Baff受体(bcma),一种免疫调节剂的制作方法

专利名称：Baff受体(bcma),一种免疫调节剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及BAFF受体，及其阻断剂在刺激或抑制B细胞和免疫球蛋白的表达方面的用途，其中BAFF是一种属于肿瘤坏死因子(TNF)家族的β-细胞活化因子。该受体可用于抗肿瘤及免疫调节，还可以用于治疗HIV等免疫抑制性疾病。此外，所述受体及其阻断剂与高血压及其相关疾病的发生有关。另外，该受体的基因转染的细胞可用于对下述病症进行基因治疗肿瘤、淋巴瘤、自身免疫疾病或与B-细胞有关的遗传性疾病。阻断剂，例如特异于所述受体的重组变体或抗体也可用于免疫调节。可以在免疫抑制性疾病中，用BAFF受体作为B-细胞刺激剂刺激B细胞的产生，例如用于接受了器官移植(例如骨髓移植)的患者以及癌症治疗康复期的病人。也可以用BAFF受体作为佐剂或共刺激剂将B细胞水平提高和/或恢复至正常水平。BAFF受体的能够阻断B细胞功能的可溶性形式也可用于抑制B-细胞介导的疾病。
背景技术：
本发明涉及TNF家族中的一种新型受体。一种已被鉴定了的新型受体，BAFF-R(或“BCMA”)。
TNF家族由称为TNF家族配体及TNF家族受体的配体及其特异性受体成对组成(Bazzoni和Beutler，1996)。该家族参与免疫系统的调节，还可能参与其它非免疫系统的调节。这种调节通常是“总开关”式的调节，因而TNF家族的信号传递能够导致以TNF为最典型(best typified)的大量后续事件。TNF能激发生物发生对外来入侵的常规保护性炎症反应，该炎症反应涉及改变参与细胞运输的粘附分子展示，产生趋化因子将特异性细胞驱动入特定区室，以及启动各种效应细胞。因而，这些途径的调节具有临床意义。
这类TNF家族细胞因子介导的各种细胞应答必须通过它们与其特异性细胞受体结合才能启动。现在已经鉴定出了至少两种不同TNF受体，分子量约为55kDa(TNFR1)和75kDa(TNFR2)[Hohman et al.，J.Biol.Chem.26414927-14934(1989)和Brockhaus et al.，PNAS，873127-3131(1990)]。这两种TNF受体基因具有广泛多形性。这两种TNFR共亨细胞表面受体的典型结构，包括胞外结构域、跨膜结构域以及胞内结构域。1型和2型TNFR的胞外部分都包括由4个富含半胱氨酸的结构域(CDR)组成的一段重复氨基酸序列模式。其它几种细胞表面蛋白中也存在类似的CDR重复模式，这些蛋白包括p75神经生长因子受体、B-细胞CD40抗原。
由于受体很容易转化为免疫球蛋白融合蛋白，所以这些蛋白是用来阐明生物途径的重要工具。这些二聚体型可溶性受体形式能够很好地抑制分泌型或表面结合型配体介导的事件。这些受体通过与它们的配体结合，来阻断与那些能够发送信号的细胞相关受体结合。这些受体-Ig融合蛋白不仅有实验性应用价值，而且它们已经成功地应用于临床，例如用TNF-R-Ig结合OKT3治疗炎性肠道疾病、类风湿性关节炎和急性临床综合征(Eason et al.，1996；Feldmann et al.，1996；van Dullemen et al.，1995)。可预计对TNF家族受体的信号传递介导的多个事件的操纵可广泛用于治疗免疫相关疾病，而且还可以用来治疗多种因免疫系统参与而导致病理性继发症状的人类疾病。Osteoprotegerin是一种新近公开的受体，其可溶形式能够阻断骨质量(bone mass)的损失，因此，由TNF家族受体的信号传递所调控的事件不一定限于免疫系统的调控。抗所述受体的抗体能阻断配体结合，因而也有临床用途。这类抗体通常寿命很长，与那些血液半衰期较短的可溶性受体-Ig融合蛋白相比，具有优势。
尽管对受体介导的途径进行抑制标志着将这些受体的治疗作用开发至了最大限度，但是最初显示出临床作用的却是TNF受体的活化(Aggarwal andNatarajan，1996)。TNF受体的活化能启动靶细胞的死亡，因而应用于肿瘤治疗不只是过去就是现在也还是很有诱惑力的(Eggermont et al.，1996)。这些受体的活化可以通过施用配体，即通过自然途径来完成，另外那些能与受体交联的抗体也是强效的激动剂。因为配体在血液中的半衰期通常都很短，而抗体在血液中存在很长的时间因而在肿瘤学上更有优势。由于这些受体中大部分都可以在肿瘤上更有选择性地表达或者它们只传递肿瘤细胞死亡或分化的信号，所以激动剂抗体可以作为治疗癌症的有力武器。类似地，大多数主动免疫事件是通过TNF家族受体来介导的，例如宿主炎性反应、抗体生成等，因此激动性(agonistic)抗体应用于其它非肿瘤学领域也有有益效果。
矛盾的是，对某种途径的抑制在治疗肿瘤方面也有有益效果。例如一些肿瘤表达Fas配体，这种表达能导致Fas阳性淋巴细胞的死亡，从而使肿瘤能逃避免疫系统。那么，这种情况下，抑制Fas系统就使得免疫系统能够通过其它途径对肿瘤作出反应，现在这种通路已经找到(Green and Ware，1997)。
发明概述申请人已经鉴定出了编码本申请中称为″BAFF-R″或″BCMA″的多肽的cDNA克隆，该多肽能结合肿瘤坏死因子BAFF，BAFF是一种属于肿瘤坏死因子(″TNF″)家族的B细胞活化因子。BAFF与此前在WO/9912964(在此引入作为参考)中公开的是同一分子。
一个实施方案中，本发明提供了BAFF-R的应用方法。这类方法中包括下述方法使用BAFF-R多肽抑制动物中的B细胞生长、树突状细胞介导的B生长及成熟或者免疫球蛋白的生成。另外，还包括了下述方法使用BAFF-R多肽刺激动物中的B细胞生长、树突状细胞介导的B生长及成熟或者免疫球蛋白的生成，或者使用BAFF-R多肽和抗-T抗体、CD40配体或者抗-CD40配体一起来共刺激动物中的B细胞生长、树突状细胞介导的B生长及成熟或者免疫球蛋白的生成。
另一实施方案中，本发明提供了使用BAFF-R治疗下列疾病的方法自身免疫疾病、高血压、心血管疾病、肾病、B细胞淋巴-增生疾病、免疫抑制性疾病、器官移植以及HIV。另外，还包括了使用药物治疗、抑制或改变免疫应答的方法，所述免疫应答涉及BAFF-R与其配体之间的信号传送途径，以及通过施用特异于BAFF-R或其表位的抗体来抑制炎症的方法。
本发明所述方法优选通过施用治疗有效量的BAFF-R多肽、包含与异源氨基酸序列融合之BAFF-R多肽或其片段的嵌合分子或者抗BAFF-R抗体同系物来实现。
一个实施方案中，本发明提供了包括BAFF-R多肽和一种药学上可接受的赋形剂的药用组合物。
另一实施方案中，本发明提供了包含与异源多肽或氨基酸序列融合之BAFF-R多肽的嵌合分子。这类嵌合分子的一个实例中包括融合到免疫球蛋白Fc区或一种表位标签序列上的BAFF-R。
另一实施方案中，本发明提供了一种能特异性结合BAFF-R多肽的抗体。可选择地，所述抗体是一种单克隆抗体。
附图简述

图1给出人BAFF-R(BCMA)cDNA的核酸序列(SEQ ID NO2)及其推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。翻译的潜在起始位点为第219或228位的核酸残基；富含半胱氨酸的区域(CRD)为SEQ ID NO2中的第240-341位核酸残基(SEQ ID NO1中的第8-41位氨基酸残基)；潜在的跨膜区域为SEQID NO2中的第375-459位核酸残基。
图2显示编码BAFF-R-Fc的质粒pJST538的核酸序列(SEQ ID NO4)及其推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO3)，其中第1-69位核酸残基为小鼠IgG-κ信号序列；第70-222位核酸残基为BAFF-R(核酸残基1-153)；第223-906位核酸残基为人IgG。
图3给出pJST535的核酸序列及其推导出的氨基酸序列，该质粒编码全长人BAFF-R。
图4给出TNF-R55与BAFF-R间的结构比较。
图5给出平板测定中，用(a)CH269(1.0μg)或(b)pJST535(0.1μg)，一种编码全长BAFF-R的质粒转染，然后用0.5μg/ml flag-hBAFF染色293EBNA细胞。
图6(a)显示293EBNA细胞用pJST535转染并染色后的FACS覆盖图(overlay)无配体(黑色图)，1μg/ml标签-hCD40L(粉红色)或flag-hBAFF(绿色)。然后，所有样品按照实施例2中所述方法，先用抗-标签M2，接着使用驴抗-小鼠IgG染色。
图6(b)显示相同实验的FACS图谱以及统计学分析。
染色情况如下(1)未染色，(2)只用7AAD，(3)第2步骤，且只用7AAD，(4)9μg/ml flag-hBAFF，(5)3μg/ml flag-hBAFF，(6)1μg/ml flag-hBAFF，(7)0.33μg/ml flag-hBAFF，(8)0.11μg/ml flag-hBAFF，(9)标签-hCD40L 1μg/ml。
图7给出按照实施例4中方法用BAFF-R-Fc进行免疫沉淀的结果。分子量以kDa计，标示于图的左侧。
泳道(1)12.5ng flag-hTWEAK，(2)12.5ng flag-hBAFF，(3)用0.5ml经BAFF-R-Fc调整的培养基使flag-hBAFF免疫沉淀的结果，(4)用0.5ml经BAFF-R-Fc调整的培养基使flag-hTWEAK免疫沉淀的结果，(5)用0.5ml经BAFF-R-Fc调整的培养基对未加配体的样品免疫沉淀的结果，(6)用来自未转染的293EBNA的0.5ml已调整过的培养基使flag-hBAFF免疫沉淀的结果，(7)用来自未转染的293EBNA的0.5ml已调整过的培养基使flag-hTWEAK免疫沉淀的结果。
图8给出脾细胞增生试验结果制成的图，该图是用每分钟掺入小鼠脾细胞的计数(CPM)相对于人BAFF的加入量(μg/ml)制成的。
图9是用来分析BAFF对Raji细胞的结合的BAFF阻断试验的结果，该图是用MFI(平均荧光强度)读数相对于RhIgG1(ng/ml)的量绘制而成的。
图10(a)是对接受了h-Ig(中间的方框)或hBCMA-Ig(下面的方框)的BaffTg小鼠以及注射了PBS的野生型同窝对照小鼠(上面的方框)进行FACS分析，得到的IgM对CD1的表达量，具体描述见实施例11。
图10(b)，在接受了h-Ig(中间方框)或hBCMA-Ig(下面的方框)的BaffTg小鼠以及注射了PBS的野生型同窝对照小鼠(上面的方框)中，通过对IgD阳性细胞群的门控(gate)而进行的FACS分析所得CD21对IgM的表达，具体描述见实施例11。
图10(c)，在接受了h-Ig(中间方框)或hBCMA-Ig(下面的方框)的Baff Tg小鼠以及注射了PBS的野生型同窝对照小鼠(上面的方框)中，通过对IgD阴性细胞群的门控而进行的FACS分析所得CD21对IgM的表达，具体描述见实施例11。
图11图示各组Baff Tg小鼠的脾重(计为mg+/-标准偏差)。
图12是用PBS、hIg、hBCMA-Ig处理过的Baff Tg小鼠以及同窝对照小鼠的蛋白尿(mg/dL)相对于注射数目作图。
图13图示Baff Tg小鼠及野生型对照小鼠的均值(average)平均动脉压(mmHg)。
图14图示Baff Tg小鼠及野生型对照小鼠的个体平均动脉压(mmHg)。
图15的条形图表示用BAFF-R-Ig(BCMA-Ig)，HuIgG或PBS处理后出现重度肾炎的SNF1小鼠的百分比。
图16图示用20ug BCMA-Ig，50ug BCMA-Ig，HuIgG或PBS体内处理后，小鼠体内的CD11c+DC细胞总数(以百万计)。测试的CD11c+DC细胞群是(1)CD8a-CD4-，(2)CD8a+CD4-，以及(3)CD8a CD4+。
发明详述I.定义术语″BAFF-R″和″BCMA″在本发明中使用时包括BAFF-R天然序列以及BAFF-R变体(其在本文中另有定义)。所述BAFF-R可以从多种来源分离到，例如从鼠或人组织类型或其它来源，或者用重组或合成的方法来制备。
“BAFF-R天然序列”包括具有与源于自然的BAFF-R氨基酸序列相同的多肽。所述BAFF-R天然序列可以从自然中分离，也可以用重组或合成的方法制备。BAFF-R的天然截短或分泌形式(例如含有胞外结构域序列的可溶形式)、天然变体形式(例如，可替换式剪接形式)以及BAFF-R天然等位变体。一个实施方案中，所述BAFF天然序列是指BAFF多肽的成熟或全长天然序列，其中包括SEQ ID NO1中的第1-184位氨基酸或其片段。
“BAFF-R胞外结构域”或“BAFF-R ECD”是指基本上不含BAFF-R的跨膜和胞内结构域的BAFF-R形式。通常，BAFF-R胞外结构域带有此类跨膜结构域及胞内结构域的不足1％，优选不足0.5％。可选择的，BAFF-R ECD包括SEQ ID NO1中的第8-41位，或4-51位，或1-53位氨基酸残基。在本发明的一个优选实施方案中，BAFF-R ECD包括SEQ IDNO1中的第1-51位氨基酸残基。本领域技术人员应该理解的是，已鉴定的本发明BAFF-R的胞外结构域是依据本领域用于鉴定疏水结构域类型的标准来鉴定的。胞外结构域的确切边界可能各不相同，但很可能本说明书具体提到的结构域的任一末端不超过5个氨基酸。因此，BAFF-R ECD可以任选地包括氨基酸8-41(SEQ ID NO1)。
“BAFF-R变体”是指如下定义的活性BAFF-R，其氨基酸序列与SEQ IDNO1所示BAFF-R全长天然序列或者与BAFF-R ECD序列有至少约80％的同一性。所述BAFF-R变体包括，例如，在SEQ ID NO1所示序列C-末端添加或缺失了一个或多个氨基酸残基而得到的BAFF-R多肽。通常，BAFF-R变体与SEQ ID NO1所示氨基酸序列之间应当具有至少约80％或85％的氨基酸序列同一性，更优选至少约90％的氨基酸序列同一性，最优选约95％的氨基酸序列同一性。
本发明中鉴定的BAFF-R序列的″氨基酸序列同一性百分比″是指，将候选序列与BAFF-R序列对齐并在必要时引入缺口以便实现最大限度的序列同一性百分比，而且不将任一保守性取代计入序列同一性时，候选序列中与BAFF-R序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基所占的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比而进行的对齐可以通过多种途径来实现，这些途径都属于本领域的技术范畴之内，例如，使用公众可得到的电脑软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定测算对齐时所用的相应参数，包括为实现所比较全长序列最大限度对齐而需要的任一算法。
术语“表位标签”在本发明中出现时是指一嵌合多肽，其中包括融合到一“标签多肽”上的BAFF-R或其结构域序列。所述标签多肽必须有提供一表位所需的足够残基，从而可以保证能够制备到抗该表位的抗体，或者使该表位可被其它一些试剂鉴定，而且该表位必须足够的短从而保证其不会干扰BAFF-R的活性。优选地，所述标签多肽还应当是独一无二的，从而确保其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。通常，合适的标签多肽有至少6个氨基酸残基，并且通常为约8～约50个氨基酸残基(优选地，约10～约20个残基)。
描述本发明所述各种多肽时使用的″分离的″是指从其所在天然环境一成分中分离并已经得到鉴定的多肽。其天然环境中的污染成分是指通常不会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素、以及其它蛋白性质的或非蛋白性质的溶质。在优选实施方案中，将所述多肽纯化至下述程度(1)足以通过使用转杯式测序仪测得N-末端或内部序列的至少15个氨基酸，或者(2)在非还原或还原条件下，使用考马氏蓝或优选银染可得到均一的SDSPAGE结果。必须分离的多肽包括位于重组细胞内原位处的多肽，因为BAFF-R天然环境中的至少一个成分不存在了。但是，分离的多肽通常经过至少一个纯化步骤制备而成。
术语″抗体″取其最广泛的含义，具体包括单一的BAFF-R单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、以及中和抗体)以及具有多表位特异性的抗BAFF-R抗体组合物。本发明中使用的“单克隆抗体”指从一组基本上均一的抗体中得到的抗体，即除了可能存在极少量天然发生的突变外，抗体个体之间是完全相同的。
本发明中，多肽的“纯化制品”或“基本上纯化的制品”是指该多肽已经从天然状态下与其一起出现的其它蛋白、脂类及核酸中分离出来。优选地，所述多肽还可分离自其它物质，例如用来纯化该多肽时使用的抗体、介质等。
本发明使用的“进行处理”“处理”以及“治疗”是指治愈性治疗、预防性治疗、以及防止性治疗。
术语“肽”、“蛋白”以及“多肽”在本发明中交互使用。
本发明使用的“生物活性”是指具有可直接或间接实施的体内或体外活性。BAFF-R的生物活性片段与该受体的活性位点之间具有，例如，70％的氨基酸同源性，更优选至少80％，最优选至少90％的同源性。受体的同一性或同源性在本发明中是指候选序列中与SEQ ID NO1所示BAFF-R残基相同的氨基酸残基所占的百分比，或者与SEQ ID NO1中指定部分的残基相同的氨基酸残基所占的百分比。
本发明中使用的″哺乳动物″是指分类学上属于哺乳动物的任一动物，包括，人、母牛、马、狗、鼠、以及猫。本发明的优选实施方案中，所述哺乳动物是人。
如非特别说明，本发明使用的是细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学中的常规技术，这些技术都属于本技术领域范畴之内。这类技术在文献中已有描述。
现在对本发明的优选实施方案做详细的参考。本发明涉及使用BAFF-R和BAFF-R相关分子影响B-细胞的生长和成熟以及免疫球蛋白的分泌。本发明涉及使用BAFF-R和BAFF-R相关分子影响免疫系统的应答，应免疫相关疾病的需要。另外，本发明还包括用BAFF-R或BAFF-R相关基因通过基因疗法治疗癌症和免疫疾病。
用本发明所述序列转化宿主制备的BAFF-R及其同系物，以及用本领域已知方法纯化到的天然BAFF-R，或者是从已知氨基酸序列制备的BAFF-R，都可以用到抗癌、抗肿瘤及免疫调节的方法中。它们也可以用于针对其它疾病的治疗及方法中。
本发明另一方面涉及将编码BAFF-R的分离的核酸编码的多肽用于″反义″治疗。本发明中使用的“反义”治疗是指施用或在原位生成寡核苷酸或其衍生物，这些寡核苷酸或其衍生物能够在细胞环境中与编码目的配体的细胞mRNA和/或DNA发生特异性地杂交，从而抑制所述编码蛋白的表达，即抑制转录和/或翻译。所述结合可以通过常规的碱基对互补，或者，例如，在与DNA双螺旋结合的情况下，通过与双螺旋的大沟间的特异性相互作用实现结合。通常，“反义”治疗是指本领域通常使用的一系列技术，包括以与寡核苷酸序列特异性结合为基础的任一治疗方法。
本发明所述反义构建体可以表达质粒的形式来递送，当它在细胞中转录时，生成的RNA与编码BAFF-配体的细胞mRNA的至少一部分互补。可替代地，所述反义构建体可以是离体制备的寡核苷酸探针。所述寡核苷酸探针优选是经过修饰对内源性核酸酶有抗性的寡核苷酸，因而在体内是稳定的。用作反义寡核苷酸的核酸分子的实例有DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯及甲基膦酸酯类似物(参见，例如5,176,996；5,264,564；and5,256,775)。另外，用来构建反义治疗所用寡聚体的常规方法已经在下列文献中综述，例如Van Der Krol et al.，(1988)Biotechniques 6958-976；以及Stein et al.(1988)Cancer Res 482659-2668，在此专门引入作为参考。
如上所述，本发明的BAFF-R是TNF受体家族的一个成员。其蛋白，片段或同系物可能具有广泛的治疗及诊断用途。
本发明所述多肽与已在WO99/12964(在此引入作为参考)公开的多肽BAFF特异性地相互作用。但是，本发明中公开的肽和方法可以用来鉴定可特异性地与BAFF-R或其片段相互作用的分子。
本发明特定实施方案中包括使用那些衍生自BAFF-R并能结合BAFF的肽的方法。BAFF-R的片段的制备方法有好几种，例如，重组、PCR、蛋白酶消化或者化学合成。多肽的内部或末端片段可以通过从编码该多肽的核酸的一端或两端除去1个或多个核苷酸制备而成。诱变后DNA的表达可产生多肽片段。
也可以用本领域的已知技术制备本发明所用的嵌合分子。本发明考虑了以下嵌合分子的用途，所述嵌合分子包括与异源氨基酸序列，例如免疫球蛋白的IgG Fc区融合的BAFF-R多肽(或其变体)。优选地，所述嵌合分子是可溶性的并包括一可溶性的BAFF-R多肽。
多肽片段也可以用本领域的已知技术化学合成，例如常规的Merrifield固相f-moc或t-boc化学合成法。例如，可以任意地将本发明的肽和DNA序列分成具有所需长度并且不重叠的片段，或者是分成具有所需长度的重叠片段。下文将对这些方法详细描述。
制备可溶性的BAFF-R可溶性的BAFF-R通常能够有效地发送信号，因而可以作为模拟天然膜形式的药物来施用。本发明所述BAFF-R有可能以可溶性细胞因子的形式被天然分泌，但是，如果不能天然分泌，那么也可以重构基因以便强制分泌。为了制备BAFF-R的可溶性分泌形式，可在DNA水平上除去N-末端跨膜区域，以及茎干区域的某些部分，并且用I型或者II型前导序列来取代它们，这些前导序列在所选表达系统中可允许有效蛋白水解。本领域技术人员可以改变分泌型表达构建体中保留的茎干区域的数量，从而使配体结合特性及分泌效率达到最优化。例如，可以制备到含有全部可能茎干长度的构建体，即N-末端截短形式，从而得到第1-51位氨基酸的蛋白质。可从这类分析中得到具有最佳长度的茎干序列。
本发明的优选实施方案中，可溶性的BAFF-R多肽是一分离的天然序列的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1中的第1-51位氨基酸残基，或其片段；一分离的BAFF-R多肽，其与含有SEQ ID NO1中第1-51位氨基酸或其片段的BAFF-R多肽天然序列之间具有至少80％(更优选90％)的氨基酸序列同一性；或者，其中含有SEQ ID NO1中第8-41位氨基酸残基的分离的BAFF-R多肽，或该多肽的片段。
制备能与BAFF-R反应的抗体本发明还包括能与本发明请求保护的BAFF-R或其共受体特异性反应的抗体。抗-蛋白/抗-肽的抗血清或单克隆抗体可以通过标准方法(参见，例如，AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow和Lane编著(Cold SpringHarbor Press1988))制备。可以用所述肽的免疫原性形式免疫哺乳动物，例如小鼠、仓鼠或兔子。赋予蛋白或肽免疫原性的技术包括将其偶联到载体上，以及本领域熟知的其它技术。
可以将BAFF-R或其共受体的免疫原性部分结合佐剂施用。免疫进程可以通过检测血浆或血清中抗体滴度来监测。可以用所述免疫原作为抗原，通过标准ELISA或其它免疫测定方法来测定抗体的水平。
在一个优选实施方案中，所述抗体具有针对BAFF-R或其共受体的抗原决定簇，例如SEQ ID NO1所示多肽的抗原决定簇，或密切相关的人或非人哺乳动物同系物(例如，70、80、或90％同源性，更优选至少95％同源性)的免疫特异性。在本发明的另一个优选实施方案中，抗-BAFF-R抗体或抗-BAFF-共受体抗体与具有下述特征的蛋白质基本上不发生交叉反应(即，为特异性反应)，即与SEQ ID NO1之间同源性小于80％的蛋白质，优选同源性小于90％的蛋白质，最优选同源性小于95％的蛋白质。″基本上不发生交叉反应″是指，抗体与非同源性蛋白质之间的结合亲和力，以及该抗体与SEQ ID NO1所示蛋白质之间的结合亲和力，这二者相比，前者为后者的不足10％，更优选不足5％，甚至更优选不足1％。
本文中术语抗体包括该抗体的能与BAFF-R或其受体特异性反应的片段。可以用常规技术将抗体片段化，用与上述用于完整抗体的同样方法来筛选可用的片段。例如，用胃蛋白酶处理抗体得到F(ab’)2片段。所述F(ab’)2片段经还原二硫键生成Fab′片段。本发明所述抗体还包括具有抗-BAFF-R或抗-BAFF-共受体活性的生物特异性分子及嵌合分子。因此，针对BAFF-R及其共受体的单克隆抗体及多克隆抗体(Ab)，以及抗体片段，如Fab′及F(ab′)2，都可以用来封闭BAFF-R与其相应共受体的作用。
也可以用标准重组DNA技术制备各种形式的抗体。(Winter and Milstein，Nature 349293-299(1991)在此专门引入作为参考)例如，将动物抗体的抗原结合区连接到人源抗体的恒定区构建出嵌合抗体(例如，Cabilly等，U.S.4,816,567，在此引入作为参考)。嵌合抗体可以减弱动物抗体用于人的临床治疗时激发的免疫原性应答。
此外，还可以合成出能识别BAFF-R或共受体的重组“人源化抗体”。人源化抗体是主要含有人IgG序列但其中已插入负责特异性抗原结合的区的嵌合体。用目的抗原免疫动物，分离相应抗体，取出负责特异性抗原结合的可变区序列。然后，将动物源的抗原结合区克隆入已经删除了抗原结合区的人抗体基因的相应位置。人源化抗体可以将人抗体中异源(即，种间)序列的使用降至最低，因而不太可能会在所治疗受试者中激发免疫应答。
通过制备含有可变区以及从不同类的免疫球蛋白分离出的人恒定区(CH1，CH2，CH3)的嵌合或人源化抗体，可以构建出不同类的重组抗体。例如，通过将抗原结合位点克隆入带有人链恒定区的载体，可以重组产生具有增加的抗原结合价的抗体。(Arulanandam et al.，J.Exp.Med.，1771439-1450(1993)，在此引入作为参考。)此外，可以使用标准重组DNA技术改变抗原结合位点邻近区的氨基酸残基，从而改变重组抗体与其对应抗原的结合亲和力。通过基于分子模型的诱变，可以提高人源化抗体的抗原结合亲和力。(Queen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.8610029-33(1989)在此引入作为参考。
制备同系物制备改变后的DNA及肽序列BAFF-R同系物在氨基酸序列上，或其它不涉及序列的方面，或者二者同时不同于天然生成的BAFF-R。非序列修饰包括BAFF-R的体内或体外化学衍生。非序列修饰包括，但不限于，乙酰化、甲基化、磷酸化、羧基化或糖基化的改变。
优选的同系物包括BAFF-R的生物活性片段，其序列与SEQ ID NO1所示序列之间的区别在于1个或多个保守的氨基酸取代，或者1个或多个非保守的但不会破坏BAFF-配体活性的氨基酸取代、缺失或插入。保守取代一般包括一个氨基酸被另一个具有相似特性的氨基酸取代，例如，下列各组内部的取代缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。
用途BAFF-R的全长基因(SEQ ID NO2)或其片段可以用作cDNA文库的杂交探针，分离出与SEQ ID NO2中所示BAFF-R序列之间具有期望的序列同一性的其它基因。编码BAFF-R的核酸序列还可以用来构建下列用途的杂交探针，即用于对编码BAFF-R基因进行做图的探针和用来对患有遗传疾病的个体进行基因分析的探针。可以设计筛选试验，找出模拟BAFF-R生物活性的先导化合物。这类筛选试验包括能够保证化学文库高输出量筛选的试验，从而使其特别适合用于鉴定小分子药物侯选物。在考虑范围之内的小分子包括合成的有机化合物或无机化合物。编码BAFF-R或其修饰形式的核酸还可以用来制备转基因动物或者“基因敲除”动物，这些动物可用于开发及筛选具有治疗价值的试剂。
如本发明所述，在本发明一个实施方案中，提供用BAFF-R多肽刺激动物体内B-细胞生长，树突状细胞诱导的B-细胞的生长及成熟或免疫球蛋白的生成的方法，或者是用BAFF-R多肽与抗-T抗体、CD40配体或抗-CD40配体一起共刺激动物体内B-细胞生长，树突状细胞诱导的B-细胞的生长及成熟或免疫球蛋白的生成的方法。另外，还包括用BAFF-R多肽抑制动物体内B-细胞生长，树突状细胞诱导的B-细胞的生长及成熟或免疫球蛋白的生成的方法。
另一实施方案中，本发明提供了使用BAFF-R治疗下列病症的方法自身免疫疾病、高血压、心血管病、肾脏疾病、B-细胞淋巴增生疾病、免疫抑制性疾病、器官移植、炎症、以及HIV。另外还包括了使用药剂治疗、抑制或改变涉及BAFF-R与其配体间信号传输途径的免疫应答。
一个实施方案中，本发明提供了包括BAFF-R多肽和一种药物上可接受的赋形剂的药用组合物。与BAFF-R多肽适配的载体及其制剂在Oslo等编著的Remington′Pharmaceutical Sciences，第16版，1980，Mack PublishingCo.一书中有描述。通常情况下，制剂中使用适量的药物学上可接受的盐来提供该制剂的等渗性。所述载体的实例包括缓冲溶液，例如盐水、Ringer′s溶液及葡萄糖溶液。溶液的pH值优选约pH5～约pH8，更优选约pH7.4～约pH7.8。其它载体包括缓释制剂，例如固相疏水聚合物的半透基质，该基质制成一定形式的成型物件，例如脂质体、膜或微粒。本领域技术人员明白，可以根据施用途径及所施用BAFF-R多肽的浓度对特定载体进一步地优化。
施用可以通过注射(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内)或通过输注等其它方法来完成，以确保能以有效的形式输送到血流中。
除另有说明外，实施本发明采用的为细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白质化学以及免疫学中的常规技术，这些都是本领域的现有技术。这类技术在文献中已有描述。参见，例如，分子克隆实验指南，第2版.(Sambrook，Fritsch和Maniatis，编著)，冷泉港实验室出版，1989；DNA克隆，第I及II卷(D.N.Glover，编著)，1985；寡核苷酸合成，(M.J.Gait，编著)，1984；美国专利US4,683,195(Mullis等)；核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins，编著)，1984；转录和翻译(B.D.Hames和S.J.Higgins，编著)，1984；动物细胞培养(R.I.Freshney，编著).Alan R.Liss，Inc.，1987；Immobilized Cells and Enzymes，IRL Press，1986；A PracticalGuide to Molecular Cloning(B.Perbal)，1984；Methods in Enzymology，第154及155卷(Wu et al.，编著)，Academic Press，New York；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos，编著)，1987，Cold SpringHarbor Laboratory；Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Mayer and Walker，编著)，Academic Press，London，1987；Handbookof Experiment Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编著)，1986；Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1986。
下列实施例的提供是为了举例说明本发明，而决不应理解为对本发明的限制。
实施例实施例1用平板试验来检测BAFF与BAFF-R的结合该实施例中描述用平板试验测定BAFF与BAFF-R转染细胞的结合。
使用SuperscriptII预扩增试剂盒(Life Technologies)从BJAB polyA+RNA中制备出全长的人BAFF-R，从而得到cDNA模板，并采用与BAFF-R5′及3′端编码序列互补的引物，用Pful进行扩增。将得到的PCR产物克隆入CH269，CH269衍生自pCEP4(Invitrogen)。得到的克隆命名为pJST535。将含有EBNA-1基因的人胚胎肾细胞(293EBNA)接种入已用纤连蛋白包被过的6孔培养板中，然后，用不同浓度的pJST535以及作为背景对照的CH269通过脂质转染胺(lipofectamine)(Life Technologies)进行转染。转染后48小时，测试转染细胞结合可溶性flag-hBAFF(氨基酸L83-L285)的能力，操作如下。所有保温均在室温下进行。吸出孔中用过的培养基，细胞用BHA缓冲液(20mM HEPES pH7.0，0.5mg/ml BSA，0.1％NaN3)洗涤，与0.5μg/ml FLAG-hBAFF的PBS溶液一起保温，该PBS中含有1mMMgCl2、1mM CaCl2及0.1％NaN3。保温1小时后，移去BAFF溶液，并用BHA洗涤细胞。然后将所述细胞在含有1μg/ml抗-FLAG单克隆抗体M2(Sigma)的PBS溶液中再保温30分钟。吸出该溶液，用BHA洗涤细胞。然后用1∶3000稀释后的碱性磷酸酶偶联型山羊抗-小鼠IgG F(ab)′2(JacksonImmunoResearch)保温30分钟。吸出该溶液，用BHA洗涤细胞。为了减少内源性碱性磷酸酶引起的背景染色量，使细胞在含有2.5mM左旋咪唑(levamisol)(Vector Laboratories)的100mM NaCl、100mM Tris-Cl pH9.5及5mM MgCl2的溶液中保温15分钟。为了检测碱性磷酸酶的产色反应，吸去该抑制剂溶液，用含固红及萘酚磷酸酯(Pierce)的溶液保温。观察染色，在低倍显微镜下照相。
所有用BAFF-R表达质粒pJST535转染过的孔都观察到了固红染料的沉积。滴定信号的频率随转染入细胞内的质粒量的减少而降低。用对照表达质粒CH269转染后的细胞未见染色。另外，当染色操作中不使用flag-hBAFF时，或者是用TNF家族成员另一配体，FLAG-标记的LIGHT，代替flag-hBAFF也未见染色出现。因此，可见BAFF对BAFF-R转染后的细胞的染色是特异性的。
实施例2用荧光激活细胞分选仪(FACS)测定BAFF与BAFF-R转染细胞的结合该实施例描述了用FACS测定试验检测BAFF与BAFF-R转染细胞间的结合。
用FuGene6(Boehringer Mannheim)将编码全长BAFF-R的质粒pJST535转染入293EBNA细胞。转染后第24小时或48小时，用含5mM EDTA的PBS从平板中取出细胞并计数。用FACS缓冲液(PBS，其中含有10％胎牛血清、0.1％NaN3和10μg/ml hIgG(Jackson ImmunoResearch)洗涤细胞，然后取2.5×105个细胞，用按9μg/ml～0.037μg/ml浓度稀释入FACS缓冲液的flag-hBAFF，在冰上保温1小时。用FACS缓冲液洗涤上述细胞，接着将细胞置于冰上，用5μg/ml的抗-FLAG单克隆抗体M2保温30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，接着将细胞置于冰上，用含有1∶100稀释的R-藻红蛋白偶联型F(ab′)2驴抗-小鼠IgG及10μg/ml 7-AAD的溶液保温30分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤后，重悬于含1％多聚甲醛的FACS缓冲液中。对选通除去了7-AAD阳性(死)细胞的部分进行FACS测定。
FACS测定结果表明BAFF-R转染细胞的级分能结合BAFF。BAFF的浓度为9μg/ml时，约28％的细胞结合BAFF的平均荧光强度(MFI)为366。当单独使用PE-标记的驴抗-小鼠试剂时，未见明显的细胞转变(shift)。所有细胞的MFI平均值为5.5，其中只有1.3％的细胞的MFI为23.5。BAFF-R转染细胞上的信号随着BAFF用量的减少而降低。BAFF为100ng/ml时，8.76％的细胞的MFI为78.9。
实施例3引入GFP标记后，用FACS测定BAFF/BAFF-R间的相互作用该实施例中，描述了用BAFF-R和GFP报道质粒共转染后的细胞与BAFF的结合情况。
按照实施例2所述方法，用pJST535和GFP报道质粒转染293EBNA细胞。该报道质粒可编码一种膜锚定的GFP分子。用这两种质粒共在转染，然后我们分析了能结合BAFF的转染细胞的百分比。从平板中取出细胞，与BAFF结合，然后用实施例2所述方法检测。同样，为了将死细胞排除在外，引入7-AAD。用FACS分析样品，并绘制曲线。右上方象限代表那些结合了BAFF(藻红蛋白阳性)并表达有GFP的细胞。
尽管并非所有GFP转染细胞都能结合BAFF，但是与对照相比，位于右上方象限中的细胞比例明显较大。相对于8％，33％的转染细胞位于右上方象限。这可能是由于，BAFF-R表达的特定水平是BAFF与细胞结合所必须的。还可能是，共受体是高亲和力相互作用的必要条件，且该受体限于293EBNA细胞上。
实施例4用BAFF-R-Fc融合体免疫沉淀flag-hBAFF该实施例描述了flag-hBAFF与BAFF-R-Fc间的特异性相互作用，BAFF-R-Fc是将BAFF-R中富含半胱氨酸的结构域(CRD)与人IgGI的Fc区融合组成的一种分子。
用RT-PCR从实施例1所述BJAB polyA+RNA中制备BAFF-R的CRD，采用与hBAFF-R编码序列中第132-152位核苷酸互补的寡核苷酸作为3′端引物。将扩增到的PCR片段克隆入CH269，让其位于鼠IgG-κ信号序列的下游以及人IgG Fc单元的上游。该构建体命名为pJST538。构建体pJST538或CH269用脂质胺转染至293EBNA。转染后20小时，收获用过的培养基及细胞提取物。用20mM Tris pH7.5/50mM Nacl/0.5％NP40/0.5％脱氧胆酸溶解细胞，离心出碎片。取一份用过的培养基及细胞提取物与等体积2xSDS还原缓冲液合并，煮沸，然后进行SDS-PAGE电泳及Western转移。为了确证表达，用溶有5％脱脂奶粉的TBST对小鼠抗-人IgG偶联的辣根过氧化物酶(HRP)做1∶3000稀释后，用其作为探针与上述膜在室温下杂交30分钟，然后用TBST洗涤。用ECL(Amersham)使印迹膜显色，在胶片上曝光。
用25ng flag-hBAFF或flag-hTWEAK与0.5ml从转染了pJST538 orCH269的293EBNA培养物中取出的用过的培养基，在4℃下搅拌保温1小时，然后加入30ul蛋白A-Sepharose(Pharmacia)，继续搅拌过夜。蛋白A-sepharose珠粒用PBS洗涤2次，然后重悬于2xSDS还原性样品缓冲液中。SDS-PAGE电泳及western转移后，将印迹膜用含有5μg/ml抗-flag单克隆抗体M2(Sigma)及5％脱脂奶粉的TBST在室温下保温1小时。印迹膜用TBST洗涤，然后用以1∶3000稀释于含5％脱脂奶粉的TBST中的山羊抗-小鼠IgG HRP偶联物(Jackson Immunoresearch)室温下保温30分钟。用ECL(Amersham)使印迹膜显色，在胶片上曝光。
用pJST538转染293EBNA细胞时，用小鼠抗-人IgG(JacksonImmunoresearch)经Western印迹分析在细胞提取物和用过的培养基中均检测到了约43kDa蛋白质的表达，这表明BAFF-R-Fc融合体得到了有效的表达和分泌。
免疫沉淀中，只是在BAFF-R-Fc与flag-hBAFF保温时出现了一条带。该条带与直接加样的flag-hBAFF共-迁移。其它条带无一出现信号，表明BAFF-R-Fc与flag-hBAFF之间的相互作用是特异性的。
实施例5制备可溶性受体形式为了形成可用于人的受体抑制剂，应当获得人受体胞外区cDNA序列。如果小鼠形式是已知的，那么就可以用小鼠cDNA序列筛选人cDNA文库，这类操作在该领域中是常规的。对于人cDNA序列而言，可以设计出PCR用的寡核苷酸引物来扩增出不带有跨膜区和胞内区的受体胞外区。一般情况下，应当将连接″TNF结构域″和跨膜区的最后一个二硫键之间的大部分氨基酸也包括在内。可以对其中包括的“茎干”区的数量进行调整从而使得到的可溶性受体的效力最佳。该扩增部分中还应当构建有合适的限制性位点，从而能确保其可克隆入各种C-末端Ig融合嵌合载体。替代地，可在3′末端插入终止信号并制备出一可溶形式的受体而不必要借助使用Ig融合嵌合体的方法。得到的载体可在生物技术学用到的大多数系统中表达，包括酵母、昆虫细胞、细菌和哺乳动物细胞以及所有表达类型中的现有实例。可以连接各种人源Fc区从而根据需要优化或消除FcR与补体间的相互作用。替代地，可以使用这些Fc区的突变形式来选择性地除去FcR或补体相互作用，或者将N-连接糖连接到Fc区，这种方式具有特定的优势。
实施例6制备激动抗体或拮抗抗体可用上述可溶性的受体免疫小鼠，用常规方法制备出单克隆抗体。用ELISA方法鉴定而得到的mAb在各种体外细胞测定中可以进一步作为可溶性抗体或者被固定在可塑性物质上的抗体，进行激动剂活性的筛选。通常HT29细胞系的死亡是一种使用便捷的系统，该系统对经由众多TNF受体的信号传送敏感。如果该细胞系不具有目标受体，可将全长受体稳定转染入HT29细胞系，从而允许开展细胞毒性测定。替代地，这类细胞可以用于细胞敏感(Cytosensor)装置，来评定受体的活化是否能激发pH改变，所述pH改变可指示一个信号传送事件。TNF家族受体在这类模式中可以有效发送信号，该方法不需知道该受体所激发的确切生物学事件。激动性的mAb可以人源化后用于临床。这种方法还可以用来限定拮抗性的mAb。这类mAb可以定义为缺乏激动剂活性，以及在用ELISA、经典结合或BIAcore技术监测时抑制受体-配体间相互作用的能力。最后，通过各种细胞应答激动剂抗体而诱导趋化因子的分泌，这种诱导可以形成筛选试验。
实施例7受体-配体相互作用的抑制剂的筛选使用受体-Ig融合蛋白，可以从组合支库中筛选出能够直接结合该受体的分子。然后可以使用受体-Ig融合蛋白和一种能抑制受体-配体间相互作用的可溶性配体，用ELISA模式的试验来对上述这些分子进行测试。该ELISA可以直接用于从各种天然产物文库等来源中筛选抑制活性化合物。可以将所述受体转染入HT29等细胞系形成一种生物测试(本例中为细胞毒性)，然后可将其用作筛选试验。
实施例8BAFF-R-IgG导致正常小鼠体内B细胞数目的减少8周龄的雌性BALB/c小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。第-8、-5、-1和+2天，在小鼠(每3个一组)腹膜内注入PBS，400μg人BAFF-R-huIgGI(hBAFF-R-Ig)融合蛋白(Teresa Cachero，Biogen提供)，或者400μg纯化后的人IgG(HuIgG)(Sandoz，Basel，Switzerland)。第0天时，小鼠接受了100μl 10％绵羊红细胞(SRBC)(Colorado Serum Company，Denver，CO)。
宰杀时，通过心脏穿刺将血液收集入含有EDT的试管，用低渗缓冲液溶解红细胞。不加EDTA而收集血液用于血清制备。从脾和肠系膜淋巴结(MLN)制备单细胞悬液，用低渗缓冲液溶解红细胞。使用PE-偶联的抗-CD45R/B220、抗-多配体聚糖/CD138和抗-B7.2，以及FITC-偶联的抗-IgM及抗-CD45R/B220，进行流式细胞仪分析。所有单抗均购自Pharmingen(SanDiego，CA)。
简而言之，在冰上，用10μg/ml Fc Block(Pharmingen)封闭Fc受体15分钟，接着加入PE-和FITC-偶联的mAb，在冰上保温20-30分钟。用1x洗涤细胞，并悬浮于0.5％多聚甲醛中。在FACSCaliburTM流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)上获取细胞荧光数据，并用CELLQuestTM软件(Becton Dickinson)进行分析。
用hBAFF-R-Ig处理后，所测试的外周血和外周淋巴器官中B细胞数目减少了约50％。在PBS处理过和HuIgG-处理过的小鼠中，B220高IgM低B细胞分别占细胞总数的23.4％和21.5％，而hBAFF-R-Ig-处理过的小鼠中，这一细胞类群所占细胞的比例仅为9.9％。PBS处理过的小鼠以及HuIgG-处理过的小鼠的血液中，浆细胞(多配体聚糖/CD138+)仅分别轻微减少5.7％和4.8％，与之相比，hBAFF-R-Ig-处理过的小鼠减少了3.9％。PBS处理过和HuIgG-处理过的小鼠中，B220+细胞上的B7.2分子分别上调了3.1％和4.5％，与之相比，hBAFF-R-Ig处理过的小鼠上调比例为1.9％。
hBAFF-R-Ig处理过的小鼠的脾内，B220高B细胞显著减少，表现为18.8％，与之相比，PBS-和HuIgG-处理过的小鼠分别为36.7％和40％。IgM高和IgM低的细胞亚群中也观察到了这种下降趋势(见表8A)。脾内新生成B细胞隔室，B220低IgM高(数据未显示)中未见变化。PBS-处理过的和HuIgG-处理过的小鼠的脾内，浆细胞(多配体聚糖/CD138+)减少的比例分别为3.3％和3.4％，与之相比，hBAFF-R-Ig处理过的小鼠中的比例为2.4％。
hBAFF-R-Ig处理过的小鼠的MLN中B220+B细胞减少14.1％，与之相比，PBS-处理过的以及HuIgG-处理过的小鼠分别为26.7％和35.8％。数据总结于8A。
表8A.hBAFF-R-Ig、PBS以及HuIgG-处理过的小鼠中的B细胞类群1
1材料和方法部分中描述了对小鼠的处理，数据以％±标准差表示
hBAFF-R-Ig处理过的小鼠在用SRBC免疫后，血液中B7.2+B细胞以及血液和脾内的浆细胞的百分比降低，这表明对B细胞活化和/或成熟存在抑制，且大大增强了活化B细胞的清除。极小百分比的抗原特异性B细胞被活化，并可应答任一抗原，本例中为SRBC。因为hBAFF-R-Ig处理导致所检测的全部组织中B细胞百分比都明显减少，达50％，所以hBAFF-R-Ig活性可能还靶向静息的成熟B细胞。
因此，可以将BAFF-R融合蛋白用作治疗药物临床用于B细胞介导的疾病。所述疾病包括那些天然状态下自身免疫的疾病，例如系统性红斑狼疮、重症肌无力、自身免疫溶血性贫血、特发的血小板减少性紫癜、抗磷脂(antiphospholipid)综合征、恰加斯病(Chaga’s disease)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、韦格纳(Wegener’s)肉芽肿病、结节性多动脉炎和急进性肾小球肾炎。所述治疗药剂还可以用于浆细胞疾病，例如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症、重链病(Heavey-chaindisease)、原发性或免疫细胞相关的淀粉样变性病、以及非显著性单克隆丙种球蛋白病(MGUS)。肿瘤学对象包括B细胞癌、白血病、和淋巴瘤。
实施例9用可溶性BAFF-R体外封闭BAFF诱导的B细胞增生该实施例中，我们研究表明可溶性BAFF-RhIgG1融合蛋白能够阻断小鼠脾细胞中BAFF诱导的B细胞增殖。
从Balb/c小鼠中分离小鼠脾细胞(5×105个细胞/ml)，并用RPMI(LifeTechnologies)将其培养于96-孔培养板中，该RPMI中加入10％胎牛血清(JRH)、2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素(LifeTechnologies)。然后加入不同量的人BAFF、10μg/ml人BAFF-RhIgG1或人Ig、以及10μg/ml抗小鼠表面μ重链(Jackson Immuno Research)。37℃培养48小时后，用1μCi/孔[甲基-3H]胸腺嘧啶(Dupont NEN)脉冲细胞24小时，用Tomtec(Orange，CT)细胞收集仪收集细胞。用Betaplate液体闪烁计数仪(Pharmacia Biotech)测定放射活性。
图8显示脾细胞增生试验的结果。每分钟小鼠脾细胞中掺入的数目(CPM)相对于所加入的人BAFF试剂的量。抗-μ或融合蛋白或对照hIgG的水平恒定保持为10μg/ml。实心正方形代表单独用BAFF诱导的增生水平。实心圆代表用BAFF和抗-μ诱导的增生。带有空心三角形的曲线表示当用BAFF-RhIgG1BAFF加抗-μ和BAFF-RhIgG1时观察到的抑制。空心菱形表示用人Ig对照时观察到的抑制。
加入BAFF和抗-μ导致小鼠脾细胞体外增生。细胞中3H胸腺嘧啶掺入量明显高于脾细胞中单独加入BAFF或单独加入抗-μ时得到的水平。单用BAFF处理脾细胞导致3H胸腺嘧啶只以极高的浓度掺入。只加入抗-μ时无增生。向脾细胞加入10μg/ml人Ig对照，渐增量的BAFF和10μg/ml抗-μ时，增生水平适度渐弱。相反，在相同条件下测定试验中加入10μg/ml人BAFF-RhIgG1融合蛋白时，增生水平减至单独使用BAFF处理时的水平。这表明BAFF-RhIgGI融合蛋白能够抑制BAFF及抗-μ诱导的脾细胞增生。
实施例10用BAFF-RhIgG1阻断BAFF与Raji细胞的结合该实施例中，用BAFF-RhIgG1融合蛋白预保温BAFF能够减少BAFF与Raji B细胞淋巴瘤细胞系的结合，描述如下。
在本次FACS测定中，将人BAFF-RhIgG1或人LTβRhIgG1在20μg/ml～39μg/ml范围内做二倍稀释后，用这些稀释液以及不加融合蛋白的对照液，在冰上对200ng/ml FLAG-标记后的人BAFF预保温30分钟。上述保温在FACS缓冲液中进行，该缓冲液中含PBS，不含Ca2+或Mg2+，加有10％FCS(JRH)和0.05％叠氮钠。预保温后，将BAFF-融合蛋白加入5×106Raji(ATCC)细胞/ml。所述保温在冰上进行30分钟，然后4℃用2mlFACS缓冲液洗涤细胞。为了检测结合的BAFF，向细胞中加入5μg/ml抗-FLAG抗体M2(Sigma)，冰上保温30分钟。再次洗涤细胞，接着用1∶100稀释的PE偶联驴抗-鼠Ig(Jackson Immuno Research)冰上保温30分钟。再用FACS缓冲液洗涤细胞后，用1％多聚甲醛固定细胞，用FACS(BectonDickinson and Co.)读取结果。
图9显示BAFF阻断试验的结果。显示检测BAFF结合Raji细胞时从FACS分析中读取的MFI(平均荧光强度)。实心正方形代表的是结合细胞前用人BAFF-RhIgGI预保温BAFF的情况下得到的数据。圆表示的是向BAFF中加入非特异性融合蛋白人LTβRhIgG1时得到的曲线。X-轴代表与细胞保温前向200ng/ml BAFF中加入的融合蛋白的量。
当在无融合蛋白的条件下预保温人BAFF时，样品的平均荧光强度(MFI)是80。当用人LTβRhIgG1预保温BAFF时，即使在20μg/ml水平，BAFF结合Raji细胞的检测结果不变。但是，当用人BAFF-RhIgG1预保温BAFF时，MFI大大降低，甚至在625ng/ml融合蛋白的水平下低至20-25。该试验的背景MFI是7。因此，BAFF-RhIgG1能够非常有效地阻断BAFF与Raji B细胞的结合。
实施例11BAFF-R-IgG减轻转基因小鼠的狼疮样自身免疫病症该实施例描述了BAFF-R-Ig减少外周B细胞类群、抑制脾大(splenamegally)和肾炎的效果。
本实验使用5月龄BAFF转基因(Tg)小鼠(C57BL/6)和年龄相当的同窝出生小鼠。BAFF Tg小鼠表现出淋巴细胞病症以及类似系统性红斑狼疮的自身免疫表型(Mackay et al.，1999)。该表型包括下述外周B细胞类群的增加，包括过渡型1(T1)和2(T2)、成熟型(M)、边缘区(MZ)以及CD 1高/IgM高B细胞。
在第0，4，7，11，14，18，21，25，28，32，35天，小鼠腹膜内注射PBS，含400mg纯化人IgG(hIg)(Sandoz，Basel，Switzerland)(3个/组)或400μg CHO-来源的人BAFF-R-huIgGI(hBCMA-Ig)融合蛋白(2个/组)，第40天时宰杀。
宰杀时，称脾重，用低渗缓冲液溶解红细胞后制备单细胞悬液。用FITC-偶联的抗CD21/CD35，PE-偶联的抗-IgD和抗CD1，cychrome-偶联的抗-CD45R/B220和生物素偶联的抗-IgM进行流式细胞计数。所有Ab均购自Pharmingen(San Diego，CA)。简而言之，在冰上用10μg/ml FcBlock(Pharmingen)封闭Fc受体10分钟，接着加入生物素-偶联的mAb冰上保温30分钟，细胞用1x洗涤，接着加入FITC、PE、Cychrome-偶联的Ab，链霉抗生物素蛋白APC和10μg/ml Fc Block。冰上保温细胞30分钟，用1x洗涤，悬浮于0.5％多聚甲醛中。用FACSCalibur(流式血细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)读取细胞荧光数据，并用CELLQuest(软件(BectonDickinson)分析。
使用尿分析所用的Multistix 10 SG试剂条(Bayer Corp.，DiagnosticsDivision)测定小鼠尿液中蛋白质的存在。
结果见下列表11A和表11B
表11A3月龄脾细胞分析每个脾中的细胞总量(×106)T1 T2 MZ 成熟型BAFF Tg小鼠816E23 9.418 9 91816E33 14 30 19 170816E99 14 24 19 150平均值 13+/2.624+/-6 16+/5.7140+/-41同窝对照816E2 5.35.8 3.173816E4 2.43.7 1.944平均值 3.9+/-24.8+/-1.52.4+/-159+/-20按照材料和方法章节中描述的方法，分离3月龄BAFF Tg小鼠(n＝3)和同龄同窝对照小鼠(n＝2)的脾，进行FACS分析。其中T1、T2、M和MZ细胞通过下列表面标记的表达定义(hi高，lo低，int中间状态)T1IgD-，IgM高，CD21loMZIgD-，IgMhi，CD21T2IgD+，IgMhi，CD21hiMIgD+，IgMlo，CD21int
表11B10月龄脾细胞分析每个脾的细胞总量(×106)T1 T2 MZ成熟型BAFF Tg小鼠802-39 13 100 34630823-3-11 7.543 6.6 200823-3-13 3.150 15180平均值 7.9+/-4.9 64+/-30 19+/-10 340+/-250同窝对照823-3-22 0.76.5 1.4 56802-64 0.28 5.4 1.3 38823-14-130.45 3.4 0.16 38平均值 0.48+/-0.215.1+/-1.5 0.95+/-0.65 44+/-10按照表1所述，对10月龄的BAFF Tg小鼠(n＝3)和同龄同窝对照(n＝3)进行FACS分析。
与用PBS和hIg处理后的Baff Tg小鼠相比，向Baff Tg小鼠施用BAFF-R-Ig后，脾内T1、T2、M、MZ细胞群和CD1高/IgM高B细胞显著减少，T1、T2、M、MZ细胞群和CD1高/IgM高B细胞的总数减少至近似或者低于用PBS处理的对照同窝小鼠的水平(图10a，10b，10c)。
BAFF-R处理过的小鼠的脾大小正常，而对照处理过的Baff Tg小鼠表现出脾大(图11)，这种现象表明BAFF-R-Ig处理Baff Tg小鼠可以减轻Baff-介导的自身免疫疾病。此外，BAFF-R-Ig处理过的小鼠中，作为肾机能障碍指标的蛋白尿进程得到抑制，而对照处理过的Baff Tg小鼠蛋白尿水平升高因而判定为患了肾炎(图12)。
Baff转基因小鼠外周B细胞数目大大增加，我们进一步分析表明这些小鼠中T1，T2，MZ B细胞亚群大大增加。B细胞发育的过渡阶段(T1和T2)是自身反应性B细胞大体消除的检查站。CD1hi/IgM高B细胞往往位于边缘区，在Baff Tg小鼠中也大大增加。后面所述这种B细胞亚群是NZB/NZW狼疮小鼠自身抗体生成的主要来源。用BAFF-R-Ig处理Baff Tg小鼠导致T1、T2、MZ和CD1hiB细胞群降低至近似或低于野生型同窝对照的水平。
BAFF-R-Ig发挥作用能减少外周B细胞库并抑制脾大和肾炎的进程。因此，BAFF-R-Ig除了可以用于系统性红斑狼疮狼疮肾炎外，它还可以用于B细胞介导的实质为自身免疫性的疾病，例如重症肌无力、自身免疫溶血性贫血、特发的血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯病、格雷夫斯病、韦格纳肉芽肿病、结节性多动脉炎和急进性肾小球肾炎。这种治疗药剂还可以用于浆细胞病症，例如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、原发性或免疫细胞相关的淀粉样变性病、以及非显著性单克隆丙种球蛋白病(MGUS)。肿瘤学对象包括B细胞癌、白血病、和淋巴瘤。
实施例12BAFF转基因小鼠的平均动脉压本试验描述了BAFF转基因小鼠血压的测定。BAFF转基因小鼠表型评估中的观察表明该小鼠有发生高血压的可能。
用氯胺酮麻醉上述Baff Tg小鼠。颈部切口暴露左侧颈动脉。颈动脉插入导管测量血压和心率。导管连接到压力传导器，用Gould数据采集系统(Po-Ne-Mah数据采集系统和Gould多种波动描记器)测量血压。从脉动压力波形中，得出心脏收缩压、心脏舒张压、平均压和心率。使用两组小鼠BAFF转基因小鼠(n＝8)和野生型对照(n＝9)。
图13显示两组的均值(average)平均动脉压(MAP，以mmHg计)。如图所示，BAFF转基因小鼠的均值MAP为102±8mmHg。对照小鼠的均值MAP为92±6mmHg。因此，BAFF小鼠的MAP比对照小鼠升高了10mmHg，尽管这一差异不具有统计显著性(ANOVA)。
数据的更详细分析见图14。该图中，显示了单个动物的结果。野生型对照(BAFF-)中，数据分布呈典型的二项分布。相反，BAFF转基因小鼠(BAFF+)中，数据分布成两组，其中一组为120-130mmHg，而另一组为80-90mmHg。
与阴性对照小鼠相比，BAFF转基因小鼠作为一个群体，往往易发高血压。个体动脉压水平分析表明BAFF转基因小鼠分布成两个亚群，其一有高血压，而另一类血压正常。因此，施用可溶性BAFF-R、融合蛋白或者抗体类似物可以减轻高血压的后果。
实施例13用BAFF-R-Ig处理已患病的SNF1小鼠可减慢其向重度肾炎发展的进程。
雌性狼疮-易感(SWRxNZB)F1(SNFI)小鼠，21周龄，显示中度肾炎(30-100mg/dl蛋白尿)，在8周期间，每周向这些小鼠腹腔内注射200μg融合蛋白人BAFF-R-huIgGI(hBCMA-Ig)、人IgG(HuIgG)(Sandoz)或200μlPBS。每周都取每个小鼠的尿液用Albustix(Bayer Corp.，Terrytown，NY)进行蛋白尿的监测。蛋白尿超过100mg/dl被定为重度肾炎。BAFF-R-Ig产自瞬间转染的EBNA 293细胞。从过量表达有hBCMA-Ig的293细胞培养物中取用过的培养基，上样于蛋白A层析柱。用25mM磷酸盐100mM NaClpH 2.8洗脱蛋白质，然后用1/20体积的0.5M NaPO4 pH 8.6中和。根据OD280选择级分，对其进行还原及非还原的SDS-PAGE凝胶电泳，Western印迹鉴定纯化后的蛋白质。
处理终止后3周，用BAFF-R-Ig处理过的小鼠中有50％出现重度肾炎，而接受过HuIgG和PBS的小鼠中分别有75％和87.5％(见图15)。这些数据表明可溶性BAFF受体、BCMA-Ig，能够阻滞B cell-介导的自身免疫疾病，例如狼疮肾炎，使病程显著延迟。
实施例14正常小鼠用BAFF-R-Ig处理后，脾树突状细胞(DC)数目减少并出现非典型的脾内定位(atypical splenic localization)向7周龄雌性BALB/c小鼠(3个/组)腹腔内注射20μg或50μg人BAFF-R-IgG1(hBCMA-Ig)、50μg人IgG(HuIgG)或者100μl PBS，每周一次，共4周。hBCMA-Ig融合蛋白纯化自稳定转染的CHO细胞系的培养物上清。最后1次注射的8周后取脾，用胶原酶(Sigma cat.#C-5138)37℃消化1小时。制备单细胞悬液，用低渗缓冲液溶解红细胞，用PBS洗涤细胞3次。制备脾细胞，用抗-CD11c-生物素再用链霉抗生物素蛋白-APC、抗-CD8a-cychrome，和抗-CD4-FITC对细胞染色，经流式细胞仪分析评估DC类群。
在另一试验中，雌性BALB/c(N＝3)小鼠腹腔内注射100μg hBCMA-Ig，每周一次，共四周，然后用CO2预冷了的2-甲基丁烷将脾脏速冻于OCT中。制备冷冻切片，用丙酮固定。切片与抗-CD11c-生物素再与链霉抗生物素蛋白-AP以及底物BCIP(Pierce)一起保温以显示树突状细胞，切片与mAb MOMA-1再与抗-大鼠IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch)以及底物3，3′二氨基联苯胺(Sigma，St.Louis MO，Cat.&num；D-1293)一起保温以显示嗜金属(metallophilic)巨噬细胞，切片与抗-CD35-生物素再与链霉抗生物素蛋白-AP以及底物(碱性磷酸酶底物试剂盒I，Vector cat#SK5100)一起保温以显示滤泡树突状细胞(FDC)。
用20μg或50μg BCMA-Ig体内处理小鼠，每周1次，共四周，这样处理后的小鼠，与用HuIgG和PBS处理后的对照相比，脾内的CD11c+树突状细胞显著减少(student’s t检验p＜0.05)。这种减少现象出现在被检测的所有CD11c+DC类群中CD8a-CD4-，CD8a+CD4-，和CD8a-CD4+(图16，表14A)。
表14A.BAFF-R-Ig处理导致脾DC数减少.
脾树突状细胞是重要的抗原提呈细胞，它们的减少会影响B细胞活化、成熟以及体液免疫。
按照材料和方法部分中所述制得冷冻脾切片。BCMA-Ig处理后的小鼠用抗-CD11c染色时呈现出非典型DC归巢模式。DC通常定位于白髓的T细胞区以及边缘区内，边缘区的桥连通道(bridging channel)尤为集中。但是BCMA-Ig处理后的小鼠中DC围绕在边缘区的周长周围，只有极少数能够进一步迁徙入白髓(数据未显示)。因此，阻断BAFF/BAFF-R与可溶性BAFF受体之间的相互作用能够干扰DC的归巢模式，这样就可以妨碍它们作为抗原提呈细胞的功能，因而影响B细胞活化、成熟及体液免疫。而且经免疫组化测定，BCMA-Ig处理后的小鼠脾内缺乏CD35+FDC(数据未显示)。由于正是FDC将抗原提呈给生发中心(GC)内的B细胞，所以缺乏这类细胞对GC结构以及B细胞的亲和成熟有不利影响。
本领域技术人员都知道，在不脱离本发明实质和范围的前提下，可以对本发明所述多肽、组合物及方法进行各种修饰和变更。因此，如果本发明的修饰和变更落在本发明所附权利要求及其等价物的范围之内，那么它们就应属于本发明所覆盖的范围。
权利要求
1.一种抑制动物体内B细胞生长的方法，该方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物选自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗体同系物。
2.一种抑制动物产生免疫球蛋白的方法，该方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物选自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗体同系物。
3.一种抑制动物体内树突状细胞诱导的B细胞生长和成熟的方法，该方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物选自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗体同系物。
4.一种治疗自身免疫疾病的方法，该方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物选自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗体同系物。
5.一种治疗动物高血压的方法，该方法包括施用治疗有效量的B细胞生长抑制剂，所述抑制剂选自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗体同系物。
6.一种治疗动物肾病的方法，该方法包括施用治疗有效量的B细胞生长抑制剂，所述抑制剂选自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗体同系物。
7.一种治疗B细胞淋巴增生疾病的方法，该方法包括施用治疗有效量的B细胞生长抑制剂，所述抑制剂选自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗体同系物。
8.权利要求1-7所述方法，其中所述BAFF-R多肽是可溶性的。
9.权利要求8所述方法，其中所述可溶性BAFF-R多肽包括BAFF-R胞外区。
10.权利要求9的方法，其中所述BAFF-R胞外区与免疫球蛋白融合。
11.权利要求1-7所述方法，其中所述BAFF-R多肽选自a)分离的天然序列BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1中第1-184位的氨基酸或其片段；b)分离的BAFF-R多肽，该多肽与天然序列BAFF-R多肽具有至少80％的氨基酸序列同一性，且该多肽中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；c)分离的BAFF-R多肽，该多肽与天然序列BAFF-R多肽具有至少90％的氨基酸序列同一性，且该多肽中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；d)分离的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第1-51位氨基酸或其片段；以及e)分离的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第8-41位氨基酸或其片段。
12.权利要求1-7的方法，其中所述抗-BAFF-R抗体同系物是单克隆抗体。
13.权利要求1-7的方法，其中所述抗-BAFF-R抗体同系物包含BCMA-IgG。
14.权利要求1-7的方法，其中所述动物是哺乳动物。
15.权利要求14的方法，其中所述哺乳动物是人。
16.一种处理、抑制或改变涉及BAFF-R和BAFF间信号传输的免疫应答的方法，该方法包括施用有效量能够干扰BAFF-R和BAFF间联系的药剂。
17.一种抑制炎症的方法，该方法包括施用有效量的特异性针对BAFF-R或其活性片段的抗体。
18.一种抑制炎症的方法，该方法包括施用有效量的特异性针对BAFF-R或其表位的抗体。
19.一种药用组合物，其中包括治疗有效量的分离的BAFF-R多肽或其片段以及药物学上可接受的载体。
20.权利要求19的药用组合物，其中所述分离的BAFF-R多肽选自a)分离的天然序列BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；b)分离的BAFF-R多肽，该多肽与天然序列BAFF-R多肽具有至少80％的氨基酸序列同一性，该多肽中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；c)分离的BAFF-R多肽，该多肽与天然序列BAFF-R多肽具有至少90％的氨基酸序列同一性，该多肽中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；d)分离的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第1-51位氨基酸或其片段；以及e)分离的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第8-41位氨基酸或其片段。
21.权利要求19的药用组合物，其中所述BAFF-R多肽片段包含与免疫球蛋白融合的BAFF-R胞外区。
全文摘要
提供了TNF家族的受体:BAFF－R。还提供了BAFF－R的嵌合分子和抗体以及它们的应用方法。
文档编号C07K19/00GK1379815SQ00814288
公开日2002年11月13日 申请日期2000年8月16日 优先权日1999年8月17日
发明者费比尼·麦凯, 杰弗里·布朗宁, 克里斯廷·安布罗斯, 朱尔格·肖普, 帕斯卡尔·施奈德, 杰弗里·汤普森 申请人:比奥根公司, 阿波泰克R＆D股份有限公司