专利名称：酶底物,合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的一族酶底物及其用途，特别是检测微生物的用途。
细菌的检测和鉴定在药物或食品工业中是非常重要的，因为已知这种生物体不仅证明是病原体，而且也造成某些类型的污染。
最近为此目的开发的方法利用有色或荧光化合物的应用，并且例如在M.Manafi等人的综述“微生物学综述”(Microbiological Reviews)55(3)，pp.335-348，1991或者更近一些时候M.Manafi的De Ware(n)Chemicus，28，pp.12-17，1998中已经描述的这些化合物的应用。
一般能够分为四组化合物-荧光标记物，例如吖啶橙，该标记物吸附到微生物细胞的核酸上或者蛋白质上时，其产生荧光的增强；-pH-依赖性指示剂，例如吖啶或者7-羟基香豆素，其强度或颜色范围或荧光根据pH而不同，因此根据微生物的生物化学活性而不同；-对介质的氧化还原性质敏感的化合物，例如亚甲蓝，其在还原介质的作用下产生颜色；-酶的有色或荧光底物，在对一种微生物或一族微生物特异性的酶存在下在水解作用下，其分别产生颜色或荧光。
在后一种类中已经描述过一些特别使得检测β-D-葡糖苷酶或者β-D-半乳糖苷酶的底物，其是微生物特别是肠杆菌科的重要的taxinomic标记物。这些底物中，可以提到水解后产生黄色邻-硝基苯酚的邻-硝基苯基衍生物，或者荧光底物，例如荧光素的衍生物或者4-甲基7-羟基香豆素的衍生物，它们产生荧光标记。这些底物相当大的限制性是扩散到培养基中的现象，这使得更难以区别菌落和本底噪声。
为了解决这一问题，曾使用过其它在水解之后产生不溶产物的底物。这些底物处于细菌菌落周围而不扩散到培养物载体上，这有利于实验的说明。
在这些底物中，已经开发了3-吲哚氧基衍生物(参见例如Kodaka等，临床微生物学杂志(J.Clin Microbiol.)33，p.199-201，1995或者专利US5358854和US5364767)或者6，7-二羟基香豆素衍生物(参见例如WO97/41138)。首先，困难的合成大大提高了费用，限制大规模工业应用的发展，另外，这些底物对培养基温育条件敏感。第二，为了发生颜色反应而向培养基中加入铁-基复合物试剂的必要性对于某些微生物是一个问题，因为其可以干扰它们的代谢，特别是干扰所研究的微生物。
本发明描述了没有上述缺陷的新的一族酶底物，因为这些化合物的合成操作简单，这些底物在水解之后不溶解，它们不扩散到培养基中并且它们不需要加入复合物试剂例如铁或者任何特殊的氧化还原条件。
本发明的一个目的是描述一类通式(I)的化合物 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任选地被间位或对位取代，当X代表碳原子时，Y和Z代表氢原子，或者Y和Z一起代表任选被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺键，R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解。
本发明中感兴趣的酶是其存在提供了检测和/或鉴定和/或定量一种或多种微生物或者分析物的信息的酶，例如蛋白质，肽或核酸。特别地，所述酶来自osidases家族，例如β-葡糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，6-磷酸半乳糖水解酶，α-半乳糖苷酶，α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，或者氨基己糖苷酶，例如N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶或者N-乙酰基-β-氨基半乳糖苷酶，或者来自酯酶家族，脂酶家族，磷酸酯酶家族，硫酸酯酶家族，DNA酶家族，肽酶家族和蛋白酶家族。优选地，所述酶来自osidases家族，例如β-D-葡糖苷酶，β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶，或者来自硫酸酯酶家族，磷酸酯酶家族或酯酶家族。
选择R基团作为要检测的酶的官能团。R是例如α-或β-糖型残基，例如木糖，葡萄糖，半乳糖，葡糖醛酸或氨基葡糖的衍生物，或者磷酸根，硫酸根，或者其中R6是具有1-16个碳原子的烷基的羧酸根(R6COO-)，核苷酸或肽。优选地，R基团是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖，β-D-葡糖醛酸根，磷酸根，硫酸根或乙酸根。
当R1和R2一起代表稠合的苯环时，是下面的结构(Ia)，其表明R1和R2拓展的结构式 当Y和Z一起代表醚键时，是指通式(Ib)中代表的键 当Y和Z一起代表硫醚键时，是指通式(Ic)中代表的键 当Y和Z一起代表任选被芳基或烷基取代的胺键时，是指通式(Id)中代表的键 其中A代表芳基或烷基。
下面指明的通式(II)，(III)，(IVa)，(IVb)和(IVc)中给出了通式(I)的特定底物 通式(II)，其中R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环。优选地，R1和R2一起代表不被取代的稠合苯环，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的。优选地，R3和R4代表H，R5代表间位或对位的H，NO2，CF3，CN，OCH3，F，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，优选地，R5代表H，R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解。特别地，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基，或者乙酸根或硫酸根。 通式(III)，其中R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环。优选地，R1和R2一起代表不被取代的稠合苯环，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的。优选地，R3和R4代表H，R5代表间位或对位的H，NO2，CF3，CN，OCH3，F，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，优选地，R5代表H，R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解。特别地，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基。
通式(IVa)，其中R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环。优选地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的。优选地，R3和R4代表H，R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解。特别地，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基或者乙酸根或硫酸根。 通式(IVb)，其中R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环。优选地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的。优选地，R3和R4代表H，R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解。特别地，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基或者乙酸根或硫酸根。 通式(IVc)，其中
A代表芳基或烷基，R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环。优选地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的。优选地，R3和R4代表H，R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解。特别地，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基，或者乙酸根或硫酸根。
本发明还涉及通式(I)的酶底物的合成方法，其中制备具有通式(V)的中间体 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任选地被间位或对位取代，当X代表碳原子时，Y和Z代表氢原子，或者Y和Z一起代表任选被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺键，R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，并且适当地被保护的R基团接枝到羟基上。
特别地，通过糖基化作用，酯化作用或磷酸化作用反应发生接枝。
在糖基化作用的情况下，有必要保护糖的羟基，例如用乙酰基。从相应的α-乙酰溴六糖衍生物获得β-D-葡糖苷或β-D-半乳糖苷的四乙酰化衍生物。
对于乙酰化衍生物，在接枝之后，在碱性试剂例如甲醇中的甲醇钠的存在下，进行糖的羟基的去保护。本领域技术人员特别是通过丙酮中的氢氧化钾的作用来选择糖基化条件。
通过在吡啶中在冷却条件下使通式(V)的衍生物与乙酸酐反应来进行有机酯例如乙酸酯的形成。通过在吡啶/二甲基甲酰胺型溶剂混合物中，任选地在催化剂例如4-二甲基氨基吡啶的存在下，反应酰氯衍生物，进行CH3(CH2)nCOOR型酯的形成。通过在POCl3的存在下在吡啶的存在下处理通式(V)的衍生物来进行磷酸酯的形成。
通过在吡啶中冷却条件下用氯磺酸处理通式(V)的衍生物来进行硫酸酯的形成。本发明的底物，在磷酸酯和硫酸酯的情况下，是盐的形式，例如钾盐或钠盐。
有利地，制备相应于下面结构式(Va)，(Vb)和(Vc)中任一个的中间体 本发明还涉及用于检测和/或鉴定和/或定量测定至少一种微生物的组合物，其含有至少一种通式(I)的酶底物和用于所述微生物的反应介质。
根据本发明，术语“反应介质”意指使得至少一种微生物的至少一种酶活性发生的介质，例如培养基。
反应介质是固体，半固体或液体。术语“固体介质”意指例如琼脂培养基。琼脂是微生物学中用于培养微生物的常规固体培养基，但是也可以使用明胶或琼脂糖。很多制剂是可获得的，例如哥伦比亚琼脂，胰胨豆胨琼脂，麦氏琼脂，沙氏琼脂，本申请人在“培养基技术手册”(Livrettechnique MILIEU DE CULTURE)中描述的那些，更一般地，在微生物培养基手册(Handbook of Microbiological Media)(CRC出版)中描述的那些。
有利地，所述反应介质是含有2至40克/升，优选地9至25克/升琼脂的琼脂培养基。
本发明的底物可以在宽pH范围中使用，特别地，在pH5.5和10.0之间，并且有利地在pH6.0和8.5之间。
所述反应介质混合物中还可以含有一种或多种成分，例如氨基酸，蛋白胨，碳水化合物，核苷酸，矿物质，维生素，抗生素，表面活性剂，缓冲液或者磷酸的铵盐，钠盐或金属盐。培养基的例子描述于本申请人的下面的专利，EP0656421或WO99/09207。
本发明的另一方面，所述反应介质含有至少两种酶底物来自本发明一族的第一酶底物和至少一种来自本发明一族的另一种酶底物和/或来自其它底物家族的另一种酶底物。其他底物的酶解产生可检测信号，其与第一底物产生的信号不同，例如不同的有色或荧光产品，以便能够证明例如一种或多种微生物的检测和/或鉴定和/或定量测定。
举例来说，可以提到下面的组合-对于尿样品的培养基的根据本发明的β-葡糖醛酸酶底物和X-β-D-葡糖苷(X是5-溴-4-氯-3-吲哚基)(CPS ID2型，bioMerieuz，Marcyl’Etoile，法国)；-对于尿样品的培养基的根据本发明的β-半乳糖苷酶底物和X-β-D-葡糖苷(法国巴黎CHROMagar公司出售的CHROMagar型定向(商标)，或者英国Hamspshire OXOID公司出售的Oxoid UTI)；-对于大肠埃希氏杆菌和大肠杆菌类的培养基的根据本发明的β-葡糖醛酸酶底物和X-β-D-半乳糖苷(Coli ID型，bioMerieuz，Marcyl’Etoile，法国)；举例来说，对于酵母和鉴定白色假丝酵母，可以使用根据本发明的氨基己糖苷酶底物。
根据本发明的底物可以加给bioMerieuz(Marcy l’Etoile，法国)出售的并且包括它们的酶底物的全部或部分的介质CSP ID2，SM ID，Albicans ID2，Coli ID和0157H7 ID，还可以加给含有七叶苷例如胆汁七叶苷琼脂并且有或没有选择性试剂的介质。
反应介质中酶底物的浓度在0.02和1克/升之间，有利地在0.03和0.30克/升之间，优选地在0.04和0.10克/升之间。
本发明还涉及包括如上定义的组合物和用于反应介质的容器的诊断试剂盒。术语“容器”意指任何固体载体，例如瓶，管，皿，微量滴定板或者用于自动机器的消耗品，例如API滤槽或VITEK卡(商标名，bioMerieuz，Marcy l’Etoile，法国)。
本发明的另一方面涉及在样本中检测和/或鉴定和/或定量测定至少一种微生物的方法，其中使来自样本的微生物接触含有通式(I)的酶底物的反应介质，并且检测所述酶底物水解形成的有色或荧光产物。
通式(I)的底物具有这样优点，即它们可以独立于大气条件用于温育。因此，通过温育含有酶底物的反应介质，并且在控制的大气中例如在需氧，厌氧或微需氧条件下或者在二氧化碳气下，优选在需氧或微需氧条件下或者在二氧化碳气下，接种至少一种微生物。
要分析的样本是临床样本，例如唾液，血液，尿液或大便样品或者任何其它样本，其分析有助于医生的诊断。所述样本也可以是来自食品工业和/或制药工业的产品样本或者是食品工业和/或制药工业的基本产品，需要保证不存在病原体微生物，或者需要计数污染菌丛或者检测具体的微生物。所述样本可以直接或者在预培养步骤之后，例如在食品样品的情况下，在含有通式(I)的底物的培养基上培养。
本发明中可以鉴定，检测或定量测定的微生物是细菌，酵母和真菌，特别是属于下面的种或分类单位的那些肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，奈瑟氏球菌科(Nesseriaceae)，Vibrionaceae，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)，弯曲杆菌属(Campylobacter)；细球菌科(Micrococcaceae)，链球菌科(Streptococcaceae)，芽胞杆菌属(Bacillus)，乳酸杆菌属(Lactobacillus)，李司忒氏菌属(Listeria)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，加德纳氏菌属(Gardnerella)，诺卡氏菌属(Nocardia)，念珠菌属(Candida)，隐球菌属(Cryptococcus)，曲霉属(Aspergillus)，更特别地大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)，大肠埃希氏杆菌0157H7(E.coli 0157H7)，志贺氏菌属(Shigella)，沙门氏菌属(Salmonella)，Proteeae，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，肠球菌(Enterococcus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，单核细胞增生利斯特氏菌(Listeramonocytogenes)，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，酵母，例如白色假丝酵母(Candidaalbicans)，团假丝酵母(Candida glabrata)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。这些微生物可以是需氧的，空气厌氧的，微需氧的或厌氧的。
本发明的另一方面，酶底物用于检测一种分析物的反应中，其中利用了酶活性(特别是碱性磷酸酯酶或β-半乳糖苷酶)，例如利用ELISA型方法检测抗体或抗原或核酸的反应(参见例如“从理论到实践的免疫剂量”(″les immunodosages de la théo rie àla pratique″)，并列由Barbier Y.，ACOMEN，Lyon，编著，p109-133，1988)；在证明β-半乳糖苷酶型基因的分子生物学技术中(参见例如“分子克隆实验手册”(″Molecular cloning a laboratory manual″)，第二版，Sambrook，Fritsch，Maniatis，冷泉港实验出版社，16.56和1.85章节，1989)；用于检测核酸(参见例如“DNA探针”"DNA probes"，第二版，Keller G.H.，Manak，M.M.，Stockton出版，5至9章节，1993)；或者在组织化学，细胞化学或者流式细胞仪技术。
下面的实施例使得有可能详细解释本发明的一些优点但是不管怎样不限制其范围。
实施例1对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷，PNB-gal产物(1) 从Acros Organics(Geel，比利时)获得对-萘酚benzein。其它试剂从Sigma Aldrich Chimie(St Quentin Fallavier，法国)获得。剧烈搅拌下将对-萘酚benzein(1.87毫克，5毫摩尔)溶解于20毫升丙酮。向该溶液加入1.4摩尔/升浓度的5毫升氢氧化钾，接着加入10毫升丙酮。然后滴加5毫升水以产生深兰色溶液。向该溶液加入10毫升丙酮中的10毫摩尔α-溴乙酰半乳糖(4.1克)。为了保持pH为大于11的值，在搅拌30分钟之后第一次加入20摩尔/升的氢氧化钾溶液2毫升并且在搅拌90分钟之后第二次加入20摩尔/升的氢氧化钾溶液2毫升。3.5小时之后第三次加入碱溶液，接着加入5毫升浓度和以前一样的α-溴乙酰半乳糖丙酮溶液。4.5小时之后最后一次加入碱溶液并且将该溶液搅拌过夜。
减压去除丙酮，0℃搅拌下将残留溶液加给300毫升0.06摩尔/升的碳酸钠溶液。抽真空过滤栗棕色沉淀，用水洗涤并且风干。将该固体溶解于100毫升二氯甲烷并且用氢氧化钾溶液在0℃下充分洗涤以去除过量对-萘酚benzein。在100毫升水中在pH11下在Dowex Marathon树脂上，通过搅拌2-3小时，去除残留的对-萘酚benzein。纯化之后是薄层色谱，使用乙酸乙酯/甲苯(3∶1)为溶剂，用氨水展开。用无水硫酸镁将暗黄色溶液干燥过夜，减压蒸发，用甲醇再配制后再次蒸发以获得一种泡沫体。将该泡沫体溶解于50毫升甲醇，并且在甲醇中使用20毫升0.4摩尔/升的甲醇钠将产物去保护5小时。然后用IR120(H+)树脂将溶液调至pH6.5并且通过静置而分离，并且减压去除溶剂。生成的糖苷对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷(1.5克)是黄栗棕色粉末形式。
实施例2对-萘酚benzein的乙酸酯衍生物的合成将对-萘酚benzein溶解于无水吡啶之后冷却到0℃，冷却条件下向该溶液加入溶解于吡啶的乙酸酐(5倍摩尔过量)。室温下24小时之后，为了分解过量的酰化试剂，搅拌下滴加冷水处理溶液。抽真空过滤分离酯形式的沉淀，用乙酸洗涤并且在热条件下在乙酸中重结晶。
实施例3对-萘酚benzein的钾盐形式的硫酸盐衍生物的合成-15℃搅拌下，向冷的对-萘酚benzein的无水吡啶溶液加入1.2摩尔过量的氯磺酸。-15℃ 1小时并且室温下30分钟之后，减压蒸发去除过量吡啶，通过溶解于乙醇并且用氢氧化钾的乙醇溶液处理直到达到pH10来分解吡啶鎓盐。真空过滤出钾盐并且用乙醇洗涤之后用二乙醚洗涤。
实施例48-氯-1，2-苯并-9-羟基-3-异吩噁唑酮-β-D-葡糖苷，(CBR-glu)产物(2)的合成 将6-亚硝基-4-氯间苯二酚(2.94克，20毫摩尔)和1，3-二羟基萘(3.20克，20毫摩尔)分别溶解于1-丁醇(30毫升)并且混合。用水浴在50℃和60℃之间加热反应混合物并且在搅拌下用30秒滴加硫酸(1.0克)。溶液变成深红色并且快速形成结晶。50℃ 15分钟和室温下1小时之后，真空过滤产物并且从热的1-丁醇中重结晶，得到2.8克8-氯-1，2-苯并-9-羟基-3-异吩噁唑酮亮深红色结晶。
和前面对于对-萘酚benzein衍生物描述的一样通过Koenigs-Knorr反应制备葡糖苷衍生物(2)。通过旋转蒸发从二氯甲烷分离四乙酰化保护形式的葡糖苷并且使用催化量的甲醇钠的无水甲醇溶液直接去保护。该糖苷是橘黄色粉末。
实施例58-氯-1，2-苯并-9-羟基-3-异吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷，(CBR-gal)产物(3)的合成制备该β-D-半乳糖苷衍生物(3)的方法和实施例中的描述相同，使用四乙酰化保护形式的β-D-半乳糖苷衍生物代替葡糖苷等价物。
实施例63-羟基-9-苯基-1，27，8-二苯并-6-荧光酮-β-D-半乳糖苷产物(4)的合成 通过在高沸点溶剂例如氯苯或二甲苯中，在路易斯酸例如SnCl4或ZnCl2存在下，通过在热条件下使1，3-二羟基萘(Aldrich，14529-7)与α，α，α-三氟甲苯(Aldrich，T6370-3)缩合制备3-羟基-9-苯基-1，27，8-二苯并-6-荧光酮。路易斯酸水解并且纯化中间体化合物之后，如实施例1所述制备半乳糖苷衍生物(4)。实施例6a:萘并藏花醇(9-羟基-7-苯酚-5-苯并[a]吩嗪酮)的合成 产物(5)保持0℃并且搅拌下，向苯酚(20克)，亚硝酸钠(18克)和氢氧化钠(9克)的500毫升水的溶液中缓慢加入50克硫酸和130毫升水的混合物。反应2小时之后，收集产物并且用冰冷却的水洗涤。用水重结晶之后，分离纯形式的对-亚硝基苯酚产物(13.4克)。
将这样制备的对-亚硝基苯酚产物(12.3克，0.1摩尔)还有N-苯基-2-萘胺(14.5克，0.067摩尔，Aldrich，17805-5)溶解于乙醇(400毫升)并且将该混合物冷却到15℃。向该溶液中加入浓盐酸(15克)。温度自发升高，并且通过过滤分离异绕森酮产物(盐酸盐形式)并且从乙醇-水(50％-50％)混合物中重结晶。重结晶的产物通过首先溶解于乙醇，然后加入羟胺，以及最后将该溶液加到热水中而可以转化为其游离碱形式。
将溶液冷却时游离碱(异绕森酮)以深栗棕色结晶的形式沉淀出。真空下过滤产生15克纯产物。
通过在浓KOH的1-丁醇的溶液中回流异绕森酮而获得目的产物(5)。通过在二氧化硅上进行闪式层析来纯化产物，用乙酸乙酯作为洗脱剂。
实施例6b根据和实施例1描述的相同的方法制备苯并藏花醇的半乳糖苷衍生物。
实施例7:对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷(PNB-gal)检测具有β-D-半乳糖苷酶活性的微生物的用途如下制备含有PNB-gal的固体琼脂培养基向含有100毫克PNB-gal和30毫克IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的1升蒸馏水加入41克哥伦比亚琼脂以有利于诱导β-半乳糖酶活性。在116℃下将琼脂高压灭菌10分钟。在分布到20毫升培养皿中之前将培养基缓慢冷却到55℃下。
从临床和环境样本中收集367种不同的菌株，包括303肠杆菌科并且利用API 20E图库(bioMerieux，法国)作为参考方法进行鉴定。在哥伦比亚琼脂培养基上在37℃下将菌株培养24小时，然后对于每一种菌株接种大约108微生物/毫升(等于0.5McFarland标准)。使用Denley接种器，将每一种悬浮液各1微升接种到上面制备的PNB-gal培养基中，每个培养皿20个菌株。所有这些培养皿在37℃下温育18小时。温育之后，与哥伦比亚琼脂培养基上的生长相比较，对培养皿检查是否存在紫色菌落。结果在表I中给出。
表I
该表表明所述底物作为β-半乳糖苷酶活性的指示剂是非常有效的。没有检测到没有β-半乳糖苷酶活性的菌株，这意味着没有假阳性，与API20E参照方法相比，对肠杆菌科菌株的灵敏性是95.1％。
实施例8pH对对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷PNB-gal存在下β-D-半乳糖苷酶发挥活性的影响将培养基高压灭菌之后，将46.37克/升浓度的哥伦比亚碱，0.03克/升的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和0.1克/升的对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷调节至各种pH(5，5-6，0-6，5-7，0-7，5-8，0-8，5)。这些各种培养基分布到培养皿中，对它们自身接种并且在三次实验中使用来自ATCC或NCTC型收集的0.5McFarland表征得很好的微生物的悬浮液。这些培养皿在37℃下温育48小时。目测检查24小时和48小时温育之后形成的菌落，并且注意颜色。结果在下面的表II中给出
表II
-指没有颜色，TI代表在培养皿上温育的时间。
根据菌株和培养的时间，菌落的颜色随着pH而不同，是pH的函数。一般情况下，在酸性pH下更呈橙色至棕色，在碱性pH下呈绿色至土黄色。这使得可以区分不同组的微生物，根据需要调节颜色(与其它酶底物组合，pH指示剂)或者证明几种代谢产物(酶水解和pH变化)，其是PNB-gal底物的好处。
实施例9反应介质对对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷PNB-gal存在下β-D-半乳糖苷酶发挥活性的影响向哥伦比亚胰胨豆胨琼脂(TSA)和山梨糖醇MacConkey(SMAC)介质中加入下面的混合物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷……………………0.03克/升对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷……………….0.1克/升高压灭菌之后，23℃下培养基的pH对于SMAC，TSA和哥伦比亚培养基分别是7.1，7.1，和7.2。这些不同的培养基分布在培养皿上，并且对它们自身接种并且在三次实验中使用来自ATCC或NCTC型收集的0.5McFarland表征得很好的微生物的悬浮液。这些培养皿在37℃下温育48小时。目测检查24小时和48小时温育之后形成的菌落，并且注意颜色。结果在下面的表III中给出表III
-指没有颜色，TI代表在培养皿上温育的时间。
根据菌株和培养的时间，菌落的颜色随着培养基而不同，是培养基的函数。一般情况下，在SMAC培养基上是橙色，在哥伦比亚培养基上是棕色，没有可能将此差异与对于培养基的pH的颜色联系在一起。对于SMAC培养基，可以将粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)与其它细菌分别开来，在另外两种培养基中则不是这种情况。另外，有利地，根据给出其它颜色(例如粉色或棕色)的其它酶底物的使用，能调节用对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷获得的菌落的颜色。
实施例10温育大气对对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷PNB-gal存在下β-D-半乳糖苷酶发挥活性的影响向下面的培养基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-Gal)或者对-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷(PNB-gal)0.1克/升酵母提取液……………………6克/升明胶蛋白胨……………………5克/升NaCl…………………………8克/升碳酸钠…………………………0.1克/升异丙基-β-D-硫代半乳糖苷…0.03克/升琼脂……………………………13克/升这些不同的培养基分布在培养皿上，并且使用来自ATCC或NCTC型收集的表征得很好的微生物接种。这些培养皿在各种气体下在37℃下温育48小时需氧生活(AE)，微需氧(MAP)，厌氧生活(ANA)，CO2，通过GENbox系统(bioMerieuz，法国)控制周围气体。目测检查24小时和48小时温育之后形成的菌落，并且注意强度和颜色。结果在下面的表IV中给出
表IV
*颜色强度(以目测观察为基础的比例规格)；-指没有颜色；TI代表温育的时间。
X-Gal使得可能检测E.faecium菌株的活性，与PNB-Gal不一样，对于在需氧生活(大肠埃希氏杆菌，阴沟肠杆菌)下强水解X-Gal的菌株，PNB-Gal使可能检测该不依赖周围气体并且更强的β-D-半乳糖苷酶活性。具体地说，在试验3条件下强度弱或非常弱，而在试验7条件下强度强。
实施例118-氯-1，2-苯并-9-羟基-3-异吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷(CBR-gal)用于检测在固体培养基中具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的用途以下面的浓度将CBR-gal底物掺入哥伦比亚琼脂中2，6，10和20毫克/100毫升，将这样制备的培养基分布到培养皿中。用下面的微生物接种每一个培养皿大肠埃希氏杆菌(NCTC，10418)，肺炎克雷白氏杆菌(NCTC，10896)，雷氏普罗威登斯菌(NCTC，7475)，阴沟肠杆菌(NCTC，11936)，粘质沙雷氏菌(NCTC，10211)，和鼠伤寒沙门氏菌(NCTC，74)。以每100毫升哥伦比亚琼脂3毫克的浓度向所有的这些培养基中掺入IPTG。所有的培养皿都在37℃下保温过夜。
对于β-半乳糖苷酶活性呈阳性的菌株(大肠埃希氏杆菌，肺炎克雷白氏杆菌，阴沟肠杆菌，和粘质沙雷氏菌)在温育过夜之后快速水解底物，给出粉色颜色，这只限于细菌菌落。所有试验浓度都可以区分这些物种，但是获得清晰可见粉色颜色而没有背景噪音的最佳浓度是大约10毫克/100毫升。对于所有试验浓度都没有观察到生长的抑制作用。
实施例128-氯-1，2-苯并-9-羟基-3-异吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷(CBR-gal)用于检测在液体培养基中具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的用途以0.5毫克/毫升至0.0078毫克/毫升不同浓度在液体培养基中试验CBR-gal底物。其中加入底物的液体反应介质由含有0.5％营养肉汤和0.5％氯化钠的磷酸盐缓冲液pH7.4组成。对于所有的底物浓度向介质中加入30微升/毫升IPTG。试验菌株是大肠埃希氏杆菌(NCTC，10418)，肺炎克雷白氏杆菌(NCTC，10896)，雷氏普罗威登斯菌(NCTC，7475)，阴沟肠杆菌(NCTC，11936)，粘质沙雷氏菌(NCTC，10211)，和鼠伤寒沙门氏菌(NCTC，74)，菌种为0.5McFarland。
所有具有β-半乳糖苷酶活性的菌株都随着时间产生粉色颜色，如下面表V中总结的。
表V
*以小时给出的结果。-表示即使在24小时之后也没有颜色。
权利要求
1.通式(I)的酶底物 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任选地在间位或对位被取代，当X代表碳原子时，Y和Z代表氢原子，或者Y和Z一起代表任选被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺键，R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，R代表一个基团，它使得O-R键能够被酶水解。
2.权利要求1要求的酶底物，特征在于所述酶来自osidases家族，例如β-葡糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶，6-磷酸半乳糖水解酶，α-半乳糖苷酶，α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，或者氨基己糖苷酶，例如N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶或者N-乙酰基-β-氨基半乳糖苷酶，或者来自酯酶家族，脂酶家族，磷酸酯酶家族，硫酸酯酶家族，DNA酶家族，肽酶家族和蛋白酶家族。
3.权利要求1和2要求的酶底物，特征在于R是α-或β-糖型残基，优选β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖，或β-D-葡糖醛酸根或磷酸根，硫酸根或乙酸根。
4.通式(II)的权利要求1-3任一项要求的酶底物 其中R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，R5代表间位或对位的H，NO2，CF3，CN，OCH3，F，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，R代表能够使O-R键被酶水解的基团。
5.权利要求4要求的酶底物，特征在于R1和R2代表稠合的苯环，R3和R4代表氢原子，R5代表氢原子，R代表α-或β-糖型残基，优选β-D-葡萄糖，或β-D-半乳糖，或硫酸根或乙酸根。
6.通式(III)的权利要求1-3任一项要求的酶底物 其中R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，R5代表间位或对位的H，NO2，CF3，CN，OCH3，F，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，R代表能够使O-R键被酶水解的一个基团。
7.权利要求6要求的酶底物，特征在于R1和R2代表稠合的苯环，R3和R4代表氢原子，R5代表H，R代表α-或β-糖型残基，优选β-D-葡萄糖，或β-D-半乳糖。
8.通式(IVa)的权利要求1-3任一项要求的酶底物 其中R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，优选地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，优选地，R3和R4代表H，R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解，特别地，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基。
9.通式(IVb)的权利要求1-3任一项要求的酶底物 其中R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，优选地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，优选地，R3和R4代表H，R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解，特别地，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基。
10.通式(IVc)的权利要求1-3任一项要求的酶底物 其中A代表芳基或烷基，R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，优选地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，优选地，R3和R4代表H，R代表一个基团使得O-R键能够被酶水解，特别地，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基。
11.权利要求8要求的酶底物，特征在于R1代表H而R2代表Cl，R3和R4代表H，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基。
12.权利要求10要求的酶底物，特征在于R1，R3和R4代表H，A代表苯基，R代表α-或β-糖型优选是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的残基。
13.权利要求1要求的酶底物的合成方法，特征在于制备具有通式(V)的中间体化合物，并且将合适地保护基R接枝到羟基上[sic] 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任选地被间位或对位取代，当X代表碳原子时，Y和Z代表氢原子，或者Y和Z一起代表任选被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺键，R1和R2各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者没有被取代的稠合的苯环，R3和R4各自独立地代表H，Cl，F，I或Br，并且可以是相同或不同的。
14.权利要求13要求的方法，特征在于所述中间体化合物相应于下面的结构式(Va)
15.权利要求13要求的方法，特征在于所述中间体化合物相应于下面的结构式(Vb)
16.权利要求13要求的方法，特征在于所述中间体化合物相应于下面的结构式(Vc)
17.一种用于检测和/或鉴定和/或定量测定至少一种微生物的组合物，其含有至少一种权利要求1-12任一项要求的酶底物和适合所述微生物的反应介质。
18.权利要求17要求的组合物，特征在于所述组合物含有至少两种权利要求1-12任一项要求的底物，其酶解产生不同颜色和/或荧光产物。
19.权利要求17或18要求的组合物，特征在于其还含有另一种酶底物，其不同于权利要求1-12任一项要求的底物，并且其酶解产生与权利要求17要求中使用底物酶解释放的不同的或者与权利要求18要求中使用底物酶解释放的不同的颜色和/或不同的荧光产物。
20.权利要求17，18或19要求的组合物，特征在于所述反应介质是固体，半固体或液体。
21.权利要求17-20任一项要求的组合物，特征在于反应介质中酶底物的浓度在0.02和1克/升之间，有利地在0.03和0.30克/升之间，优选地在0.04和0.10克/升之间。
22.包括权利要求17-21任一项要求的组合物和盛反应介质的容器的诊断试剂盒。
23.一种用于检测和/或鉴定和/或定量测定样本中至少一种微生物的方法，特征在于使来源于样本的微生物接触含有权利要求1-12中定义的酶底物以获得接种培养基，并且检测所述酶底物水解形成的有色或荧光产物。
24.权利要求23要求的方法，特征在于在控制的环境下例如需氧，厌氧或微需氧条件下或者在二氧化碳气下，优选在需氧或微需氧条件下或者在二氧化碳条件下，温育接种的反应培养基。
25.权利要求1-12任一项要求的酶底物在使用酶活性的技术例如ELISA技术，所述技术中分析物是抗体，抗原或者核酸，或者其中分析物是β-半乳糖苷酶型基因的分子生物技术中检测分析物的用途。
全文摘要
本发明涉及新的通式(I)的酶底物，其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任选地被间位或对位取代；当X代表碳原子时，Y和Z代表氢原子，或者Y和Z一起代表任选被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺键；R
文档编号C07H15/24GK1399641SQ00816190
公开日2003年2月26日 申请日期2000年10月25日 优先权日1999年10月28日
发明者L·阿姆斯特朗, A·詹姆斯 申请人:比奥美希奥公司