酸和/或相关的化合物。
微生物生物合成嘧啶核苷酸的效率可通过基因操作嘧啶的生物合成途径而达到最佳。就基因操作方法而论，嘧啶生物合成途径的基因转录速度和/或基因拷贝数增加。由于这个原因，胞内酶活性和基因产物的比例增加。酶活性的增加使得在营养培养基中供给的化合物至嘧啶核苷酸和/或相关化合物的转化增加，从而增加合成效率。因而，可显示，例如，二氢乳清酸脱氢酶的活性增加，其催化(S)-二氢乳清酸至乳清酸的氧化-这是嘧啶核苷酸从头生物合成嘧啶的第四阶段-增加产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)中UMP合成的效率(Nudler，A.A.，Garibyan，A.G.和Bourd，G.I.(1991)FEMSMicrobiol.Lett.82263-266)。
本发明涉及来源于谷氨酸棒状杆菌的，用于嘧啶生物合成途径的二氢乳清酸脱氢酶的新pyrD基因，及其制备嘧啶核苷酸和/或嘧啶相关化合物的用途。
本发明其中一个部分包含pyrD基因产物。SEQ ID NO.2描述了一种多肽序列。该pyrD基因编码具有33953分子量的322个氨基酸的多肽。本发明还涉及，此多肽的功能性衍生物，其可通过将SEQ ID NO2的序列缺失，插入或置换或缺失，插入和置换的组合，一个或多个氨基酸，优选直到25％的氨基酸，最优选直到15％的氨基酸而得到。术语功能性衍生物是指该衍生物的酶活性与具有SEQ ID NO.2序列的多肽的酶活性处于同一数量级。
本发明的另一部分包含编码上述多肽的多核苷酸序列。该核苷酸序列可以从自谷氨酸棒状杆菌分离的序列(即，SEQ ID NO.1)开始产生，其中这些序列是通过定点诱变而修饰的或，使用遗传密码反向翻译相应的多肽之后，进行化学全合成。
这些多核苷酸序列最适于以用于宿主生物，优选微生物转化的基因构造的形式应用。这些基因构造是由多核苷酸的至少一个拷贝和至少一个调节序列组成的。调节序列包含启动子，终止子，增强子及核糖体结合位点。
用这些基因构造转化的优选宿主生物是棒状杆菌属和芽孢杆菌属(Bacillus)，但任一真核微生物也可用于此目的，优选Ashbya，假丝酵母属(Candida)，毕赤氏酵母属(Pichia)，糖酵母属(Saccharomyces)和汉逊氏酵母属(Hansenula)的酵母菌株。
本发明的另一部分包含通过培养以上述方法转化的宿主生物，随后分离嘧啶来制备嘧啶和嘧啶衍生物。嘧啶衍生物指的是一种具有嘧啶环的化合物，其可以通过用本发明的其中一个多核苷酸转化宿主生物来制备。
培养微生物和从微生物产物中分离嘧啶的方法和过程对于本领域的技术人员来说是熟知的。
下列实施例描述本发明是如何产生的，及其为了增加嘧啶核苷酸和/或相关化合物的生产效率，在微生物基因操作中的应用。
序列列表(I)一般信息(1)申请人(A)名称BASF-LYNX Bioscience AG(B)街 Im Neuenheimer Feld 515(C)市 Heidelberg(D)国家德国(E)邮政编码69120(F)电话06221/4546(G)传真06221/454770(2)标题来源于谷氨酸棒状杆菌的二氢乳清酸脱氢酶的序列及其在微生物生产嘧啶和/或嘧啶相关化合物中的用途(3)序列数2(4)计算机可读形式的类型(A)媒体类型软盘(B)计算机 IBM PC兼容的(C)操作系统Windows NT(D)软件Microsoftword 97 SR-1(I)SEQ ID NO.1的信息(1)序列特征(A)长度966(B)类型核酸(C)链的类型双链(D)拓扑结构线形(2)分子类型DNA(3)假拟无(4)反义无(5)源(A)生物Corynebacterium glutamicum谷氨酸棒状杆菌(6)序列描述SEQ ID NO.1ATGGAAAAAATCATCGCAGTGCACGATGATTCCCTCTCCCAGGAAGTCTTCGGCGTCACCTTCCCACGACCACTAGGCCTCGCCGCAGGTTTCGACAAAAACGCATCAATGGCTGATGCCTGGGGTGCCGTTGGATTCGGATACGCCGAACTTGGCACCGTCACCGCCTCCCCACAGCCAGGAAACCCCACCCCGCGCCTTTTCCGCCTGCCTGCCGACAAAGCTATCTTGAACCGCATGGGATTCAACAACCTGGGTGCAGCAGAAGTCGCAAAAAACCTGCGCAACCGGAAATCCACCGATGTCATCGGCATCAACATCGGTAAAACCAAAGTGGTTCCCGCTGAACACGCAGTAGATGACTACCGCCGTTCTGCATCTTTGTTAGGTGATCTTGCTGATTACCTGGTTGTCAACGTTTCCTCCCCCAACACTCCGGGTCTCCGCGATCTGCAGGCTGTGGAATCTTTGCGACCAATCCTCGCCGCAGTGCAGGAATCCACCACCGTCCCAGTCTTGGTGAAAATCGCACCAGACCTCTCCGACGAAGACATCGACGCCGTAGCTGACCTGGCAGTTGAGCTCAAACTCGCCGGAATCGTAGCCACCAATACCACCATTTCCCGCGAAGGCCTCAACACTCCTTCAGGTGAAGTCGAAGCCATGGGTGCTGGCGGAATCTCCGGTGCTCCAGTAGCAGCCCGATCTTTGGAGGTACTCAAGCGCCTCTACGCACGGGTAGGCAAAGAGATGGTGTTGATCTCTGTCGGTGGCATCAGCACCCCTGAGCAAGCCTGGGAACGCATCACCTCCGGCGCAACCCTTCTGCAGGGATACACCCCATTCATCTACGGTGGCCCCGATTGGATCAGAGATATCCACCTTGGTATCGCCAAGCAGCTGAAAGCTCACGGTCTGCGCAACATCGCTGACGCTGTGGGCAGCGAATTGGAGTGGAAGAACTAA(I)SEQ ID NO.2的信息(1)序列特征(A)长度322(B)类型氨基酸(C)链的类型单链(D)拓扑结构线形(2)分子类型氨基酸(3)假拟无(4)反义无(5)源(B)生物Corynebacterium glutamicum谷氨酸棒状杆菌(6)序列的描述SEQ ID NO.2MEKIIAVHDDSLSQEVFGVTFPRPLGLAAGFDKNASMADAWGAVGFGYAELGTVTASPQPGNPTPRLFRLPADKAILNRMGFNNLGAAEVAKNLRNRKSTDVIGINIGKTKVVPAEHAVDDYRRSASLLGDLADYLVVNVSSPNTPGLRDLQAVESLRPILAAVQESTTVPVLVKIAPDLSDEDIDAVADLAVELKLAGIVATNTTISREGLNTPSGEVEAMGAGGISGAPVAARSLEVLKRLYARVGKEMVLISVGGISTPEQAWERITSGATLLQGYTPFIYGGPDWIRDIHLGIAKQLKAHGLRNIADAVGSELEWKN
权利要求
1.一种具有二氢乳氢酸脱氢酶活性的多肽，其选自(a)一种具有SEQ ID NO.2中描述的氨基酸序列的多肽，(b)一种与(a)相比，已经通过一个或多个氨基酸的缺失，插入或置换而被修饰了的多肽。
2.一种编码权利要求1多肽的多核苷酸。
3.一种基因构造，其包含权利要求2的多核苷酸的至少一个拷贝，和至少一个调节序列。
4.一种用权利要求3的基因转化的宿主生物。
5.一种生产嘧啶和嘧啶衍生物的方法，其中先培养权利要求4的宿主生物，随后分离嘧啶或嘧啶衍生物。
全文摘要
本发明包含一种用于从谷氨酸棒状杆菌生物合成嘧啶的基因(pyrD)的核苷酸序列及其用于微生物生产嘧啶的用途。
文档编号C07K14/34GK1358229SQ00809504
公开日2002年7月10日 申请日期2000年6月23日 优先权日1999年6月25日
发明者M·马克, K·赫尔布斯特 申请人:阿克萨隆生物科学股份公司