专利名称：敬钊缨毛蛛毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蜘蛛毒素，具体涉及一种敬钊缨毛蛛毒素。
上述发明目的是通过以下方案实现的敬钊缨毛蛛毒素-I(英文名jinzhaotoxin-I，JZTX-I)的氨基酸序列为Ala Cys Gly Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Gln Gly Lys5 10Pro Pro Cys Cys Ala Asn Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys15 20 25Ile Trp Ser Pro。30 33下面结合附图对本研究作进一步的详细说明。
蜘蛛毒素采集方法的意义蜘蛛由于个体小含毒量少，其毒液采集很困难。传统采毒方法往往是把毒囊直接从活体蜘蛛上离体，将其匀浆或在毒囊上扎孔后用水溶解来收集所含毒液。这种方法存在明显的不足，整个过程不但十分烦琐得到毒素的产率不高，而且这样得到的产物不仅仅只是蜘蛛在天然状况下分泌的毒液，还含有大量的成熟毒素前体蛋白以及非毒素成分，会给其中单一毒素组分的分离纯化带来诸多不便，更主要的是收集完毒素后活体蜘蛛也会死掉，造成资源的大量浪费。本采集蜘蛛毒液方法不但很好地解决了上述困难，采毒过程中活体蜘蛛不会致死，可继续进行人工饲养，能多次采毒利用。
2、敬钊缨毛蛛毒素-I的分离纯化方法根据蛋白质带电荷的性质和蛋白质的疏水性进行二次分离。结合阳离子交换和反相HPLC色谱法。将5毫克上述粗毒溶于6毫升双蒸水中，上样到事先用0.2摩尔/升磷酸一氢钠和磷酸二氢钠(pH6.25)平衡好的Waters Protein-Pak CM 8HR阳离子交换柱(5×50毫米)中，用0％-90％氯化钠梯度洗脱，时间为80分钟，流速3毫升/分钟。在280nm紫外波长检测下共得到9个吸收峰。收集第6个峰并脱盐处理后进一步反相HPLC纯化。C18反相分析柱经0％-50％乙腈(含0.1％三氟乙酸)溶液梯度洗脱，时间为40分钟，流速为0.7毫升/分钟。在280nm紫外波长检测下共得到6个吸收峰。收集第5个峰后在相同条件下进行第二次反相HPLC，得到单一目的峰(
图1)，质谱仪检测为单一组分并测得其准确分子量为3675.64(图2)。
敬钊缨毛蛛毒素-I经491-A测序仪得到其氨基酸序列，由33个氨基酸残基组成，含有6个半胱氨酸。其按顺序分析结果计算得出的理论分子量为3675与质谱仪所测分子量完全吻合，证明序列的正确性，并经部分还原修饰结合酶解法确证6个半胱氨酸是以3对二硫键的形式存在(图3)。该毒素的物理化学性质为纯化冻干粉为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色澄明。该蛋白质的最大紫外吸收波长为280nm，等电点(pI)为8.34，略偏碱性。
为了更好地说明和揭示该毒素分子的作用，我们在器官水平和分子水平来阐述敬钊缨毛蛛毒素-I的毒理机制。
敬钊缨毛蛛毒素-I对动物离体器官的影响试验1、主要材料及仪器敬钊缨毛蛛毒素-I按上述方法从海南敬钊缨毛蜘蛛粗毒中分离得到，同时通过HPLC和MALDI TOF质谱仪鉴定了其纯度为99％以上；试验小鼠(昆明小白鼠)由本实验室饲养提供，15-20克重；蟾蜍在本地市场上购得，50-60克重；电刺激器采用国产品(教学多用电子刺激器，型号为DOC-III)RM6240B生物信号记录系统采用国产品。2、试验结果2.1、对小鼠膈神经膈肌的影响小鼠膈神经膈肌按常规方法进行分离剥制。分离后的标本在持续充95％氧气的台氏浴液静置10分钟后，给予电刺激诱导膈肌的收缩，空白对照为一个小时内无明显衰减。刺激神经加10-5克/升蛛毒后，5min后膈肌的收缩强度增加了200％。另一组标本，刺激神经引起肌肉兴奋后先用15微摩尔/升D-筒箭毒阻断膈肌收缩，再直接用电刺激膈肌引起收缩，加相同浓度的蛛毒后，10min内肌肉兴奋强度增加了150％(图4)。电刺激强度4.5V、波宽0.2ms、频率15次/分。2、对蟾蜍心脏的影响蟾蜍离体蛙心均按常规方法进行分离剥制。离体不带神经的蛙心在空白对照的情况下能产生节律性的自我搏动。加入10-5克/升蛛毒后1min内即可观察到蛙心收缩的强度增强，并且收缩的频率增加(图5)。
综上所述试验结果表明敬钊缨毛蛛毒素-I是一种新型的兴奋性蜘蛛毒素，对神经、肌肉、心脏均具有敏感性。
敬钊缨毛蛛毒素-I对钠离子通道作用的分析试验主要材料及仪器敬钊缨毛蛛毒素-I按上述方法从海南敬钊缨毛蜘蛛粗毒中分离得到，同时通过HPLC和MALDITOF质谱仪鉴定了其纯度为99％以上；试验大鼠本室饲养提供爪蟾本室饲养提供所有试剂均购自于Sigma公司；膜片钳放大器德国HEKA公司EPC9；电压钳放大器美国AXON公司GeneClamp500B。
2、试验方法及结果钠离子通道在不同的组织器官上共有9不同的亚型，根据能否被河豚毒素(TTX)阻断被分成两大类TTX敏感型钠通道和TTX不敏感型钠通道。两者在电压依从性激活与电流特征存在明显差异在静息电位水平，TTX敏感型钠通道的激活阈值要低于TTX不敏感型钠通道；TTX敏感型钠通道激活后产生的电流在2ms内完全失活，而TTX不敏感型钠通道电流在10ms内也不会完全失活。
在大鼠背根神经节细胞上有三种电压敏感型钠通道(Nav1.7，Nav1.8和Nav1.9)，第一种为TTX敏感型钠通道，而第二和第三种均为TTX不敏感型钠通道。实验表明，在1μM的浓度下，敬钊缨毛蛛毒素-I对TTX不敏感型钠通道无明显影响，不抑制TTX敏感型钠电流大小，但能延缓其失活时间，延缓电流的幅度占总电流大小的34±4％，有效半数影响浓度为0.995±0.020μM(图6)。
Nav1.5是分布于心脏、骨骼肌肉细胞膜上的一TTX不敏感型钠通道亚型，不能被低浓度的TTX阻断。敬钊缨毛蛛毒素-I对此钠通道的影响方式类似于对神经细胞膜钠通道的影响，但敏感程度要高。在0.167μM的浓度下，敬钊缨毛蛛毒素-I能延缓钠电流25±3％失活，不抑制钠电流的大小，其有效半数影响浓度为0.300±0.002μM(图7)。
上述试验结果表明敬钊缨毛蛛毒素-I不抑制敏感型钠电流大小，但能延缓钠电流失活时间，是一种专一性延缓钠电流失活时间的毒素。
敬钊缨毛蛛毒素-I的氨基酸序列如下Ala Cys Gly Gln Phe5Trp Trp Lys Cys Gly Gln Gly Lys Pro Pro Cys Cys Ala Asn Phe10 15 20Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile Trp Ser Pro。
25 30 3权利要求
1.一种敬钊缨毛蛛毒素，其特征在于从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化的敬钊缨毛蛛毒素-I，该毒素的氨基酸序列如下Ala Cys Gly Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Gln Gly Lys Pro Pro5 10 15Cys Cys Ala Asn Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile20 25 30Trp Ser Pro。3全文摘要
本发明涉及一种敬钊缨毛蛛毒素。从敬钊缨毛蛛粗毒中分离获得的敬钊缨毛蛛毒素－I(JZTX－I)是蜘蛛肽类分子，它由33个氨基酸残基组成，其中有6个半胱氨酸，是以3对二硫键形成存在，分子量为3675.64。JZTX－I毒素的提取，先用软管束诱物进行活体采毒，粗毒经阳离子交换和反相HPLC色谱法进行二次分离；JZTX－I毒素经器官水平和分子水平的试验，表明该毒素是一种兴奋性蜘蛛毒素，对神经、肌肉、心脏均具有敏感性；对钠离子通道作用上，不抑制敏感型钠电流大小，但能延缓钠电流失活时间，是一种专一性的延缓钠电流失活时间的毒素。
文档编号C07K14/535GK1473851SQ03124718
公开日2004年2月11日 申请日期2003年8月6日 优先权日2003年8月6日
发明者梁宋平, 肖玉成, 谢锦云 申请人:湖南师范大学