支化聚合物糖及其核苷酸的制作方法

专利名称：支化聚合物糖及其核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明属于改性糖及其核苷酸的领域。
背景技术：
肽的表达后的体外改性是补救那些依赖于由工程化表达系统控制糖基化的方法的缺陷的有吸收力的策略；包括聚糖结构的改性或聚糖在新部位的引入两者。可利用重组体真核糖基转移酶的综合工具箱，使得具有通常设计的糖基化模式和糖基结构的哺乳动物复合糖的体外酶合成成为可能。参见，例如美国专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；和WO/9831826；US2003180835；和WO 03/031464。
基于酶的合成的优点是区域选择性和立体选择性。此外，酶合成使用未受保护的底物进行。三种主要类型的酶用于合成碳水化合物，糖基转移酶(如，唾液酸转移酶，寡糖基转移酶，N-乙酰葡糖氨基转移酶)，和糖苷酶。糖苷酶进一步分类为外切糖苷酶(如，β-甘露糖苷酶，β-葡糖苷酶)，和内切糖苷酶(如，Endo-A，Endo-M)。这些类别的酶的每一种成功地在合成上用于制备碳水化合物。作为一般性综述，参见Crout等人，Curr.Opin.Chem.Biol.298-111(1998)。
糖基转移酶改性糖肽上的低聚糖结构。糖基转移酶对于产生具有良好立体化学和区域化学控制的特定产物是有效的。糖基转移酶已用于制备低聚糖和改性末端N-和O-连接的碳水化合物结构，特别是在哺乳动物细胞中产生的糖肽上。例如，将糖肽的末端低聚糖完全唾液酸化和/或岩藻糖基化以提供更一致的糖结构，它改进糖肽药代动力学和各种其它生物性能。例如，β-1，4-半乳糖转移酶用于合成乳糖胺，糖基转移酶在合成碳水化合物中的功用的说明(参见，如Wong等人，J；Org Chem.475416-5418(1982))。此外，许多合成过程使用唾液酸转移酶以从胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸转移唾液酸到半乳糖的3-OH或6-OH(参见，如Kevin等人，Chem.Eur.J.21359-1362(1996))。岩藻糖基转移酶用于从鸟苷-5′-二磷酸岩藻糖转移岩藻糖单元到糖受体的特定羟基的合成途径。例如，Ichikawa由涉及用克隆的岩藻糖基转移酶的唾液酸化乳糖胺的岩藻糖基化的方法制备唾液酸基Lewis-X(Ichikawa等人，J.Am.chem.Soc.1149283-9298(1992))。对于治疗用途的复合糖合成中的最新进展的讨论，参见Koeller等人，Nature Biotechnology 18835-841(2000)。也参见美国专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；和WO/98 31826。
除调节多肽上糖基基团的结构以外，兴趣已经着眼于制备糖肽，该糖肽被一个或多个非糖改性基团(如水溶性聚合物)改性。聚(乙二醇)(″PEG″)是结合到多肽的例示的聚合物。用于衍生肽治疗剂的PEG的使用显示了降低肽的免疫原性。例如，美国专利号4,179,337(Davis等人)公开了非致免疫多肽，如结合到聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇的酶和肽类激素。每摩尔多肽使用10-100摩尔聚合物。尽管结合物的体内清除时间相对于多肽的清除时间被延长，但是仅保持约15％生理活性。因此，延长的循环半衰期被肽效力的急剧降低抵销。
肽活性的损失可直接归因于用于结合水溶性聚合物的化学的非选择性本质。连接PEG(和它的衍生物)到肽的主要模式是通过肽氨基酸残基的非特异键合。例如，美国专利号4,088,538公开了共价结合到PEG的酶的酶活性聚合物-酶结合物。相似地，美国专利号4,496,689公开了α-1蛋白酶抑制因子与聚合物(如PEG)的共价连接复合物。Abuchowski等人(J.Biol.Chem.2523578(1977)公开了MPEG到牛血清白蛋白的胺基团的共价连接。美国专利号4,414,147公开了通过将干扰素连接到二羧酸的酸酐(如聚(乙烯琥珀酸酐))而使干扰素减少疏水性的方法。PCT WO87/00056公开了PEG和聚(氧乙基化)多元醇对例如蛋白质(如干扰素-β、白细胞介素-2和免疫毒素)的结合。EP 154,316公开和要求保护化学改性的淋巴因子，如包含直接键合到淋巴素至少一个伯氨基的PEG的IL-2。美国专利号4,055,635公开了共价连接到聚合物物质(如多糖)的蛋白水解酶的水溶性复合物的药物组合物。
连接PEG到肽的另一种模式是通过糖肽上糖基残基的非特异性氧化。氧化糖被用作连接PEG部分到肽的部位。例如M′Timku1u(WO94/05332)公开了氨基-PEG用于将PEG添加到糖蛋白的用途。糖基部分被随机氧化成对应的醛，它随后偶合到氨基-PEG。
在每种上述方法中，将聚(乙二醇)以随机、非特异方式加入到肽主链的反应性残基上。对于治疗性肽的生产，很明显，需要采用导致特异标记、可容易表征、基本均匀的产物的形成的衍生策略。制备特异性标记肽的有前途的途径是通过使用酶(如糖基转移酶)使改性糖部分附加到肽上。改性糖部分必须起糖基转移酶底物的功能并被适当地活化。因此，需要提供获得活化的改性糖的容易路径的合成途径。本发明提供了这样的途径。

发明内容
本发明提供了聚合物物质，结合到这些聚合物物质的糖和活化糖以及包括这些聚合物的核苷酸糖。聚合物物质包括水溶性和水不溶性物质两者。此外，聚合物是支化或直链聚合物。例示的糖部分包括直链和环状结构和醛糖以及酮糖。
聚合物改性基团可以在糖部分的任何位置连接。在以下的讨论中，本发明通过参考实施方案举例说明，其中聚合物改性基团连接到呋喃糖的C-5或吡喃糖的C-6。本领域技术人员将认识到讨论的焦点是为了更清楚的说明，使用在此说明的方法和本领域公认的方法，聚合物部分可以连接到吡喃糖和呋喃糖两者的其它位置。
在例示的实施方案中，本发明提供了结合到聚合物的糖或糖核苷酸 在通式I和I I中，R1是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7表示H、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的杂烷基。R2是H、OH或包括核苷酸的基团。根据此实施方案的例示的R2具有如下通式 其中R8是核苷。
符号R3，R4，R5，R6和R6′独立地表示H、取代或未取代烷基、OR9、NHC(O)R10。标记d是0或1。R9和R10独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或唾液酸。R3，R4，R5，R6和R6′中的至少一个包括聚合物改性部分(如PEG)。在例示的实施方案中，R6和R6′与它们连接的碳一起是唾液酸侧链的组分。在进一步例示的实施方案中，此侧链被聚合物改性部分官能化。
在例示的实施方案中，聚合物部分通常通过核上的杂原子，通过连接基L结合到糖核，如下所示 R11是聚合物部分而L选自键和连接基团。标记w表示选自1-6，优选1-3和更优选1-2的整数。例示的连接基团包括取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基部分和唾液酸。连接基的例示的组分是酰基基团。
当L是一条键时，它在R11的前体上的反应性官能团和L前体上的补充反应性的反应性官能团之间形成。在与R11的反应之前，L可以在糖核上就位。或者，R11和L可以被引入预形成的组合体(cassette)，该预形成的组合体随后连接到糖核。如在此说明的那样，具有适当反应性官能团的前体的选择和制备在本领域技术人员的能力范围内。此外，前体的结合用本领域公知的化学进行。
在例示的实施方案中，L是从氨基酸或小肽(如，1-4个氨基酸残基)形成的连接基团，提供改性糖，其中聚合物改性部分通过取代的烷基连接基连接。例示的连接基是甘氨酸。
在例示的实施方案中，R6包括聚合物改性部分。在另一个例示的实施方案中，R6包括聚合物改性部分和连接基L两者，连接基L结合改性部分到分子的剩余部分。
在例示的实施方案中，聚合物改性部分是包括两个或多个连接到中心部分的聚合物链的支化结构。根据本发明这一实施方案的有用的聚合物改性部分前体的例示的结构具有如下通式
根据此通式的糖和核苷酸糖基本是纯水溶性聚合物。X3′是包括可电离(如，COOH等)或其它反应性官能团的基团(参见，例如下文)。C是碳。X5优选是非反应性基团(如H，未取代烷基，未取代杂烷基)。R12和R13独立地是选择的聚合物臂，如非肽，非反应性聚合物臂。X2和X4是优选在生理条件下基本非反应性的连接片段，它们可以相同或不同。或者，这些连接可包括被设计成在生理相关条件下降解的一个或多个基团，如酯、二硫化物等。X2和X4结合聚合物臂R12和R13到C。当X3′与连接基、糖或连接基-糖组合体上补充反应性的反应性官能团反应时，X3′转化成连接片段X3的组分。
通过前体与合适的糖或糖连接基的反应，本发明提供了具有如下通式的糖和核苷酸糖 ；和 其中由各种符号表示的基团的鉴别与以上讨论的相同。La是取代或未取代烷基或取代或未取代杂烷基基团。在例示的实施方案中，La是唾液酸的侧链基团，它被所示的聚合物改性部分官能化。
聚合物改性部分包括两个或多个可以是水溶性或基本不溶于水的重复单元。用于本发明的化合物的例示的水溶性聚合物包括PEG(如m-PEG)，PPG(如m-PPG)，聚唾液酸，聚谷氨酸酯，聚天冬氨酸酯，聚赖氨酸，聚亚烯亚胺，生物可降解聚合物(如，聚交酯，聚甘油酯)，和官能化PEG，如末端官能化的PEG。
本发明的聚合物结合物的糖部分选自天然和非天然呋喃糖和己糖两者。非天然糖任选地包括烷基化或酰基化羟基和/或胺基团，如环上的醚、酯和酰胺取代基。其它非天然糖包括在环上位置的H、羟基、醚、酯或酰胺取代基，在天然糖中在该位置不存在这样的取代基。或者，碳水化合物缺少应在衍生其名称的碳水化合物中发现的取代基，如脱氧糖。仍然进一步的例示的非天然糖包括氧化(如、-酮酸和-糖醛酸)和还原(糖醇)碳水化合物两者。糖部分可以单糖，低聚糖和多糖。
用于本发明的例示的天然糖包括葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、岩藻糖、甘露糖、甘露糖胺、木糖、核糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、和唾液酸。
例示的基于唾液酸的结合物具有如下通式 其中AA是不包括羧基基团的氨基酸残基的那个部分而NP是核苷酸磷酸。ONP也可以由活化部分替代以形成活化糖。如将由本领域技术人员认识到的那样，聚合物改性部分-连接基也可以在C-6，C-7和/或C-9连接到唾液酸侧链。
也提供了生产活化唾液酸-PEG结合物的合成方法，该结合物是酶(如糖基转移酶)的合适的底物。该方法包括如下步骤(a)在适于在甘露糖胺和N-保护的氨基酸之间形成酰胺结合物的条件下接触甘露糖胺与活化的N-保护的氨基酸(或被聚合物改性部分、连接基前体或连接基-聚合物改性部分组合体官能化的氨基酸)；(b)在适于将酰胺结合物转化成唾液酸酰胺结合物的条件下接触酰胺结合物与丙酮酸盐和唾液酸醛缩酶；(c)在适于形成胞苷一磷酸唾液酸酰胺结合物的条件下接触唾液酸酰胺结合物与胞苷三磷酸和合成酶；(d)从胞苷一磷酸唾液酸酰胺结合物脱除N-保护基团，由此产生游离胺；和(e)接触游离胺与活化的PEG(直链或支化的)，由此形成胞苷一磷酸唾液酸-聚(乙二醇)。
核苷可以选自天然和非天然核苷两者。用于本发明的例示的天然核苷包括胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶。本领域充分展示了非天然核苷的结构和它们的制备方法。
本发明的例示的改性糖核苷酸包括聚合物改性的GDP-Man，GDP-Fuc，UDP-Gal，UDP-GalNAc，UDP-Glc，UDP-GlcNAc，UDP-Glc，UDP-GlcUA和CMP-SA等。例子包括UDP-Gal-2′-NH-PEG，UDP-Glc-2′-NH-PEG，CMP-5′-PEG-SA等。由本发明覆盖的化合物包括其中L-R11部分结合到呋喃糖或吡喃糖的那些，如在呋喃糖的C-5或在吡喃糖的C-6，通常通过连接到此碳原子的杂原子。
当本发明的化合物是核苷酸糖或活化糖时，核苷酸糖的聚合物结合物通常是酶的底物，该酶转移糖部分和它的聚合物取代基到底物的适当受体部分上。因此，本发明也提供了使用核苷酸糖或活化糖和适当酶的聚合物结合物通过糖结合改性的底物。可以使用本发明的化合物进行糖结合的底物包括肽(如糖肽、肽)、脂质(如糖脂)和配基(鞍氨醇，神经酰胺)。


图1是唾液酸转移酶的表，对于该唾液酸转移酶，选择的改性唾液酸核苷酸和活化糖是底物。
图2是制备唾液酸-聚(乙二醇)结合物的本发明的通用合成方案。
图3是制备唾液酸-甘氨酰-聚(乙二醇)结合物的本发明的合成方案。
发明详述和实施方案缩写支化和未支化PEG，聚(乙二醇)，如m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；支化和未支化PPG，聚(丙二醇)，如m-PPG，甲氧基-聚(丙二醇)；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；Gal NAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰葡萄糖胺基；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖胺基乙酸酯；Sia，唾液酸；和NeuAc，N-乙酰神经氨基。
定义术语″唾液酸″表示九个碳羧基化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最通常成员是N-乙酰基-神经氨酸(2-酮基-5-乙酰氨基-3，5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮吡喃糖-1-酮酸(通常缩写为Neu5Ac，NeuAc，或NANA)。家族的第二成员是N-羟乙酰基-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基是羟基化的。第三个唾液酸家族成员是2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamor i等人，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。也包括9-取代唾液酸如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac如9-O-lactyl-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。对于唾液酸家族的综述参见，如Varki，Glycobiology 225-40(1992)；唾液酸化学，代谢和功能，R.Schauer，Ed.(Springer-Yerlag，纽约(1992))。唾液酸化合物的合成和在唾液酸化中的用途公开于1992年10月1日公开的国际申请WO 92/16640。
在此使用的术语″改性糖″(modified sugar)表示在本发明的方法中酶法加成到肽的氨基酸或糖基残基上的天然或非天然碳水化合物。改性糖选自许多酶底物，包括但不限于糖核苷酸(单-，二-，和三-磷酸)，活化糖(如，糖基卤化物，糖基甲磺酸酯)和既未活化也不是核苷酸的糖。″改性糖″由″改性基团″(modifying group，或称修饰基团)共价官能化。有用的改性基团包括但不限于水溶性聚合物、治疗部分(moieties，或称基团)、诊断部分、生物分子等。改性基团优选不是天然的或未改性碳水化合物。选择由改性基团的官能化部位使得它不防止″改性糖″被酶法加成到肽。
术语″水溶性″表示在水中具有一定可检测程度的溶解度的部分。检测和/或定量化水溶解度的方法是本领域公知的。例示的水溶性聚合物包括肽、糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可具有混合序列或由单一氨基酸组成，如聚(赖氨酸)。例示的多糖是聚(唾液酸)。例示的聚(醚)是聚(乙二醇)，如m-PEG。聚(乙烯亚胺)是例示的聚胺，和聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。例示的聚合物典型地由2-8个聚合物单元组成。
水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)(即PEG)。然而，应当理解其它相关聚合物也适用于本发明的实施，并且术语PEG或聚(乙二醇)的使用希望在此方面是包括性的和不是排它性的。术语PEG包括任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG，二官能PEG，多臂PEG，叉状PEG，支化PEG，悬垂(pendent)PEG(即含有一个或多个悬垂于聚合物主链的官能团的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解键的PEG。
聚合物主链可以是线性或支化的。支化聚合物主链通常是本领域已知的。典型地，支化聚合物含有中心支化核部分和多个连接到中心支化核的线性聚合物链。PEG通常以支化形式使用，它可以通过将环氧乙烷加成到各种多元醇(如甘油、季戊四醇和山梨醇)而制备。中心支化部分也可以衍生自几种氨基酸，如赖氨酸。支化聚(乙二醇)可以用通用形式表示为R(-PEG-OH)m，其中R表示核部分，如甘油或季戊四醇，而m表示臂的数目。多臂PEG分子，如在美国专利号5,932,462中描述的那些也可以用作聚合物主链，该文献在此全文引入作为参考。
许多其它聚合物也适于本发明。非肽和水溶性，具有2-约300个末端的聚合物主链特别适用于本发明。合适的聚合物的例子包括但不限于其它聚(亚烷基二醇)，如聚(丙二醇)(″PPG″)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯属醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷氮烯(polyphosphazene)、聚_唑啉，聚(N-丙烯酰基吗啉)，如美国专利号5,629,384所述，该文献在此全文引入作为参考，及其共聚物、三元共聚物和混合物。尽管聚合物主链的每个链的分子量可变化，它典型地为约100Da-约100,000Da，通常约6,000Da-约80,000Da。
在此使用的术语″糖结合″表示改性糖物质到多肽(如本发明的突变的人生长激素)的氨基酸或糖基残基的酶介导的结合。″糖结合″的亚类是″二醇-PEG化″，其中改性糖的改性基团是聚(乙二醇)，及其烷基衍生物(如，m-PEG)或反应性衍生物(如，H2N-PEG，HOOC-PEG)。
在此使用的术语″糖基连接基团″表示改性基团(如，PEG部分，治疗部分，生物分子)共价连接到其上的糖基残基；糖基连接基团结合改性基团到结合物的剩余部分。在本发明的方法中，″糖基连接基团″共价连接到糖基化或非糖基化肽，由此将试剂连接到肽的氨基酸和/或糖基残基。″糖基连接基团″通常由″改性糖″到肽的氨基酸和/或糖基残基的酶连接而衍生自″改性糖″。糖基连接基团可以是在改性基团-改性糖组合体形成期间降解的糖衍生结构(如，氧化→席夫碱形成→还原)，或糖基连接基团可以是完整的。″完整的糖基连接基团″表示衍生自糖基部分的连接基团，其中连接改性基团和到结合物的剩余部分的糖单体不降解，如氧化(如被偏高碘酸钠氧化)。本发明的″完整的糖基连接基团″可以通过糖基单元的加成或一个或多个糖基单元从母糖结构的脱除衍生自天然低聚糖。
在取代基被从左到右书写的它们常规的化学式指定情况下，它们同等地包括化学上一致的取代基，该化学上一致的取代基来自从右向左书写的结构，如-CH2O-也被写作-OCH2-。
术语″烷基″自身或作为另一个取代基的一部分，除非另外说明，表示直链或支链、或环状烃基、或其组合，它们可以是完全饱和的、单或多不饱和的并且可包括二价和多价目基团，具有指定的碳原子数目(即C1-C10表示1-10个碳)。饱和烃基的例子包括但不限于基团如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、(例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的)同系物和异构体等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的例子包括，但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基、和高级同系物和异构体。除非另外说明，术语″烷基″也用于包括以下更详细定义的烷基衍生物，如″杂烷基″。限于烃基的烷基称为″均烷基″。
术语″亚烷基″自身或作为另一个取代基的一部分表示衍生自烷烃的二价基团，如例示的为，但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并进一步包括以下描述为″杂亚烷基″的那些基团。典型地，烷基(或亚烷基)含有1-24个碳原子，并且含有10个或更少碳原子的那些基团在本发明中是优选的。″低级烷基″或″低级亚烷基″是更短链烷基或亚烷基，通常含有8个或更少碳原子。
术语″烷氧基″，″烷基氨基″和″烷基硫代″(或硫代烷氧基)以它们常规的意义使用，并且表示分别通过氧原子，氨基，或硫原子连接到分子剩余部分的那些烷基。
术语″杂烷基″自身或与另一个术语结合，除非另外说明，表示直链或支链、或环状烃基、或其组合，由所述数目的碳原子和至少一个杂原子组成，该杂原子选自O、N、Si和S，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化而氮杂原子任选地被季化。一个或多个杂原子O，N和S和Si可以位于杂烷基的任何内部位置或位于烷基连接到分子剩余部分的位置。例子包括，但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH-CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。相似地，术语″杂亚烷基″按自身或作为另一个取代基的一部分表示衍生自杂烷基的二价基团，如例示的为，但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可占据一个或两个链末端(如，亚烷氧基，亚烷基二氧基，亚烷基氨基，亚烷基二氨基等)。仍然进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的取向不被书写连接基团的通式的方向暗示。例如，通式-C(O)2R′-表示-C(o)2R′-和-R′C(O)2-两者。
术语″环烷基″和″杂环烷基″按它们自身或与其它术语结合，除非另外说明，分别表示″烷基″和″杂烷基″的环状形式。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环连接到分子剩余部分的位置。环烷基的例子包括，但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括，但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)，1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
术语″卤代″或″卤素″按它们自身或作为另一个取代基的一部分，除非另外说明，表示氟、氯、溴或碘原子。另外，术语如″卤代烷基″意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语″卤代(C1-C4)烷基″意在包括，但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
术语″芳基″除非另外说明，表示可以是单个环或多个环(优选1-3个环)的多不饱和、芳香的取代基，它们稠合在一起或共价连接。术语″杂芳基″表示包含1-4个杂原子的芳基(或环)，该杂原子选自N，O，和S，其中氮和硫原子任选地被氧化，而氮原子任选地被季化。杂芳基可以通过杂原子连接到分子的剩余部分。
芳基和杂芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-_唑基、4-_唑基、2-苯基-4-_唑基、5-_唑基、3-异_唑基、4-异_唑基、5-异_唑基、2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2，3-二氢苯并[1，4]二_英-6-基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基和6-喹啉基。每个以上提及的芳基和杂芳基环体系的取代基选自上述的可接受取代基。
为简便起见，术语″芳基″当与其它术语(如，芳氧基，芳基硫氧基，芳基烷基)结合使用时包括以上定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语″芳基烷基″用于包括那些基团，其中芳基连接到烷基(如，苄基，苯乙基，吡啶基甲基等)，所述烷基包括那些烷基，其中碳原子(如，亚甲基)被例如氧原子替代(如，苯氧基甲基，2-吡啶氧基甲基，3-(1-萘氧基)丙基等)。
每个上述术语(如，″烷基，″″杂烷基，″″芳基″和″杂芳基″)意在包括指定的基团的取代和未取代形式两者。以下提供了每种类型基团的优选取代基。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基，烯基，杂亚烷基，杂烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，环烯基，和杂环烯基的那些)的取代基通常称为″烷基取代基″，并且它们可以是选自，但不限于如下的各种基团中的一种或多种数目为零到(2m′+1)的-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R_、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R_、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R_)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR_、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，其中m′是这样的基团中碳原子的总数目。R′，R″，R_和R″″每个优选独立地表示氢、取代或未取代杂烷基、取代或未取代芳基，如被1-3个卤素取代的芳基、取代或未取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如每个R基团独立地选择，象每个R′，R″，R_和R″″基团那样(当多于一个的这些基团存在时)。当R′和R″连接到相同的氮原子时，它们可以与氮原子结合以形成5-，6-，或7-元环。例如，-NR′R″意在包括，但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从取代基的以上讨论，本领域技术人员应当理解术语″烷基″意在包括下列基团，所述基团包括结合到氢原子以外的基团的碳原子，如卤代烷基(如、-CF3和-CH2CF3)和酰基(如、-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
相似于对于烷基所述的取代基，对于芳基和杂芳基的取代基通常称为″芳基取代基″。取代基选自，例如卤素、-OR′，＝O，＝NR′，＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R_、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R_、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R_)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR_、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(o)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基、和氟(C1-C4)烷基，数目为从零到芳族环体系上开放化合价的总数目；并且其中R′，R″，R_和R″″优选独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基、取代或未取代芳基和取代或未取代杂芳基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如每个R基团独立地选择，象每个R′，R″，R′″和R″″基团那样(当多于一个的这些基团存在时)。在以下的方案中，符号X表示上述的″ R″。
在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被通式为-T-C(O)-(CRR′)q-U-的取代基替代，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR′-或单键，而q是0-3的整数。或者，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被通式为-A-(CH2)r-B-的取代基替代，其中A和B独立地是-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或单键，而r是1-4的整数。这样形成的新环的单键中的一个可任选地被双键替代。或者，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被通式为-(CRR′)s-X-(CR″R′″)d-的取代基替代，其中s和d独立地是0-3的整数，而X是-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、或-S(O)2NR′-。取代基R，R′，R″和R′″优选独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
在此使用的术语″杂原子″意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
PEG的反应性衍生物(或其它连接基)连接一个或多个肽部分到连接基的用途在本发明的范围内。本发明不被反应性PEG类似物的特性限制。聚(乙二醇)的许多活化衍生物是市售的和文献中可得到。选择和(如果需要)合成适当的活化PEG衍生物是在本领域技术人员的能力范围内(采用该衍生物以制备用于本发明的底物)。参见Abuchowski等人Cancer Biochem.Bophys.，7175-186(1984)；Abuchowski等人，J.Biol.Chem.，2523582-3586(1977)；Jackson等人Anal.Biochem.，165114-127(1987)；Koide等人，Biochem Biophys.Res.Commun.，111659-667(1983))，tresylate(Nilsson等人，Methods Enzymol.，10456-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12119-128(1990))；N-羟基琥珀酰亚胺衍生物活性酯(Buckmann等人，Makromol.Chem.，1821379-1384(1981)；Joppich等人，Makromol.Chem.，1801381-1384(1979)；Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，841487-1491(1987)；Kitamura等人，Cancer Res.，514310-4315(1991)；Boccu等人，Z.Naturforsch.，38C94-99(1983)，碳酸酯(Zalipsky等人，聚(乙二醇)化学生物技术和生物医疗应用，Harris，Ed.，P1enum Press，纽约，1992，pp.347-370；Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，15100-114(1992)；Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11141-152(1985))，咪唑基甲酸酯(Beauchamp等人，Anal.Biochem.，13125-33(1983)；Berger等人，Blood，711641-1647(1988))，4-二硫代吡啶(Woghiren等人，Biocon jugate Chem.，4314-318(1993))，异氰酸酯(Byun等人，ASAIOJournal，M649-M-653(1992))和环氧化物(美国专利号4,806,595，授予Noishiki等人，(1989)。其它连接基团包括在氨基和活化PEG之间的尿烷键。参见Veronese等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，11141-152(1985)。
术语″氨基酸″表示天然和合成氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及以后改性的那些氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯、和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物表示与天然氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即α碳结合到氢、羧基、氨基、和R基团，如高丝氨酸、原亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物含有改性R基团(如，原亮氨酸)或改性肽主链，但保持与天然氨基酸相同的基本化学结构。″氨基酸模拟物″表示结构不同于氨基酸的通用化学结构，但采用与天然氨基酸相似的方式起作用的化合物。
″肽″表示聚合物，其中单体是氨基酸、氨基酸类似物和/或氨基酸模拟物并且通过酰胺键结合在一起，或者称为多肽。另外，也包括非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。不是基因编码的氨基酸也可用于本发明。此外，改性以包括反应性基团、糖基化部位、聚合物、治疗部分、生物分子等的氨基酸也可用于本发明。用于本发明的所有氨基酸可以是D-或L-异构体。通常优选是L-异构体。此外，其它肽模拟物也可用于本发明。在此使用的″肽″表示糖基化和非糖基化肽两者。也包括由表达肽的体系不完全糖基化的肽。对于通用综述，参见Spatola，A.F.，氨基酸，肽和蛋白质的化学和生物化学，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，纽约，p.267(1983)。
术语″核苷″表示糖基胺，该糖基胺是核酸的组分并且包括连接到β-D-呋喃核糖以形成核糖核苷，或连接到2-脱氧-β-D-呋喃核糖以形成脱氧核糖核苷的含氮碱基。碱基可以是嘌呤如，腺嘌呤或鸟嘌呤，或嘧啶如，胸苷，胞苷，尿苷或假尿苷。核苷也包括被微生物使用的不常见核苷。
在此使用的术语″靶向部分″表示在身体的特定组织或区域中选择性定位的种类。定位由分子决定子的特定识别、靶向剂或结合物的分子大小、离子相互作用、疏水性相互作用等介导。靶向试剂到特定组织或区域的其它机理是本领域技术人员已知的。例示的靶向部分包括抗体、抗体片段、铁传递蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白，G-CSF，GM-CSF，M-CSF，EPO等。
在此使用的″治疗部分″表示用于治疗的任何试剂，包括，但不限于、抗生素、抗炎剂、抗肿瘤药、细胞毒素、和放射性试剂。″治疗部分″包括生物活性剂的药物前体，构建物(其中一个以上的治疗部分结合到载体，如多价试剂)。治疗部分也包括蛋白质和包括蛋白质的构建物。例示的蛋白质包括，但不限于红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素(如，干扰素-α、-β、-γ)，白细胞介素(如，白细胞介素II)，血清蛋白(如，因子VII，VIIa，VIII，IX，和X)、人体绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵胞激素(FSH)和促黄体素(LH)和抗体融合蛋白(如肿瘤坏死因子受体((TNFR)/Fc域融合蛋白))。
在此使用的″抗肿瘤药″表示用于对抗癌症的任何试剂，包括，但不限于细胞毒素和试剂(如抗代谢物、烷基化试剂、蒽环类化合物、抗生素、抗有丝分裂剂、丙卡巴肼、羟基脲、门冬酰胺酶、皮质激素、干扰素和放射性试剂)。也包括在术语″抗肿瘤药″的范围内的是具有抗肿瘤活性的肽，如TNF-α的结合物。结合物包括，但不限于在治疗性蛋白质和本发明的糖蛋白之间形成的那些。代表性的结合物在PSGL-1和TNF-α之间形成。
在此使用的″细胞毒素或细胞毒试剂″表示对细胞有害的任何试剂。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(authracinedione)、米托蒽醌、金霉素、放线霉素D、1-去氢睾甾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素及其类似物或同系物。其它毒素包括，例如蓖麻毒素、CC-1065和类似物、倍癌霉素(duocarmycin)。进一步的其它毒素包括diptheria毒素、和蛇毒(如，眼镜蛇蛇毒)。
在此使用的″放射性试剂″包括有效诊断或破坏肿瘤的任何放射性同位素。例子包括，但不限于铟-111、钴-60。另外，天然放射性元素如铀、镭、和钍(它们通常表示放射性同位素的混合物)是放射性试剂的合适例子。金属离子典型地与有机螯合部分螯合。
许多有用的螯合基团、冠醚、穴状配体等是本领域已知的并且可以引入本发明的化合物(如，EDTA，DTPA，DOTA，NTA，HDTA等和它们的膦酸酯类似物如DTPP，EDTP，HDTP，NTP等)。参见，例如Pitt等人，″用于铁超负荷的治疗的螯合剂的设计，″于INORGANIC CHEMISTRY INBIOLOGY AND MEDICINE；Martell，Ed.；美国化学会，Washington，D.C.，1980，pp.279-312；Lindoy，大环配体复合物的化学；CambridgeUniversity Press，Cambridge，1989；Dugas，BIOORGANIC CHEMISTRY；Springer-Verlag，纽约，1989，以及其中包含的参考文献。
另外，允许螯合剂、冠醚和环糊精到其它分子的连接的多样途径是本领域技术人员可获得的。参见，例如Meares等人，″体内螯合物-标记蛋白质和多肽的性能。″于MODIFICATION OF PROTEINSFOOD，NUTRITIONAL，AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS；″Feeney，等人，Eds.，美国化学会，Washington，D.C.，1982，pp.370-387；Kasina等人，Biocon jugate Chem.，9108-117(1998)；Song等人，Biocon jugateChem.，8249-255(1997)。
介绍本发明提供了聚合物物质，以及结合到这些聚合物的糖、活化糖、和核苷酸糖。核苷酸糖的聚合物结合物通常是酶的底物，所述酶转移糖部分和它的聚合物取代基到底物的适当受体部分上。因此，本发明也提供了使用核苷酸糖和适当酶的聚合物结合物通过糖结合改性的底物。可以使用本发明的化合物进行糖结合的底物包括肽，如糖肽，脂质，如配糖酯和配基(鞍氨醇，神经酰胺)。
如在先前部分中讨论的那样，本领域公认的共价PEG化的化学方法依赖于通过反应性基团在氨基酸或碳水化合物上的化学结合。通过对结合物和反应条件的仔细设计，使用化学介导的结合策略制备有用的结合物。聚合物对蛋白质或糖蛋白的化学结合的主要缺点是缺乏活化聚合物的选择性，它通常导致在涉及蛋白质或糖蛋白生物活性的部位的聚合物的连接。已开发了几种方案以解决部位选择性结合化学，然而，仅开发了适于各种重组蛋白质的一种通用方法。
与本领域公认的方法形成对照，本发明提供了化合物，该化合物以新颖的策略用于支化水溶性聚合物的高度选择性、部位定向的糖结合，如糖-PEG化。在本发明的例示的实施方案中，支化水溶性聚合物的部位定向连接通过特异肽序列的体外酶糖基化、使用本发明的核苷酸糖或活化糖完成。糖-结合可以采用糖基转移酶(如唾液酸转移酶)用酶法进行，该转移酶能够转移物质支化水溶性聚合物-糖(如PEG-唾液酸)到糖基化部位(″糖-PEG化″)。
如以上讨论的那样，本发明提供了被聚合物部分改性的具有任何所需碳水化合物结构的糖结合物。糖核苷酸和基于这些糖结构的活化糖也是本发明的组成部分。聚合物改性部分由酶法，化学法或其组合连接到糖部分，由此产生改性核苷酸糖。糖被聚合物改性部分在任何所需位置取代。在例示的实施方案中，糖是在一个或多个C-1，C-2，C-3，C-4或C-5处取代的呋喃糖。在另一个实施方案中，本发明提供了被聚合物改性部分在一个或多个C-1，C-2，C-3，C-4，C-5或C-6取代的吡喃糖。优选，聚合物改性部分直接连接到从碳悬垂的氧、氮或硫。或者， 聚合物改性部分连接到位于糖和改性部分之间的连接基。连接基连接到从选择的碳悬垂的氧、氮或硫。
在目前优选的实施方案中，聚合物改性部分附加到一定位置，选择该位置使得获得的结合物起酶底物的作用，该酶用于结合改性糖部分到另一种物质，如肽、糖肽、脂质、糖脂等。例示的酶在此更详细地讨论并包括糖基转移酶(唾液酸转移酶，葡萄糖基转移酶，半乳糖转移酶，N-乙酰葡萄糖基转移酶，N-乙酰半乳糖转移酶，甘露糖基转移酶，岩藻糖基转移酶等)。本发明的例示的糖核苷酸和活化糖结合物也包括突变体糖苷酶和突变体糖神经酰胺酶的底物，改性该底物以具有合成、而不是水解活性。
在例示的实施方案中，本发明的结合物包括结合到一种或多种聚合物(如支化聚合物)的糖、活化糖或核苷酸糖。例示的聚合物包括水溶性和水不溶性类别两者。
在例示的实施方案中，聚合物改性基团直接或间接连接到吡喃糖或呋喃糖。例如 ；和 在通式I和II中，R1是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7表示H、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的杂烷基。R2是H、OH、NH或包括核苷酸的部分。根据此实施方案的例示的R2具有如下通式 其中X1表示O或NH和R8是核苷。
符号R3，R4，R5，R6和R6′独立地表示H、取代或未取代烷基、OR9、NHC(O)R10。标记d是0或1。R9和R10独立地选自H、取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基或唾液酸。R3，R4，R5，R6，和R6′中的至少一个包括聚合物改性部分(如PEG)。在例示的实施方案中，R6和R6′中与它们连接的碳一起是唾液酸侧链的组分。在仍然进一步例示的实施方案中，此侧链被聚合物改性部分(或连接基-聚合物改性部分)在一个或多个C-6，C-7或C-9改性。
符号R3，R4，R5和R6独立地表示H、OR9、NHC(O)R10。R9和R10独立地选自H、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的杂烷基。R3，R4，R5，R6，和6′中的至少一个包括聚合物改性部分。
在另一个例示的实施方案中，糖部分是氧化和结合到聚合物改性部分的唾液酸部分，如描述于普通转让的U.S.临时专利申请No._____(代理人案卷号No.040853-01-5150)，提交日2005年1月6日。
在例示的实施方案中，聚合物改性部分通过连接基结合到糖核 其中R11是聚合物部分而L选自键和连接基团，而w是1-6，优选1-3和更优选1-2的整数。
当L是键时，它在R11的前体上的反应性官能团与L前体上的补充反应性的反应性官能团之间形成。如在此说明的那样，具有适当反应性官能团的前体的选择和制备在本领域技术人员的能力范围内。此外，按照本领域公知的化学进行前体结合。
在例示的实施方案中，L是从氨基酸、氨基酸模拟物、或小肽(如，1-4个氨基酸残基)形成的连接基团，提供改性糖，其中聚合物改性部分通过取代的烷基连接基连接。连接基通过氨基酸的胺部分和羧酸(或反应性衍生物，如活性酯，酰卤等)的反应形成，该氨基酸具有L和R11前体上的补充反应性的基团。结合物的元素可以采用基本上任何方便的顺序结合。例如在结合R11和L的前体之前，L的前体可以在糖核上就位。或者，L上带有反应性官能度的R11-L组合体(cassette)并随后通过此物质上补充反应性的反应性官能团连接到糖。
在例示的实施方案中，聚合物改性部分是R3和/或R6。在另一个例示的实施方案中，R3和/或R6包括聚合物改性部分和连接基L两者，连接基L结合聚合物部分到分子的剩余部分。在另一个例示的实施方案中，聚合物改性部分是R3。在再一个例示的实施方案中，R3包括聚合物改性部分和连接物L两者，连接物L结合聚合物部分到分子的剩余部分。在又一个例示的实施方案中，其中糖是唾液酸，聚合物改性部分在R5处或在唾液酸侧链的位置，如C-9处连接。
线性聚合物结合物在例示的实施方案中，本发明提供了与线性聚合物(如水溶性或水不溶性聚合物)之间形成的糖或活化糖结合物或核苷酸糖结合物。在本发明的结合物中，聚合物连接到糖、活化糖或糖核苷酸。如在此讨论的那样，聚合物直接或通过连接基连接到糖部分。
根据此实施方案的例示的化合物具有根据通式I或II的结构，其中至少一个R1，R3，R4，R5或R6具有如下通式 根据此实施方案的另一个例子具有如下通式 其中s是0-20的整数而R11是线性聚合物改性部分。
任何分子量(如2Kda，5Kda，10Kda，20Kda，30Kda和40Kda)的PEG部分均可用于本发明。
支化聚合物结合物在例示的实施方案中，聚合物改性部分是包括两个或多个连接到中心部分的聚合物链的具有如下通式的支化结构 其中R11和L如以上所讨论并且w′是2-6、优选2-4和更优选2-3的整数。
用于形成根据本发明此实施方案的结合物的例示的前体具有如下通式 根据此通式的支化聚合物是基本纯的水溶性聚合物。X3′是包括可电离(如COOH、H2PO4、HSO3、HPO3等)或其它反应性官能团的部分，如下文所述。C是碳。X5优选是非反应性基团(如，H，未取代烷基，未取代杂烷基)，并且可以是聚合物臂。R12和R13独立地是选择的聚合物臂，如非肽、非反应性聚合物臂。X2和X4优选是在生理条件下基本非反应性的连接片段，它们可以相同或不同。或者，这些键可包括一个或多个被设计成在生理相关条件下降解的部分，如酯、二硫化物等。X2和X4结合聚合物臂R12和R13到C。当X3′与连接基、糖或连接基-糖组合体上补充反应性的反应性官能团反应时，X3′转化成连接片段X3的组分。
X2和X4的例示的连接片段包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)aO、(CH2)aS或(CH2)aY′-PEG或(CH2)aY′-PEG，其中Y′是S或O而a是1-50的整数。
在例示的实施方案中，前体(III)，或其活化衍生物通过在X3′和糖部分上补充反应性的基团之间的反应结合到糖、活化糖或糖核苷酸。或者，X3′与前体上的反应性官能团反应成连接基L。通式I和II的一个或多个R1，R3，R4，R5或R6可包括支化聚合物改性部分。
在例示的实施方案中，如下部分 是连接基臂L。在此实施方案中，例示的连接基衍生自天然或非天然氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物、或从一种或多种这样的物质形成的小肽。例如，在本发明的化合物中发现的某些支化聚合物具有如下通式 Xa是通过支化聚合物改性部分和糖部分的前体上的反应性官能团的反应、或前体到连接基的反应形成的连接部分。例如，当X3′是羧酸时，它可以活化并直接结合到从氨基-糖(如，GalNH2，G1cNH2，ManNH2等)悬垂的胺基团，形成是酰胺的Xa。以下描述另外的例示的反应性官能团和活化前体。标记c表示1-10的整数。其它符号具有与以上讨论的那些相同的同一性。
在另一个例示的实施方案中，Xa是采用另一个连接基形成的连接部分 其中Xb是连接部分并且独立地选自对于Xa说明的那些基团，而L1是键、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的杂烷基。
Xa和Xb的例示的物质包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH。
例如， 其中s是0-20的整数而R11是线性聚合物改性部分。
在另一个例示的实施方案中，X4是结合到R13的肽键，它是氨基酸，二-肽或三-肽，其中α-胺部分和/或侧链杂原子被聚合物改性。
在进一步例示的实施方案中，R6包括支化聚合物改性基团并且改性糖或核苷酸糖具有选自如下的通式 ；和 其中由各种符号表示的基团的特性与以上讨论的相同。La是取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的杂烷基部分。在例示的实施方案中，La是唾液酸侧链的部分，唾液酸被所示的聚合物改性部分改性。
在仍然另一个例示的实施方案中，本发明提供了具有如下通式的糖和核苷酸糖
由各种符号表示的基团的特性与以上讨论的相同。如本领域技术人员将认识到的那样，通式VI和VIII中的连接基臂同样适用于在此说明的其它改性糖。
以上说明的本发明的实施方案进一步参考下列物质举例说明，所述物质中聚合物是水溶性聚合物，特别是聚(乙二醇)(″PEG″)，如甲氧基-聚(乙二醇)(″m-PEG″)。本领域技术人员将认识到以下内容中的重点是为清楚的说明和使用PEG作为例示的聚合物的各种基序同样适用于其中采用PEG以外的聚合物的物质。
水溶性聚合物许多水溶性聚合物是本领域技术人员已知的并可用于实施本发明。术语水溶性聚合物包括物质如糖(如葡聚糖，直链粉淀，透明质酸，聚(唾液酸)，类肝素，肝素等)；聚(氨基酸)，如聚(门冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成聚合物(如聚(丙烯酸)、聚(醚)，如聚(乙二醇)；肽，蛋白质等。聚合物典型地包括至少两个聚合物单元。在例示的实施方案中，聚合物是2-25个单元。在另一个例示的实施方案中，聚合物包括2-8个聚合物单元。本发明可以采用任何水溶性聚合物实施，仅有的限制在于聚合物必须包括结合物剩余部分可以连接于其上的点。
聚合物的活化方法也可以见于WO 94/17039，美国专利号5,324,844，WO 94/18247，WO 94/04193，美国专利号5,219,564，美国专利号5,122,614，WO 90/13540，美国专利号5,281,698，和另外WO93/15189，以及用于在活化聚合物与肽，如凝血因子VIII(WO94/15625)，血红蛋白(WO 94/09027)、运氧分子(美国专利号4,412,989)，核糖核酸酶和超氧化物岐化酶之间的结合(Veronese等人，App.Biochem.Biotecb.11141-45(1985))。
优选的水溶性聚合物是那些其中聚合物样品中聚合物分子的基本部分具有大约相同的分子量的聚合物；这样的聚合物是″均匀分散的″。
本发明进一步通过参考聚(乙二醇)结合物说明。可得到PEG官能化和结合的几篇综述和专题文章。参见，例如Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，酶学方法13530-65(1987)；Wong等人，Ehzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，治疗性药物载体体系中的关键综述9249-304(1992)；Zalipsky，Biocon jugate Chem.6150-165(1995)；和Bhadra，等人，Pharmazie，575-29(2002)。使用反应性分子制备反应性PEG分子和形成结合物的途径是本领域已知的。例如，美国专利号5,672,662公开了选自如下的聚合物酸的活性酯的水溶性和可分离的结合物线性或支化聚(环氧烷烃)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯属醇)、和聚(丙烯酰基吗啉)。
美国专利号6,376,604说明了在有机溶剂中通过使聚合物的末端羟基与二(1-苯并三唑基)碳酸酯反应制备水溶性和非肽聚合物的水溶性1-苯并三唑基碳酸酯的方法。活性酯用于形成与生物活性剂(如蛋白质或肽)的结合物。
WO 99/45964描述了包括生物活性剂和活化的水溶性聚合物的结合物，该水溶性聚合物包括聚合物主链，该主链含有通过合适键连接到聚合物主链的至少一个末端，其中至少一个末端包括含有连接到支化部分的近反应性基团的支化部分，其中生物活性剂连接到至少一个近反应性基团。其它支化聚(乙二醇)描述于WO 96/21469，美国专利号5,932,462描述了采用支化PEG分子形成的结合物，该PEG分子包括支化末端，该末端包括反应性官能团。游离反应性基团可用于与生物活性物质(如蛋白质或肽)反应，在聚(乙二醇)和生物活性物质之间形成结合物。美国专利号5,446,090描述了双官能PEG连接基和它在形成结合物中的用途，该结合物在每个PEG连接基末端具有肽。
包括可降解PEG连接的结合物描述于WO 99/34833；和WO99/14259，以及描述于美国专利号6,348,558。这样的可降解连接适用于本发明。
以上说明的本领域公认的聚合物活化方法可用于在这里介绍的本发明所述的支化聚合物的形成以及这些支化聚合物到其它物质(如糖、糖核苷酸等)的结合。
以下讨论例示的改性基团。可以对它们向肽赋予一种或多种所需性能的能力选择改性基团。例示的性能包括但不限于提高的药物动力学、提高的药效动力学、改进的生物分布、提供多价物质、改进的水溶性、提高或减少的亲油性和组织靶向。
用于本发明的例示的聚(乙二醇)分子包括，但不限于具有如下通式的那些 其中A2是H、OH、NH2、取代或未取代烷基、取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基、取代或未取代杂环烷基、取代或未取代杂烷基，如乙缩醛、OHC-、H2N-(CH2)q-、HS-(CH2)q、或-(CH2)qC(Yb)Zb。标记″e″表示1-2500的整数。标记b，d，和q独立地表示0-20的整数。符号Za和Zb独立地表示OH、NH2、离去基团，如咪唑、对硝基苯基、HOBT、四唑、卤化物、S-Ra、活化酯的醇部分；-(CH2)pC(Yb)V、或-(CH2)pU(CH2)sC(Yb)v。符号Ya表示H(2)、＝O、＝S、＝N-Rb。符号Xa，Ya，Yb，A1，和U独立地表示基团O、S、N-Rc。符号V表示OH、NH2、卤素、S-Ra、活化酯的醇组分、活化酰胺的胺组分、糖-核苷酸、和蛋白质。标记p，q，s和v是独立地选自0-20的整数。符号Ra，Rb，和Rc独立地表示H，取代或未取代烷基，取代或未取代杂烷基，取代或未取代芳基，取代或未取代杂环烷基和取代或未取代杂芳基。
用于本发明的线性和支化聚合物(如PEG)的具体实施方案包括
和这些物质的碳酸酯和活性酯，如 可用于形成线性和支化聚合物物质，这些物质的连接基臂结合物以及在这些化合物与糖和核苷酸糖之间的结合物。标记e和f独立地选自1-2500。
适于活化直链PEG用于制备在此说明的化合物的其它例示的活化、或离去基团包括但不限于如下物质 在本领域技术人员的能力范围内的是对于前体上的选择部分到聚合物改性部分选择适当的活化基团。
采用这些和其它物质活化的PEG分子和制备活化PEG的方法说明于WO 04/083259。
在例示的实施方案中，支化聚合物是基于半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸、二-或三-赖氨酸核的PEG。因此，进一步例示的支化PEG包括
标记e和f独立地选自1-2500。
在又一个实施方案中，支化PEG部分基于三-赖氨酸肽。三-赖氨酸可以是单-，二-，三-，或四-PEG-基化的。根据此实施方案的例示的物质具有如下通式
其中e，f和f′独立地选自1-2500的整数；和q，q′和q″独立地选自0-20的整数。
在本发明的例示的实施方案中，PEG是m-PEG(5kD，10kD，20kD，30kD或40kD)。例示的支化PEG物质是赖氨酸-、丝氨酸-或半胱氨酸-(m-PEG)2，其中m-PEG是20kD m-PEG。
对于本领域技术人员很明显的是，用于本发明的支化聚合物包括以上说明的情况的变化形式。例如以上显示的二-赖氨酸-PEG结合物可包括三个聚合物子单元，第三个键合到在以上结构中显示为非改性的α-胺。相似地，被三个或四个聚合物子单元官能化的三-赖氨酸在本发明的范围内。
本领域技术人员将认识到支化聚合物的一个或多个m-PEG臂可以由具有不同末端(如OH、COOH、NH2，C2-C10-烷基等)的PEG部分替代。此外，很容易通过在α-碳原子和侧链的官能团之间插入烷基连接基(或除去碳原子)改性以上的结构。因此，″高(homo)″衍生物和高级同系物，以及低级同系物在用于本发明的支化PEG的核范围以内。
在此描述的支化PEG物质容易通过下列路线中说明的方法制备 其中Xb是O、NH或S而r是1-10的整数。标记e和f独立地选自1-2500的整数。例示的支化PEG物质是10,000，15,000，20,000，30,000和40,000道尔顿。
因此，根据此方案，将天然或非天然氨基酸与活化的m-PEG衍生物(在此情况下甲苯磺酸酯)接触，通过烷基化侧链杂原子Xb形成化合物1。将单-官能化m-PEG氨基酸与反应性m-PEG衍生物经受N-酰基化条件，由此装配支化m-PEG 2。如本领域技术人员将认识到的那样，甲苯磺酸酯离去基团可以改为任何合适的离去基团，如卤素、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等。相似地，用于酰基化胺的反应性碳酸酯可以改为活性酯，如N-羟基琥珀酰亚胺等，或者酸可以使用脱水剂(如二环己基碳化二亚胺，羰二咪唑等)原位活化。
在以上说明的例示的方案中，改性基团是线性PEG部分，然而，任何改性基团，如水溶性聚合物、水不溶性聚合物、支化聚合物、治疗部分等可以通过而引入糖基部分。
用于本发明的化合物的进一步支化聚合物物质由PBG官能化的支化核举例说明，如以下说明的例子 其中R14是OH或另一个反应性官能团。例示的反应性官能团是C(O)Q′，其中选择Q′使得C(O)Q′是反应性官能团。用于Q′的例示的物质包括卤素、NHS、五氟苯基、HOBT、HOAt、和对硝基苯基。标记″e″和标记″f″是独立地选自1-2500的整数。
以上说明的支化化合物、和用于本发明化合物的另外的支化化合物容易从如下材料制备 聚合物改性糖物质本发明的核苷酸糖的糖部分可以选自天然和非天然呋喃糖和己糖两者。非天然糖任选地包括烷基化或酰基化羟基和/或胺部分，如环上的醚、酯和酰胺取代基。其它非天然糖在环上的一定位置包括H、羟基、醚、酯或酰胺取代基，在天然糖中在该位置不存在这样的取代基。糖部分可以是单糖，低聚糖或多聚糖。
用于本发明的例示的天然糖包括葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、核糖、N-乙酰葡萄糖、唾液酸和N-乙酰半乳糖。
相似地，核苷可以选自天然和非天然(或罕见)核苷两者。用于本发明的例示的天然核苷包括胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶。罕见核苷可包括但不限于这样的分子如阿糖尿苷和阿糖胸苷。本领域充分展示了非天然和罕见核苷以及它们的制备方法。
本发明的例示的改性糖核苷酸包括GDP-Man，GDP-Fuc，UDP-Gal，UDP-Gal-NH2，UDP-GalNAc，UDP-Glc，UDP-Glc-NH2，UDP-GlcNAc，UDP-Glc，UDP-GlcUA和CMP-Sia。如以上讨论的本发明的糖，本发明的糖核苷酸可以被聚合物改性部分(或连接基-改性部分)在糖的任何位置取代。例如，由本发明覆盖的化合物包括那些其中L-R11部分结合到呋喃糖类核苷酸糖的C-5或吡喃糖类核苷酸糖的C-6的化合物。
连接到在此公开的结合物的例示的部分包括，但不限于PEG衍生物(如，烷基-PEG，酰基-PEG，酰基-烷基-PEG，烷基-酰基-PEG氨基甲酰基-PEG，芳基-PEG)，PPG衍生物(如，烷基-PPG，酰基-PPG，酰基-烷基-PPG，烷基-酰基-PPG氨基甲酰基-PPG，芳基-PPG)，治疗部分，诊断部分，甘露糖-6-磷酸酯，肝素，类肝素，SLex，甘露糖，甘露糖-6-磷酸酯，唾液酸基Lewis X，FGF，VFGF，蛋白质，软骨素，角质素，皮肤素，白蛋白，整联蛋白(integrins)，触角低聚糖，肽等。结合各种改性基团到糖部分的方法是本领域技术人员容易得到的(聚(乙二醇)化学生物技术和生物医疗应用，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Pub.Corp.，1992；聚(乙二醇)化学和医疗应用，J.Milton Harris，Ed.，ACS学术讨论会丛刊No.680，美国化学会，1997；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，SanDiego，1996；和Dunn等人，Bds.聚合物药物输送系统，ACS学术讨论会丛刊Vol.469，美国化学会，Washington，D.C.1991)。
以它们的改性形式的本发明的例示的糖核苷酸包括核苷酸单-，二-或三磷酸酯或其UDP-糖苷，CMP-糖苷，或GDP-糖苷的类似物。甚至更优选，改性糖核苷酸选自UDP-半乳糖，UDP-半乳糖胺，UDP-葡萄糖，UDP-葡糖胺，GDP-甘露糖，GDP-岩藻糖，CMP-唾液酸，或CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙酰基胺衍生物也用于本发明的方法。
在其它实施方案中，改性糖是活化糖。用于本发明的活化改性糖典型地是由合成转变以包括活化离去基团的糖苷。在此使用的术语″活化离去基团″表示那些部分，它们容易在酶调节的亲核取代反应中转移。许多活化糖是本领域已知的。参见，例如Vocadlo等人，碳水化合物化学和生物，Vol.2，Erns t等人Ed.，Wiley-VCH VerlagWeinheim，德国，2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.346419(1993)；Lougheed，等人，J.Biol.Chem.27437717(1999))。
活化基团(离去基团)的例子包括氟、氯、溴、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等。用于本发明的优选活化离去基团是不显著地空间阻碍糖苷到受体的酶转移的那些。因此，活化糖苷衍生物的优选实施方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，特别优选糖基氟化物。在糖基氟化物中，最优选α-半乳糖基氟化物，α-甘露糖基氟化物，α-葡萄糖基氟化物，α-岩藻糖基氟化物，α-木糖基氟化物，α-唾液酸基氟化物，α-N-乙酰葡萄糖胺基氟化物，α-N-乙酰半乳糖胺基氟化物，β-半乳糖基氟化物，β-甘露糖基氟化物，β-葡萄糖基氟化物，β-岩藻糖基氟化物，β-木糖基氟化物，β-唾液酸基氟化物，β-N-乙酰葡萄糖胺基氟化物，β-N-乙酰半乳糖胺基氟化物。
按照说明，糖基氟化物可以从游离糖通过首先乙酰基化糖并且然后采用HF/吡啶处理它而制备。这产生被保护的(乙酰基化的)糖基氟化物(即，α-二醇氟化物)的热力学最稳定端基异构体。如果需要稳定较小的端基异构体(即，β-糖基氟化物)，它可以由如下方式制备采用HBr/HOAc或采用HCl转化过乙酰基化的糖以产生端基异构体溴化物或氯化物。此中间体与氟化物盐(如氟化银)反应以产生糖基氟化物。乙酰基化糖基氟化物可以通过与温和(催化)碱在甲醇(如NaOMe/MeOH)中的反应而解保护。此外，许多糖基氟化物是可市购的。
其它活化的糖基衍生物可以使用本领域技术人员已知的常规方法制备。例如，糖基甲磺酸酯可以由如下方式制备使糖的完全苄基化半缩醛形式用甲磺酰氯处理，随后催化氢化以脱除苄基。
在进一步例示的实施方案中，改性糖是具有触角结构的低聚糖。在另一个实施方案中，触角的一个或多个末端带有改性部分。当多于一个的改性部分连接到具有触角结构的低聚糖时，低聚糖可用于″放大″改性部分；结合到肽的每个低聚糖单元将多拷贝的改性基团连接到肽上。以上图中说明的本发明典型的结合物的通用结构包括通过采用触角结构制备本发明结合物产生的多价物质。许多触角糖结构是本领域已知的，而本方法可以没有限制地采用它们实施。
在例示的实施方案中，活化的改性糖是多变体酶的底物，该酶转移糖到底物的适当受体部位上。例示的突变体酶包括，如普通转让的PCT公开WO03/046150和W003/045980中描述的那些。
其中糖部分被水溶性聚合物(如水溶性聚合物改性的水溶性聚合物改性糖、活化糖和核苷酸糖物质用于本发明。例示的改性糖核苷酸带有通过糖上胺部分改性的糖基。改性糖核苷酸(如糖核苷酸的糖基-胺衍生物)也适用于本发明的方法。例如，糖基胺(没有改性基团)可以酶法结合到肽(或其它物质)而游离的糖基胺部分随后结合到所需的改性基团。或者，改性糖核苷酸可起酶底物的作用，该酶转移改性糖到底物上的糖基受体，如肽、糖肽、脂质、苷元(aglycone)、糖脂等。
在一个实施方案中，糖结合到支化聚合物物质，如在此说明的那些。
在另一个实施方案中，糖部分是改性唾液酸。当唾液酸是糖时，唾液酸被改性基团在丙酮基(pyruvyl)侧链上的9-位置或在胺部分上的5-位置改性，该胺部分正常地在唾液酸中乙酰化。
在另一个实施方案中，其中糖核是半乳糖或葡萄糖，R5是NHC(O)Y。
在例示的实施方案中，改性糖基于6-氨基-N-乙酰基-糖基部分。如以下对于N-乙酰半乳糖胺所示，6-氨基-糖部分容易由标准方法制备
(a.半乳糖氧化酶；NH4OAc，NaBH3CN；b. 在以上方案中，标记n表示1-2500，优选10-1500，和更优选10-1200的整数。符号″A″表示活化基团，如卤素、活化酯(如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)的组分、碳酸酯(如，对硝基苯基碳酸酯)的组分等。本领域技术人员将认识到其它PEG-酰胺核苷酸糖容易由此和类似方法制备。此外，如本文所述，支化聚合物可以取代线性PEG。
本发明的另一种例示的聚合物改性核苷酸糖具有如下通式，其中C-6位置是改性的 其中X6是键或O，J是S或O，而y是0或1。标记e和f独立地选自1-2500。
在其它例示的实施方案中，酰胺部分被基团(如尿烷或脲)代替。
在以下的讨论中，对适用于实施本发明的改性糖的许多具体例子进行了描述。在例示的实施方案中，唾液酸衍生物用作改性基团连接到其上的糖核。对唾液酸衍生物的讨论重点是仅为了清楚的说明而不应当解释为限制本发明的范围。本领域技术人员将认识到各种其它糖部分可以采用类似于使用唾液酸作为例子说明的方式活化和衍生。例如，许多方法可用于改性半乳糖，葡萄糖，N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖以命名一些糖底物，它们很容易被本领域公认的方法改性。参见，例如Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.6524(2000))。
在图2中，描述了根据本发明的通用方案。因此，根据图2，在甘露糖胺和受保护的氨基酸之间的酰胺结合物由如下方式形成在适当的条件下接触甘露糖胺与N-保护的氨基酸以形成结合物。受保护的氨基酸的羧基末端原位活化或它任选地转化成贮存稳定的反应性基团，如N-羟基-琥珀酰亚胺。氨基酸可以选自任何天然或非天然氨基酸。本领域技术人员理解如何在本发明的方法中保护侧链氨基酸免受不希望的反应。在适当的条件下酰胺结合物与丙酮酸盐和唾液酸醛缩酶反应以转化酰胺结合物成唾液酸酰胺结合物，它随后由唾液酸酰胺结合物与核苷酸磷酸前体和适当酶的反应，转化成核苷酸磷酸唾液酸酰胺结合物。在例示的实施方案中，前体是胞苷三磷酸而酶是合成酶。在核苷酸糖的形成之后，氨基酸胺被解保护，提供游离的、反应性胺。胺被用作结合改性部分到核苷酸糖的部位。在图2中，例示的改性部分为水溶性聚合物，即聚(乙二醇)，如PEG，m-PEG等。
本发明进一步在图3中举例说明，它描述了制备唾液酸-甘氨酰-PEG-胞苷一磷酸的方案。相似于图2中说明的方案，图3源自甘露糖胺。糖采用FMOC-甘氨酸，使用受保护的氨基酸的N-羟基琥珀酰亚胺活化衍生物结合。由唾液酸醛缩酶对结合物和丙酮酸盐的作用将获得的酰胺结合物转化成对应的唾液酸。使用胞苷三磷酸和合成酶将获得的唾液酸结合物转化成胞苷一磷酸类似物。通过从氨基酸胺部分脱除保护基团解保护CMP-类似物，将此部分转化成用于结合反应(conjugation)的反应性部位。胺部分与活化PEG物质(m-PEG-O-硝基苯基碳酸酯)反应，由此形成唾液酸-甘氨酰-PEG-胞苷一磷酸。
基于唾液酸的例示的糖核具有如下通式 其中D是-OH或(R11)w′-L-。符号G表示H、(R11)w′-L-或-C(O)(C1-C6)烷基。R11如以上所述。D和G中的至少一个是R11-L-。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括如下结构的糖、活化糖或糖核苷酸 其中L2如在对L的论述中所述，如键、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的杂烷基。标记e表示1-约2500的整数。
在另一个实施方案中，糖或糖核苷酸包括如下结构 其中s选自0-20的整数，而e是1-2500。
由支化聚合物官能化的选择的基于唾液酸的核苷酸糖具有如下通式 其中AA是氨基酸残基，PEG是聚(乙二醇)或甲氧基-聚(乙二醇)而NP是核苷酸，它通过磷酸二酯键(″核苷酸磷酸″)连接到糖基部分。本领域技术人员将认识到ONP可以由在此讨论的活化部分替代。
在进一步的实施方案中，唾液酸衍生物的结构是选自如下的成员 其中X6是键或O，而J是S或O。标记a，b和c独立地选自0-20，而e和f独立地选自1-2500。
此外，如以上讨论的那样，本发明提供了由水溶性聚合物改性的核苷酸糖，它是直链或支化的。例如，具有以下所示通式的化合物在本发明的范围内 其中X6是键或O，而J是S或O。标记e和f独立地选自1-2500。
也提供了包括本发明组合物的肽和糖肽、脂质和糖脂的结合物。结合物由如下方式形成；在适当的条件下结合本发明的核苷酸糖或活化糖和底物与糖部分的适当受体部分和酶(改性核苷酸糖是该酶的底物)，以将改性糖从核苷酸糖转移到受体部分上。例如，本发明提供了具有如下通式的结合物
其中J和X6如以上所讨论。标记a，b，c，e和f如以上所讨论。
本发明的选择的化合物基于具有甘露糖、半乳糖和葡萄糖的立体化学的物质。这些化合物的通式是 其中R3-R6之一是改性部分，如聚合物改性部分或聚合物改性部分-连接基构建物。
如以上讨论的那样，本发明的某些化合物是聚合物改性的糖核苷酸。以它们的改性形式用于本发明的例示的糖核苷酸包括核苷酸单-，二-或三磷酸或其类似物。在优选的实施方案中，改性糖核苷酸选自UDP-糖苷，CMP-糖苷，或GDP-糖苷。甚至更优选，改性糖核苷酸选自UDP-半乳糖，UDP-半乳糖胺，UDP-葡萄糖，UDP-葡糖胺，GDP-甘露糖，GDP-岩藻糖，CMP-唾液酸，或CMP-Sia。在例示的实施方案中，核苷酸单-二-或三-磷酸连接到C-1。
糖核苷酸的糖基-胺衍生物也适用于本发明的方法。例如，糖基胺(没有改性基团)可以酶法结合到肽(或其它物质)而游离糖基胺部分随后结合到所需的改性基团。
本发明的糖核苷酸结合物通常由如下通式描述 其中符号如以上讨论的表示基团。当糖核是甘露糖时，聚合物改性部分优选在R3，R4或R6。对于葡萄糖，聚合物改性部分任选地在R5或R6。标记″u″是0，1或2。
基于GDP甘露糖的本发明的进一步例示的核苷酸糖具有如下结构 在进一步例示的实施方案中，本发明提供了基于UDP半乳糖具有如下结构的结合物 在另一个例示的实施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖并具有如下通式 在三个前述通式的每一个中，基团和标记的同一性如以上所讨论。
对本领域技术人员显而易见的是，线性PEG部分可以被支化聚合物或在此所述的其它线性聚合物物质替代。
在一个实施方案中，其中糖核是半乳糖或葡萄糖，R5是NHC(O)Y。
水不溶性聚合物在另一个实施方案中，类似于以上讨论的那些，改性糖包括水不溶性聚合物，而不是水溶性聚合物。水不溶性聚合物，象水溶性聚合物一样，典型地由至少两个聚合物单元组成。在一个例示的实施方案中，聚合物由2-25个聚合物单元组成。在另一个例示的实施方案中，聚合物由2-8个聚合物单元组成。本发明的结合物也可包括一种或多种水不溶性聚合物。本发明的此实施方案通过使用结合物作为载体而说明，采用该载体以受控方式输送治疗肽。聚合物药物输送(传递，delivery)系统是本领域已知的。参见，例如Dunn等人，Eds.聚合物药物和药物输送系统，ACS学术讨论会丛刊Vol.469，美国化学会，Washington，D.C.1991。本领域技术人员将认识到基本上任何已知的药物输送系统均适用于本发明的结合物。
代表性水不溶性聚合物包括，但不限于聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚亚烷基对苯二甲酸酯、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚卤乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、泊洛沙姆类和聚乙烯基苯酚及其共聚物。
用于本发明结合物的合成改性天然聚合物包括，但不限于烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、和硝基纤维素。一大类合成改性天然聚合物的特别优选成员包括，但不限于甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧甲基纤维素、三乙酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、和丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物和海藻酸。
在此讨论的这些和其它聚合物可以容易地从商业来源如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)，Polysciences(Warrenton，PA.)，Aldrich(Milwaukee，WI.)，Fluka(Ronkonkoma，NY)，和BioRad(Richmond，CA)获得，或从这些供应商获得的单体使用标准技术合成。
用于本发明结合物的代表性生物可降解聚合物包括，但不限于聚交酯、聚乙醇酸交酯及其共聚物、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(交酯-共-己内酯)、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)、聚酸酐、聚原酸酯，其共混物和共聚物。特别有用的是形成凝胶的组合物，如包括胶原，泊洛沙姆类等的那些。
用于本发明的聚合物包括″杂合″聚合物，该杂合聚合物包括在它们结构的至少一部分中含有生物再吸收分子的水溶性材料。这样的聚合物的例子是包括水不溶性共聚物的聚合物，该共聚物每个聚合物链含有可生物再吸收区域，亲水性区域和多个可交联官能团。
对于本发明的目的，″水不溶性材料″包括基本不溶于水或含水环境的材料。因此，尽管共聚物的某些区域或链段可以是亲水性或甚至水溶性的，聚合物分子作为整体在任何基本的量度不溶于水。
对于本发明的目的，术语″可生物再吸收分子″包括能够代谢或破坏和再吸收和/或通过身体的正常排泄途径消除的区域(部分)。这样的代谢产物或降解产物优选对身体是基本非毒性的。
可生物再吸收区域可以是疏水性或亲水性的，只要共聚物作为整体不变成水溶性的。因此，可生物再吸收区域根据优先选择使得聚合物作为整体不溶于水。因此，选择相对性能，即由可生物再吸收区域包含的官能团的种类，和可生物再吸收区域与亲水性区域的相对比例以保证有用的可生物再吸收组合物保持水不溶性的。
例示的可再吸收聚合物包括，例如聚(α-羟基-羧酸)/聚(氧化烯)的合成生产的可再吸收嵌段共聚物(参见Cohn等人，美国专利号4,826,945)。这些共聚物不交联并且是水溶性的，从而使得身体可排泄降解的嵌段共聚物组合物。参见Younes等人，J Biomed.Mater.Res.211301-1316(1987)；和Cohn等人，J Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。
目前优选的可生物再吸收聚合物包括一种或多种选自如下的组分聚(酯)、聚(羟基酸)、聚(内酯)、聚(酰胺)、聚(酯-酰胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(膦嗪)、聚(磷酸酯)、聚(硫代酯)、多糖及其混合物。仍然更优选，可生物再吸收聚合物包括聚(羟基)酸组分。在聚(羟基)酸中，优选是聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。
除形成体内吸收(″生物再吸收″)的片段以外，用于本发明方法的优选聚合物包衣也可形成可分泌和/或可代谢片段。
更高等级共聚物也可用于本发明。例如，Casey等人，美国专利号4,438,253，它在1984年3月20日公开，公开了从聚(乙醇酸)和羟基封端聚(亚烷基二醇)的酯交换生产的三-嵌段共聚物。公开了这样的组合物用作可再吸收单丝缝合线。这样组合物的灵活性由芳族原碳酸酯(如四-对甲苯基原碳酸酯)向共聚物结构中的引入控制。
也可以采用基于乳酸和/或乙醇酸的其它聚合物。例如，Spinu，美国专利号5,202,413，它在1993年4月13日公开，公开了可生物降解多嵌段共聚物，该共聚物含有聚交酯和/或聚乙醇酸交酯的按顺序定向嵌段，由交酯和/或乙醇酸交酯到低聚物二醇或二元胺上的开环聚合，随后采用二官能化合物，如二异氰酸酯、二酰基氯、或二氯硅烷的扩链而生产。
用于本发明的包衣的可生物再吸收区域可以设计为可水解和/或酶裂解的。对于本发明的目的，″可水解裂解的″表示共聚物，特别地可生物再吸收区域对水或含水环境中水解的易感性。相似地，在此使用的″可酶裂解的″表示共聚物，特别是可生物再吸收区域对由内源或外源酶的裂解的易感性。
当放入体内时，亲水性区域可以加工成可排泄和/或可代谢片段。因此，亲水性区域可包括，例如聚醚、聚环氧烷烃、多元醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚(烷基_唑啉)、多糖、碳水化合物、肽、蛋白质及其共聚物和混合物。此外，亲水性区域也可是，例如聚环氧烷烃。这样的聚环氧烷烃可包括，例如聚(环氧乙烷)、聚(环氧丙烷)及其混合物和共聚物。
是水凝胶组分的聚合物也用于本发明。水凝胶是能够吸收相对大数量水的聚合物材料。水凝胶形成化合物的例子包括，但不限于聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、角叉菜胶和其它多糖、羟基亚乙基甲基丙烯酸(HEMA)，以及其衍生物等。可以生产稳定，可生物降低和可生物再吸收的水凝胶。此外，水凝胶组合物可包括显示一种或多种这些性能的亚单元。
其整体性可以通过交联控制的生物兼容性水凝胶组合物是已知的和目前优选用于本发明的方法。例如，Hubbell等人，U.S.专利Nos.5,410,016，它在4月25，1995和5,529,914，它在1996年6月25日公开，公开了水溶性体系，该体系是含有在两个水解不稳定延伸物之间夹入的水溶性中心嵌段链段的交联嵌段共聚物。这样的共聚物进一步由可光聚合的丙烯酸酯官能团封端。当交联时，这些体系成为水凝胶。这样共聚物的水溶性中心嵌段可包括聚(乙二醇)；然而水解不稳定延长物可以是聚(α-羟基酸)，如聚乙醇酸或聚乳酸。参见Sawhney等人，Macromolecules 26581-587(1993)。
在另一个实施方案中，凝胶是热可逆凝胶。目前优选的是包括组分，如泊洛沙姆类、胶原、明胶、透明质酸、多糖、聚氨酯水凝胶、聚氨酯-脲水凝胶及其组合的热可逆凝胶。
在仍然另一个例示的实施方案中，本发明的结合物包括脂质体的组分。脂质体可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如在Eppstein等人，美国专利号4,522,811中所述，该文献在1985年6月1日公开。例如，脂质体制剂可以由如下方式制备在无机溶剂中溶解适当的脂质(如硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、硬脂酰基磷脂酰胆碱，花生酰基磷脂酰胆碱，和胆固醇)，然后蒸发该溶剂，在容器表面上留下干燥脂质的薄膜。然后将活性化合物或其药用盐的水溶液引入容器。然后由手将容器起漩涡以从容器侧面释放脂质材料和分散脂质聚集体，因此形成脂质体悬浮液。
上述微粒子和制备微粒子的方法通过例子提供了和它们不希望限定用于本发明的微粒子的范围。对本领域技术人员显然的是由不同方法制造的微粒子的阵列用于本发明。
在直链和支化两者的水溶性聚合物的论述中以上讨论的结构格式对于水不溶性聚合物通常也是适用的。因此，例如半胱氨酸、丝氨酸、二赖氨酸和三赖氨酸支化核可以由两个水不溶性聚合物部分官能化。用于生产这些物质的方法通常很类似于用于生产水溶性聚合物的那些。
治疗性糖肽的体内半衰期也可以由PEG部分如聚乙二醇(PEG)提高。例如，蛋白质被PEG的化学改性(PEG化)增加了它们的分子大小并降低它们的表面和官能团-可及性，它们每个依赖于连接到蛋白质的PEG的大小。这导致血浆半衰期的改进并导致蛋白质水解稳定性，以及免疫原性和肝吸收的降低(Chaffee等人J.Clin.Invest.891643-1651(1992)；Pyatak等人Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29113-127(1980))。有报导白细胞介素-2的PEG化增加了它的体内抗瘤效力(Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.841487-1491(1987))而衍生自单克隆抗体A7的F(ab′)2的PEG化改进它的肿瘤定位(Kitamura等人Biochem.Biophys.Res.Commun.281387-1394(1990))。因此，在另一个实施方案中，采用PEG部分用本发明的方法衍生的肽的体内半衰期相对于非衍生肽的体内半衰期有所增加。
肽体内半衰期的增加最好表达为此数量的百分比增加。百分比增加范围的下限是约40％，约60％，约80％，约100％，约150％或约200％。范围的上限是约60％，约80％，约100％，约150％，或大于约250％。
改性糖的制备通常，糖部分和改性基团通过使用反应性基团连接在一起，该反应性基团典型地由连接过程转变成新的有机官能团或非反应性物质。糖反应性官能团位于糖部分上的任何位置。用于实施本发明的反应性基团和反应类别通常是生物结合物化学领域公知的那些。可用于反应性糖部分的目前有利的反应类型是在相对温和条件下进行的那些。这些包括，但不限于亲核取代(如，胺和醇与酰卤，活性酯的反应)，亲电取代(如，烯胺反应)以及到碳-碳和碳-杂原子多键的加成(如，Michael反应，Diels-Alder反应)。这些和其它有用的反应讨论于，例如March，高级有机化学，3rd Ed.，John Wiley & Sons，纽约，1985；Hermanson，生物结合物技术，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，蛋白质改性；化学进展系列，Vol.198，美国化学会，Washington，D.C.，1982。
从糖核、连接基前体或聚合物改性部分前体悬垂的有用反应性官能团包括，但不限于(a)羧基及其各种衍生物，包括，但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-羟基苯并三唑酯，酰卤，酰基咪唑，硫代酯，对硝基苯基酯，烷基，烯基，炔基和芳族酯；(b)羧基，它可以转化成，如酯，醚，醛等。
(c)卤代烷基，其中卤化物可以之后被亲核基团，例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、负碳离子或醇盐离子置换，因此导致新基团在卤素原子官能团的共价连接；(d)亲二烯体(dienophile)基团，它能够参与Diels-Alder反应，例如马来酰亚氨基(maleimido)；(e)醛或酮基，使得随后的衍生通过羰基衍生物如，例如亚胺，腙，缩氨基脲或肟的形成，或通过机理如格氏加成或烷基锂加成是可能的；(f)为与胺的随后反应(例如以形成磺酰胺)的磺酰卤；(g)硫醇基团，它可以，例如转化成二硫化物或与酰卤反应；(h)胺或巯基，它可以，例如酰基化，烷基化或氧化；(i)烯烃，它可经历，例如环加成，加成，Michael加成等；和(j)环氧化物，它可以与，例如胺和羟基化合物反应。
可以选择反应性官能团使得它们不参与，或干扰必须组装反应性糖核或改性基团的反应。或者，可以由保护基团的存在保护反应性官能团以不参与反应。本领域技术人员理解如何保护特定的官能团使得它不干扰选择的成套反应条件。对于有用的保护基团的例子参见，例如Greene等人，有机合成中的保护基团，John Wiley & Sons，纽约，1991。
在以下的讨论中，说明用于实施本发明的改性糖的具体例子。在例示的实施方案中，唾液酸衍生物用作改性基团连接到其上的糖核。对唾液酸衍生物的讨论重点是仅为了清楚的说明而不应当解释为限制本发明的范围。本领域技术人员认识到各种其它糖部分可以采用类似于使用唾液酸作为例子说明的方式活化和衍生。例如，许多方法可用于改性半乳糖，葡萄糖，N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖以命名几个糖底物，它们容易由本领域公认的方法改性。参见，例如Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.6524(2000))。
在以下的方案1中，将氨基糖苷1采用受保护的氨基酸(如，甘氨酸)衍生物的活性酯处理，将糖胺残基转化成对应的受保护的氨基酸酰胺加合物。将加合物采用醛缩酶处理以形成α-羟基羧酸酯2。将化合物2通过CMP-SA合成酶的作用转化成对应的CMP衍生物，随后进行CMP衍生物的催化氢化以生产化合物3。通过化合物3与活化的(m-)PEG或(m-)PPG衍生物(如，PEG-C(O)NHS，PPG-C(O)NHS)反应，通过甘氨酸加合物的形成引入的胺用作PEG或PPG连接的部位，分别产生4或5。
方案1如本领域技术人员认识到的那样，聚合物改性部分也可以是支化部分，如在此描述的那些。
以下提供了制备本发明的支化聚合物改性糖的例示的方案 以下说明制备本发明的聚合物改性糖的另一个例示的方案 表1说明由聚合物改性部分(如支化-或直链PEG或PPG部分)衍生的糖单磷酸酯的代表性例子。表1的某些化合物由方案1的方法制备。其它衍生物由本领域公认的方法制备。参见，例如Keppler等人，Glycobiology1111R(2001)；和Charter等人，Glycobiology 101049(2000))。其它胺反应性聚合物改性部分前体和组分，如PEG和PPG类似物是市售的，或者它们可以由本领域技术人员容易得到的方法制备。
表1 其中R是聚合物(支化或直链)改性部分。
用于实施本发明的改性糖磷酸酯可以在其它位置以及以上说明的那些被取代。唾液酸的目前优选取代在以下通式中说明 其中一个或多个Xc，Ya，Yb，Yc和Z是连接基团，其优选选自-O-、-N(H)-、-S，CH2-，和N(R)2。当Xc，Ya，Yb，Yc和Z是连接基团时，它连接到聚合物改性部分，如Rc，Rd，Re，Rf和Rg所示。或者，这些符号表示结合到支化-或直链水溶性或水不溶性聚合物、治疗部分、生物分子或其它部分的连接基。当Rc，Rd，Re，Rf或Rg不是聚合物改性部分时，XcRc，YaRd，YbRe，YcRf或ZRg的组合是H、OH或NC(O)CH3。
还提供了生产活化唾液酸-聚合物改性基团结合物的方法，该结合物是酶的适当底物，该酶转移改性糖部分到受体上，如糖基转移酶。该方法包括如下步骤(a)在适当的条件下使甘露糖胺与活化的N-保护的氨基酸(或由聚合物改性部分，连接基前体或连接基-聚合物改性部分组合体官能化的氨基酸)接触以在甘露糖胺和N-保护的氨基酸之间形成酰胺结合物；(b)在适当的条件下使酰胺结合物与丙酮酸盐和唾液酸醛缩酶接触以转化酰胺结合物成唾液酸酰胺结合物；(c)在适当的条件下使唾液酸酰胺结合物与胞苷三磷酸和合成酶接触以形成胞苷一磷酸唾液酸酰胺结合物；(d)从胞苷一磷酸唾液酸酰胺结合物脱除N-保护基团，因此产生游离胺；和(e)使游离胺与活化的PEG(直链或支化)接触，由此形成胞苷一磷酸唾液酸-聚(乙二醇)。
交联基团用于本发明方法的改性糖的制备包括改性基团到糖残基的连接和形成稳定加合物，它是糖基转移酶的底物。糖和改性基团可以通过零-或更高级交联剂偶合。可用于连接改性基团到碳水化合物部分的例示的双官能化合物包括但不限于双官能聚(乙二醇)、聚酰胺、聚醚、聚酯等。连接碳水化合物到其它分子的通用过程是文献中已知的。参见，例如Lee等人，Biochemistry 281856(1989)；Bhatia等人，Anal.Biochem.178408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)和Bednarski等人，WO 92/18135。在以下的讨论中，将反应性基团处理为新生改性糖的糖部分上良性的。讨论的重点是为了清楚的说明。本领域技术人员将认识到讨论也与改性基团上的反应性基团相关。
例示的策略涉及使用杂双官能交联剂SPDP(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯将被保护巯基引入到糖上，然后解保护巯基，从而形成与改性基团上的另一个巯基的二硫键。
许多试剂适用于采用分子内化学交联物改性改性糖的组分(对于交联试剂和交联过程的综述参见Wold，F.，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.，和Cooney，D.A.，InENZYMES ASDRUGS.(Holcenberg，和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，纽约，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，所有文献在此引入作为参考)。优选的交联试剂衍生自各种零长度、均-双官能、和杂-双官能交联试剂。零-长度交联试剂包括两个内在化学基团的直接结合(而没有引入外部材料)。
改性糖到肽的结合使用介导结合的适当酶，将改性糖结合到糖基化或非糖基化肽。因此，本发明的化合物，特别是核苷酸糖优选是酶的底物，该酶从核苷酸糖转移糖部分到氨基酸、糖基、或苷元受体部分上。用作受体(如半乳糖基受体)的糖给体的核苷酸糖，所述半乳糖基受体例如GalNAc，Galβ1，4GlcNAc，Galβ1，4GalNAc，Galβ1，3GalNAc，乳糖-N-四糖，Galβ1，3GlcNAc，Galβ1，3Ara，Galβ1，6GlcNAc，Galβ1，4Glc(乳糖)，以及本领域技术人员公知的其它受体(参见，如Paulson等人，J.Biol.Chem.2535617-5624(1978))。
本发明的改性核苷酸糖是其底物的例示的酶包括糖基转移酶。糖基转移酶可以是克隆的，或从任何来源分离。许多克隆的糖基转移酶是已知的，如它们的多核苷酸序列。参见，如″克隆糖基转移酶的WWW指导，″(http://www.vei.co.uk/TGN/gt guide.htm)。糖基转移酶氨基酸序列和从其可以推论出氨基酸序列的编码糖基转移酶的核苷酸序列也发现于各种公开的可利用的数据库，包括GenBank，Swiss-Prot，EMBL，和其它。
本发明的化合物为其底物的糖基转移酶包括，但不限于半乳糖转移酶，岩藻糖基转移酶，葡萄糖基转移酶，N-乙酰半乳糖氨基转移酶，N-乙酰葡糖氨基转移酶，葡萄糖醛酰基转移酶，唾液酸转移酶，甘露糖基转移酶，葡糖醛酸转移酶，半乳糖醛酸转移酶，和寡糖基转移酶。合适的糖基转移酶包括从真核生物，以及原核生物获得的那些。
在一些实施方案中，本发明的化合物是岩藻糖基转移酶的底物。岩藻糖基转移酶是本领域技术人员通常已知的，例示的为从GDP-岩藻糖转移L-岩藻糖到受体糖羟基位置的酶。
在另一组实施方案中，化合物是半乳糖转移酶的底物。例示的半乳糖转移酶包括α(1，3)半乳糖转移酶(E.C.No.2.4.1.151，参见，如Dabkowski等人，Transplant Proc.252921(1993)和Yamamoto等人Nature 345229-233(1990)，牛的(GenBank j04989，Joziasse等人，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))，鼠类(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989))，猪的(GenBank L36152；Strahan 等人，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一种合适的α1，3半乳糖转移酶涉及B血型抗原的合成(EC2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人类))。仍然进一步的例示的半乳糖转移酶是核Ga1-T1。仍然进一步的例子包括β(1，4)半乳糖转移酶，它包括，例如EC2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛的(D′Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183211-217(1989)，人类(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))，鼠类(Nakazawa等人，J.Biochem.104165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖转移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38234-242(1994))。其它合适的半乳糖转移酶包括，例如α1，2半乳糖转移酶(如来自，Schizosaccharomyces pombe，Chapell等人，Mol.Biol.Cell 5519-528(1994))。在本发明实施中也合适的是α1，3-半乳糖转移酶的可溶解形式，如由Cho等人，J.Biol.Chem.，27213622-13628(1997)报导。
a)唾液酸转移酶唾液酸转移酶是本发明的化合物为其底物的另一种类型糖基转移酶。例子包括ST3Gal III(如，鼠或人类ST3Gal III)，ST3Gal IV，ST3Gal I，ST6Gal I，ST3Gal V，ST6Gal II，ST6Gal NAc I，ST6Gal NAcII，和ST6Gal NAc III(在此使用的唾液酸转移酶命名法如描述于Tsuji等人，Glycobiology 6v-xiv(1996))。称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)的例示的α(2，3)唾液酸转移酶将唾液酸转移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原末端Gal。参见Vanden Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1981)，Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982)和Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一种例示的α2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)转移唾液酸到二糖或糖苷的非还原末端Gal。参见Rearick等人，J.Biol.Chem.2544444(1979)和Gillespie等人，J.Biol.Chem.26721004(1992)。进一步的例示的酶包括Ga1-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸转移酶(参见Kurosawa等人Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。本发明的化合物为其底物的其它唾液酸转移酶包括形成聚唾液酸的那些。例子包括α-2，8-聚唾液酸转移酶，如ST8SiaI，ST8SiaII，ST8SiaIII，ST8SiaIV和ST8SiaV。参见例如，Angata等人J.Biol.Chem.27518594-18601(2000)；Kono等人，J.Biol.Chem.27129366-29371(1996)；Greiner等人，Infect.Immun.724249-4260(2004)；和Jones等人，J.Biol.Chem.27714598-14611(2002)。
用于要求保护的方法的唾液酸转移酶的例子是ST3Gal III，它也称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)。此酶催化唾液酸到类别Galβ1，3GlcNAc或类别Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal的转移(参见，如Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1991))。仍然进一步的唾液酸转移酶包括从空肠弯曲杆菌分离的那些，包括α(2，3)。参见如W099/49051。
优选，本发明的化合物是酶的底物，该酶转移改性唾液酸到序列Galβ1，4GlcNAc-，在完全唾液酸化碳水化合物结构上在末端唾液酸下面的最通常的次末级序列。
b)GalNAc转移酶本发明的选择的化合物是N-乙酰半乳糖氨基转移酶的底物。例示的N-乙酰半乳糖氨基转移酶包括，但不限于α(1，3)N-乙酰半乳糖氨基转移酶，β(1，4)N-乙酰半乳糖氨基转移酶(Nagata等人，J.Biol.Chem.26712082-12089(1992)和Smith等人，J.Biol.Chem.26915162(1994)和多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Homa等人，J.Biol.Chem.26812609(1993))。
c)糖苷酶本发明也包括对于野生型和突变体糖苷酶的底物。突变体β-半乳糖苷酶已显示为催化通过α-糖基氟化物到半乳糖基受体分子的偶合形成二糖。(Withers，U.S.Pat.No.6284494；2001年9月4日)。适用于本发明的其它糖苷酶包括，例如β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-乙酰葡萄糖胺酶、β-N-乙酰半乳糖胺酶、β-木糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、半纤维素酶、淀粉酶、葡萄糖胺酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-N-乙酰葡萄糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、α-木糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、和神经氨酸酶/唾液酸酶、内切神经酰胺糖苷酶。
具体实施例方式
提供了如下实施例以说明本发明的选择性实施方案但不应解释为限制它的范围。
实施例实施例1制备UDP-GalNAc-6′-CHO将UDP-GalNAc(200mg，0.30mmol)溶于1mM CuSO4溶液(20mL)和25mM NaH2PO4溶液(pH 6.0；20mL)。然后加入半乳糖氧化酶(240U；240μL)和过氧化氢酶(13000U；130μL)，将装备有气室的反应系统用氧气填充并在室温下搅拌几天。然后过滤反应混合物(旋转盒；MWCO 5K)并将滤液(～40mL)在4℃下贮存直到需要时。TLC(二氧化硅；EtOH/水(7/2)；Rf＝0.77；采用茴香醛染色显现)。
实施例2制备UDP-Gal NAc-6′-NH2)将乙酸铵(15mg，0.194mmol)和NaBH3CN(1M THF溶液；0.17mL，0.17mmol)在0℃下加入上面得到的UDP-Ga lNAc-6′-CHO溶液(2mL或～20mg)并允许升温到室温过夜。将反应通过G-10柱过滤并收集水和产物。将适当的级分冷冻干燥和冷冻贮存。TLC(二氧化硅；乙醇/水(7/2)；Rf＝0.72；采用宁海德林试剂显现)。
实施例3制备UDP-GalNAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1 KDa)。
将半乳糖胺基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)(58mg，0.045毫摩尔)溶于DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)。然后加入UMP-吗啉酸酯(60mg，0.15毫摩尔)，将获得的混合物在70℃下搅拌48h。通过反应混合物鼓氮气脱除溶剂，由反相色谱精制残余物(C-18二氧化硅，步骤梯度10-80％，甲醇/水)。收集所需的级分并在减压下干燥以得到白色固体。TLC(二氧化硅，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)观测值，1485，1529，1618，1706。
实施例4制备半胱氨酸-PEG2(2)
4.1合成化合物1在氩气下将氢氧化钾(84.2mg，1.5mmol，作为粉末)加入L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)在无水甲醇(20L)中的溶液。将混合物在室温下搅拌30min，和然后分几个部分在2小时内加入分子量为20千道尔顿的mPEG-O-甲苯磺酸酯(Ts；1.0g，0.05mmol)。将混合物在室温下搅拌5天，和由旋转蒸发浓缩。将残余物采用水(30mL)稀释，和在室温下搅拌2小时以破坏任何过量的20千道尔顿mPEG-O-甲苯磺酸酯。将溶液然后采用乙酸中和，pH调节到pH 5.0，装载到反相色谱(C-18二氧化硅)柱上。将柱采用甲醇/水的梯度洗脱(产物在约70％甲醇下洗脱)，产物洗脱由蒸发性光散射监测，收集适当的级分并采用水(500mL)稀释。将此溶液进行色谱分析(离子交换，XK 50 Q，BIG Beads，300ml，氢氧化物形式；水对水/乙酸的梯度-0.75N)，将适当级分的pH采用乙酸降低到6.0。然后将此溶液在反相柱(C-18二氧化硅)上捕集，采用上述甲醇/水梯度洗脱。将产物级分汇集、浓缩、再溶于水并冷冻干燥以提供白色固体(1)。化合物的结构数据如下1H-NMR(500 MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH3O)，3.7(t，OCH2CH2O)，3.95(q，1H，CHN)。产物的纯度由SDS PAGE确认。
4.2合成化合物2(半胱氨酸-PEG2)将三乙胺(～0.5mL)滴加到溶于无水CH2Cl2(30mL)的化合物1(440mg，22μmol)的溶液直到溶液为碱性。将20千道尔顿mPEG-O-对硝基苯基碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg，30.8μmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液分几个部分在1小时内在室温下加入。将反应混合物在室温下搅拌24小时。然后通过旋转蒸发脱除溶剂，将残余物溶于水(100mL)，采用1.0N NaOH调节pH到9.5。将碱性溶液在室温下搅拌2小时，然后采用乙酸中和到pH 7.0。然后将溶液装载到反相色谱(C-18二氧化硅)柱上。将柱采用甲醇/水进行梯度洗脱(产物在约70％甲醇下洗脱)，由蒸发性光散射监测产物洗脱，收集适当的级分并采用水(500mL)稀释。将此溶液进行色谱分析(离子交换，XK 50 Q，BIG Beads，300ml，氢氧化物形式；水对水/乙酸的梯度-0.75N)，将适当级分的pH采用乙酸降低到6.0。然后将此溶液在反相柱(C-18二氧化硅)上捕集并采用上述甲醇/水梯度洗脱。将产物级分汇集、浓缩、再溶于水并冷冻干燥以提供白色固体(2)。化合物的结构数据如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ 2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，2.95(t，2H，O-C-CH2-S)，3.12(q，1H，S-CHH-CHN)，3.39(s，3H CH3O)，3.71(t，OCH2CH2O)。产物的纯度由SDS PAGE确认。
实施例5制备UDP-GalNAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1 KDa)。
将半乳糖胺基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1千道尔顿)(58mg，0.045毫摩尔)溶于DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)。然后加入UMP-吗啉酸酯(60mg，0.15毫摩尔)，将获得的混合物在70℃下搅拌48小时。通过反应混合物鼓氮气脱除溶剂，由反相色谱精制残余物(C-18二氧化硅，步骤梯度10-80％，甲醇/水)。收集所需的级分，在减压下干燥以得到白色固体。TLC(二氧化硅，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)观察值，1485，1529，1618，1706。
SDS PAGE过程产物1和2的纯度由SDS PAGE确认。使用4-20％Tris-甘氨酸SDSPAGE凝胶(Invitrogen)。将样品与SDS样品缓冲剂1∶1混合，在Tris-甘氨酸运行缓冲剂(LC2675-5)中在恒定电压(125V)下运行1小时50min。在电泳之后，将凝胶采用水(100mL)洗涤10min，随后采用5％氯化钡水溶液(100mL)洗涤10min。通过采用0.1N碘溶液(4.0mL)在室温下染色凝胶显现产物1或2，通过用水洗涤凝胶停止染色过程。将显现的产物谱采用HP Scanjet 7400C扫描，采用HP Precision ScanProgram优化凝胶的图像。
尽管参考具体的实施方案公开了本发明，显然的是本发明的其它实施方案和变化形式可以由本领域技术人员设计而不背离本发明的真实精神和范围。
在此申请中引用的所有专利、专利申请和其它出版物在此对于所有的目的全文引入作为参考。
权利要求
1.通式为选自如下的成员的化合物 和 其中R1是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7表示H、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的杂烷基；R2是选自如下的成员H、OH、活化基团和包括核苷酸的部分；R3，R4，R5，R6和R6′独立地选自H、取代或未取代的烷基、OR9、和NHC(O)R10其中R9和R10独立地选自H、取代或未取代烷基或取代或未取代的杂烷基，而R3，R4，R5，R6和R6′的至少一个包括聚合物改性部分。
2.根据权利要求1的化合物，其中R2具有如下通式 其中R8是核苷。
3.根据权利要求2的化合物，其中R8是选自胞嘧啶、尿苷、鸟苷、腺苷和胸苷的成员。
4.根据权利要求1的化合物，其中R3，R4，R5和R6的至少一个包括如下部分 其中R11是聚合物改性部分；L是选自键和连接基团的成员；而w选自1-6的整数。
5.根据权利要求4的化合物，其中该连接基团是选自取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基部分的成员。
6.根据权利要求5的化合物，其中如下部分 具有通式 其中X2和X4独立地选自连接片段；Xa是连接片段；R12和R13是独立地选择的聚合物臂；而c是1-20的整数。
7.根据权利要求5的化合物，其中该连接基团具有如下通式 其中Xa和Xb是独立地选择的连接片段；而L1是选自键、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的杂烷基的成员。
8.根据权利要求7的化合物，其中Xa和Xb是独立地选自如下的连接片段S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH。
9.根据权利要求5的化合物，其中该连接基包括酰基部分。
10.根据权利要求9的化合物，其中L-R11具有如下通式 其中s是0-20的整数；而R11是该聚合物改性部分。
11.根据权利要求1的化合物，其中该聚合物改性部分具有如下通式 其中X2和X4独立地选自连接片段；X5是非反应性基团；而R12和R13独立地是选择的聚合物臂。
12.根据权利要求11的化合物，其中X2和X4是独立地选自如下的连接片段S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH和(CH2)gY″，其中g是1-50的整数；和Y″是选自O、S和NH的成员。
13.根据权利要求11的化合物，其中X4是肽键；和R13是氨基酸残基。
14.根据权利要求1的化合物，具有通式 其中D是选自-OH和(R11)w′-L-的成员；G表示选自H、(R11)w′-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成员；w′是2-6的整数，并且D和G的至少一个是(R11)w′-L-。
15.根据权利要求14的化合物，具有通式 和 其中La是选自取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基的成员。
16.根据权利要求1的化合物，具有通式 和 其中La是选自氨基酸残基和含有2-4个氨基酸残基的肽基残基的成员；X2和X4独立地选自连接片段；X5是非反应性基团；而R12和R13是独立地选择的聚合物臂。
17.根据权利要求16的化合物，具有如下通式 其中X2和X4独立地选自连接片段；Xa是连接片段；R12和R13是独立地选择的聚合物臂；和c是1-20的整数。
18.根据权利要求1的化合物，具有如下通式 其中AA-NH是氨基酸残基；和P是聚合物改性基团。
19.根据权利要求18的化合物，其中-AA-NH是-CH2NH。
20.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物是酶底物，所述酶从选自活化糖、核苷酸糖及其组合的成员转移糖部分到底物的受体部分。
21.根据权利要求20的化合物，其中所述受体部分是选自糖基残基，氨基酸残基和苷元的成员。
22.一种制备胞苷一磷酸唾液酸-聚(乙二醇)的方法，该方法包括(a)在适当的条件下使甘露糖胺与活化的N-保护的氨基酸接触以在该甘露糖胺和N-保护的氨基酸之间形成酰胺结合物；(b)在适当的条件下使该酰胺结合物与丙酮酸盐和唾液酸醛缩酶接触以转化该酰胺结合物成唾液酸酰胺结合物；(c)在适当的条件下使该唾液酸酰胺结合物与胞苷三磷酸和合成酶接触以形成胞苷一磷酸唾液酸酰胺结合物；(d)从该胞苷一磷酸唾液酸酰胺结合物脱除N-保护基团，由此产生游离胺；和(e)使该游离胺与活化的PEG接触，由此形成所述胞苷一磷酸唾液酸-聚(乙二醇)。
23.根据权利要求21的方法，其中该活化的N-保护的氨基酸具有如下结构式
全文摘要
本发明提供了在它们的结构中包括一个或多个聚合物改性部分的糖、核苷酸糖、活化糖。参考线性和支化聚合物，如水溶性聚合物聚(乙二醇)对本发明进行了举例说明。
文档编号C07H21/02GK101087801SQ200580003264
公开日2007年12月12日 申请日期2005年1月26日 优先权日2004年1月26日
发明者S·德弗雷斯, C·鲍 申请人:尼奥斯技术有限公司