抗真菌肽的制作方法

专利名称：抗真菌肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗真菌肽，特别是从昆虫中获得的抗真菌肽，所述昆虫特别是鳞翅昆虫(lepidopterans)。本发明也提供了应用这些抗真菌肽治疗或预防真菌生长的方法，所述方法被用于各种目的，例如预防植物的真菌感染、治疗动物(特别是人类)的真菌感染、以及预防食物腐败变质。
背景技术：
真菌是真核细胞生物，它们可以有性或无性地繁殖，并且可以是双相形式的，其在自然环境是一种形式，而在感染宿主体内是另一种不同的形式。植物和动物的真菌感染都是农业、医学和食品生产/储存领域的重大问题。因为多种原因，真菌感染正成为主要的关注点，所述原因包括有限数目的可用的抗真菌剂、耐较老抗真菌剂的物种的发生率的增加、以及对机会性真菌感染高危的免疫缺陷患者人群的增长。
人类的真菌病被称作霉菌病。一些霉菌病是地方性的，其中只在作为真菌的天然栖息地的地理区域内才会获得感染。这些地方性霉菌病通常是自限的，并且很少有症状。一些霉菌病主要是机会性的，出现于免疫缺陷患者体内，例如器官移植患者、进行化疗的肿瘤患者、烧伤患者、AIDS患者、或糖尿病酮症患者。
真菌引起了多种植物疾病，例如但不限于霉变、腐烂、锈病、黑穗病、和枯萎病等。例如，土壤中所带有的真菌性植物病原体在农业和园艺业上都造成了巨大的经济损失。具体地，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是表现出强致病性的主要的真菌性植物病原体之一，它与多种植物物种及品种的幼苗性疾病及叶疾病例如种子腐烂、根部腐烂、猝倒病、叶和茎的腐烂有关，造成了巨大的经济损失。另一个实例是辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)，它是广泛分布的以及高度损害性的土壤传播真菌性植物病原体，它造成了辣椒(Capsicum annuum L.)的根部腐烂和根茎腐烂以及叶、果实和茎的气生性枯萎病。
植物的真菌感染是潮湿气候中的特殊问题，它可以成为谷物储存中的主要问题。植物可以发育出某些程度的对致病性真菌的天然抗性，但是现代的生长方法、收获和储存系统时常给植物病原体提供良好的环境。抗真菌剂包括多烯衍生物，例如两性霉素B和结构相关的化合物如制霉菌素和匹马菌素。此外，已经从多种天然存在的来源中分离出了抗真菌肽(DeLucca and Walsh，1999)。但是，仍需要鉴定出更多的具有能在医学、农业和工业相关应用中所使用的抗真菌活性的化合物，以便控制和/或预防真菌生长。

发明内容
本发明者已经分离并表征了新的抗微生物肽，特别是抗真菌肽。因此，在本发明的第一个部分，提供了基本上纯化的肽，其包括选自以下一组的序列i)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；ii)与SEQ ID NO4具有至少60％相同性的氨基酸序列；iii)SEQ ID NO5所示的氨基酸序列；iv)与SEQ ID NO5具有至少80％相同性的氨基酸序列；v)SEQ ID NO48所示的氨基酸序列；vi)与SEQ ID NO48具有至少70％相同性的氨基酸序列；vii)SEQ ID NO53所示的氨基酸序列；viii)与SEQ ID NO53具有至少70％相同性的氨基酸序列；ix)i)到viii)中任一项的生物学活性片段；和x)包括i)到ix)中任一项的氨基酸序列的前体，
其中所述肽或其片段表现出抗真菌的和/或抗细菌的活性。
在第一个部分的优选实施方式中，有关的肽与SEQ ID NO4、SEQ IDNO5、SEQ ID NO48或SEQ ID NO53所示的序列具有至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少92％、更优选地至少95％、更优选地至少97％、以及甚至更优选地至少99％相同性。
优选地，SEQ ID NO4的前体是SEQ ID NO1或SEQ ID NO2，SEQID NO5的前体是SEQ ID NO3，SEQ ID NO48的前体是SEQ ID NO47，SEQ ID NO53的前体是SEQ ID NO52。
优选地，可以从昆虫中纯化出所述肽。更优选地，可以从鳞翅昆虫中纯化出所述肽。更优选地，可以从螟蛾科(Pyralidae)的鳞翅昆虫中纯化出所述肽。更优选地，可以从蜡螟(Galleria sp.)中纯化出所述肽。甚至更优选地，可以从大蜡螟(Galleria mellonella)中纯化出所述肽。
在特别优选的实施方式中，可以从已经被暴露于真菌或细菌感染的昆虫中纯化出所述肽。对于鳞翅昆虫而言，优选地可以从已经暴露于细菌(例如但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)和/或藤黄微球菌(Micrococcus luteus))的末龄幼虫中纯化出所述肽。
在另一个实施方式中，优选地，肽具有约4.5kDa到约3.3kDa之间的分子量。更优选地，肽具有约4.3kDa、约4.0kDa、或约3.6kDa的分子量。
仍在更优选的实施方式中，肽包括N末端的包括螺旋结构的两亲性区域(至少相对于C末端)、C末端的也包括螺旋结构和酸性残基的疏水性区域(至少相对于N末端)、和带电荷的C末端的尾部。
在更优选的实施方式中，肽包括氨基酸序列Xaa1Lys Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Ala Ile Lys Lys Gly Gly Xaa6Xaa7IleXaa8Lys Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Ala Xaa16Thr Ala HisXaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28Xaa29Xaa30(SEQ ID NO62)。
优选地，Xaa1是Gly、Pro、Ala或缺失，更优选地是Gly或缺失；优选地，Xaa2是Ile、Val、Ala、Leu、Met或Phe，更优选地是Ile或Val；优选地，Xaa3是Pro，Gly，Asn，Gln or His，更优选地是Pro或Asn；优选地，Xaa4是Ile、Val、Ala、Leu、Met或Phe，更优选地是Ile或Val；优选地，Xaa5是Lys、Arg、Gly、Pro、Ala、Asn、Gln或His，更优选地是Lys、Gly或Asn；优选地，Xaa6是Gln、Asn、His、Lys或Arg，优选地是Gln或Lys；优选地，Xaa7是Ile、Val、Ala、Leu或Gly、更优选地是Ile或Ala；优选地，Xaa8是Gly、Pro、Ala、Lys或Arg，更优选地是Gly或Lys；优选地，Xaa9是Val、Leu、Ile、Gly、Pro或Ala，更优选地是Ala或Gly；优选地，Xaa10是Ile、Val、Met、Ala、Phe或Leu，更优选地是Leu或Phe；优选地，Xaa11是Arg、Lys、Gly、Pro或Ala，更优选地是Arg、Gly或Lys；优选地，Xaa12是Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Leu、Met、或Phe，更优选地是Gly或Val；优选地，Xaa13是Ile、Leu、Val、Ala、Met或Phe，更优选地是Val、Ile或Leu；优选地，Xaa14是Asn、Gln、His、Gly、Pro、Ala、Ser或Thr，更优选地是Asn、Gly或Ser；优选地，Xaa15是Ile、Val、Ala、Leu或Gly，更优选地是Ile或Ala；优选地，Xaa16是Ser、Thr、Gly、Pro或Ala，更优选地是Ser或Gly；优选地，Xaa17是Asp或Glu；优选地，Xaa18是Ile、Leu、Val、Ala、Met或Phe，更优选地是Ile或Val；优选地，Xaa19是Ile、Leu、Val、Ala、Tyr、Trp或Phe，更优选地是Ile或Tyr；优选地，Xaa20是Ser、Thr、Asn、Gln、His、Glu或Asp，更优选地是Ser、Asn或Glu；优选地，Xaa21是Gln、Asn或His，更优选地是Gln或His；优选地，Xaa22是Phe、Leu、Val、Ala、Ile或Met，更优选地是Phe、Val或Ile；优选地，Xaa23是Lys或Arg；优选地，Xaa24是Pro、Gly、Asn、Gln或His，更优选地是Pro或Asn；优选地，Xaa25是Lys或Arg；优选地，Xaa26是Lys、Arg、His、Asn或Gln，更优选地是Lys、His、Gln或Arg；优选地，Xaa27是Lys、Arg、His、Asn、Gln或缺失，更优选地是Lys、His或缺失；优选地，Xaa28是Lys、Arg或缺失，更优选地是Lys或缺失；优选地，Xaa29是Asn、Gln、His或缺失，更优选地是Asn或缺失；优选地，Xaa30是His、Asn、Gln或缺失，更优选地是His或缺失。
在更优选的实施方式中，可以用苏氨酸残基取代SEQ ID NO62中的第17位上的赖氨酸。
优选地，肽(或其片段)表现出抗真菌活性。更优选地，肽表现出针对真菌科的抗真菌活性，所述真菌科选自但不限于赤壳科、格孢腔菌科、球腔菌科、黑痣菌科、小球腔菌科、胡刷菌科。更优选地，肽表现出针对真菌属的抗真菌活性，所述真菌属选自但不限于镰孢属(在本领域也称作赤霉属)、链格孢属、壳二孢属、刺盘孢属、刺盘孢属和曲霉属。在特别优选的实施方式中，肽表现出针对真菌属的抗真菌活性，所述的感染植物真菌属选自但不限于链格孢属、壳二孢属、灰霉菌属、尾孢属、刺盘孢属、色二孢属、白粉菌属、镰孢属、顶囊壳属、长蠕孢属、小球腔菌属、壳球孢菌属、丛赤壳属、斜尖状孢子菌属、疱霉属、瘤梗孢属、疫霉属、单轴霉属、足球菌属、柄锈菌属、Puthium、核球壳素、梨孢属、腐霉属、丝核菌属、Scerotium、核盘菌属、壳针孢属、根串株霉、钩丝壳属、黑星菌属、和轮枝孢属。在更优选的实施方式中，肽表现出针对真菌的抗真菌活性，所述真菌选自禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、狂犬壳二孢(Ascochyta rabiei)、白色假丝酵母(Candida albicans)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、克鲁斯氏假丝酵母(C.krusei)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)。
在另一个方面，本发明提供了与至少一种其它多肽/肽序列融合的本发明的肽。
在一个优选的实施方式中，至少一种其它多肽/肽选自增强本发明的肽的稳定性的多肽/肽、辅助纯化融合蛋白的多肽/肽、辅助细胞(特别是植物细胞)分泌本发明的肽的多肽/肽、使得融合蛋白对真菌或细胞无毒性，但经例如蛋白裂解性降解的加工处理后生成本发明的抗真菌肽的多肽/肽。
在另一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，多核苷酸包括选自以下一组的序列i)SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO11所示的核苷酸序列；iii)SEQ ID NO12所示的核苷酸序列；iv)SEQ ID NO13所示的核苷酸序列；v)SEQ ID NO50所示的序列；vi)SEQ ID NO51所示的核苷酸序列；
vii)SEQ ID NO55所示的核苷酸序列；viii)SEQ ID NO56所示的核苷酸序列；ix)编码本发明的肽的序列；x)与SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、或SEQ ID NO12具有至少66％相同性的核苷酸序列；xi)与SEQ ID NO11或SEQ ID NO13具有至少71％相同性的核苷酸序列；xii)与SEQ ID NO55或SEQ ID NO56具有至少62％相同性的序列；和xiv)在高严格条件下与(i)到(viii)中任一项杂交的序列。
优选地，多核苷酸编码具有抗真菌和/或抗细菌活性的肽。
在一个优选的实施方式中，相关的多核苷酸与SEQ ID NO9、SEQ IDNO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO55或SEQ ID NO56具有至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少92％、更优选地至少95％、更优选地至少97％、以及更优选地至少99％相同性。
优选地，可以从昆虫中分离出多核苷酸。更优选地，可以从鳞翅昆虫中分离出多核苷酸。更优选地，可以从螟蛾科的鳞翅昆虫中分离出多核苷酸。更优选地，可以从蜡螟中分离出多核苷酸。甚至更优选地，可以从大蜡螟中分离出多核苷酸。
在另一个实施方式中，多核苷酸包括SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO49或SEQ ID NO54所示的序列。
此外，本发明提供了用于复制和/或表达本发明的多核苷酸的合适载体。因此，也提供了包括本发明的多核苷酸的载体。
载体例如可以是例如质粒、病毒、转座子或噬菌体载体，所述载体具有复制起点、和优选地用于表达多核苷酸的启动子以及任选的启动子的调节子。所述载体可以含有一个或多个选择性标记物，例如对于细菌质粒而言，标记物是氨苄西林耐药基因；或者对于哺乳动物表达载体是新霉素耐药基因。
载体可以被用于例如体外生成RNA或者被用于转染或转化宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了包括本发明的载体或多核苷酸的宿主细胞。
优选地，宿主细胞是动物的、酵母菌的、细菌的或植物的细胞。更优选地，宿主细胞是植物细胞。
在进一步的方面，本发明提供了用于制备第一方面中的肽的方法，所述方法包括在使得编码所述肽的多核苷酸表达的条件下培育本发明的宿主细胞，并回收所表达的肽。
本发明也提供了用本发明的方法所产生的肽。
在进一步的方面，本发明提供了包括本发明的肽、多核苷酸、载体、抗体或宿主细胞、以及一种或数种可接受的载体的组合物。
在一个实施方式中，载体是药用可接受的、兽医用可接受的或农业用可接受的载体。
在仍另一个实施方式中，本发明提供了用于杀死真菌、或抑制真菌的生长和/或繁殖的方法，方法包括将真菌暴露于本发明的肽。
本领域技术人员要知道，可以用本领域已知的任一方法将真菌暴露于肽。在一个实施方式中，将真菌暴露于包括肽的组合物。在另一个实施方式中，将真菌暴露于产肽的宿主细胞。
通过将本发明的多核苷酸引入到植物或动物体内，使得在转基因生物体中生成所述肽，可以生成抗真菌感染的植物和非人的动物。
因此，在另一个方面，本发明提供了转基因植物，植物已经用本发明的多核苷酸转化，其中植物产生本发明的肽。
转基因植物可以是任一种植物，但是，植物优选地是农作物。这些农作物实例包括但不限于小麦、大麦、水稻、鹰嘴豆、豌豆等。
在进一步的方面，本发明提供了控制农作物中的真菌感染的方法，该方法包括培育本发明的转基因植物的农作物。
另外，在另一个方面，本发明提供了转基因的非人的动物，动物已经用本发明的多核苷酸转化，其中动物产生本发明的肽。
在进一步的方面，本发明提供了治疗或预防患者体内的真菌感染的方法，方法包括给患者施用本发明的肽。
另外，本发明提供了本发明的肽在生产治疗或预防患者体内的真菌感染的药物中的用途。
也提供了与第一方面中的肽特异性结合的抗体。这些抗体可以被用作在转基因系统例如转基因植物中的肽生产的标记物。另外，这些抗体可以被用于从昆虫裂解物和/或重组表达系统中纯化出本发明的肽的方法。
本发明者预见到本发明的肽也具有抗细菌的活性。因此，本发明也提供了用于杀死细菌、或抑制细菌的生长和/或繁殖的方法，方法包括将细菌暴露于本发明的肽。
细菌可以是革兰阳性或革兰阴性的细菌。
如本领域技术人员所知道的，可以用本领域已知的任一方法将细菌暴露于肽。在一个实施方式中，将细菌暴露于包括肽的组合物。在另一个实施方式中，将细菌暴露于产生肽的宿主细胞。
在进一步的方面，本发明提供了控制农作物中的细菌感染的方法，方法包括培育本发明的转基因植物的农作物。
在进一步的方面，本发明提供了一种治疗或预防患者体内的细菌感染的方法，方法包括给患者施用本发明的肽。
另外，本发明提供了本发明的肽在生产用于治疗或预防患者体内的细菌感染的药物中的用途。
在进一步的方面，本发明提供了用于杀死真菌或抑制真菌的生长或繁殖的方法，方法包括将真菌暴露于一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO14的25到67位残基的氨基酸序列、ii)SEQ ID NO17所示的氨基酸序列、iii)包括SEQ ID NO15的26到67位残基的氨基酸序列、iv)与i)到iii)中任一项具有至少75％相同性的氨基酸序列、v)包括SEQ ID NO18的26到66位残基的氨基酸序列、vi)与v)具有至少50％相同性的氨基酸序列、和vii)i)到vi)中任一项的生物学活性片段。
在优选的实施方式中，相关的肽与i)到iii)或v)中任一项具有至少60％、更优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少92％、更优选地至少95％、更优选地至少97％、以及甚至更优选地至少99％相同性。
依据成熟肽序列的ClustalW比对的系统树的构造(图9)，表明GmmoricinA、GmmoricinC1、GmmoricinC2和BmmoricinX是紧密相关的，并且可以认为它们簇集在一起作为moricin的一个亚族。对该亚族中的两个成员(合成的Gm-moricinA和Gm-moricinC2)的抗真菌测试说明该组肽比合成的家蚕(B.mori)moricin具有更好的抗真菌活性。因此，在特别优选的实施方式中，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO18的26到66位残基的氨基酸序列、ii)与i)具有至少50％相同性的氨基酸序列、和iii)i)或ii)的生物学活性片段。
优选地，可以从昆虫中分离出肽。更优选地，可以从鳞翅昆虫中分离出肽。更优选地，可以从选自螟蛾科、夜蛾科、蚕蛾科、和天蛾科中的鳞翅昆虫中分离出肽。
在一个实施方式中，所提供的肽是前体例如SEQ ID NO14、SEQ IDNO15、或SEQ ID NO18，其被加工处理生成生物学活性肽。
如本领域技术人员所知道的，可以用本领域已知的任一方法将真菌暴露于肽。在一个实施方式中，将真菌暴露于包括肽的组合物。在另一个实施方式中，将真菌暴露于产肽的宿主细胞。在仍另一个实施方式中，将真菌暴露于产肽的转基因植物。
在进一步的方面，本发明提供了控制农作物的真菌感染的方法，方法包括培育转基因植物的农作物，其产生包括选自以下一组的序列的肽i)包括SEQ ID NO14的25到67位残基的氨基酸序列、ii)包括SEQ ID NO16的25到66位残基的氨基酸序列、iii)SEQ ID NO17所示的氨基酸序列、iv)SEQ ID NO15的26到67位残基的氨基酸序列、v)与i)到iv)中任一项具有至少75％相同性的氨基酸序列、vi)包括SEQ ID NO18的26到66位残基的氨基酸序列、vii)与vi)具有至少50％相同性的氨基酸序列、和viii)i)到vii)中任一项的生物学活性片段。
优选地，肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO18的26到66位残基的氨基酸序列、ii)与i)具有至少50％相同性的氨基酸序列、和iii)i)或ii)的生物学活性片段。
在上述部分的优选的实施方式中，肽不是SEQ ID NO59、SEQ IDNO60、SEQ ID NO61或其具有抗真菌活性的片段。
在进一步优选的实施方式中，肽在32位点(相对于在SEQ ID NO62中所示的位置)上不含有丙氨酸残基。
在进一步的方面，本发明提供了治疗或预防患者体内的真菌感染的方法，方法包括给患者施用一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO14的25到67位残基的氨基酸序列、ii)SEQ ID NO17所示的氨基酸序列、
iii)包括SEQ ID NO15的26到67位残基的氨基酸序列、iv)与i)到iii)中任一项具有至少75％相同性的氨基酸序列、v)包括SEQ ID NO18的26到66位残基的氨基酸序列、vi)与v)具有至少50％相同性的氨基酸序列、和vii)i)到vi)中任一项的生物学活性片段。
另外，本发明提供了肽在生产用于治疗或预防患者体内的真菌感染的药物中的用途，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO14的25到67位残基的氨基酸序列、ii)SEQ ID NO17所示的氨基酸序列、iii)包括SEQ ID NO15的26到67位残基的氨基酸序列、iv)与i)到iii)中任一项具有至少75％相同性的氨基酸序列、v)包括SEQ ID NO18的26到66位残基的氨基酸序列、vi)与v)具有至少50％相同性的氨基酸序列、和vii)i)到vi)中任一项的生物学活性片段。
也提供了包括本发明的肽、多核苷酸、载体、宿主细胞、抗体或组合物的试剂盒。
在进一步的实施方式中，试剂盒包括其它的抗微生物的化合物，例如SEQ ID NO 14到18、或57到61所示的化合物，或它们的生物学活性片段。
优选地，试剂盒还包括关于试剂盒使用的信息和/或说明书。
显而易见的是，本发明的一个方面的优选的特点和特征都可应用于本发明的多个其它的方面。
在本说明书全文中，用语“包括”或“包含”被理解为表示包括给定的元件、整数或步骤、或元件、整数或步骤的组，但不排除其它任何的元件、整数或步骤、或元件、整数或步骤的组。
此外将用下面的不受限的实施例的方式并参照附图描述本发明。


图1两种Gm-moricinA cDNA克隆的核苷酸序列(GmmoriAe-SEQID NO6、GmmoriAc-SEQ ID NO7)的序列比对。GmmoriAe的序列与GmmoriAa和GmmoriAd的序列相同，但是，后两种序列的5’末端更短。下划线显示出了非保守的核苷酸，用双下划线表示造成所推定的Gm-moricinA前体蛋白中的氨基酸取代的突变。
图2两种Gm-moricinA cDNA克隆(GmmoriAe-SEQ ID NO1；GmmoriAc-SEQ ID NO2)的推定的蛋白序列的序列比对。下划线显示出克隆GmmoriAc中的非保守残基。
图3大蜡螟的Gm-moricinA cDNA克隆pGmmoriAa的核苷酸序列和推定的前前蛋白序列(分别是SEQ ID NO29和1)。所推定的蛋白序列开始于骨架内的第一个甲硫氨酸残基。斜体显示了预测的分泌信号肽，以及用黑体突出显示了成熟的Gm-moricinA肽。用下划线显示出通过对纯化的Gm-moricinA肽的Edman测序所得到的肽序列。用肽序列下方的单箭头表明所预测的信号肽的解离(SignalP)位点，以及用双箭头表明了预测的生成肽的成熟形式的解离位点。
图4大蜡螟的Gm-moricinB cDNA的核苷酸序列和推定的前前蛋白序列(分别是SEQ ID NO8和3)。所推定的蛋白序列开始于骨架内的第一个甲硫氨酸残基。斜体显示了预测的分泌信号肽，以及用黑体突出显示了成熟的Gm-moricinB肽。用下划线显示出通过对纯化的Gm-moricinB肽的Edman测序所得到的肽序列。用肽序列下方的单箭头表明所预测的信号肽的解离(SignalP)位点，以及用双箭头表明了预测的生成肽的成熟形式的解离位点。
图5大蜡螟Gm-moricinC1 cDNA克隆Gm3-01ae的核苷酸序列和推定的前前蛋白序列(分别是SEQ ID NO49和47)。所推定的蛋白序列开始于骨架内的第一个甲硫氨酸残基。斜体显示了预测的分泌信号肽，以及用黑体突出显示了成熟的Gm-moricinC1肽。用下划线显示出通过对纯化的Gm-moricinC1肽的Edman测序所得到的肽序列。用肽序列下方的单箭头表明所预测的信号肽的解离(SignalP)位点，以及用双箭头表明了预测的生成肽的成熟形式的解离位点。下划线显示出三个非保守的核苷酸，用双下划线表示造成氨基酸取代的开放阅读框中的突变。在氨基酸序列下面用斜体显示了该核苷酸取代所造成的单个氨基酸改变。
图6大蜡螟Gm-moricinC2 cDNA克隆Gm3-03的核苷酸序列和推定的前前蛋白序列(分别是SEQ ID NO54和52)。所推定的蛋白序列开始于骨架内的第一个甲硫氨酸残基。斜体显示了预测的分泌信号肽，以及用黑体突出显示了成熟的Gm-moricinC2肽。用肽序列下方的单箭头表明所预测的信号肽的解离(SignalP)位点，以及用双箭头表明了预测的生成肽的成熟形式的解离位点。用点状下划线表示多腺苷酸化信号的可能位点。
图7GmmoricinC1(Gm3-01ae，SEQ ID NO49)和Gm-moricinC2(Gm3-03，SEQ ID NO54)的cDNA的核苷酸序列的序列比对。黑体显示了起始和终止密码子。下划线显示了Gm-moricinC2的开放阅读框中的不同于Gm-moricinC1的19个核苷酸，以及用双下划线表示造成氨基酸取代的突变。
图8Gm-moricinC1(SEQ ID NO47)和Gm-moricinC2(SEQ ID NO52)的推定的蛋白序列的序列比对。下划线显示非保守残基。注意，发现Gm-moricinC1的等位基因变体在其13位点上具有VAL残基。
图9来自大蜡螟的抗真菌肽(GmmoriASEQ ID NO1、GmmoriBSEQ ID NO3、GmmoriC1SEQ ID NO47和GmmoriC2SEQ ID NO52)以及来自鳞翅类家蚕蛾的相关肽(Bmmor，P82818)(SEQ ID NO16)、斜纹夜蛾(Slmor，BAC79440)(SEQ ID NO14)、甜菜夜蛾(Semor，AAT38873)(SEQ ID NO57)、烟草天蛾(Msmor，AA074637)(SEQ ID NO15)、烟芽夜蛾(Hwir，P83416)(SEQ ID NO17)、全须夜蛾(Hpmor，AAW21268)(SEQ ID NO58)、Caligoillioneus(CiP1646，CiP1647，CiP1648分别是SEQ ID NO59、60和61)的ClustalW比对。在比对中也包括先前未公布过的推定的家蚕蛾的moricin(BmmorX，BP125548)(SEQ ID NO18)。大蜡螟序列对应于cDNA序列的翻译开放阅读框。
序列表说明SEQ ID NO1大蜡螟的前Gm-moricinA；SEQ ID NO2大蜡螟的前Gm-moricinA的等位基因变体(GmmoriAc)；SEQ ID NO3大蜡螟的前Gm-moricinB；SEQ ID NO4大蜡螟的Gm-moricinA；SEQ ID NO5大蜡螟的Gm-moricinB；SEQ ID NO6包括大蜡螟的已知的5’和3’未翻译序列的编码前Gm-moricinA的cDNA；SEQ ID NO7包括大蜡螟的已知的5’和3’未翻译序列的编码前Gm-moricinA的等位基因变体(GmmoriAc)的cDNA；SEQ ID NO8包括大蜡螟的已知的5’和3’未翻译序列的编码前Gm-moricinB的cDNA；SEQ ID NO9编码大蜡螟的前Gm-moricinA的cDNA；SEQ ID NO10编码大蜡螟的前Gm-moricinA的等位基因变体(GmmoriAc)的cDNA；SEQ ID NO11编码大蜡螟的前Gm-moricinB的cDNA；SEQ ID NO12编码大蜡螟的Gm-moricinA的cDNA；SEQ ID NO13编码大蜡螟的前Gm-moricinB的cDNA；SEQ ID NO14斜纹夜蛾的moricin样前肽(基因库编号为BAC79440的推定的肽)；SEQ ID NO15烟草天蛾的moricin样前肽(基因库编号为AA074637的推定的肽)；
SEQ ID NO16家蚕蛾的前moricin(Hara and Yamakawa(1995)以及基因库编号P82818)；SEQ ID NO17烟芽夜蛾的Virescein(moricin样肽)(基因库编号P83416)；SEQ ID NO18家蚕蛾moricin-X(基因库编号BP125548所编码)；SEQ ID NO19分离的Gm-moricinA的N末端序列；SEQ ID NO20分离的Gm-moricinB的N末端序列；SEQ ID NO21到28寡核苷酸引物；SEQ ID NO29克隆GmmoriAa的多核苷酸序列；SEQ ID NO30分离的Gm-moricinC1的N末端序列；SEQ ID NO31到46寡核苷酸引物；SEQ ID NO47大蜡螟的前Gm-moricinC1；SEQ ID NO48大蜡螟的Gm-moricinC1；SEQ ID NO49包括大蜡螟的已知的5’和3’未翻译序列的编码前Gm-moricinC1的cDNA；SEQ ID NO50编码大蜡螟的前Gm-moricinC1的cDNA；SEQ ID NO51编码大蜡螟的Gm-moricinC1的cDNA；SEQ ID NO52大蜡螟的前Gm-moricinC2；SEQ ID NO53大蜡螟的Gm-moricinC2；SEQ ID NO54包括大蜡螟的已知的5’和3’未翻译序列的编码前Gm-moricinC2的cDNA；SEQ ID NO55编码大蜡螟的前Gm-moricinC2的cDNA；SEQ ID NO56编码大蜡螟的Gm-moricinC2的cDNA；SEQ ID NO57甜菜夜蛾的moricin样肽(基因库编号为AAT38873的推定的肽)；SEQ ID NO58全须夜蛾的moricin样肽(基因库编号为AAW21268的推定的肽)；
SEQ ID NO59Caligo illioneus的moricin样肽(WO 2004/016650所述的CiP1646)；SEQ ID NO60Caligo illioneus的moricin样肽(WO 2004/016650所述的CiP1647)；SEQ ID NO61Caligo illioneus的moricin样肽(WO 2004/016650所述的CiP1648)；SEQ ID NO62蜡螟的抗真菌肽的共有序列。
具体实施例方式
常用技术和定义除非有具体说明，在此所用的所有技术和科学术语都应当被认为具有和本领域普通技术人员通常所理解的意义(例如，细胞培养、微生物学、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学、真菌学和生物化学领域)。
除非另有说明，在本发明中所用的重组蛋白、细胞培养、转基因植物生产和微生物学技术都是本领域技术人员所公知的标准方法。在文献中都描述并解释了这些技术，文献来源例如是J.Perbal，A Practical Guideto Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour LaboratoryPress(1989)；T.A.Brown(editor)，Essential Molecular BiologyA PracticalApproach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991)；D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNA CloningA Practical Approach，Volumes 1-4，IRLPress(1995 and 1996)；和F.M.Ausubel et al.(editors)，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括到目前为止的所有改版)，在此通过引用将其所有内容并入本申请。
术语“抗真菌”肽在此指的是具有抗真菌性能的肽，例如抑制真菌细胞的生长，或杀死真菌细胞，或中断或延迟真菌生命周期中的某个阶段例如孢子发生、孢子生成和交配。
术语“抗细菌”肽在此指的是具有抗细菌性能的肽，例如抑制细菌细胞的生长，或杀死细菌细胞，或中断或延迟细菌生命周期的阶段例如孢子形成、和细胞分裂。
多肽/肽我们用“基本上纯化的肽”表示通常已经与脂类、核酸、其它肽、以及与其天然状态相关的其它污染分子分离开了的肽。优选地，基本上纯化的肽的至少60％、更优选地是至少75％、以及更优选地是至少90％与其它与之天然相关的组分是游离的。
术语“多肽”和“肽”通常可以互换使用。但是，术语“肽”一般用于表示不大的氨基酸链，例如长度为100个或更短的氨基酸残基。
用GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定出肽的％相同性，其中缺口生成补偿＝8，以及缺口延伸补偿＝3。查询序列的长度至少为15个氨基酸，GAP分析在至少15个氨基酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度至少为50个氨基酸，GAP分析在至少50个氨基酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度至少为100个氨基酸，GAP分析在至少100个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，查询序列的长度至少为250个氨基酸，GAP分析在至少250个氨基酸的区域上比对两个序列。
“生物学活性”片段在此表示本发明的肽的一部分，其保留了全长肽所定义确定的活性。在绝大多数实施方式中，该活性是抗真菌活性，但是，在一些实施方式中，该活性是抗细菌活性。生物学活性片段可以是任一长度，只要它们保留了所定义的活性，但是，在优选的实施方式中，它们的长度是至少10个氨基酸，更优选地是至少15个氨基酸。
通过往本发明的核酸中引入合适的核苷酸变化，或者通过体外合成所需的肽都可以制备出本发明的肽的氨基酸序列突变体。这些突变体包括例如氨基酸序列中的残基缺失、插入或取代。可以进行缺失、插入和取代的组合以便得到最终的构建体，只要终末的肽产物具有所需的特征。
利用本领域已知的任一技术可以制备突变的(改变的)肽。例如，本发明的多核苷酸可以进行体外诱变。这些体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆到合适载体内，将载体转化到“诱变”株例如大肠杆菌XL-1红(Stratagene)内，以及繁殖所转化的细菌到合适数目的世代。在另一个实施例中，本发明的多核苷酸进行如Harayama(1998)所广泛描述的DNA改组技术。这些DNA改组技术可以包括与本发明的那些基因相关的基因，例如编码家蚕蛾的moricin的基因(Hara and Yamakawa，1995)。利用在此所述的技术可以容易地筛选源自突变的/改变的DNA的肽产物，以确定出它们是否具有抗真菌和/抗细菌的活性。
在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变的性质将依赖于所要修饰的特征。可以单个地或系列地修饰突变的位置，例如通过(1)首先用保守氨基酸选择物进行取代，然后根据所得到的结果进行更重要的选择；(2)缺失靶残基；或(3)在定位的位点附近插入其它残基。
氨基酸序列缺失的范围通常是约1到15个残基，更优选地是约1到10个残基以及一般是约1到5个连续残基。
取代突变体是在肽分子中去除至少一个氨基酸残基并在该位置所插入的不同的残基。与取代诱变最为相关的位点包括被鉴定为活性位点的位点。
其它有关的位点是这样一些位点，在所述位点上从各种菌株或物种中所得到的特定残基都相同。这些位置对于生物学活性可能是重要的。对于这些位点，特别是处于具有至少三个其它的相同保守位点的序列内的位点，优选地以相对保守的方式取代。在题为“取代示例”的表1中显示了这些保守取代。
表1取代示例

具体地，先前已经显示moricin具有两个α螺旋结构(Hemmi et al，2002)。考虑到本发明的肽与moricin样肽的亲缘关系(见图5)，可能的是，相似的结构对于保持本发明的肽的抗真菌活性也是重要的。因此，当设计例如SEQ ID NO4的突变体时，本领域人员利用特殊氨基酸的化学知识以及联合已知的推定肽四级结构的方法，可以容易地产生具有一个或数个氨基酸变异的肽(与SEQ ID NO4相比较)，其具有抗真菌活性。
此外，如果需要，可以将非天然的氨基酸或化学的氨基酸类似物作为取代物或添加物引入到本发明的肽中。这些氨基酸包括，但不限于，常用氨基酸的D异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸、设计者氨基酸(designer amino acids)例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸、和常用的氨基酸类似物。
本发明的范围也包括本发明的肽在合成的过程中或之后被生物素化、苄基化、糖基化、乙酰基化、磷酸化、酰胺化、已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白裂解性解离、与抗体分子或其它细胞配体相连接等所不同地修饰。这些修饰可以作用为增加本发明的肽的稳定性和/或生物学活性。
用各种方法都可以生成本发明的肽，包括生产和回收天然肽、生产和回收重组肽、以及化学合成肽。在一个实施方式中，通过培养能在足以生成肽的条件下表达肽的细胞，并回收肽可以生成本发明的分离的肽。用于培养的优选细胞是本发明的重组细胞。有效的培养条件包括，但不限于，有效的培养基、生物反应器、温度、pH值和使得肽生产的氧气条件。有效的培养基指的是其中细胞被培养产生本发明的肽的任一培养基。这些培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷源、和合适的盐、矿物质、金属和其它养分例如维生素的水性培养基。本发明的细胞可以被培养在传统的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿、和Petri培养板中。可以在适合于重组细胞的温度、pH值和氧饱和度条件下进行培养。这些培养条件都是在本领域一般技术人员的专业知识之内。
多核苷酸我们用“分离的多核苷酸”表示通常已经从在自然状态下与其相关的或相连的多核苷酸序列中分离出来的多核苷酸。优选地，分离多核苷酸的至少60％、更优选地是至少75％、以及更优选地是至少90％与其它与之天然相关的组分是游离的。此外，术语“多核苷酸”此可以与术语“核酸分子”互换使用。
用GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定出多核苷酸的％相同性，其中缺口生成补偿＝8，以及缺口延伸补偿＝3。查询序列的长度至少为45个核苷酸，GAP分析在至少45个核苷酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度至少为150个核苷酸，GAP分析在至少150个核苷酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，查询序列的长度至少为300个核苷酸，GAP分析在至少300个核苷酸的区域上比对两个序列。
在高度严格的条件下，本发明的多核苷酸可以与编码本发明的肽的多核苷酸选择性地杂交。此外，本发明的寡核苷酸具有在严格条件下与本发明的多核苷酸选择性杂交的序列。高严格条件在此是下面的条件(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M NaCl/0.0015柠檬酸钠/0.1％ Na2SO4，50℃；(2)在杂交期间采用去污剂，例如甲酰胺例如50％(体积/体积)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白、0.1％ Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯酮、50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)、和750mM NaCl、75mM柠檬酸钠、42℃；或者(3)采用50％甲酰胺、5xSCC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、5xDenhardt溶液、经超声处理过的鲑精DNA(50g/ml)、0.1％ SDS和10％硫酸葡聚糖、42℃(0.2xSCC和0.1％SDS)。
当与天然存在的分子比较时，本发明的多核苷酸可以具有一种或多种突变，所述突变可以是核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变体可以是天然存在的(即从天然来源中分离到的)或合成的(例如如上述的通过对核酸进行定向诱变或DNA改造)。因此，显而易见的是本发明的多核苷酸可以是天然存在的或重组的。
本发明的寡核苷酸可以是RNA、DNA或它们的衍生物。这些寡核苷酸的最小的大小是在寡核苷酸和本发明的核酸分子上的互补序列之间形成稳定的杂交体所需的大小。本发明包括可以被用作例如鉴定核酸分子的探针的寡核苷酸，或用作扩增本发明的核酸分子的引物的寡核苷酸。
重组载体本发明的一个实施方式包括重组载体，其包括至少一个本发明的分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被插入到任一能将多核苷酸分子转运到宿主细胞内的载体内。这样一种载体含有异源的多核苷酸序列，即没有天然地发现与本发明的多核苷酸分子相邻的多核苷酸序列，或优选地源自不同于本发明的多核苷酸所来源的物种。载体可以是RNA或DNA，或者是原核的或真核的，以及通常是转座子(例如在US 5,792,294中所述的转座子)、病毒或质粒。
一种类型的重组载体包括与表达载体可操纵地连接的多核苷酸分子。词语“可操纵地连接”指的是多核苷酸分子以使得分子在被转化到宿主细胞内后能被表达的方式插入到表达载体内。表达载体在此是能转化宿主细胞以及能影响特异多核苷酸分子的表达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体也能在宿主细胞内进行复制。表达载体可以是原核的或真核的，以及通常是病毒或质粒。本发明的表达载体包括任一在本发明的重组细胞内具有功能(即指导基因表达)的载体，所述重组细胞包括细菌、真菌、体内寄生虫、节肢动物、动物、和植物细胞。本发明的特别优选的表达载体可以指导植物细胞内的基因表达。本发明的载体也可以被用于在无细胞的表达系统中生产肽，这些系统在本领域是公知的。
具体而言，本发明的表达载体含有调节序列例如转录调节序列、翻译调节序列、复制起点、和其它的与重组细胞相兼容的并能调节本发明的多核苷酸分子的表达的调控序列。具体而言，本发明的重组分子包括转录调节序列。转录调节序列是控制转录的启动、延伸和终止的序列。特别重要的转录调节序列是控制转录启动的序列，例如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。合适的转录调节序列包括任一能在至少一种本发明的重组细胞内发挥作用的转录调节序列。各种这样的转录调节序列对于本领域的技术人员是熟知的。优选的转录调节序列包括那些在细菌、酵母菌、节肢动物和哺乳动物细胞内发挥作用的序列，其包括但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、λ噬菌体、噬菌体T7、T7lac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白、α-配对因子、毕赤酵母醇氧化酶、甲病毒亚基因组启动子(例如辛德比斯病毒亚基因组启动子)、抗生素耐药基因、杆状病毒、玉米夜蛾昆虫病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、熊痘病毒、其它痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒(例如中间早期启动子)、猿猴病毒40、逆转录病毒、肌动蛋白、逆转录病毒的长末端重复、Rous肉瘤病毒、热休克蛋白、磷酸和硝酸转录调节序列以及其它能控制原核或真核细胞内的基因表达的序列。特别优选的转录调节序列是能积极指导植物内的转录的启动子，或者是组成型的或阶段和/或组织特异的，这依赖于植物或其部分的用途。这些植物启动子包括，但不限于，表现为组成型表达的启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；用于叶特异性表达的启动子例如二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的启动子；用于根特异性表达的启动子例如来自谷氨酰胺合酶基因的启动子；用于种子特异性表达的启动子例如欧洲油菜(Brassica napus)的cruciferinA启动子；用于脉管特异性表达的启动子例如马铃薯的I型patatin启动子以及用于果实特异性表达的启动子例如番茄的聚半乳糖醛酸酶(PG)启动子。
本发明的重组分子也可以(a)含有分泌信号(即信号片段的核酸序列)，以便使得细胞能分泌所表达的本发明的肽，这就产生肽和/或(b)含有导致本发明的核酸分子表达为融合蛋白的融合序列。合适的信号片段的实例包括任一能指导本发明的肽的分泌的信号片段。优选的信号片段包括，但不限于，组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、干扰素、白介素、生长因子、病毒的被膜糖蛋白信号片段、烟草的nectarin信号肽(US 5,939,288)、烟草的延伸蛋白信号、大豆的油质蛋白油状体结合蛋白信号、拟南芥的空泡样碱性甲壳酶信号肽、以及本发明的天然的信号序列。另外，本发明的核酸分子可以与融合信号相连接，所述融合信号能指导所表达的肽进入到蛋白体内，例如泛素融合片段。重组分子也可以含有位于本发明的核酸分子的核酸序列的周围和/或之内的插入的和/或未翻译的序列。
宿主细胞本发明的另一个实施方式包括重组细胞，其包括经本发明的一种或多种重组分子所转化的宿主细胞。用任一可以将多核苷酸插入到细胞内的方法可以完成多核苷酸向细胞内的转化。转化技术包括，但不限于，转染、电穿孔、微注射、脂染、吸附、原生质体融合。重组细胞可以保持为单个细胞的生物体或者可以生长成组织、器官或多细胞的生物体。本发明的被转化的多核苷酸分子可以仍然保留在染色体外或者可以以保留所述多核苷酸分子被表达的能力的方式被整合到所转化的(即重组的)细胞的染色体内。
尽管在此所讨论的肽具有抗真菌的或抗细菌的活性，可以从细菌的或真菌的宿主细胞中获得合适量的本发明的重组肽。更具体而言，肽可以被生成为融合蛋白，可以在从重组宿主细胞中回收到融合蛋白后将其加工处理。Hara和Yamakawa(1996)描述了这样一种系统的实例，其中从大肠杆菌中产生作为融合蛋白的moricin(SEQ ID NO16)。从重组宿主细胞中收集融合蛋白，并用氰或O-邻氧碘苯甲酸将其裂解以便释放出生物学活性moricin肽。可以容易地设计出相似的系统，以便在细菌或真菌的宿主细胞内生成本发明的肽。
进行转化的合适的宿主细胞包括任一可以用本发明的多核苷酸转化的细胞。本发明的宿主细胞可以是那些能够内源性地(即天然地)产生本发明的肽或者可以在被本发明的至少一种多核苷酸转化之后产生这样的肽的细胞。本发明的宿主细胞可以是任一能生成至少一种本发明蛋白的细胞，并包括细菌的、真菌的(包括酵母菌)、寄生虫的、节肢动物的、动物的和植物的细胞。宿主细胞的实例包括沙门氏菌、埃希氏菌、杆菌、李斯特菌、酵母菌、夜蛾、分支杆菌、蛾、BHK(幼仑仓鼠肾)细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS(例如COS-7)细胞、和Vero细胞。宿主细胞的其它实例是大肠杆菌包括大肠杆菌K-12衍生物、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌包括减毒株、草地夜蛾、粉纹夜蛾、BHK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS细胞、Vero细胞、以及非致癌性的成肌细胞G8细胞(例如ATCC CRL 1246)。其它的合适的哺乳动物细胞宿主包括其它的肾细胞株、其它成纤维母细胞细胞株(例如人、小鼠或鸡胚胎的成纤维母细胞细胞株)、骨髓瘤细胞株、中国仓鼠卵巢细胞、小鼠NIH/3T3细胞、LMTK细胞和/或HeLa细胞。特别优选的宿主细胞是植物细胞例如那些从Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)得到的植物细胞。
通过处理例如宿主细胞内的多核苷酸分子的拷贝数目、这些多核苷酸分子转录的效率、所形成的转录物的翻译的效率、和翻译后修饰的效率，可以用重组DNA技术提高所转化的多核苷酸分子的表达。用于增加本发明的多核苷酸分子的表达的重组技术包括，但不限于，多核苷酸分子与高拷贝数目的质粒的可操纵地连接、多核苷酸分子向一个或多个宿主细胞染色体内的整合、向质粒添加载体稳定性序列、对转录调节信号(例如启动子、操纵子、增强子)的取代或修饰、对翻译调节信号(例如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)的取代或修饰、对对应于宿主的密码子选择的本发明的多核苷酸分子的修饰、以及转录去稳定序列的缺失。
转基因植物术语“植物”指的是整个植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、和植物细胞等。被预期用于本发明实践的植物包括单子叶植物和双子叶植物。优选地，转基因植物是商业上有用的农作物植物。靶农作物包括但不限于下面的种类谷类(小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、高梁和相关农作物)；甜菜(甜菜和饲料甜菜)；梨果、核果和软果(苹果、梨、梅、桃、杏仁、樱桃、草莓、覆盆子和黑莓)；豆科植物(豆、扁豆、豌豆、大豆)；油类植物(油菜、芥末、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)；黄瓜类植物(葫芦、黄瓜、甜瓜)；纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)；柑橘类水果(橙子、柠檬、葡萄柚、蜜桔)；蔬菜(菠菜、莴苣、芦笋、甘蓝、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯、辣椒)；樟科(酪梨、肉桂、樟脑)；或植物例如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、藤本植物、蛇麻花、覆草皮、香蕉、和天然橡胶植物，以及观赏植物(花卉、灌木、阔叶树和常绿植物例如针叶树)。特别优选的农作物包括豌豆、鹰嘴豆、小麦和大麦。
在本发明的上下文中所定义的转基因植物包括植物(以及所述植物的一部分和细胞)和它们的子代，所述植物已经被重组技术所遗传修饰，造成了在所需植物或植物器官内产生至少一种本发明的肽。利用本领域已知的技术可以生成转基因植物，例如在A.Slater et al.，PlantBiotechnology-The Genetic Manipulation of Plants，Oxford University Press(2003)，和P.Christou and H.Klee，Handbook of Plant Biotechnology，JohnWiley and Sons(2004)中所述的技术。
可以在转基因植物的所有发育阶段中组成型地表达本发明的多核苷酸。根据植物或植物器官的用途，可以以阶段特异性的方式表达肽。此外，根据植物可以易感于真菌感染的特殊用途，可以组织特异地表达多核苷酸。
在本发明中可以使用已知或已经发现能引起在植物中表达编码相关肽的基因的调节序列。对所用的调节序列的选择依赖于相关的靶植物和/或靶器官。这些调节序列可以从植物或植物病毒中获得，或者可以被化学合成。这些调节序列对于本领域人员是公知的。
其它的调节序列(例如终止序列和多腺苷酸信号)包括任一在植物中发挥这些作用的序列，对这些序列的选择对于本领域人员是显而易见的。这些序列的一个实例是根瘤土壤杆菌的opaline合酶基因。
可以得到一些用于将含有编码相关肽的核酸序列的表达构建体引入到靶植物内的技术。这些技术包括但不限于用钙/聚乙烯乙二醇法转化原生质体、电穿孔和微注射或(包被的)颗粒粒子轰击。除了这些所谓的直接DNA转化方法外，包括载体的转化系统也被广泛应用，例如病毒的和细菌的载体(例如来自土壤杆菌属的载体)。在选择和/或筛选之后，利用本领域已知的方法可以将已经被转化的原生质体、细胞或植物的一部分再生成整个植物。对于转化和/或再生技术的选择在本发明中并不重要。
在Banzet等(2002)和EP 798381中描述了表达抗真菌肽的转基因植物的实例。在每种情况中，重组抗真菌肽的表达造成了转基因植物可耐受真菌的感染。在这些文档中所罗列出的相似的方法可以被用于生产本发明的肽，所述肽赋予了转基因植物对真菌感染的抗性。
转基因的非人动物用于生成转基因植物的技术在本领域是公知的。关于这个方面的有用的普通教科书是Houdebine，Transgenic animals-Generation and Use(Harwood Academic，1997)。
例如可以将异源的DNA引入到受精的哺乳动物卵内。例如，用微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、逆转录病毒感染或其它方法可以转化全能或多能干细胞，然后将所转化的细胞引入到胚胎内，然后胚胎发育成了转基因动物。在高度优选的方法中，用含有所需DNA的逆转录病毒感染发育中的胚胎，从受感染的胚胎中生成转基因动物。但是，在最为优选的方法中，合适的DNA优选地在单细胞阶段被共注射到胚胎的生殖核或细胞浆内，以及使得胚胎发育成成熟的转基因动物。
另一种用于生成转基因动物的方法包括用标准方法将核酸微注射到前核阶段的卵内。然后在将其转移到假妊娠受体的输卵管之前培育受注射的卵。
也可以用核转移技术生产转基因动物。利用这个方法，用整合了受调节序列控制下的相关的结合区或结合伴侣的编码序列的质粒稳定地转染来自供体动物的纤维母细胞。然后，将稳定的转染子与去核的卵母细胞融合，将其培育并转移到雌性的受体内。
组合物本发明的组合物包括“可接受的载体”。可接受的载体优选地是所处理的动物、植物、植物或动物材料、环境(包括油状和水样本)所能耐受的任何物质。这些可接受的载体的实例包括水、盐水、林格液、葡萄糖溶液、Hank溶液、和其它水样的生理平衡的盐溶液。也可以使用非水性的载体例如不挥发性油、芝麻油、油酸乙酯、或甘油三酯。
药物组合物含有治疗有效量的本发明的抗真菌肽。根据本领域已知的方法可以容易地确定出抗真菌肽的治疗有效量。药物组合物可以被制剂成含有治疗有效量的抗真菌肽以及适用于本领域已知的施用途径(局部、牙龈、静脉内、雾化吸入、局部注射)的药用可接受载体。对于农业应用，组合物包括治疗有效量的本发明的肽以及适用于所治疗的生物体(例如植物)的农业可接受的载体。
短语“药用可接受载体”指的是当施用给动物(特别是哺乳动物，更特别是人类)时不会产生过敏的、有毒的或其它的不良反应的分子单体和组合物。
药用可接受载体或稀释剂的有用实例包括但不限于不影响本发明的肽的活性的溶剂、分散介质、包被剂、稳定剂、保护性胶体、黏附剂、浓缩剂、触变剂、渗透剂、螯合剂、和等张剂和延迟吸收剂。通过使用包被例如卵磷脂，通过保持所需的颗粒大小(对于分散而言)以及通过应用表面活性剂可以保持正确的流动性。更为普遍的是，本发明的肽可以与对应于有用的制剂技术的任一无毒的固体或液体添加剂组合。
本发明的液体组合物包括水溶性的浓缩剂、乳化的浓缩剂、乳剂、浓缩的悬浮液、喷雾剂、可湿性粉末(或用于喷雾的粉末)、糊剂和凝胶。
可以使用作为用于撒粉(dusting)的粉末和颗粒的形式的本发明的肽，具体的是通过对颗粒载体的挤压、压缩、浸渗或通过对粉末、和泡腾片或锭剂的颗粒化所得到的粉末和颗粒。
表面活性剂也可以构成各种组合物中的一种组分。表面活性剂可以是等张或非等张类型的乳化剂、分散剂或湿化剂或这些表面活性剂的混合物。实例包括，但不限于，聚丙烯酸盐、木素磺酸酸盐、苯酚磺酸或萘磺酸酸盐、氧化乙烷与脂肪醇或脂肪酸或脂肪胺的缩聚物、取代酚(具体的是烷基酚或芳香酚)、硫化琥珀酸酯的盐、牛磺酸衍生物(具体的是烷基牛磺酸)、醇或酚的聚氧乙烯的磷酯、多元醇的脂肪酸酯、含有上述化合物的硫酸、磺酸和磷酸功能集团的衍生物。
根据所处理的特殊病变和所选择的导向方法，可以制剂并全身或局部施用这些试剂。合适的途径可以包括例如口服、直肠、经皮、阴道、经粘膜、或肠道施用；肠外给药包括肌肉内、皮下、或髓内注射、以及鞘内、静脉内、或腹腔内注射。
对于农业组合物，可以使用天然的或合成的、有机的或无机的物质，化合物可以与这些物质组合，以便有助于其应用于植物、种子或土壤。因此，该载体一般是惰性的，并且它应当是农业可用的，特别是可用于所处理的植物。该载体可以是固体(粘土、天然的或合成的硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料等)或者是液体(水、醇，特别是丁醇等)。
通过用标准的农业技术例如喷雾法将抗真菌肽应用于植物部分或土壤或其它围绕在植物的根部周围的生长介质或者应用于植物的种子(在其被播种之前)可以实现植物病原体对抗真菌肽的暴露。所述肽可以以组合物的形式被应用于植物或植物生长介质，所述组合物包括与固体或液体稀释剂以及任选的各种佐剂例如表面活性剂混合在一起的肽。固体组合物可以是分散性粉末、颗粒、或谷粒的形式。
本发明的组合物也可以被用于多种产品，所述产品包括但不限于手消毒皂、低敏的护手霜、洗发剂、洗面奶、洗衣用品、洗碗用品(包括bar glass dip)、浴室洗涤用品、牙齿用品(例如漱口水、牙科粘胶、唾液注射滤器、水过滤器)以及去臭产品。
本发明的一个实施方式是能将本发明的肽缓慢地释放到动物、植物、动物或植物材料、或环境(包括土壤和水样品)中的可控释剂型。控释剂型在此包括控释载体中的本发明的肽。合适的控释载体包括，但不限于，生物兼容的聚合物、其它聚合的基质、胶囊、微胶囊、微粒、弹丸制剂、渗透泵、弥散装置、脂质体、脂质球、和经皮转运系统。优选的控释剂型是生物可降解的(即生物可蚀解的)。
优选地在范围为约1到约12个月的时间段内释放出制剂。本发明的优选的控释制剂优选地能影响治疗至少约1个月，更优选地至少约3个月，甚至更优选地至少约6个月，甚至更优选地至少约9个月，以及甚至更优选地至少约12个月。
如本领域技术人员所知道的，经验上可以容易地确定出组合物中的肽、载体、或宿主细胞的有效浓度。
US6,331,522提供了包括抗真菌肽的组合物的实例。技术人员可以容易地生成包括本发明的肽的相似的组合物。
抗体本发明也提供了本发明的肽或其片段的单克隆的或多克隆的抗体。因此，本发明还提供了用于生产本发明的肽的单克隆或多克隆抗体的方法。
术语“特异性结合”指的是抗体与本发明的至少一种蛋白/肽结合但不与其它已知的moricin样肽例如SEQ ID NO 14到17所示的肽结合的能力。
术语“表位”在此指的是抗体所结合的本发明的肽的一个区域。可以给动物施用表位以生成抗表位的抗体。但是，本发明的抗体优选地与整个肽背景中的表位区域特异性结合。
如果需要多克隆抗体，用免疫原性的肽免疫接种所选的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)。根据已知的方法，收集并处理被免疫动物的血清。如果含有多克隆抗体的血清含有针对其它抗原的抗体，通过免疫亲和色谱法可以纯化多克隆抗体。用于生产和加工多克隆抗血清的技术在本领域是已知的。为了生成这些抗体，本发明也提供了被半抗原于用作动物中的免疫原的另一种肽的本发明的肽或其片段。
本领域技术人员可以容易地生成针对本发明的肽的单克隆抗体。用杂交瘤制备单克隆抗体的常用方法学是公知的。通过细胞融合，以及通过其它技术例如致癌性DNA对B淋巴细胞的定向转化、或Epstein Barr病毒的转染也可以生成永生的产抗体的细胞株。可以筛选单克隆抗体谱的各种性能例如同种型和表位亲和力。
另一种技术包括筛选噬菌体展示文库，其中例如噬菌体在其被包被的表面上表达具有大量互补决定区(CDR)的scFv片段。该技术在本领域是公知的。
对于本发明的目的，除非油特殊的不同的说明，术语“抗体”包括整个抗体的片段，只要它们保留了与靶抗原的结合活性。这些片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段、以及单链抗体(scFv)。此外，抗体及其片段可以是人源化的抗体，如在EP-A-239400中所述的那样。
本发明的抗体可以与固体支持物结合，和/或可以与合适的试剂、对照、说明书等等一起包装成合适容器中的试剂盒。
优选地，本发明的抗体是被可检测标记的。容许直接检测抗体结合的示例的可检测标记包括放射性标记、荧光团、染料、磁珠、化学发光剂、胶状颗粒等。容许间接检测结合的标记的实例包括酶，其中底物可以提供显色的或荧光的产物。其它的示例的可检测标记包括共价结合的酶，其能在加入合适的底物后提供可检测的产物信号。用于缀合的适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等。如果不能商品化获得，用本领域技术人员已知的技术可以容易地生成这些抗体-酶缀合物。更多的示例的可检测标记包括生物素(其以高亲和力与抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素结合)、荧光染料(例如藻胆蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白、萤光素和Texas红)，它们可以与荧光激活细胞分选器、半抗原等一起使用。优选地，可检测标记(例如生物素)容许用于平板发光计中的直接检测。在本领域已知的检测本发明的肽的技术中可以使用这些标记抗体。
用途本发明的肽在医学、兽医学、农学、食品防腐、家居和工业领域有着多种用途，其中它可用于减轻和/或预防真菌或细菌的感染。
例如，本发明的肽可以被用于治疗真菌感染、和细菌感染(例如S.mutans、P.aeruginosa或P.gingivalis感染)的药物组合物。能适合于肽治疗的阴道、尿道、粘膜、呼吸道、皮肤、耳、口、或眼部的真菌或细菌感染包括，但不限于白色假丝酵母、伴放线放线菌、粘性放线菌、福氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、纤细拟杆菌、解脲拟杆菌、简要弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、生痰弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、溶组织梭状芽孢杆菌、啮蚀艾肯氏菌、纠缠真杆菌、具核梭杆菌、牙槽梭杆菌、微小消化链球菌、牙髓卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、变黑普里沃菌、短小棒状杆菌、铜绿假单胞菌、有害月形单胞菌、金黄色葡萄球菌、星座链球菌、格氏链球菌、中问链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、齿垢密螺旋体、食果胶密螺旋体、索氏密螺旋体、小韦荣(氏)球菌、和Wolinella succinogenes。
对于农业应用而言，可以用抗真菌肽提高农作物在植物生命期内或在收获后农作物保存中的抗病性或耐病性。抑制了暴露于肽的病原体的生长。抗真菌肽可以消除已经生长于植物上的病原体或者可以保护植物避免未来的病原体攻击。病原体可以是任一生长在植物内或生长在植物周围的真菌。提高抗性被定义为与野生型植物相比较，植物或收获后的农作物增强了对真菌性病原体的耐受性。抗性可以是从疗效的轻微减低到完全消除，使得植物不受病原体存在的影响。
因此，本发明的肽也可以被用于治疗和/或预防植物的真菌感染。这些植物真菌包括，但不限于，那些选自以下属的属链格孢属、壳二孢属、葡萄孢属、尾孢属、刺盘孢属、色二孢属、白粉菌属、镰孢属、小球腔菌属、顶囊壳属、长蠕孢属、壳球孢菌属、丛赤壳属、斜尖状孢子菌属、疱霉属、瘤梗孢属、疫霉属、单轴霉属、足球菌属、柄锈菌属、Puthium、核球壳素、梨孢属、腐霉属、丝核菌属、Scerotium、核盘菌属、壳针孢属、根串株霉、钩丝壳属、黑星菌属、和轮枝孢属。可以被本发明的肽所治疗的植物真菌感染的特殊实例包括谷类植物的小麦白粉病、葫芦的菊科白粉病和瓜类白粉病、苹果的苹果白粉病、葡萄藤的葡萄白粉病、棉花、苹果、水稻和草皮的丝核菌属感染、谷类植物和甘蔗的黑粉菌属感染、苹果的苹果黑星菌、谷类植物的长蠕孢菌属感染、小麦的颖枯病菌、大麦的Rhynchosporium secalis感染、草莓、番茄和葡萄的灰霉病菌感染(灰霉)、落花生的花生褐斑病菌感染、或各种农作物的其它斜尖状孢子菌属感染、小麦和大麦的Pseudocercosporella herpotrichoides感染、水稻的稻瘟霉感染、马铃薯和番茄的晚疫病菌感染、各种植物中的镰孢(霉)属(例如尖孢镰孢)和轮枝孢属感染、葡萄的霜霉病、水果和蔬菜的链格孢属感染、黄瓜的霜霉病、香蕉的黑条叶斑病菌感染、芸苔的小球腔菌属感染、以及各种农作物的Colleotrichum感染。
本发明的抗真菌肽也可以用作防腐剂，以便保持食物制品例如奶酪、面包、蛋糕、肉、鱼、饯、动物食品等的新鲜度和储存期。抗真菌肽也可以被用于抗微生物的食品包装例如涂覆于塑料或聚合物或结合于可食用的涂层或膜。例如，肽包被或膜可以含有足够量的用于这些产品例如奶酪、糖、毛织物等的抗真菌肽。
实施例实施例1肽纯化材料和方法昆虫用人工食谱喂养大蜡螟(蜡螟)。给末龄期幼虫注射10μl各含有近106个细胞的大肠杆菌和藤黄微球菌的水。作为对照，给一些幼虫注射10μl磷酸缓冲液。在通过去除腹足提取血淋巴之前，将幼虫在室温下放置48个小时。在冰上将血淋巴收集于含有一些苯硫脲结晶的试管内，离心5分钟以便去除细胞碎片，并将其冷冻在-80℃。
抗真菌和抗细菌活性检测利用抑制带板检测法测试样品的活性。对于细菌(大肠杆菌和藤黄微球菌)，用营养琼脂(Oxoid)以及近5×106个细胞/ml的细胞密度制备培养板。
对于真菌，用含有0.8％琼脂糖的YPD肉汤(10g/L酵母提取液、10g/L蛋白胨、40g/L D-葡萄糖)以及近106个孢子/ml的孢子密度制备培养板。为了测试活性，将2μl相关样品点斑到板的表面上，生物体在合适的条件(对于细菌是37℃下过夜，对于真菌是室温下1-3天)下生长，直到可以检测出是否存在清除带。被测试的真菌是禾谷镰孢、链格孢、狂犬壳二孢、胶孢炭疽菌、十字花科小球腔菌以及黑曲霉。
肽纯化用C18固相提取处理两种来自不同的大蜡螟免疫接种的粗制血淋巴。用等体积的0.1％三氟乙酸(TFA)稀释融化的血淋巴(1.4或4.8ml)，并在冰上摇晃30-45分钟。将样品高速离心10分钟，并去除上清液。用20％乙腈/0.05％TFA沉淀第一个样品(1.4ml血淋巴)，并高速再离心5分钟。将上清液装到三个经20％乙腈/0.05％TFA平衡的C18固相萃取柱(Maxi-Clean，300mg cartridges，Alltech)中。用20％乙腈/0.05％TFA洗涤每个柱，并用1ml 60％乙腈/0.05％TFA洗脱。将第二个标本(4.8ml血淋巴)装到三个经0.05％TFA平衡的C18固相萃取柱(Maxi-Clean，900mgcartridges，Alltech)中，用0.05％TFA洗涤每个柱，并用3ml 20％乙腈/0.05％TFA以及随后的3ml 60％乙腈/0.05％TFA逐步洗脱。在Speedvac(Savant)中干燥来自60％乙腈/0.05％TFA洗脱液中的样品(1ml)，并重悬于100μl水中。利用上述的板检测法测试样品抗大肠杆菌、藤黄微球菌和各种真菌的活性。
在监测225或215nm处的吸光度的Beckman Gold系统上，用反向HPLC纯化粗制的血淋巴样品。将样品(1.4-1.8ml)装入到经溶剂A(2％乙腈、0.065％TFA)平衡的Jupiter C18、5μm、300A、250×10mmsemi-prep柱(Phenomenex)中，并用梯度为0-70％溶剂B(95％乙腈、0.05％TFA)在70分钟内以5ml/min的速度进行洗脱。在Speedvac中干燥每5ml部分中的500μl，重悬于10μl水，并如上所述的测试抗大肠杆菌、藤黄微球菌和禾谷镰孢的活性。
对于Gm-moricinA而言，用等体积的0.05％TFA稀释相关部分，并装入到HPLC中的经10％溶剂B平衡的Prosphere C18、5μm、300A、250×4.6mm分析柱(Alltech)中。在60分钟内，用以1ml/min速度流动的梯度为10-50％B洗脱柱。在Speedvac中干燥每1.8ml部分中的200μl，重悬于10μl水，并测试抗大肠杆菌、藤黄微球菌和禾谷镰孢的活性。用等体积的0.05％TFA稀释相关部分，并装入到HPLC中的经15％溶剂B平衡的Macrosphere C8、5μm、300A、250×4.6mm分析柱(Alltech)中。在60分钟内，用以1ml/min速度流动的梯度为15-55％B洗脱柱。在Speedvac中干燥每1.8ml部分中的300μl，重悬于10μl水，并测试抗大肠杆菌、藤黄微球菌和禾谷镰孢的活性。
对于Gm-moricinB而言，用等体积的0.05％TFA稀释相关部分，并装入到HPLC中的经15％溶剂B平衡的Prosphere C18、5μm、300A、250×4.6mm分析柱(Alltech)中。在75分钟内，用以1ml/min速度流动的梯度为15-65％B洗脱柱。在Speedvac中干燥每1.8ml部分中的200μl，重悬于10μl水，并测试抗大肠杆菌、藤黄微球菌和禾谷镰孢的活性。用等体积的0.05％TFA稀释相关部分，并装入到HPLC中的经15％溶剂B平衡的Macrosphere C8、5μm、300A、250×4.6mm分析柱(Alltech)中。在60分钟内，用以1ml/min速度流动的梯度为15-55％B洗脱柱。在Speedvac中干燥每1.8ml部分中的300μl，重悬于10μl水，并测试抗大肠杆菌、藤黄微球菌和禾谷镰孢的活性。用等体积的0.05％TFA稀释相关部分，并装入到在215、254、和280nm处监视的SMART系统(AmershamBiosciences)中运行的经溶剂A平衡的μRPC C2/C18、3μm、100×2.1mm分析柱(Amersham Biosciences)中。在25分钟内，用以200μl/min速度流动的梯度为0-100％溶剂B洗脱柱。在Speedvac中干燥每200μl部分中的50μl，重悬于10μl水，并测试抗禾谷镰孢的活性。
对于Gm-moricinC1而言，用等体积的0.05％TFA稀释相关部分，并装入到HPLC中的经10％溶剂B平衡的Prosphere C18、5μm、300A、250×4.6mm分析柱(Alltech)中。在60分钟内，用以1ml/min速度流动的梯度为10-50％B洗脱柱。在Speedvac中干燥每1.8ml部分中的200μl，重悬于10μl水，并测试抗禾谷镰孢的活性。收集相关部分，并用等体积的0.05％TFA稀释，装入到C2/C18柱中。用在SMART系统中流动的溶剂A平衡柱子，并在25分钟内，用以200μl/min流动的梯度为0-100％溶剂B洗涤柱子，同时在215、254和280nm处进行监测。用峰检测收集相关部分，并直接测试抗禾谷镰孢的活性。
肽鉴定利用0.5μl样品加上0.5μl基质，用Voyager Elite MALDI-TOF质谱法(Perseptive Biosystems)分析相关部分。对于线性模式谱，基质是芥子酸以及标准物是cecropinA和肌红蛋白的混合物，对于反射模式谱，基质是α-氰基-4-羟基苯丙烯酸以及标准物是牛血清白蛋白的胰蛋白酶消化物。对于N末端的氨基酸测序，在纤维玻璃盘上干燥纯化的肽，格局产品说明书，利用Procise Model 492蛋白测序仪(Applied Biosystems)进行Edman降解。
结果和讨论用C18固相提取和C18半制备色谱法处理两批不同的粗制血淋巴。经C18固相提取部分纯化后所得到的样品显示出抗大肠杆菌、藤黄微球菌、禾谷镰孢、链格孢菌、狂犬壳二孢、胶孢炭疽菌、十字花科小球腔菌以及黑曲霉的活性。对样品在C18半制备柱上的纯化产生在近25-40％乙腈之间所洗脱出的部分，该部分显示出了抗测试生物体禾谷镰孢的活性。在C18分析柱中进一步地纯化在三个不同的梯度位置上所得到的三个部分。对于Gm-moricinA而言，得到了具有抗禾谷镰孢活性的三个部分。在C8分析柱中进一步纯化其中一个部分，产生具有抗禾谷镰孢活性的一个部分。该部分也显示出了抗十字花科小球腔菌和狂犬壳二孢(A.rabiei)的活性。该部分表现出了如质谱法所判断到的足够高的纯度。该部分不需进一步的纯化即可用于Edman测序。
对于Gm-moricinB而言，在C18分析柱上的纯化产生一个显示出抗禾谷镰孢活性的部分，将该部分在C8分析柱上进行进一步的纯化，产生一个具有抗禾谷镰孢活性的部分。将该部分在C2/C18柱上进行进一步的纯化，产生一个表现出抗禾谷镰孢活性的部分。该部分显示出了足够高的经质谱法所确定出的纯度，并用Edman降解对其进行测序。
对于Gm-moricinC1而言，C18分析柱上的纯化产生两个表现出抗禾谷镰孢活性的部分。汇集这些部分并在C2/C18柱上进行进一步的纯化，产生三个具有抗禾谷镰孢活性的部分。其中一个具有经质谱法确定出的足够高纯化的部分被用于经Edman降解的测序。
MALDI质谱法和Edman测序被用于鉴定纯化的肽。Gm-moricinA具有的表观分子量为4242.9，以及部分氨基酸序列是KVNVNAIKKGGKAIGKGFKVISAASTAHDVYE(SEQ ID NO19)。对于Gm-moricinB，质谱包括一个主峰(3569)以及一些小的组分，使得不可能确定出活性组分的分子量。主要成分的氨基酸序列被确定为GGQIIGKALRGINIASTAHDIISQFKPK(SEQ ID NO20)。Gm-moricinC1的表观分子量为3924.2Da以及部分氨基酸序列是KVPIGAIKKGGKIIKKGLGVIGAAGTAHEVYS(SEQ ID NO30)。利用BLASTP对非冗余数据库进行短配对的搜索发现这三种肽与已知肽例如家蚕、烟草天蛾和斜纹夜蛾的moricin、以及烟芽夜蛾的virescein具有一些同源性。
实施例2对编码大蜡螟moricin样肽的cDNA的鉴定总RNA和多聚(A)+RNA的制备在注射大肠杆菌和藤黄微球菌细胞悬浮液之后24小时，从大蜡螟中切割下脂肪体组织。将已经在冰上冷却至少30分钟的幼虫钉在Sylgard皿中的冰冷PBS下，并沿背中线下的纵向切口打开。用精细的制表镊去除肠道并收集脂肪体。将切割下的脂肪体简单地点吸于吸附组织上，并且在放置于液氮中的微量离心管中进行速冻。将冻存的组织储存在-80℃。
用Trizol试剂(Astral scientific)分离出总RNA。简单地，将近500mg冷冻的脂肪体组织重悬于1mL Trizol试剂中，并在Polytron组织匀浆器中进行匀浆。
利用mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences)，通过两轮寡(dT)-纤维素旋转柱层析的选择分离出多腺苷酸化的RNA。根据产品说明书，将近1mg总RNA结合于寡(dT)-纤维素旋转柱，洗涤，并在1mL低盐缓冲液中进行洗脱。如上所述，将所洗脱的RNA结合于第二个旋转柱上，洗涤并洗脱，终体积为1mL。通过加入终浓度为0.1M的乙酸钠以及200μl乙醇沉淀出mRNA。通过离心回收mRNA，并将其重悬于5μl DEPC处理过的水中。
cDNA文库的制备利用Lambda UniZapc DNA合成和克隆系统(Stratagene)，从近5μgmRNA中制备出cDNA文库。将纯化的cDNA(近20ng)与1μg载体DNA连接，并用GigapackIII Gold包装提取物(Amersham scientific)进行包装，以便生成滴度为每mL 5×105个菌斑形成单位的cDNA文库。PCR对编码moricin样肽的cDNA的鉴定用对大蜡螟Gm-moricinA和Gm-moricinB肽的氨基酸序列的逆转录设计出短的、最小变性的寡核苷酸。表2给出了这些寡核苷酸的序列。
表2用于鉴定大蜡螟moricin的cDNA的引物

*在一些位点上使用脱氧次黄苷三磷酸(I)，以便减少寡核苷酸池的总体兼并性。每个寡核苷酸对GmAF1/GmAF2和GmAF3/GmAF4都被用作为PCR扩增编码Gm-moricinA和Gm-moricinB肽的cDNA片段的引物。近2ng用于文库构建的纯化的双链cDNA被用作PCR反应的模板。
从丙烯酰胺凝胶中切下预期大小的PCR产物，在乙酸铵中洗脱出DNA，并通过乙醇沉淀回收DNA。将纯化的DNA连接到克隆载体pGEM-Teasy(Promega)，并通过电穿孔将其转化到大肠杆菌DH10B细胞内。利用基于载体的多个克隆位点侧方的T7和SP6启动子序列的引物，利用PCR筛选所形成的细菌克隆中的插入物。对于每种Gm-moricinA和Gm-moricinB PCR产物，对含有预期大小的一些克隆的两条链都进行测序，并用所推导出的蛋白序列将克隆确认为真正的Gm-moricinA和Gm-moricinB cDNA产物。选择出每种moricin cDNA类型中的代表性克隆，将其用于随后的文库筛选。
探针合成用PCR反应合成探针，其中用放射性标记的ATP代替dATP。从每种Gm-moricinA和Gm-moricinB cDNA片段(表3)的代表性克隆中设计出独特的序列引物。利用表3中所述的引物以及作为模板的克隆pGmmA7(Gm-moricinA)和pGmmB11(Gm-moricinB)的cDNA插入物制备出每种大蜡螟moricin cDNA的杂交探针。
表3用于制备文库筛选的杂交探针的部分克隆和寡核苷酸引物

表4描述了用于两种探针中的每种探针的PCR反应的组成。反应条件包括最初的变性步骤94℃下3分钟，随后是30个循环的94℃下45秒、53℃下30秒、72℃下45秒，以及终末步骤是72℃下5分钟到结束。
表4探针标记反应条件

利用尺寸排除旋转柱层析(BioRad P30微型生物旋转柱)从完全反应物中清除未结合的dNTP，并用TLC监测放射性同位素的整合情况。
文库筛选将cDNA文库以每板5×104pfu的密度铺板到5个15cm的LB琼脂板上。在硝化纤维素滤膜上进行两次菌斑的拾取，变性DNA并利用标准方法将其固定到膜上(Sambrook et al.，1989，supra)。
首先用大蜡螟Gm-moricinA基因的探针筛选文库，洗涤初始滤膜并用大蜡螟Gm-moricinB基因的探针再次进行筛选。
将滤膜放置在杂交瓶(Hybaid)中，并在20ml含有5XSSPE、5XDenhardt溶液、0.5％w/v SDS、和200μg/ml新鲜变性的鲱精DNA的溶液中、60℃下预杂交最少2个小时。通过煮沸10分钟以及随后的冰上冷却将探针变性。将冷却的探针溶液加入到滤膜上，并在60℃下杂交过夜。
每次变化后都将滤膜在0.5xSSPE、0.1％SDS中、60℃下洗涤三次。
分离并表征编码大蜡螟Gm-moricinA肽的cDNA从初次文库筛选中鉴定出近80个杂交噬菌体。其中4个进行了菌斑纯化、质粒切割、以及利用Beckman CEQ8000 DNA分析仪和BeckmanDCTS化学用染料终止子测序对两条链都进行了cDNA插入物测序。鉴定出三个克隆(pGmmoriAa、pGmmoriAd、pGmmoriAe)，它们仅仅在5’末端的长度上有所不同。第四个克隆(pGmmoriAc)是相同基因的等位基因变体，它们与其它三个克隆有着6个核苷酸取代的不同，其中两个核苷酸取代造成了预测分泌信号肽中的氨基酸取代。其它变化或是沉默变化或者出现在mRNA的非翻译区。图1以序列比对的形式显示出了这些Gm-moricinA cDNA克隆中的两个克隆的核苷酸序列，图2以序列比对的形式显示出了所推论出的氨基酸序列。
图3显示了克隆pGmmoriAa的核苷酸序列，它代表最为常见的克隆类型，以及所推论的编码Gm-moricinA肽的开放阅读框的蛋白序列，所述蛋白序列开始于骨架内的第一个甲硫氨酸残基。图中也显示了预期蛋白前体的加工位点。
分离并表征编码大蜡螟Gm-moricinB肽的cDNA从初次文库筛选中鉴定出超过150个杂交噬菌体。其中3个进行了菌斑纯化、质粒切割、以及利用Beckman CEQ8000 DNA分析仪和Beckman DCTS化学用染料终止子测序对两条链都进行cDNA插入物测序。这些克隆(称作pGmmoriBe1、pGmmoriBe2和pGmmoriBd1)仅仅在5’末端的长度上有所不同。
图3显示了代表性克隆pGmmoriBe1的核苷酸序列，以及所推论的编码Gm-moricinB肽的开放阅读框的蛋白序列，所述蛋白序列开始于第一个骨架内甲硫氨酸残基。
用PCR从cDNA文库中鉴定出Gm-moricinC1和Gm-moricinC2用肽测序所得到的Gm-moricinC1的氨基酸序列设计出变性引物(Gm3-1和Gm3-2，见表5)，以便用PCR从大蜡螟cDNA文库中分离出基因。对PCR产物的测序鉴定出两种形式的Gm-moricinC基因。设计出特异引物(GmC1-F、GmC1-R、GmC2-F和GmC2-R，见表5)，当在巢式PCR中应用所述引物和基于pBluescript SK噬菌粒(Stratagene)的载体引物时，可以区分出两种形式的基因。
对于Gm-moricinC1，利用引物对Gm3-1/M13(反向)和GmC1-F/T3，用巢式PCR得到3’基因片段，以及利用引物对Gm3-2/M13(前向)和GmC1-R/T7，用巢式PCR得到5’片段。对于Gm-moricinC2，利用引物对Gm3-1/M13(反向)和GmC2-F/T3，用巢式PCR得到3’基因片段，以及利用引物对Gm3-2/M13(前向)和GmC2-R/T7，用巢式PCR得到5’片段。对所得到的PCR产物进行测序，所述产物包括基因的从5’到3’的未翻译区的序列。
然后设计出第三组特异引物(GmC1utr5、GmC1utr3、GmC2utr5和GmC2utr3，见表5)，以便与两个基因的5’和3’未翻译区进行退火。用引物对GmC1utr5/GmC1utr3和GmC2utr5/GmC2utr3进行PCR确定出Gm-moricinC1和Gm-moricinC2肽开放阅读框的全部序列。
对于Gm-moricinC1，测序8个克隆，它们除了长度上的不同之外，仅在3个核苷酸位点上有所不同。这些取代中的两个是位于肽开放阅读框内，一个造成了预测分泌信号肽中的氨基酸改变(残基13，MET或VAL)。图5显示出了代表性克隆Gm-moricinC1、Gm3-01ae的核苷酸序列，以及所推论的开放阅读框的蛋白序列，所述序列开始于骨架内的第一个甲硫氨酸残基。图上显示出了预计蛋白前体的加工位点。该图也显示了序列中的三个位点，其中发现了核苷酸取代，并显示了在肽开放阅读框中的位点13上所发现的氨基酸变异。
表5用于鉴定大蜡螟Gm-moricinC1和Gm-moricinC2基因的引物

对于Gm-moricinC2，在四个独立的克隆中都没有观察到核苷酸变异。
图6显示出了Gm-moricinC2的代表性克隆Gm3-03的核苷酸序列，以及所推论的开放阅读框的蛋白序列，所述序列开始于骨架内的第一个甲硫氨酸残基。图上也显示出了预计蛋白前体的加工位点。
图7和8分别显示了Gm-moricinC1和Gm-moricinC2在核苷酸和氨基酸水平上的比对。在核苷酸水平上，Gm-moricinC1和Gm-moricinC2在开放阅读框内有着19个核苷酸的不同，其中3个位于预计的信号区，以及2个和14个分别位于成熟肽的N和C末端半侧内(图8)。在氨基酸水平上，Gm-moricinC1和Gm-moricinC2有着最多6个氨基酸的差异，包括预计信号区的1-2个氨基酸差异(依据于Gm-moricinC1的形式)，以及4个氨基酸差异位于肽编码区(图9)。编码区内的氨基酸差异都位于肽的C末端半侧，该区域是核苷酸序列有着显著分歧的区域。
结构分析利用DSModeling 1.1(Accelrys Inc)分析家蚕的moricin NMR结构(Hemmi et al.，2002)。利用家蚕moricin所建立的Gm-moricinA和家蚕moricin X的同源模型被作为DSModeling中的模板和缺省设定。利用PSIPRED(McGuffin et al.，2000)进行二级结构预测。利用ClustalW(Chenna，et al.，2003)构建出系统树，其中enbocin作为无关项。
讨论对于Gm-moricinA、Gm-moricinB和Gm-moricinC1而言，N末端的氨基酸测序所确定出的部分序列与所翻译的DNA序列部分相同。这使得能够从相应DNA序列的预测开放阅读框中提取出肽的完整序列。通过对cDNA文库的PCR也鉴定出了Gm-moricinC2，它是一种与Gm-moricinC1紧密相关的肽。利用BLASTP，用所推论出的成熟肽的序列搜索非冗余数据库中的短匹配。这些搜索说明这些肽与先前在其它鳞翅类动物(包括家蚕、烟草天蛾、斜纹夜蛾和烟芽夜蛾)中所鉴定到的moricin和virescein肽相似。用这四种肽对大蜡螟肽的GAP比对说明活性肽的相同性为77％。总而言之，与来自烟芽夜蛾的virescein显示出了最高的相似性，Gm-moricinB比Gm-moricinA、Gm-moricinC1和Gm-moricinC2更相似于已知的moricin。
图9显示了Gm-moricinA、Gm-moricinB、Gm-moricinC1和Gm-moricinC2与其它鳞翅类动物的相关肽的ClustalW比对。通过组合该比对、氨基酸测序的信息以及关于昆虫抗微生物肽的信号肽加工处理的知识(Boman et al.，1989)，大蜡螟的成熟肽更可能是开始于残基26(图9)。与此有所不同的是Gm-moricinB，其中N末端氨基酸序列和质谱数据都显示从大蜡螟血淋巴中分离出的活性肽开始于残基36。
如在文献(Hemmi et.al，2002)中所讨论的以及利用DSModeling所进一步分析的那样，家蚕的moricin结构的主要特点是从残基5到36的螺旋，在残基22和23之间具有一个弯曲。将该结构信息与图9所示的肽序列比对的结构信息相关联是令人感兴趣的。螺旋起始于位点5(相对于成熟蛋白的N末端)，恰在脯氨酸残基之后，该残基存在于除Gm-moricinA外的每种moricin序列内。对于Gm-moricinA而言，利用PSIPRED预测到的二级结构提示螺旋起始于其他moricin的等价位点(残基4)，尽管它缺乏脯氨酸残基。家蚕moricin的N末端区(1-22)是两亲性的，在螺旋的一个面上具有6个碱性氨基酸。其他的moricin在相同的区域上含有5到7个碱性残基，尽管碱性氨基酸的序列位点并不是保守的。这说明这是带阳性电荷的螺旋面，这才是重要的特点，而不是碱性残基的确切的序列位点。Gm-moricinB是一个有趣的实例，因为活性肽具有带明显更弱的阳性电荷的N末端区，这是因为10个残基的截断。对于家蚕moricin而言，C末端的螺旋区(23到36残基)是疏水性的，在螺旋区的中间部分具有完全保守的酸性残基。Gm-moricinA和C.illioneusmoricinP1648是有趣的，其中它们在其C末端的螺旋区的末端都含有额外的酸性残基，并且Gm-moricinA模型显示有两个酸性残基簇集在螺旋的一个面上。家蚕moricin以及约一半的已知moricin序列都在其螺旋区的末端上具有脯氨酸残基。也预测Gm-moricinA螺旋结束于相同的位点，尽管其缺乏脯氨酸残基。对于家蚕moricin而言，其C末端的尾部是无结构的。在所有的moricin中，该尾部是带有强电荷的，这是区分moricin和cecropin(Hemmi et al)一个特点。
实施例3合成的大蜡螟Gm-moricinA、Gm-moricinB和Gm-moricinC2的抗各种真菌的活性利用标准的肽合成技术，用Auspep(Melbourne，Australia)合成四种moricin肽。它们是家蚕moricin(SEQ ID NO16的残基25到66)、Gm-moricinA(SEQ ID NO4)、Gm-moricinB(SEQ ID NO5)和Gm-moricinC2(SEQ ID NO53)。测试了这些肽抗细菌大肠杆菌和藤黄微球菌，以及抗如在实施例1中所述的真菌禾谷镰孢、链格孢、狂犬壳二孢、胶孢炭疽菌、十字花科小球腔菌以及黑曲霉的孢子的活性。所测试的浓度是0.1、1、10和100μM以及1pg/μl。表6显示了结果，并且说明所有的肽都显示出了一些抗真菌的活性。
也用抑制带板检测法测试了合成肽抗真菌的菌丝体的活性。通过在微量离心管的无菌水中用微研杵的碾碎将禾谷镰孢(F.graminearum)和尖孢镰孢(F.oxysporum)的菌丝体片段化。利用含有0.8％琼脂糖的YPD肉汤以及一个体积的菌丝体片段(造成了真菌的均一生长)制备出真菌培养板。将相关样品(2μl)点斑到板的表面上，生物体在合适的条件下生长。表6概括了结果，并且说明moricin肽也具有抗真菌的菌丝体的活性。
表6合成moricin肽抗各种微生物的活性所示的浓度(μM)是其中在区带抑制检测法中所观察到的最低浓度，N表示没有观察到活性，短划线表示样品没有被测试。

Eco，大肠杆菌；Mlu，藤黄微球菌；Fgr，禾谷镰孢孢子；Fgm，禾谷镰孢菌丝体；Fox，尖孢镰孢孢子；Fom，尖孢镰孢菌丝体；Ara，狂犬壳二孢孢子；Lma，十字花科小球腔菌孢子；Ani，黑曲霉孢子。
还在妇幼医院(Adelaide，Australia)采用NCCLS M27-A2微肉汤稀释方法针对6种酵母对合成的Gm-moricinA进行了测试。测试的酵母是白色假丝酵母、近平滑假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯氏假丝酵母、热带假丝酵母、和新型隐球菌。针对各种测试酵母，以0.125-64μg/ml测试了该肽(双份)。在24、48或72小时时适当对板进行读数。测得的MIC90值为对近平滑假丝酵母，热带假丝酵母和新型隐球菌为4.0μg/ml，对克鲁斯氏假丝酵母为8.0μg/ml，而对白色假丝酵母和光滑假丝酵母为64.0μg/ml。这些结果说明，Gm-moricinA具有抗酵母的活性。
根据对成熟肽序列的ClustalW比对(图9)所进行的对系统树的构建说明GmmoricinA、GmmoricinC1、GmmoricinC2和BmmoricinX是紧密相关的，认为可以将它们簇集在一起作为moricin的亚族。对该亚组中的两个成员(Gm-moricinA和Gm-moricinC2)的抗真菌的测试说明该组肽比合成的家蚕moricin具有更好的抗真菌的活性(表6)。
实施例4抗真菌肽在拟南芥中的表达用大蜡螟Gm-moricinA基因对拟南芥进行土壤杆菌介导的转化将编码Gm-moricinA的DNA克隆到土壤杆菌转移载体p277(来自CSIRO Plant Industy，Canberra，Australia)内。通过将pART7的NotI片段插入到pART27内构建出了该载体(Gleave，1992)。P277载体含有用于植物表达的CaMV 35S启动子和OCS终止子，用于抗生素选择的标记物、以及植物转化所需的序列。选出三种Gm-moricinA DNA构建体，将其转化到拟南芥内无信号肽的成熟Gm-moricinA、包括其天然信号肽的全长Gm-moricinA、以及由拟南芥空泡碱性壳质酶信号肽以及成熟Gm-moricinA序列构成的融合物。通过PCR合成这些构建体，并将其直接克隆到p277转移质粒内。
利用三亲本杂交法实现了土壤杆菌GV3101的转化。这包括在非选择性的LB板上共同划线培养根瘤农杆菌GV3101、带有辅助质粒RK2013的大肠杆菌、和带有所需重组p277质粒的大肠杆菌。28℃下的过夜孵育产生混合培养物，收集并将其稀释，划线铺板到LB板上，这就选择出了带有p277重组质粒的根瘤农杆菌GV3101。
用标准的方法在23℃、每天日照18个小时的条件下培养拟南芥植物。通过花浸渍进行对拟南芥植物的转化。植物生长到3-5周大，其中多个花茎上出现处于不同发育阶段的花。将转化根瘤农杆菌GV3101的过夜培养物碎片化并将其重悬在含有湿化剂Silwet-77的5％蔗糖中。将花浸渍到细菌悬浮液中，并用摆动运动将其充分浸湿。将植物包装在塑料膜内，并将其在试验台面上室温下放置过夜，在开包之前将其放回到恒温在21℃的植物生长箱内。在1-2周后重复浸渍，以便增加转化种子的数目。在浸渍后3-4周收集种子，对于每种生态型，将其种子被膜干燥一段适宜长的时间，然后将种子灭菌并在含有选择性抗生素和抗真菌剂的Noble琼脂板上发芽。
将阳性的转化体移到Arasystem罐(Betatech)内，在Aracon systemsleeves中生长到成熟，并仔细地收集种子。用PCR和逆转录酶PCR(RT-PCR)筛选32个所转化的拟南芥植物(T1代)，以便确认重组基因的存在和表达。利用Extract-N-Amp植物PCR和Extract-N-Amp Reagent试剂盒(Sigma)从经全长Gm-moricinA构建体所转化的植物的叶子中提取出基因组DNA。利用特异于Gm-moricinA基因的引物(LMxho5，5′-CTCGAGAACAATGAAGTTTACAGGAATATTCTTCA-3′(SEQ ID NO41)和LMxba3，5′-TCTAGATTAGTGCCTTCTGTTTTTAATGTGTTCATAGAC-3′(SEQ IDNO42))对提取物进行PCR。对于RT-PCR，随机选择8种经全长Gm-moricinA构建体所转化的植物进行分析。将这些植物的叶子速冻，并用研钵和研棒将其在液氮中粉碎。用RNesay植物试剂盒(Qiagen)分离出RNA。利用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)从RNA中制备出cDNA。利用1μl cDNA、重组Taq聚合酶(Invitrogen)、54℃的退火温度、和Gm-moricinA特异引物(LMxho5和LMxba3)进行PCR。在1.2％琼脂糖凝胶中显像每种25μl PCR反应物中的3μl反应物。
将T1幼苗移植并经两代培育成种子，以便最终分离出纯合的T3种子。然后可以筛选T3植物是否增加了对真菌性疾病的抗性。
利用尖孢镰孢的接种方案从J.Manners(CSIRO Plant Industry，Queensland，Australia)得到了已知对于拟南芥为致病性的尖孢镰孢株。将真菌分离株保持在1/2强度的Potato Dextrose Agar(PDA)上。
从保持储存液中取出核心，并将其用于接种500ml Potato DextroseBroth(PDB)。在摇晃器中28℃下孵育培育瓶7天。在用血细胞计数仪进行定量之前，经Miracloth排空接种物。用无菌的蒸馏水稀释孢子，将其用于接种拟南芥株。
培育一些生态型的拟南芥进行测试，所述拟南芥包括Columbia0(Col-0)、Landsberg erecta(L-er)合Sg-1(来自CSIRO Plant Industry，Canberra，Australia)。将用于接种的拟南芥植物一个一个地在“jiffy”盆中生长近2-3周。在感染前近4天，停止给植物浇水。通过将孢子(5ml的2×106-1×107孢子/ml)直接地加入到邻近植物茎部的土壤中，接种拟南芥植物。将植物孵育在25下，并在孵育后近10-12天对枯萎症状和/或死亡进行积分。
为了进一步地表征特异的基因型所引起的疾病水平，用一组寡核苷酸引物(Fol8Sits-F，5′-CGCCAGAGGACCCCTAAAC-3′(SEQ ID NO43)和Fol8Sits-R，5′-ATCGATGCCAGAACCAAGAGA-3′(SEQ ID NO44))扩增尖孢镰孢的18SrRNA的区域。引物显示与拟南芥RNA从很少同源性到没有同源性，并且作用为显示出与植物RNA比较时的真菌RNA水平的差异。
结果和讨论当用尖孢镰孢感染时，所有的三种拟南芥生态型(Col-0、L-er、Sg-1)都表现出了疾病症状。通过感染后6天的显著反应，在Sg-1生态型中观察到了最为明显的疾病表型。对从受感染的Col-0和L-er植物中所提取到的RNA的定量PCR显示出尖孢镰孢RNA的存在，甚至植物只有很弱的疾病表型，这确认了已经发生了感染。
用三种Gm-moricinA构建体转化拟南芥(Sg-1生态型)，种子在卡那霉素选择下发芽。对于没有信号肽的Gm-moricinA、包括其天然信号肽的全长Gm-moricinA、和壳质酶信号肽-Gm-moricinA融合物的转化率(所生成的T1幼苗对所播种的种子比例的百分比)分别是0.53、0.85和0.25％。对从经全长Gm-moricinA构建体所转化的植物的叶子中所提取到的基因组DNA的PCR显示所有的植物都含有转基因。用RT-PCR进行对8个随机选择的含有全长Gm-moricinA基因的转化体的进一步分析。在所有8株中都检测到了转录，说明Gm-moricinA基因已经被有效地表达。
容易用与在此所述的方法相似的方法表达本发明的其它蛋白，例如植物中的Gm-moricinB、Gm-moricinC1、和/或Gm-moricinC2。
实施例5大蜡螟Gm-moricinA抗血清的制备和用途利用医学和兽医科学研究所(Adelaide，Australia)中的给新西兰白兔皮下注射的标准方法(见，例如Ed Harlow and David Lane(editors)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988))产生抗合成Gm-moricinA的抗体。标准方法处理一只兔子，其中初次接种为1ng肽以及随后的三次0.83mg的强化接种。用0.1mg肽加上氢氧化铝接种第二只兔子，随后用0.83mg和氢氧化铝进行三次强化接种。在末次强化接种之后，从每只兔子中收集到近40ml血清。不需进一步纯化即可使用抗血清，并用ELISA、点印迹法和Western印迹法评价抗血清。
如制造商所推荐的，利用10％ Bis-Tris NuPAGE Novex预制凝胶(Invitrogen)和MES跑胶缓冲液进行蛋白电泳。利用在Novablot半干印迹仪上的0.2μM Trans-Blot硝基纤维素膜(BioRad)、以0.8mA/cm2在含有20％甲醇的转移缓冲液(25mM Bicine、25mM Bis-Tris、1mM EDTA，pH 7.2)中进行Western印迹转移。利用所有步骤之间的3次5分钟的洗涤，在含有0.1％Tween-20的PBS中室温下处理膜。所用的步骤是用3％BSA的过夜封闭、与肽抗血清(1/250-1/500稀释)孵育1小时以及与抗兔IgG碱性磷酸酶缀合物(Sigma，1/30000稀释)孵育1小时。用四唑氮蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)(Promega)在底物缓冲液(100mM Tis-Cl、5mM MgCl2、100mM NaCl，pH 9.5)中显像印迹。
在Western印迹法中，在1/250抗血清稀释液中，在SDS-PAGE凝胶上检测出50ng(可能更少量)的Gm-moricinA是有可能的。抗血清似乎是高度特异的，因为加入1μg合成肽的SDS-PAGE凝胶的Western印迹法仅仅检测到了Gm-moricinA，但没有检测到Gm-moricinB、家蚕moricin、和无关的对照肽。
实施例6大蜡螟Gm-moricinA肽在昆虫细胞中的表达利用用GATEWAY技术(Invitrogen)所构建出的重组杆状病毒，在Sf21细胞中表达Gm-moricinA肽。所设计出的引物含有与真核细胞控制区以及Gm-moricinA特异序列相连接的attB1和attB2识别序列(LmlattB1，5′-attB1-TCGAAGGAGATGCCACCATGAAGTTTACAGGAATATTCTTCA-3′(SEQ ID NO45)和Lm2attB2，5′-attB2-TTAGTGCCTTCTGTTTTTAATGTGTTCATAGAC-3′(SEQ ID NO46))。用这些引物和Pfx聚合酶(Invitrogen)扩增Gm-moricinA-attB PCR产物。根据产品说明书，经pDONR201输入载体(100fmol)将PCR产物(100fmol)穿梭到pDEST-8杆状病毒目标载体内。用氨苄西林培养板和利用FastPlasmid最小质粒纯化试剂盒(Eppendorf)所制备的质粒选择转化体。用PCR、限制性酶消化和序列分析确认阳性转化体。
通过42℃下热休克45秒、冰上冷却2分钟、以及摇晃的SOC培养基中37℃下生长3小时，将pDEST-8-Gm-moricinA质粒DNA转化到DH10Bac感受态细胞株(Invitrogen)内。在37℃下过夜孵育之后，选择出含有四环素、庆大霉素、卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)的LB培养板上的白色克隆。利用标准的“Bac-to-Bac”方案(Invitrogen)，从在37℃下过夜生长的培养物中提取出杆粒DNA，并用利用M13前向和反向引物的PCR筛选Gm-moricinA基因。
用DOTAP脂质体转染试剂(Roche)将杆粒DNA转染到Sf21细胞内，并将其生长在6孔板的BaculoGold Max-XP无血清培养基(BDBiosciences)中。在27℃下近90个小时的孵育造成了明显的细胞致病。取出并澄清上清液，通过将细胞刮取到新鲜培养基中来收集细胞成分，离心并将其重悬在50mM Tis(pH 6.8)中。
为了分析Sf21细胞提取物中是否存在Gm-moricinA mRNA，用Perfect RNA试剂盒(Eppendorf)制备RNA。用Superscript II One-StepRT-PCR试剂盒(Gibco)和Lm2attB1及Lm2attB2引物进行RT-PCR。也用C18固相提取加工处理细胞和上清液样品，并测试其抗禾谷镰孢的活性(见实施例1)，以及用利用Gm-moricinA抗血清的Western印迹法(见实施例5)测定其中是否存在Gm-moricinA。
结果和讨论RNA制备和RT-PCR确认了Sf21细胞提取液中存在着Gm-moricinAmRNA。经C18固相提取所处理过的细胞和上清液显示出抗禾谷镰孢的活性。Western印迹结果说明充分处理过的Gm-moricinA已经生成并被分泌到了上清液中。这些结果确认了杆状病毒细胞可以生成经正确加工处理过的具有抗病毒活性的Gm-moricinA肽。
本领域人员知道，在不脱离所广泛描述的发明的精神或范围的情况下，可以对在具体实施方式
中所示的发明内容进行很多变异和/或修饰。因此，这些实施方式不论在哪个方面都仅仅被认为是作为举例说明的，而不是限制的。
将上面所讨论的所有文献的全部内容都并入本申请。
对本说明书中已经包含的文档、技术、材料、设备、文章等的任何讨论都只针对于给本发明提供背景知识的目的。这并非承认因其存在于本申请的各个权利要求的优先权日之前，这些内容中任一内容或全部内容便构成了现有技术基础的一部分或者是本发明所属领域中的公知常识。
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ttttagtttt ataaattata ttaagtatta attttataat taataaaaaa gcttaaatat 420<210>9<211>192<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>9atgaagttta caggaatatt cttcataatt atggcgatca ttgccctctt tatagggtca60aatgaagcgg cgcctaaagt caatgttaat gccattaaga agggaggaaa ggccatagga 120aaaggattta aagtaatcag tgcggcgagt acagcgcatg acgtctatga acacattaaa 180aacagaaggc ac 192<210>10<211>192<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>10atgaatttta caggaatatt cttcatgatt atggcgatca ttgccctctt tatagggtca60aatgaagcgg cgcctaaagt caatgttaat gccattaaga agggaggaaa ggccatagga 120aaaggattta aagtaatcag tgcggcgagt acagcgcatg acgtctatga acacattaaa 180aacagaaggc ac 192<210>11<211>204<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>11atgagattgt ccataatatt ggtcgttgtg atgatggtga tggctatgtt tgtgagcagt60ggagatgcgg cgcctggaaa aattcctgtg aaagcgatta aaaaaggagg gcaaattatt 120ggtaaagctc tgcgtggaat caatatagcg agtactgcac atgacataat tagccagttc 180aaaccgaaaa agaagaaaaa ccat 204<210>12<211>117<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>12aaagtcaatg ttaatgccat taagaaggga ggaaaggcca taggaaaagg atttaaagta60atcagtgcgg cgagtacagc gcatgacgtc tatgaacaca ttaaaaacag aaggcac 117
<210>13<211>99<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>13ggagggcaaa ttattggtaa agctctgcgt ggaatcaata tagcgagtac tgcacatgac 60ataattagcc agttcaaacc gaaaaagaag aaaaaccat 99<210>14<211>67<212>PRT<213>Spodoptera litura<400>14Met Lys Leu Thr Lys Val Phe Val Ile Leu Ile Val Val Val Ala Leu1 5 10 15Leu Val Pro Ser Glu Ala Ala Pro Gly Lys Ile Pro Val Lys Ala Ile20 25 30Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ile Gly Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile35 40 45Ala Ser Thr Ala His Asp Val Tyr Ser Phe Phe Lys Pro Lys His Lys50 55 60Lys Lys His65<210>15<211>67<212>PRT<213>Manduca sexta<400>15Met Lys Leu Thr Ser Leu Phe Ile Phe Val Ile Val Ala Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Phe Ser Ser Thr Asp Ala Ala Pro Gly Lys Ile Pro Val Lys Ala20 25 30Ile Lys Gln Ala Gly Lys Val Ile Gly Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn35 40 45Ile Ala Gly Thr Thr His Asp Val Val Ser Phe Phe Arg Pro Lys Lys50 55 60
Lys Lys His65<210>16<211>66<212>PRT<213>Bombyx mori<400>16Met Asn Ile Leu Lys Phe Phe Phe Val Phe Ile Val Ala Met Ser Leu1 5 10 15Val Ser Cys Ser Thr Ala Ala Pro Ala Lys Ile Pro Ile Lys Ala Ile20 25 30Lys Thr Val Gly Lys Ala Val Gly Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile35 40 45Ala Ser Thr Ala Asn Asp Val Phe Asn Phe Leu Lys Pro Lys Lys Arg50 55 60Lys His65<210>17<211>41<212>PRT<213>Heliothis virescens<400>17Gly Lys Ile Pro Ile Gly Ala Ile Lys Lys Ala Gly Lys Ala Ile Gly1 5 10 15Lys Gly Leu Arg Ala Val Asn Ile Ala Ser Thr Ala His Asp Val Tyr20 25 30Thr Phe Phe Lys Pro Lys Lys Arg His35 40<210>18<211>66<212>PRT<213>Bombyx mori<400>18Met Tyr Phe Leu Lys Tyr Phe Ile Val Val Leu Val Ala Leu Ser Leu1 5 10 15
Met Ile Cys Ser Gly Gln Ala Asp Pro Lys Ile Pro Val Lys Ser Leu20 25 30Lys Lys Gly Gly Lys Val Ile Ala Lys Gly Phe Lys Val Leu Thr Ala35 40 45Ala Gly Thr Ala His Glu Val Tyr Ser His Val Arg Asn Arg Gly Asn50 55 60Gln Gly65<210>19<211>32<212>PRT<213>Galleria mellonella<400>19Lys Val Asn Val Asn Ala Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ala Ile Gly Lys1 5 10 15Gly Phe Lys Val Ile Ser Ala Ala Ser Thr Ala His Asp Val Tyr Glu20 25 30<210>20<211>28<212>PRT<213>Galleria mellonella<400>20Gly Gly Gln Ile Ile Gly Lys Ala Leu Arg Gly Ile Asn Ile Ala Ser1 5 10 15Thr Ala His Asp Ile Ile Ser Gln Phe Lys Pro Lys20 25<210>21<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide primer<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>N＝inosine
<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>N＝inosine<400>21aaygtnaayg cnathaaraa rgg 23<210>22<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide primer<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(19)..(19)<223>N＝A，C，G or T<400>22ytcrtanacr gcrtgngcnt g 21<210>23<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide primer<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>N＝inosine
<400>23ggnggncara thathggnaa rgc 23<210>24<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide primer<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>N ＝A.C.G or T<400>24tgnsndatda trtcrtgngc ngt 23<210>25<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide primer<400>25gaggaaaggc cataggaaaa gg22<210>26<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide primer<400>26actcgccgca ctgattac 18
<210>27<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide primer<400>27ggggggcaga tcattggg 18<210>28<211>19<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide primer<400>28ttatgtcatg ggccgtact19<210>29<211>337<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>29ggtaacatct ttattagtta tcgtaaaata acagattgta gaaatgaagt ttacaggaat60attcttcata attatggcga tcattgccct ctttataggg tcaaatgaag cggcgcctaa 120agtcaatgtt aatgccatta agaagggagg aaaggccata ggaaaaggat ttaaagtaat 180cagtgcggcg agtacagcgc atgacgtcta tgaacacatt aaaaacagaa ggcactaata 240aaaccaaaaa taattattta ttttataagg taattttaag acatataatg tatgttgcaa 300attattaagt gaaataaaat ataaaatatt ttttgtt337<210>30<211>32<212>PRT<213>Galleria mellonella<400>30Lys Val Pro Ile Gly Ala Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Gly Leu Gly Val Ile Gly Ala Ala Gly Thr Ala His Glu Val Tyr Ser20 25 30<210>31<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucleotide sequence<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>N＝A，C，G or T<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>N ＝A，C，G or T<400>31ccnaargtnc cnathggngc 20<210>32<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Primer<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>N ＝A，C，G or T<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>N＝inosine<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>N＝A，C，G or T<400>32tanacttcrt gngcdgtncc 20<210>33<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucleotide Primer<400>33aggtcttggt gtaattggtg 20<210>34<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Sequence<400>34gcagcaccaa ttacaccaag 20<210>35<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Sequence<400>35taaaaagggt ctaggtgtgc 20<210>36<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Sequence<400>36gcggcgccaa gcacacctag 20<210>37<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Primer<400>37cttcaatctt agtgaaaact tcgc 24<210>38<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucleotide Primer<400>38ggatagtact tcataattat atac 24<210>39<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Sequence<400>39gttgcaggac ttaatactta gtg 23<210>40<211>25<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Sequence<400>40gagtatttta ctaataagta tgtgg 25<210>41<211>35<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Primer<400>41ctcgagaaca atgaagttta caggaatatt cttca 35<210>42<211>39<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Primer<400>42tctagattag tgccttctgt ttttaatgtg ttcatagac 39<210>43<211>19<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Oligonucleotide Primer<400>43cgccagagga cccctaaac19<210>44<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Primer<400>44atcgatgcca gaaccaagag a 21<210>45<211>42<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Primer<400>45tcgaaggaga tgccaccatg aagtttacag gaatattctt ca 42<210>46<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Oligonucleotide Primer<400>46ttagtgcctt ctgtttttaa tgtgttcata gac33<210>47<211>63<212>PRT<213>Galleria mellonella<400>47Met Lys Leu Thr Gly Leu Phe Phe Met Ile Met Ala Met Leu Ala Leu1 5 10 15Phe Val Gly Ala Gly Gln Ala Asp Pro Lys Val Pro Ile Gly Ala Ile20 25 30Lys Lys Gly Gly Lys Ile Ile Lys Lys Gly Leu Gly Val Ile Gly Ala35 40 45
Ala Gly Thr Ala His Glu Val Tyr Ser His Val Lys Asn Arg His50 55 60<210>48<211>38<212>PRT<213>Galleria mellonella<400>48Lys Val Pro Ile Gly Ala Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Gly Leu Gly Val Ile Gly Ala Ala Gly Thr Ala His Glu Val Tyr Ser20 25 30His Val Lys Asn Arg His35<210>49<211>375<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>49gtaacagtac caccgtgtac agtcgcagta gttagtcttc aatcttagtg aaaacttcgc60ttctctttat caaccatgaa gctgaccggt ctatttttca tgatcatggc gatgctcgcc 120ctgtttgttg gcgctggtca agccgaccct aaggtgccca ttggcgccat caagaagggt 180ggcaaaatta ttaaaaaagg tcttggtgta attggtgccg ctggtacagc gcatgaagta 240tatagccacg tcaagaacag gcattagatt cttgaagaat atatagtata taattatgaa 300gtactatcct tttgtatatg tgactaagtg cataatgtaa agtcaaatga aatatatatt 360atttatcctc gtgcc375<210>50<211>192<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>50atgaagctga ccggtctatt tttcatgatc atggcgatgc tcgccctgtt tgttggcgct60ggtcaagccg accctaaggt gcccattggc gccatcaaga agggtggcaa aattattaaa 120aaaggtcttg gtgtaattgg tgccgctggt acagcgcatg aagtatatag ccacgtcaag 180aacaggcatt ag 192
<210>51<211>117<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>51aaggtgccca ttggcgccat caagaagggt ggcaaaatta ttaaaaaagg tcttggtgta60attggtgccg ctggtacagc gcatgaagta tatagccacg tcaagaacag gcattag 117<210>52<211>63<212>PRT<213>Galleria mellonella<400>52Met Lys Leu Thr Gly Leu Phe Leu Met Ile Met Ala Val Leu Ala Leu1 5 10 15Phe Val Gly Ala Gly Gln Ala Asp Pro Lys Val Pro Ile Gly Ala Ile20 25 30Lys Lys Gly Gly Lys Ile Ile Lys Lys Gly Leu Gly Val Leu Gly Ala35 40 45Ala Gly Thr Ala His Glu Val Tyr Asn His Val Arg Asn Arg Gln50 55 60<210>53<211>38<212>PRT<213>Galleria mellonella<400>53Lys Val Pro Ile Gly Ala Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Gly Leu Gly Val Leu Gly Ala Ala Gly Thr Ala His Glu Val Tyr Asn20 25 30His Val Arg Asn Arg Gln35<210>54<211>462<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>54acttcattgt gtacagttgc aggacttaat acttagtgaa ctacttactc ctcgttacca60
accatgaagc tgaccggtct atttctcatg atcatggcgg tgctcgcgct gtttgttggc 120gctggtcaag ccgaccctaa ggtgcccatt ggcgctatca agaagggcgg caaaattatt 180aaaaagggtc taggtgtgct tggcgccgcg ggcacagcgc acgaagtgta caaccacgtt 240aggaacaggc agtaacgtca tgcgtgattg ttgtacatac agtacttaca atacgatttg 300tcttggctgt gatatatctt tagataaatt aatttataat accacatact tattagtaaa 360atactcaaat atattgatta tagatacatt aataaatatt aattattaca atattttgtt 420tttatgtaca atgcgaatag attctaccct ctgcctcgtg cc 462<210>55<211>192<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>55atgaagctga ccggtctatt tctcatgatc atggcggtgc tcgcgctgtt tgttggcgct60ggtcaagccg accctaaggt gcccattggc gctatcaaga agggcggcaa aattattaaa 120aagggtctag gtgtgcttgg cgccgcgggc acagcgcacg aagtgtacaa ccacgttagg 180aacaggcagt aa 192<210>56<211>117<212>DNA<213>Galleria mellonella<400>56aaggtgccca ttggcgctat caagaagggc ggcaaaatta ttaaaaaggg tctaggtgtg60cttggcgccg cgggcacagc gcacgaagtg tacaaccacg ttaggaacag gcagtaa 117<210>57<211>67<212>PRT<213>Spodoptera exigua<400>57Met Lys Leu Thr Lys Val Phe Val Ile Val Ile Val Val Val Ala Leu1 5 10 15Leu Val Pro Ser Glu Ala Ala Pro Gly Lys Ile Pro Val Lys Ala Ile20 25 30Lys Lys Ala Gly Thr Ala Ile Gly Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile35 40 45
Ala Ser Thr Ala His Asp Val Tyr Ser Phe Phe Lys Pro Lys His Lys50 55 60Lys Lys His65<210>58<211>54<212>PRT<213>Hyblaea puera<400>58Ala Met Ser Leu Val Ser Cys Ser Thr Ala Ala Pro Ala Lys Ile Pro1 5 10 15Ile Lys Ala Ile Lys Thr Val Gly Lys Ala Val Gly Lys Gly Leu Arg20 25 30Ala Ile Asn Ile Ala Ser Thr Ala Asn Asp Val Phe Asn Phe Leu Lys35 40 45Pro Lys Lys Arg Lys His50<210>59<211>41<212>PRT<213>Caligo illioneus<400>59Gly Lys Ile Pro Ile Asn Ala Ile Arg Lys Gly Ala Lys Ala Val Gly1 5 10 15His Gly Leu Arg Ala Leu Asn Ile Ala Ser Thr Ala His Asp Ile Ala20 25 30Ser Ala Phe His Arg Lys Arg Lys His35 40<210>60<211>37<212>PRT<213>Caligo illioneus<400>60Arg Lys Ile Pro Val Glu Ala Ile Lys Lys Gly Ala Ser Arg Ala Trp1 5 10 15
Arg Ala Leu Asp Leu Ala Ser Thr Ala Tyr Asp Ile Ala Ser Ile Phe20 25 30Asn Arg Lys Arg Glu35<210>61<211>40<212>PRT<213>Caligo illioneus<400>61Gly Lys Ile Pro Val Glu Ala Leu Lys Lys Gly Ala Lys Val Ala Gly1 5 10 15Arg Ala Trp Arg Ala Leu Asp Leu Ala Ser Thr Ala Tyr Asp Ile Ala20 25 30His Leu Phe Asp Arg Lys Arg Asn35 40<210>62<211>43<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Consensus sequence for Galleria peptides<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa＝GLY，PRO，ALA or ABSENT，or more preferably GLY or ABSENT<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa＝ILE，VAL，ALA，LEU，MET or PHE，or more preferably ILE orVAL<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa＝PRO，GLY，ASN，GLN or HIS，or more preferably PRO or ASN<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa＝ILE，VAL，ALA，LEU，MET or PHE，or more preferably ILE orVAL<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa＝LYS，ARG，GLY，PRO，ALA，ASN，GLN or HIS，or morepreferably LYS，GLY or ASN
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa＝GLN，ASN，HIS，LYS or ARG，or more preferably GLN or LYS<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>Xaa＝ILE，VAL，ALA，LEU or GLY，or more preferably ILE or ALA<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>Xaa＝GLY，PRO，ALA，LYS or ARG，or more preferably GLY or LYS<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>Xaa＝VAL，LEU，ILE，GLY，PRO or ALA，or more preferably ALA orGLY<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>Xaa＝ILE，VAL，MET，ALA，PHE or LEU，or more preferably LEU orPHE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>Xaa＝ARG，LYS，GLY，PRO or ALA，or more preferably ARG，GLY orLYS<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>Xaa＝GLY，PRO，ALA，VAL，ILE，LEU，MET or PHE，or morepreferably GLY or VAL<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(22)..(22)<223>Xaa＝ILE，LEU，VAL，ALA，MET or PHE，or more preferably VAL，ILE orLEU<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(23)..(23)<223>Xaa＝ASN，GLN，HIS，GLY，PRO，ALA，SER or THR，or morepreferably ASN，GLY or SER<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>Xaa＝ILE，VAL，ALA，LEU or GLY，or more preferably ILE or ALA<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(26)..(26)<223>Xaa＝SER，THR，GLY，PRO or ALA，or more preferably SER or GLY
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>Xaa＝ASP or GLU<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>Xaa＝ILE，LEU，VAL，ALA，MET or PHE，or more preferably ILE orVAL<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa＝ILE，LEU，VAL，ALA，TYR，TRP or PHE，or more preferably ILEor TYR<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>Xaa＝SER，THR，ASN，GLN，HIS，GLU or ASP，or more preferablySER，ASN or GLU<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>Xaa＝GLN，ASN or HIS，or more preferably GLN or HIS<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa＝PHE，LEU，VAL，ALA，ILE or MET，or more preferably PHE，VALor ILE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>Xaa＝LYS or ARG<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>Xaa＝PRO，GLY，ASN，GLN or HIS，or more preferably PRO or ASN<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>Xaa＝LYS or ARG<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>Xaa＝LYS，ARG，HIS，ASN or GLN，or more preferably LYS，HIS，GLNor ARG<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa＝LYS，ARG，HIS，ASN，GLN or ABSENT，or more preferably LYS，HIS or ABSENT
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(41)..(41)<223>Xaa＝LYS，ARG or ABSENT，or more preferably LYS or ABSENT<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(42)..(42)<223>Xaa＝ASN，GLN，HIS or ABSENT，or more preferably ASN or ABSENT<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(43)..(43)<223>Xaa＝HIS，ASN，GLN or ABSENT，or more preferably HIS or ABSENT<400>62Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Lys Lys Gly Gly Xaa Xaa Ile Xaa1 5 10 15Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Thr Ala His Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40
权利要求
1.一种基本上纯化的肽，其包括选自以下一组的序列i)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；ii)与SEQ ID NO4具有至少60％相同性的氨基酸序列；iii)SEQ ID NO5所示的氨基酸序列；iv)与SEQ ID NO5具有至少80％相同性的氨基酸序列；v)SEQ ID NO48所示的氨基酸序列；vi)与SEQ ID NO48具有至少70％相同性的氨基酸序列；vii)SEQ ID NO53所示的氨基酸序列；viii)与SEQ ID NO53具有至少70％相同性的氨基酸序列；ix)i)到viii)中任一项的生物学活性片段；和x)包括i)到ix)中任一项的氨基酸序列的前体，其中所述肽或其片段表现出抗真菌的和/或抗细菌的活性。
2.权利要求1的肽，其可纯化自昆虫。
3.权利要求1或2的肽，其可纯化自螟蛾科的鳞翅昆虫。
4.权利要求1到3中任一项的肽，其中所述肽表现出针对真菌的抗真菌活性，所述真菌选自禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、狂犬壳二孢(Ascochyta rabiei)、白色假丝酵母(Candida albicans)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、克鲁斯氏假丝酵母(C.krusei)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和十字花科小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)。
5.权利要求1到4中任一项的肽，其与至少一种其它的多肽/肽序列融合。
6.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括选自以下一组的序列i)SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO11所示的核苷酸序列；iii)SEQ ID NO12所示的核苷酸序列；iv)SEQ ID NO13所示的核苷酸序列；v)SEQ ID NO50所示的核苷酸序列；vi)SEQ ID NO51所示的核苷酸序列；vii)SEQ ID NO55所示的核苷酸序列；viii)SEQ ID NO56所示的核苷酸序列；ix)编码权利要求1到5中任一项的肽的序列；x)与SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、或SEQ ID NO12具有至少66％相同性的核苷酸序列；xi)与SEQ ID NO11或SEQ ID NO13具有至少71％相同性的核苷酸序列；xii)与SEQ ID NO50或SEQ ID NO51具有至少62％相同性的核苷酸序列；xiii)与SEQ ID NO55或SEQ ID NO56具有至少62％相同性的核苷酸序列；和xiv)在严格条件下与i)到viii)中任一项杂交的序列。
7.权利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌和/或抗细菌活性的肽。
8.一种载体，其包括权利要求6或权利要求7的多核苷酸。
9.一种宿主细胞，其包括权利要求6或权利要求7的多核苷酸、或权利要求8的载体。
10.权利要求9的宿主细胞，其是植物细胞。
11.制备权利要求1到5中任一项的肽的方法，所述方法包括在使得编码所述肽的多核苷酸表达的条件下培育权利要求9或10的宿主细胞，以及回收所表达的肽。
12.一种组合物，其包括权利要求1到5中任一项的肽以及一种或多种可接受的载体。
13.一种组合物，其包括权利要求6或7的多核苷酸以及一种或多种可接受的载体。
14.一种用于杀死真菌和/或细菌、或抑制真菌和/或细菌生长和/或繁殖的方法，所述方法包括将所述真菌和/或细胞暴露于权利要求1到5中任一项的肽。
15.一种转基因植物，所述植物已经用权利要求6或7的多核苷酸转化，其中所述植物产生权利要求1到5中任一项的肽。
16.一种控制农作物的真菌和/或细菌感染的方法，所述方法包括培育权利要求15的转基因植物的农作物。
17.一种转基因的非人动物，所述动物已经用权利要求6或7的多核苷酸转化，其中所述动物产生权利要求1到5中任一项的肽。
18.一种治疗或预防患者体内的真菌和/或细菌感染的方法，所述方法包括给患者施用权利要求1到5中任一项的肽。
19.权利要求1到5中任一项的肽在生产用于治疗或预防患者体内的真菌和/或细菌感染的药物中的用途。
20.一种抗体，其特异性结合权利要求1到5中任一项的肽。
21.一种用于杀死真菌、或抑制真菌的生长和/或繁殖的方法，所述方法包括将真菌暴露于一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO14的残基25到67的氨基酸序列；ii)SEQ ID NO17所示的氨基酸序列；iii)包括SEQ ID NO15的残基26到67的氨基酸序列；iv)与i)到iii)中任一项具有至少75％相同性的氨基酸序列；v)包括SEQ ID NO18的残基26到66的氨基酸序列；vi)与v)具有至少50％相同性的氨基酸序列；和vii)i)到vi)中任一项的生物学活性片段。
22.权利要求21的方法，其中所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO18的残基26到66的氨基酸序列；ii)与i)具有至少50％相同性的氨基酸序列；和iii)i)或ii)的生物学活性片段。
23.一种控制农作物的真菌感染的方法，所述方法包括培育转基因植物的农作物，所述转基因植物产生一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO14的残基25到67的氨基酸序列；ii)包括SEQ ID NO16的残基25到66的氨基酸序列；iii)SEQ ID NO17所示的氨基酸序列；iv)包括SEQ ID NO15的残基26到67的氨基酸序列；v)与i)到iv)中任一项具有至少75％相同性的氨基酸序列；vi)包括SEQ ID NO18的残基26到66的氨基酸序列；vii)与vi)具有至少50％相同性的氨基酸序列；和viii)i)到vii)中任一项的生物学活性片段。
24.权利要求23的方法，其中所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO18的残基26到66的氨基酸序列；ii)与i)具有至少50％相同性的氨基酸序列；和iii)i)或ii)的生物学活性片段。
25.一种治疗或预防患者体内的真菌感染的方法，所述方法包括给患者施用一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO14的残基25到67的氨基酸序列；ii)SEQ ID NO17所示的氨基酸序列；iii)包括SEQ ID NO15的残基26到67的氨基酸序列；iv)与i)到iii)中任一项具有至少75％相同性的氨基酸序列；v)包括SEQ ID NO18的残基26到66的氨基酸序列；vi)与v)具有至少50％相同性的氨基酸序列；和vii)i)到vi)中任一项的生物学活性片段。
26.一种肽在生产用于治疗或预防患者体内的真菌感染的药物中的用途，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQ ID NO14的残基25到67的氨基酸序列；ii)SEQ ID NO17所示的氨基酸序列；iii)包括SEQ ID NO15的残基26到67的氨基酸序列；iv)与i)到iii)中任一项具有至少75％相同性的氨基酸序列；v)包括SEQ ID NO18的残基26到66的氨基酸序列；vi)与v)具有至少50％相同性的氨基酸序列；和vii)i)到vi)中任一项的生物学活性片段。
27.一种试剂盒，其包括权利要求1到5中任一项的肽。
全文摘要
本发明提供了抗真菌的和抗细菌的肽，特别是从昆虫(特别是鳞翅昆虫)中获得的抗真菌肽。本发明也提供了使用这些抗真菌肽治疗或预防真菌生长的方法，所述方法可以被用于各种目的，例如预防植物的真菌感染，治疗动物(特别是人)的真菌感染，和预防食物腐败变质。具体地，本发明提供了生产抗真菌肽的转基因植物，所述植物具有增加的抗真菌感染/生长的抗性。
文档编号C07K16/18GK1950396SQ200580012917
公开日2007年4月18日 申请日期2005年2月23日 优先权日2004年2月24日
发明者彼得·戴维·伊斯特, 苏珊·伊丽莎白·布朗 申请人:联邦科学技术研究组织, 粮食研究发展公司