专利名称：用于疫苗中的hbv抗原的纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产用于治疗或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染的乙型肝炎疫苗的一种新方法。它还涉及通过本发明所述新方法可获得的HBV疫苗。
由于目前对慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的治疗有限，因此它构成了一个巨大的全球公众健康问题。估计在世界范围内数量超过3亿的慢性HBV携带者有发展成为慢性活动型肝炎、肝硬化和原发性肝癌的危险。
目前存在的许多疫苗需要加入防腐剂以防止变质。常用的防腐剂是硫柳汞，它是一种含汞的化合物。虽然评论员强调含硫柳汞疫苗的潜在危害不应该被夸大，但已经出现了对于在疫苗中使用汞的担心(Offit；P.A.JAMA第283卷；第16期)。不过发现新的和可能更安全的制备疫苗方法来替代在所述生产方法中使用硫柳汞应该是有利的。因而需要开发不含硫柳汞的疫苗，尤其是乙型肝炎疫苗。
第一方面，本发明提供了一种生产适用于疫苗中的乙型肝炎抗原的方法，所述方法包括在含有游离-SH基的还原剂存在下纯化所述抗原。
本发明优选提供一种生产稳定的无硫柳汞痕迹的乙型肝炎抗原的方法，所述方法包括在含有游离-SH基的还原剂存在下纯化所述抗原。
如本文所述，当利用汞吸收分光光度测定法在纯化抗原制品中检测不到硫柳汞时，所述抗原制剂通常是无硫柳汞痕迹的。
在通过吸收分光光度测定法适当地测量时，所述肝炎抗原制剂优选包含每20μg蛋白少于0.025μg的汞。
优选所述纯化是在不存在硫柳汞下进行的，并且所述纯化抗原完全不含硫柳汞。
优选所述抗原是稳定的，如在这里举例的实施例1中所描述的，适宜基本上与在硫柳汞存在下纯化后的肝炎抗原一样稳定。
优选所述肝炎抗原是具有免疫原性的。
优选所述还原剂是在所述抗原纯化工序中加入，优选是在表达所述抗原的细胞生长后加入。
优选所述还原剂是半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇或谷胱甘肽，半胱氨酸是最优选的。
因此本发明优选提供一种生产无硫柳汞痕迹的稳定的免疫原性乙型肝炎抗原的方法，所述方法包括在半胱氨酸存在下纯化所述抗原。
优选所述纯化在半胱氨酸溶液存在下进行。
优选溶液中或粉末状的半胱氨酸在所述工序中加入至终浓度在1mM至10mM之间，优选是1mM至5mM，更优选所述半胱氨酸加入至终浓度约2mM。
优选所述半胱氨酸是L-半胱氨酸。
本发明还提供一种生产不含硫柳汞的稳定乙型肝炎抗原的方法，其中所述粗制抗原经过凝胶渗透层析，经过离子交换层析，然后与含有游离-SH基的还原剂混合。
优选所述离子交换层析是阴离子交换层析。
本发明还提供一种通过本发明制备方法可获得的不含硫柳汞的乙型肝炎抗原，其中所述抗原至少与在硫柳汞存在下制备的乙型肝炎抗原具有一样的免疫原性和抗原性。
本发明还提供一种免疫原性乙型肝炎抗原，所述抗原的平均ELISA蛋白比率超过1.5，并且其RF1含量的IC50值至少降低至在存在硫柳汞情况下制备的乙型肝炎表面抗原的三分之一。
另一方面，本发明涉及一种生产适用于疫苗的肝炎抗原的方法，所述方法包括在硫柳汞存在下纯化所述抗原和随后在含有游离-SH基的还原剂存在下处理抗原。
适宜在纯化步骤后进行所述处理例如透析以除去硫柳汞。
优选所述还原剂是半胱氨酸、DTT、谷胱甘肽或2-巯基乙醇。
本发明的所述乙型肝炎抗原可以用于治疗或预防乙型肝炎感染，特别是治疗或预防例如慢性乙型肝炎感染。
本发明还提供一种包含与佐剂结合的本发明乙型肝炎抗原的疫苗制剂。优选所述佐剂是铝盐或TH1细胞反应的优先刺激物。
优选所述抗原是乙型肝炎表面抗原。
乙型肝炎表面抗原的制备已有详细的纪录。参见例如，Harford等Develop.Biol.Standard 54，第125页(1983)、Gregg等，Biotechnology，5，第479页(1987)、EP-A-0 226 846、EP-A-0 299 108和其中的参考文献。
此中用到的“乙型肝炎表面抗原”或“HBsAg”表述包括任何HBsAg抗原或呈现出HBV表面抗原抗原性的其片段。人们会理解，除了HBsAg S抗原的226个氨基酸的序列(参见Tiollais等，Nature，317，489(1985)和其中的参考文献)之外，如果需要，此中所描述的HBsAg还可以含有在上面参考文献中和EP-A-0 278 940中描述的全部或部分的前-S序列。这里描述的HBsAg也可以指变体，例如在WO 91/14703中描述的“逃避突变体”。
HBsAg也可以指在EP 0 198 474或EP 0 304 578中所描述的多肽。
通常所述HBsAg是颗粒状的。在一个尤其优选实施方案中，所述HBsAg基本上由上面所提到的HBsAg S-抗原组成。
所述疫苗可以有利地包含一种药学上可接受的赋形剂，例如合适的佐剂。合适的佐剂是市场上有售的，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；铝盐，例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子衍生多糖或阴离子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球；单磷酰脂质A和quil A。细胞因子，例如GM-CSF或白介素-2、白介素-7或白介素-12也可以用作佐剂。
在本发明所述制剂中，优选所述佐剂组合物诱导主要是TH1型的免疫应答。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)往往有利于诱导针对所给予抗原的细胞介导免疫应答。在一个优选实施方案中，其中的应答主要是Th1型，Th1型细胞因子的水平会比Th2型细胞因子的水平增大到一个更大的范围。这些细胞因子的水平可以很容易地利用标准测定法确定。对于细胞因子家族的综述，参见见Mosmann和Coffman,Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
因此，用于引起主要为Th1型应答的合适佐剂包括，例如单磷酰脂质A，优选3-脱氧-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)与铝盐的组合。其他已知的优先诱发TH1型免疫应答的佐剂包括含有CpG的寡核苷酸。所述寡核苷酸的特征在于，所述CpG二核苷酸是未甲基化的。这类寡核苷酸是熟知的，描述于例如WO 96/02555中。同样描述了免疫刺激性DNA序列例如，Sato等，Science 273352，1996。另一种优选佐剂是皂苷，优选是QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)，它可以单独使用或与其他佐剂联合使用。例如，一个增强的系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，例如在WO 94/00153中所描述的QS21和3D-MPL的组合，或者在WO 96/33739中所描述的其中QS21被胆固醇猝灭的反应原性较低的组合物。其他优选的制剂包括水包油乳剂和生育酚。包含QS21、3D-MPL和生育酚的水包油乳剂的尤其有效佐剂制剂描述于WO 95/17210中。
包含QS21、3D-MPL和生育酚的水包油乳剂的尤其有效佐剂制剂描述于WO 95/17210中，它是一种优选的制剂。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供一种包含本发明乙型肝炎表面抗原的疫苗，它另外还包含TH-1诱导佐剂。一个优选实施方案是一种疫苗，其中所述TH-1诱导佐剂选自由下列组成的佐剂组3D-MPL、QS21、QS21和胆固醇的混合物和CpG寡核苷酸。另外一个优选实施方案是含有由单磷酰脂质A或其衍生物、QS21和生育酚的水包油乳剂的作为佐剂的乙型肝炎表面抗原的一种疫苗。
优选所述疫苗另外还包含皂苷，更优选是QS21。包括CpG和皂苷的另一种尤其合适的佐剂制剂描述于WO 00/09159中，它是一种优选制剂。最优选在那种特定制剂中所述皂苷是QS21。优选所述制剂另外还包含水包油乳剂和生育酚。
本发明此外还提供一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包含与佐剂结合的本发明乙型肝炎表面抗原，另外还包含选自以下的一种或多种抗原白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、无细胞百日咳抗原(Pa)、灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)、流感嗜血菌抗原(Hib)、甲型肝炎抗原、单纯疱疹病毒(HSV)、衣原体、GSB、HPV、肺炎链球菌和奈瑟氏菌抗原。提供针对其他疾病的保护作用的抗原也可以联合到本发明的所述疫苗制剂中。
在一个具体实施方案中，所述疫苗制剂包含通过本发明制备方法可获得并与佐剂和灭活脊髓灰质炎病毒结合的乙型肝炎表面抗原。
本发明同样也提供一种治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染的方法，所述方法包括给予患有或易感乙型肝炎病毒感染的人或动物受治疗者安全和有效量的本发明疫苗，以用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染。
本发明还提供本发明的乙型肝炎表面抗原在用于乙型肝炎病毒感染、例如慢性乙型肝炎病毒感染患者的治疗药物的制备中的应用。
本发明所述疫苗含有免疫保护量的所述抗原，并可以通过常规技术制备。
疫苗制备方法通常描述于Pharmaceutical Biotechnology，61卷Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach，Powell和Newman编辑，Plenum Press，1995和New Trends and Developments in Vaccines，Voller等编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。例如，在脂质体内包封描述于例如Fullerton的美国专利4,235,877中。蛋白与大分子的缀合例如在Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757中公开。Quil A的应用由Dalsgaard等在Acta VetScand，18349(1977)中公开。3D-MPL可得自Ribi immunochem，USA，并在英国专利申请第2220211号和美国专利4912094中公开。QS21在美国专利第5057540号中公开。
本发明通过下列实施例说明，但并不限于下列实施例，其中
图1图解说明所述Engerix BTM的无硫柳汞生产方法。
图2图解说明主体抗原(bulk antigen)批料的SDS-PAGE分析；和图3图解说明通过无硫柳汞方法生产的主体抗原批料中的残留酵母蛋白。
实施例1硫柳汞存在下乙型肝炎表面抗原的生产方法SB Biologicals乙型肝炎单价疫苗(Engerix BTM)的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中作为重组蛋白表达的(参见Harford等，在上述引文中)。所述24kD蛋白在胞内产生并在重组酵母细胞中积聚。在发酵结束时收获所述酵母细胞，然后在温和表面活性剂例如Tween 20存在下破碎细胞以释放所需蛋白。随后含有所述可溶性表面抗原颗粒的细胞匀浆经过一系列沉淀得到预纯化，然后通过超滤浓缩。
所述重组抗原的进一步纯化是在随后的层析分离中进行的。第一步，所述粗抗原浓缩液在Sepharose 4B介质上进行凝胶渗透层析。在所述4B凝胶渗透层析步骤中，在洗脱缓冲液中存在硫柳汞。所述洗脱缓冲液的组成如下10mM Tris，5％乙二醇，pH7.0，50mg/L硫柳汞。硫柳汞包含在这个缓冲液中来控制生物负荷。大部分的硫柳汞在随后的纯化步骤包括离子交换层析、超速离心和脱盐(凝胶渗透)中被清除，这样通过所述原先的方法制备的纯化主体抗原制剂每20μg蛋白含有约1.2μg硫柳汞并少于2μg硫柳汞。
用DEAE-基质进行离子交换层析，然后将这种混合液在预先制备的不同氯化铯浓度的4个液层上进行铯-梯度超速离心。所述抗原颗粒在所述梯度中根据它们的密度与污染细胞组分分离开来，并在所述离心工序结束时洗脱。然后通过在Sepharose凝胶上进行第二次凝胶渗透，从这种混合液中清除氯化铯。
当通过在所述4B凝胶渗透缓冲液中含有硫柳汞的方法制备HBsAg时，浓度超过30mg/ml的蛋白回收到来自CsCl梯度的混合的含HBsAg级分中，通过来自Abbott Laboratories的AUSZYME试剂盒来测定，相当于相等浓度的HBsAg。
所述CsCl超速离心步骤通常从所述HBsAg制剂中清除残余的脂类、DNA和少量蛋白污染物。它是通过在Beckman Instruments，Fullerton，Califomia的Ti 15转子中以转速30,000rpm区带离心进行约40-60小时。待纯化的样品加入到终浓度为0.75M、1.5M、2.5M和3.25M CsCl的多层CsCl溶液上。在离心结束时将所述梯度被洗脱成多个级分。含有HBsAg的级分可以通过在280nm的UV吸收或者通过AUSZYME试剂盒检测所述级分的稀释液来鉴别。所述HBsAg带是在密度1.17至1.23g/cm3之间。
所述含有纯化HBsAg的溶液在被用于制备疫苗制剂之前除菌过滤。
从所述酵母细胞裂解物中纯化如同所述抗原在胞内生产一样复杂，设计用于清除不同类型(酵母)污染物的一系列分离技术对于获得纯净的主体抗原是必要的。所述纯化步骤是重要的，因为待纯化的制品是包含多拷贝表面抗原多肽的脂蛋白颗粒，而且这个结构必须在整个纯化工序中得到保持。这个工序的特点是它生产出的表面抗原颗粒具有完整的免疫原性，而不需要另外的化学处理来加强免疫原性(对照EP0135435)。
所述生产方法的细节进一步描述于欧洲专利0199698中。实施例2用无硫柳汞方法生产酵母来源HBsAg以及所述HBsAg的表征1.酵母来源HBsAg的生产和纯化1.1生产工序概述乙型肝炎表面抗原可以通过酿酒酵母的一个适当菌株的发酵来生产，例如Harford等(在上述引文中)所描述的。
在所述重组酵母菌株大规模发酵结束时，收获细胞，并在温和表面活性剂例如Tween 20存在下破碎细胞。然后所述表面抗原通过多步骤的提取和纯化程序分离，所述程序严格按照上面实施例I中直到在Sepharose 4B上进行的第一次凝胶渗透步骤所描述的。1.2无硫柳汞纯化工序与实施例1中所描述的所述工序相比较，在无硫柳汞方法中引入了下列两个变化。
1.4B凝胶渗透层析步骤中的洗脱缓冲液不再含有硫柳汞。
2.加入半胱氨酸(终浓度2mM)到得自所述阴离子交换层析步骤的洗出混合液中。
已经发现从所述4B凝胶渗透缓冲液中去除硫柳汞会导致所述HBsAg颗粒在所述CsCl密度梯度离心步骤期间沉淀，从而造成制品损失和所回收抗原的聚合和凝集。
向得自前面的阴离子交换层析步骤的洗出混合液中加入终浓度为2mM的半胱氨酸，防止抗原在CsCl密度离心过程中沉淀和损失。
半胱氨酸是用于这种处理的优选物质，因为它是天然存在的氨基酸，而且可以在利用Sepharose 4BCLFF作为柱基质，在随后的凝胶渗透柱上进行的脱盐步骤中清除。
与实施例1中所描述的方法相比，在所述生产方法中没有其他的变化。
所述无硫柳汞方法生产具有与来自于实施例1中所述方法的抗原相当的纯度和特性的主体抗原。1.2a以50μg/ml加入到所述4B缓冲液中的所述硫柳汞被认为分解了，所形成的乙基汞可以共价连接到所述蛋白的半胱氨酸残基的游离巯基上。所述蛋白包含14个半胱氨酸残基，其中有7个位于101位和150位之间。
所述蛋白的这个区域相信位于所述颗粒的表面，包含HBsAg的主要抗原性区域，包括免疫显性a区域和RF1单克隆抗体的识别位点(Waters J等，Postgrad.Med.J.，198763(Supp1.2)51-56.和Ashton-Rickardt和Murray J.Med.Virology，198929196)。利用存在于所述4B凝胶渗透缓冲液中的硫柳汞纯化的抗原，在所述纯化工序结束时含有约0.5-0.6μg汞。这些汞通过简单的透析不能够完全去除。
在一个实验中，在主体抗原制剂中测量到0.56μg汞/20μg蛋白。将这种制剂在室温下150mM NaCl、10mM NaPO4pH6.9缓冲液中透析16个小时。在透析结束时，测量的浓度为0.33μg Hg/20μg蛋白。
相反，在还原剂例如0.1-5.0mg/ml的L-半胱氨酸、50mM的DTT或0.5M的2-巯基乙醇存在下透析，然后进行第二次透析以去除所述还原剂，导致所述抗原制剂中汞的含量减少到不到0.025μg汞/20μg蛋白。这是所述方法的检测最低限度。
通过吸收分光光度法测量所述汞含量。将所述抗原稀释于含有0.01％w/v重铬酸钾(K2Cr2O7)和5％v/v硝酸的溶液中。标准溶液利用硫柳汞作为汞源制备。在蒸汽发生器中汽化后，利用汞特异性阴极在253.7nm处测量样品和标准溶液的原子吸收。所述稀释液体的原子吸收作为空白测量。所述样品的汞含量通过从所述标准溶液中获得的校准曲线来计算。结果以μg汞/20μg蛋白表示。1.3无硫柳汞主体抗原的生产纯化主体抗原的工艺步骤显示于图1中。1.4不用硫柳汞制备的疫苗的组成在表1中提供了不含防腐剂并由所述无硫柳汞方法制备的抗原配制得来的乙型肝炎疫苗的标准定量组成。表1组分 用量/ml活性组分-蛋白质，其中至少95％是HBsAg 20μg氢氧化铝(吸附剂)(以Al2O3表示) 0.95mg氯化钠9.0mg(最大值)二水合磷酸氢二钠 0.98mg二水合磷酸二氢钠 0.71mg注射用水q.s.ad1.0ml所述组分可以通过加入3D-MPL和/或其他佐剂而有所变化。2.通过无硫柳汞方法生产的主体抗原和疫苗的的表征2.1纯化主体抗原的试验和测定2.1.1比较基础通过依照这个实施例(实施例1.2)的无硫柳汞方法制备3批主体抗原，并标记为HEF001、HEF002和HEF003。将这些主体抗原与通过先前的方法(实施例1中所描述的)在硫柳汞存在下制备的1批主体抗原(HEP2055)进行比较。2.1.2主体抗原的试验和测定检验通过无硫柳汞方法生产的所述3批主体抗原，所述结果总结于表2中。
通过Lowry等(J.Biol.Chem.1951193265)的方法测量蛋白含量。
利用来自Cape Cod Associates，704 Main St.，Falmouth，MA 02540，USA的市售试剂盒，通过鲎胶凝技术测量内毒素含量。将所述试剂根据US Pharm.Endotoxin Reference Standard标准化。
通过Huddleston和Allred(J.Amer.Oil Chemist Soc.，196542983)的方法测量Tween 20。
利用来自Abbott Laboratories，One Abbott Park Road，Abbott Park，IL 60064，USA的市售AusZYME试剂盒测量HBsAg含量。使用所述制备厂商的测定程序B。通过含有硫柳汞的方法纯化的一批主体抗原用作建立剂量反应曲线的标准。
通过Dubois等(Anal.Chem.195628350)的方法测量多糖。
利用来自E.Merck，B.P.4119，Darmstad D-6100，Germanny的市售试剂盒(Merkotest Total Lipids 3321)测量脂类。
利用来自Molecular Devices Corp.，Gutenbergstraβe 10，Ismaning，Munich，Germany的仪器和试剂，通过Threshold方法测量DNA含量。
在所述试验和测定中的实测值，除了通过ELISA检测的抗原活性外，都在利用琼脂糖4B凝胶渗透步骤的含硫柳汞洗脱缓冲液生产的主体抗原批料的观测范围之内。所述三批HEF制剂的这种测量值(1.63-2.25)高于主体抗原批料HEP2055的测量值，后者的ELISA/蛋白比率为1.13。通过AUSZYME试剂盒测量的含有硫柳汞的主体抗原批料的ELISA/蛋白比率通常为约1.0，并在0.8-1.2的范围之内，很少超过1.4。2.1.3SDS-PAGE凝胶分析通过在还原条件下的SDS-PAGE分析和考马斯蓝染色，分析所述主体抗原制剂。所有样品都显示出一条24K的主带以及痕量的二聚体蛋白。根据不存在污染蛋白的可见条带来评价，判定所述样品是高纯度的(纯度＞99％)。
通过在还原和非还原条件下的SDS-PAGE分析和银染，测定所述主体抗原制剂的样品(1μg)(图2)。在还原条件下，所述样品显示出迁移到24K的一条强带以及痕量的二聚体和多聚体形式。所述凝胶带型与作为对照品的HFP2055相比无法区分。所述样品同样在非还原条件下进行分离。在这些条件下很少物质迁移至24K处，而迁移到二聚体和多聚体位置上的多肽量增加了。与对照品HEP2055批料相比，所述各批无硫柳汞主体抗原显示出略高程度的聚合作用。
通过利用针对血浆HBsAg产生的兔多克隆抗体的蛋白质印迹分析证实了由考马斯蓝染色或银染所揭示的24K多肽的身份。所述主体抗原制剂显示出一条24K的主带以及二聚体和多聚体形式。所述技术显示出很少量的所述表面抗原蛋白的分解产物。在通过无硫柳汞方法制备的主体抗原和所述HEP2055批料之间没有差异。
通过在还原条件下的SDS-PAGE分析和利用针对酵母蛋白产生的兔多克隆抗血清的蛋白质印迹分析，测定残留酵母蛋白的存在(图3)。所述技术是定性的，而不能够对所述杂质定量。
在用无硫柳汞方法制备的所述3批主体抗原和HEP2055批料上显示出恒定的带型，但有一条带例外。
在HEP2055主体抗原的±23K处出现的一条强染色带实际上在所述3批HEF制剂中不存在。蛋白质印迹分析显示，所述无硫柳汞纯化方法产生更纯的抗原制品。表2纯化无硫柳汞主体抗原的检验和测定结果
2.1.4其他生化检验和测定2.1.4.1DNA含量通过Threshold法(Molecular Devices Corp)测量所述3批主体抗原的DNA含量。测量的量小于10pg DNA/20μg蛋白(表2)；这与通过目前已被批准的方法生产的主体抗原的DNA含量是同一水平。2.1.4.2氨基酸组成在用6N HCl酸水解后通过在离子交换柱氨基酸层析和柱后茚三酮检测，测定所述3批HEF主体抗原的氨基酸组成。没有测定脯氨酸和色氨酸。所述结果在表3中给出。
所测定的组成与在HEP2055中测定的组成和来自DNA序列的预测组成很好吻合。虽然测量HEP2055得到的甘氨酸残基数量接近于所述预测组成，但更通常测量到主体抗原制剂的值为16至17个残基。实测的半胱氨酸残基的平均数是预测的14，这表明在CsCl梯度步骤中的处理没有造成额外的半胱氨酸结合到所述颗粒上。2.1.4.3游离半胱氨酸的定量利用过甲酸氧化所述颗粒而不用先前的酸水解，来测量依照所述方法获得的主体抗原制剂中存在的游离半胱氨酸的数量。在离子交换柱上分离氧化的游离半胱氨酸，并且柱后用茚三酮检测。通过这个方法测定半胱氨酸的极限是1μg/ml。
当以在表2中给出的原始蛋白浓度进行测定时，在所述3批HEF抗原制剂中测量不到游离半胱氨酸。
所述技术测量存在于所述缓冲液中的游离半胱氨酸残基和通过二硫键结合到HBsAg蛋白上但不构成所述多肽序列一部分的半胱氨酸残基。2.1.4.4N-末端序列分析通过所述改良方法生产的3批主体抗原中的可能蛋白污染物和降解产物的存在，通过以Edman降解为基础的N-末端序列分析来评价。检测到所述HBsAg蛋白的N-末端序列MENITS，而没有其他序列的干扰。正如在通过常规方法生产的HBsAg多肽中所观测到的一样，也证实了所述N-末端甲硫氨酸有60-75％通过乙酰化被封闭。表3HBsAg的氨基酸组成
2.1.4.5激光散射分析通过激光散射，比较利用所述改良方法生产的所述HBsAg颗粒和HEP2055参照批料之间的粒径大小(表4)。
测定的平均分子量显示所述制剂之间良好的一致性。表4通过激光散射测定的HBsAg颗粒分子量抗原批号MW(道尔顿)HEF001 3.07×106HEF002 2.76×106HEF003 2.76×106HEP2055 3.34×1062.1.4.6电镜检查在固定和用醋酸双氧铀染色后，通过电子显微镜检查所述主体抗原制剂。
在所有所述样品中观察到的颗粒是相似的，并符合HBsAg典型的±20nm近球形或鹅卵石样的颗粒。在所述3批HEF中观察到的颗粒与在HEP2055中观察到的无法区分。2.1.5免疫分析2.1.5.1对RF1单克隆抗体的反应性通过ELISA抑制测定法，测试所述3批主体抗原制剂对RF1单克隆抗体的反应性。已经表明，RF1单克隆抗体保护黑猩猩免受HBV的攻击，并认为它识别HBsAg颗粒上的保护性构象表位(Iwarson S等，1985，J.Med，Virol.，1689-96)。
RF1杂交瘤可以在BalbC小鼠的腹膜腔内或在组织培养中繁殖。
以1/50000稀释于饱和缓冲液(含有1％BSA和0.1％Tween 20的PBS)中的腹水与待测HBsAg样品于PBS中的各种稀释液(终浓度的范围在100μg和0.05μg/ml之间)以1∶1混合。
混合物在Nunc Immunoplates(96U)上37℃保温1hr，然后转移到标准HBsAg制剂包被的板上37℃保温1hr。所述标准HBsAg制剂是一批通过含硫柳汞方法纯化的主体抗原(Hep 286)。用含有0.1％Tween20的PBS洗涤后，加入以1/1000稀释到饱和缓冲液中的生物素缀合绵羊抗小鼠IgG，然后在37℃保温1hr。洗涤后，在相同的孔中加入以1/1000稀释到饱和缓冲液中的链霉抗生物素蛋白-生物素酰化过氧化物酶复合物，然后在37℃保温30分钟。洗板后，与在0.1M柠檬酸缓冲液pH4.5中含有OPDA 0.04％、H2O20.03％的溶液一起在室温下保温20分钟。用2N H2SO4终止所述反应，在490/630nm处测量光密度(O.D.)，然后作图。
IC50定义为抑制50％所述抗体结合到包被的HBsAg上的抗原浓度(抑制剂浓度)，利用4参数方程计算IC50并以ng/ml表示。
也测试包括HEP2055的一系列HEP抗原批料，并以单纯疱疹gD抗原作为阴性对照。所述测定法测量每一种试验抗原抑制RF1与已结合到微量滴定板上的标准抗原制剂(HEP286)结合的能力。
表5给出了抑制50％的RF1结合所述固定抗原的每种抗原浓度。表5RF1单克隆抗体结合HBsAg的抑制主体抗原IC50(ng/ml)*HEP2863834HEP6733437HEP7203150HEP2055 2384HEF001468HEF002574HEF003540*IC50＝抑制50％RF1结合所述固定抗原的抗原浓度(ng/ml)所述结果显示，抑制RF1结合所需的HEF抗原减至四分之一至七分之一(表5)。这表明通过所述改良方法制备的所述抗原与HEP主体抗原相比增加了所述RF1表位的呈递。
利用来自Engerix BTM疫苗接种者的人血清替代所述RF1 mAb进行同类型的抑制测定，在所述各批HEP抗原和所述HEF抗原之间没有显示出差异。2.1.5.2结合单克隆RF1的亲和力利用来自Amersham Pharmacia Biotech，Amersham Place，LittleChalfont，Bucks，UK的Biacore 2000仪器，通过表面等离子体激元共振来测量RF1单克隆抗体结合所述3批HEF抗原和HEP2055的动力学参数。
测量的动力学参数是ka缔合速率常数(M-1S-1)kd解离速率常数(S-1)Ka平衡常数或亲合常数M-1)其中Ka=kakd]]>得出的值在表6中给出。表6RF1结合HBsAg的亲合常数主体抗原ka kd Ka(×10-3)(×105) (×10-7)HEF001 6.81 3.21 21.97HEF002 6.89 3.73 18.83HEF003 7.39 4.67 15.80HEP2055 3.31 6.30 5.31所述3批HEF抗原具有相似的缔合/解离常数和结合亲和力值。相反，HEP2055具有更弱的结合RF1的亲和力。
这与显示出通过无硫柳汞方法制备的抗原增加了所述RF1表位的呈现的ELISA抑制测定的结果相一致。2.2.用通过所述改良方法生产的抗原配制的疫苗的检验和测定将所述3批HEF抗原吸附到氢氧化铝上，然后按照表1中显示的组成配制成为疫苗。所述表述是小瓶中的成人剂量(1ml中含有20μg抗原蛋白)。所述批号确定为DENS001A4、DENS002A4和DENS003A4。
利用Abbott Laboratories AUSZYME ELISA试剂盒并以利用50μg/ml硫柳汞配制的一批传统疫苗作为标准，通过体外抗原含量测定法测量疫苗效力。利用在PharmaEuropa Special Issue Bio97-2(December1997)中所描述的方法B测量抗原效力。所述3批HEF有高的抗原含量值，接近于规定含量20μg抗原蛋白的两倍。2.2.1DENS疫苗对RF1单克隆抗体的反应性利用RF1单克隆抗体在抑制测定中进一步测试所述吸附疫苗的抗原性。所述测定法测量所述疫苗样品抑制RF1结合固定主体抗原(HEP286)的能力。
以1/50000稀释于饱和缓冲液(含有1％BSA和0.1％Tween 20的PBS)中的腹水与待测疫苗样品在PBS的各种稀释液(浓度范围在20μg和0.05μg/ml之间)以1∶1混合。
混合物在Nunc Immunoplates(96U)上37℃振荡保温2hr，然后转移到HBsAg包被的板上。用于包被的所述HBsAg制剂是通过含硫柳汞方法纯化的一批主体抗原(Hep286)。然后这些板在37℃振荡保温2hr。用含有0.1％Tween 20的PBS洗涤后，加入以1/1000稀释到饱和缓冲液中的生物素缀合绵羊抗小鼠IgG，然后在37℃保温1hr。洗涤后，在所述各孔中加入以1/1000稀释到饱和缓冲液中的链霉抗生物素蛋白-生物素酰化过氧化物酶复合物，然后在37℃保温30分钟。洗板后，与在0.1M柠檬酸缓冲液pH4.5中含有OPDA 0.04％、H2O20.03％的溶液一起在室温下保温20分钟。用2N H2SO4终止所述反应，在490/630nm处测量光密度(O.D.)，然后作图。
IC50定义为抑制50％所述抗体结合到包被的HBsAg上的抗原浓度(抑制剂浓度)，利用4参数方程计算IC50并以ng/ml表示。
从通过所述改良方法生产的主体抗原制备得来的疫苗与从传统HEP主体抗原配制得来的不用硫柳汞作为防腐剂的Engerix BTM疫苗相比较。
所述测定以3次重复测定进行。
所述结果在表7中给出，它显示出与不含防腐剂的Engerix BTM疫苗相比较，需要大约一半量的DENS疫苗即可获得对RF1结合50％的抑制。这反映出HEF/DENS抗原上面所述RF1表位的呈递增加了，这与利用RF1抗体对所述纯化主体抗原进行的试验是一致的。表7配制的疫苗对RF1结合的抑制
(1)抑制50％的RF1抗体结合固定抗原的疫苗浓度2.2.2DENS疫苗在小鼠中的免疫原性在Balb/C小鼠中进行了一项研究，以比较所述三批一致性DENS(DENS consistency lots)与依照目前抗原生产方法生产的并用硫柳汞配制的Engerix BTM之间的免疫原性。
测试下列批料#DENS001A4
#DENS002A4#DENS003A4#ENG2953A4/Q作为参照简要地讲，以对应于成人剂量的1/10(2μg)或1/50(0.4μg)的疫苗剂量，以2周间隔肌肉免疫12只一组的小鼠两次。通过从在第28天抽取的血清，监测由接种引起的针对HBsAg的抗体应答和同种型分布型。实验设计12只一组的Balb/C小鼠在0天和第15天双腿肌肉免疫(2×50μl)，疫苗剂量如下表8组别和疫苗剂量
在第15天(I后2周)和第28天(II后2周)从眶后窦取血。
对于这个实验的设计(4种制剂×2倍剂量，每组12只小鼠)，利用PASS统计程序先验性地测量所述效能。所述PASS(效能和样本大小(Power and Sample Size))统计程序由NCSS，329 North 1000 East，Kaysville，Utah 84037获得。对于所述2因素方差分析，制剂之间具有5％α误差的GMT的2.5倍差异应该以效能＞90％检测到。结果血清学利用HBsAg(Hep286)作为包被抗原和用生物素缀合抗小鼠抗体来显示抗HBs抗体结合，通过ELISA测定法测量体液应答(总Ig和同种型)。只分析II后2周的血清。
表9显示在II后2周测量各个血清的平均和GMT抗-HBsIg抗体应答。
由DENS和传统乙型肝炎制剂诱发相当的抗体应答在2μg剂量下，与SB Biologicals乙型肝炎单价疫苗(Engerix BTM)的GMT为2882EU/ml相比，所述DENS各批GMT的范围在2304和3976EU/ml之间；在0.4μg剂量下，与SB Biologicals乙型肝炎单价疫苗(Engerix BTM)的GMT为627EU/ml相比，所述DENS各批GMT的范围在696和1182EU/ml之间。
●正如所预期的，在2μg和0.4μg剂量的所有制剂中观察到明显的抗原剂量范围效应，在GMTs上有3至6倍的差异。
●观察到4只无应答小鼠(效价＜50EU/ml)，与所述抗原剂量或注射所用的批号没有明显的联系(1、2、3和8组；每组一只小鼠)。根据统计分析(Grubbs测试)，在进一步的分析中放弃这些小鼠。表9第28天在小鼠中的抗体应答应答(第二次接种后II后2周)
统计分析在对II后数据进行对数转换后，利用所述疫苗(4批)和抗原剂量(2μg和0.4μg)作为因素，对所述抗HBs效价进行双因素方差分析。这个分析确认了在所述两个抗原剂量之间观察到了统计学上的显著性差异(p值＜0.001)，而在所述各批疫苗之间没有显示出任何显著性差异(p值＝0.2674)。如前面所提到的，是先验估计所述效能，所述实验设计使得在效能＞90％下，可以检测到制剂之间具有GMT2.5倍差异和5％α误差。同种型分布表10显示了从对II后混合血清的分析中计算得来的同种型重新分配(IgG1、IgG2a和IgG2b)。
●正如所预期的，由这些基于明矾的疫苗诱发了明显的TH2反应，因为观察到主要是IgG1抗体。
没有观察到各批DENS或SB Biologicals乙型肝炎单价疫苗之间在同种型分布上的任何差异。表10在28天混合血清中IgG同种型的重新分配
实施例3联合疫苗的配制本发明所述主体抗原尤其适合于配制成为含有IPV的联合疫苗。
当利用体外免疫测定(通过ELISA测量D-抗原含量)和体内大鼠效力试验，对联合DTPa-HBV-IPV疫苗的初始批次进行的稳定性研究，显示出所述IPV组分、详细地讲是1型脊髓灰质炎抗原效力下降。对于3型没有观察到效力损失。对于2型，效力损失在预期的范围之内(保存每一年的损失不超过10％)。
已经开始了研究以确定在所述DTPa-HBV-IPV联合疫苗中的这种效力损失的原因。通过观察，SB Biologicals DTPa-IPV疫苗中IPV的稳定性是令人满意地(保存每一年抗原含量损失不超过10％)，结论是所述HBV组分可能导致所述DTPa-HBV-IPV疫苗中IPV的不稳定性。
用于所述初始DTPa-HBV-IPV制剂中的所述HBV组分是同样用于制备SB Biologicals乙型肝炎单价疫苗并如实施例1中所述制备的所述纯化r-DNA，酵母来源HBsAg。
分析所述主体HBsAg中硫柳汞的存在，作为确定所述HBV组分中哪一种成分对IPV有害的第一个尝试。先前已经发现(Davisson等，1956，J.Lab.Clin.Med 478-19)，在DTP疫苗中用作防腐剂的硫柳汞在DTP-IPV联合疫苗中“对脊髓灰质炎病毒是有害的”。疫苗制备商考虑了这一观测结果，他们已经用其他防腐剂替代硫柳汞来配制他们的含IPV疫苗。最近，重新调查硫柳汞在4℃长期保存条件下对IPV效力的所述作用。报告了4-6个月后1型脊髓灰质炎病毒抗原的效力损失到无法检测的水平(Sawyer，L.A.等.1994，Vaccine 12851-856)。
利用原子吸收光谱学，在依照实施例1的纯化抗原中检测到约0.5μg汞(Hg)/20μg HBsAg。
这个数量的汞(作为硫柳汞、乙基氯化汞和所述硫柳汞降解产物)可以减小到针对于37℃保温7天的IPV主体浓缩物中1型D-抗原含量的ELISA反应无法检测的水平。
建立了一种方法来释放所述主体HBsAg中存在的汞。假定汞可以结合到所述HBsAg颗粒的巯基上，因而在还原剂存在下可以被释放。用其他还原剂进行实验后，选择L-半胱氨酸作为从所述HBsAg颗粒中释放汞的试剂。主体HBsAg在含有5.7mM L-半胱氨酸的盐溶液中透析后，在所述保留液中检测不到汞(所述测试方法的检测极限25ngHg/20μg HBsAg)。所述透析后抗原与IPV批料浓缩物混合，然后通过在37℃保温7天测量所述D-抗原含量来评估所述1型病毒的稳定性。未混合的IPV主体浓缩物和与未用半胱氨酸处理的HBsAg混合的IPV主体浓缩物用作对照。用在2℃至8℃保存7天的所述样品获得所述参考ELISA效价。
所述结果总结于表11表11
(1)以D-抗原单位(DU)表示从这些实验室制剂中获得的所述数据清楚地证明，如果HBsAg在与IPV混合之前用半胱氨酸处理以去除残留的汞，可以显著增强1型脊髓灰质炎病毒的稳定性。
上面所示的数据同样表明，所述参比IPV制剂在37℃保温7天后D-抗原含量损失23％。如先前所报道的，这证实了所述1型Mahoney脊髓灰质炎病毒的固有不稳定性(Sawyer，L.A.等(1994)，Vaccine 12851-856)。
虽然市售批次的DTPa-HBV-IPV和DTPa-HBV-IPV/Hib疫苗已经利用使用5.7mM L-半胱氨酸去除残留汞从而保护IPV稳定性的透析方法来制备，但所述透析方法不适合于大规模生产，并且它涉及一系列的辅助性步骤来制备不含硫柳汞或汞的HBsAg。相反，本发明所述不用硫柳汞制备的HBsAg可以直接用于联合疫苗的配制，特别是那些含有IPV的联合疫苗的配制。4.总结前面所用的纯化酵母来源表面抗原的方法包括一个凝胶渗透步骤，其中含汞的抗微生物化合物硫柳汞包含在所述洗脱缓冲液中以控制生物负荷量。
在所述方法的后续步骤中所述硫柳汞未被完全清除，从而在所述纯化主体抗原中存在约1.2μg硫柳汞/20μg蛋白。
为了生产完全不含硫柳汞(汞)的主体抗原，所述纯化方法在两个步骤上进行了改变。
●在所述4B凝胶渗透步骤中从所述洗脱缓冲液中去除硫柳汞。
●向得自所述阴离子交换层析步骤的所述洗出混合液中加入半胱氨酸(终浓度2mM)。这防止了在CsCl密度梯度离心过程中抗原的沉淀。
所述生产方法没有其他的变化。
已经对通过所述改良方法生产的主体抗原进行了表征。物理化学试验和测定显示，所述不含硫柳汞抗原在它们的特性上与通过所述先前使用的方法生产的抗原无法区分。所述抗原颗粒具有同样的成分。
通过SDS-PAGE分析、利用多克隆抗HBsAg抗体的蛋白质印迹分析、N-末端序列分析和氨基酸组成判断，所述HBsAg多肽的身份和完整性未受所述改良方法的影响。电子显微镜和激光散射分析显示，所述颗粒具有预期的酵母来源HBsAg的典型形状和大小。利用抗酵母蛋白血清的蛋白质印迹分析的分析显示，通过所述不含硫柳汞方法生产的所述抗原具有污染酵母蛋白的相似模式。然而，迁移至23K处的污染条带的数量在利用所述改良方法生产的所述3批HBsAg中大大减少了。
免疫分析显示，所述不含硫柳汞颗粒具有增强的抗原性。所述颗粒对Abbott AUSZYME试剂盒(包含单克隆抗体的混合物)具有更强的反应性，ELISA/蛋白比率为1.6至2.25。利用所述保护性RF1单克隆抗体也显示出这种增强的抗原性。抑制RF1结合到标准固定抗原所需的不含硫柳汞抗原减至四分之一至七分之一。所述不含硫柳汞抗原和传统抗原的结合抑制曲线属于两个截然不同的曲线类中。利用表面钙等离子体激元共振对RF1的结合亲合常数进行的测量，也显示出这种差异。所述不含硫柳汞制剂的结合亲和力是所述批次的标准主体抗原的3-4倍。
所述主体抗原制剂通过吸附在氢氧化铝上且不用防腐剂配制成疫苗。
利用Abbott AUSZYME ELISA试剂盒和含硫柳汞SB Biologicals乙型肝炎单价疫苗作为标准品进行的体外效力测试显示，获得了高的体外效力值。通过这个试验测量的所述抗原含量接近于所述规定值20μg蛋白/ml的两倍。
在利用RF1单克隆抗体结合固定抗原的抑制测定中，同样见到从不含硫柳汞抗原制备的疫苗的增强反应性。与通过所述先前所用方法纯化并不用防腐剂配制的抗原相比，50％抑制RF1结合固定抗原需要约一半量的不含硫柳汞疫苗。
所述不含硫柳汞疫苗对于RF1的这种增强抗原性与从所述体和在所述主体抗原制剂上进行的外效力试验(抗原含量)和RF1抗体试验获得的结果相一致。
利用间隔2周的激活接种(priming vaccination)和加强接种以及2μg和0.4μg抗原的剂量进行小鼠免疫原性试验。在第28天、加强接种后14天从小鼠取血。分析所述血清的抗体效价和同种型组成。对于所述两个给药剂量观察到明显的抗原剂量效应，但不含硫柳汞疫苗和不含防腐剂疫苗之间在抗体效价(GMT)方面的应答中没有统计学上的显著差异。
在所述同种型分布上没有观察到实质性差异。
权利要求
1.一种用于生产适用于疫苗的乙型肝炎抗原的方法，所述方法包括在具有游离-SH基团的还原剂存在下纯化所述抗原。
2.一种依照权利要求1的方法，其中所述乙型肝炎抗原是无硫柳汞痕迹的稳定免疫原性抗原。
3.一种依照权利要求1或权利要求2的方法，其中所述纯化抗原制品每20μg蛋白含有少于0.025μg的汞。
4.一种依照权利要求1至权利要求3中任一项的方法，其中所述纯化抗原制品不含硫柳汞。
5.一种依照权利要求1的生产乙型肝炎抗原的方法，其中粗制乙型肝炎抗原制剂(a)经过凝胶渗透层析；(b)经过离子交换层析；和(c)与具有游离-SH基团的还原剂混合。
6.一种依照前面任一项权利要求的方法，其中所述还原剂是半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。
7.一种依照权利要求6的方法，其中所述还原剂是半胱氨酸。
8.一种依照权利要求7的方法，其中所述半胱氨酸加入至终浓度在1-10mM之间。
9.一种依照权利要求8的方法，其中所述半胱氨酸加入至终浓度约2mM。
10.一种依照前面任一项权利要求的方法，其中所述抗原是在用所述还原剂处理之前在硫柳汞存在下纯化的。
11.一种依照权利要求1至权利要求10中任一项的方法可获得的免疫原性乙型肝炎抗原。
12.一种依照权利要求11的免疫原性乙型肝炎抗原，其中所述抗原的免疫原性和抗原性至少与在硫柳汞存在下生产的乙型肝炎抗原的一样。
13.一种依照权利要求11或权利要求12的免疫原性乙型肝炎抗原，其平均ELISA蛋白比率超过1.5，而且其RF1含量的IC50值至少降低至在硫柳汞存在下生产的所述乙型肝炎表面抗原的三分之一。
14.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含权利要求11-13中所要求保护的乙型肝炎抗原。
15.一种依照权利要求14的疫苗组合物，所述疫苗组合物与一种佐剂结合。
16.一种依照权利要求15的疫苗组合物，其中所述佐剂是铝盐。
17.一种权利要求15或权利要求16中所要求保护的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含TH-1诱导佐剂。
18.一种依照权利要求17的疫苗组合物，其中所述TH1诱导佐剂选自由以下组成的组3-DMPL、QS21、3-DMPL和QS21以及CpG寡核苷酸。
19.一种权利要求14至权利要求18中任一项所要求保护的疫苗组合物，所述疫苗组合物还含有选自以下的一种或多种抗原白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、无细胞百日咳抗原(Pa)、灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)、流感嗜血菌(haemophilus influenzae)抗原(Hib)、甲型肝炎抗原、单纯疱疹病毒(HSV)、衣原体、GSB、HPV、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)和奈瑟氏菌抗原。
20.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含乙型肝炎抗原和半胱氨酸溶液。
21.一种依照前面权利要求中任一项的方法、抗原或疫苗，其中所述乙型肝炎抗原是表面抗原。
全文摘要
本发明涉及生产适用于疫苗的乙型肝炎抗原的一种方法，所述方法包括在半胱氨酸存在下纯化所述抗原，涉及包含这类抗原的疫苗。
文档编号C07K1/14GK1468256SQ01816998
公开日2004年1月14日 申请日期2001年8月7日 优先权日2000年8月10日
发明者K·德海德, P·舒, M·赛兰托尼, O·范奥普斯特尔, K 德海德, 纪心, 缕账固囟 申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司