专利名称：针对pla的制作方法
技术领域：
本发明涉及反义寡核苷酸在治疗医疗状况(medical condition)中的应用的领域。更具体而言，本发明描述了用于抑制磷脂酶A2(PLA2)以及治疗与该分子激活关联的状况的新型反义寡核苷酸。
背景技术：
整个本申请提及的所有出版物都通过引用被全部并入此处，包括其中引用的所有参考文献。
炎症是人体对损伤、感染或对被免疫系统认为是外来物质的分子的反应。缺少、过度或者不受控制的炎症导致大量的一系列疾病，诸如哮喘、关节炎以及自身免疫性疾病、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、心血管炎症以及胃肠炎症。大量的研究证实，预致敏中性粒细胞(primedneutrophils)、单核细胞以及巨噬细胞参与了这类炎性疾病。最近，也有文献记载了由小胶质细胞(microglia cells)释放的过氧化物在神经退化性疾病的发病机理中的作用，所述神经退化性疾病的实例包括阿兹海默氏症(Alzheimer’s disease)(AD)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)(PD)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)以及缺血性和创伤性脑损伤。
由吞噬细胞NADPH氧化酶产生的过氧化物和由磷脂酶A2产生的促炎脂质介质(proinflammatory lipid mediators)对宿主防御而言属于最重要的功能之内。然而，在改变的生理状态下，过氧化物和脂介质会促进炎症反应并参与导致组织损伤的过程以及各种炎性疾病的病理生理学过程。现今，非甾体抗炎药物(NSAIDs)是用于治疗炎性状况的最广泛的处方药物中的一种。然而，它们具有不利的副作用，最常见的是胃肠道的溃疡和出血。此外，这些药物仅仅降低前列腺素的产生而不影响在将中性粒细胞聚集至炎症位点的过程中起关键作用的白三烯(leukotrienes)的产生。因而，人们仍在继续寻求新的副作用更小的抗炎药物的研究。人们对阻断炎症级联反应的因子进行了大量的试验，诸如皮质类固醇、抗内毒素抗体、TNF拮抗剂、IL-1受体拮抗剂和其它因子，都没有获得显著的成功。
本发明人开发了一种细胞系，该细胞系是缺乏胞液型磷脂酶A2(PLA2)表达的PLB-985细胞系的稳定的克隆，并证实了cPLA2除了已知的在促炎脂质介质的产生中的作用外，还是吞噬细胞NADPH氧化酶复合体组装后的激活过程中的关键物质。这两个酶之间的关联提供了cPLA2释放的花生四烯酸(AA)激活组装的NADPH氧化酶的分子基础[Dana，R.等(1998)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)273441-5；Lowenthal，A.和Levy，R.(1999)生物化学杂志27421603-10；Levy，R等(2000)血液(Blood)95660-5；Pessach，I.等(2001)生物化学杂志27633495-503；Shmelzer，Z等(2003)细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)162683-692；Tarsi-Tsuk，D.和Levy，R(1990)免疫学杂志(J.Immunol.)；1442665-2670；Dana，R等生物化学杂志(Biochem.J)297217-223；Hazan-Halevy，I.等(2000)生物化学杂志27512416-12423]。由于氧化酶激活需要cPLA2，对其抑制应该不仅能消除炎症介质的形成，而且应该还能调节参与炎性疾病发病机理的氧自由基的不受控制的加速释放。此外，发明人的研究显示在体内(in vivo)的炎症或者在体外(in vitro)的炎症状况中，cPLA2和NADPH氧化酶两者的水平和活性在中性粒细胞和单核细胞中都会升高[Levy，R等(1994)生物化学与生物物理学(Biochim.Biophys.Acta)1220261-265；Shaked，G.等(1994)创伤杂志(J.Trauma)3722-29；Levy，R等(2000)血液95660-665；Levy，R和Malech，H.(1991)免疫学杂志1473066-3071；Levy，R等(1994)生物化学与生物物理学1220253-260；Reizenberg，K.等(1997)欧洲临床调查杂志(Eur.J.Clin.Invest.)27398-404]。令人惊讶的是，一份最近的报告报道，向中心粒细胞添加cPLA2抑制剂吡咯烷不会抑制NADPH氧化酶的活性[Rubin，B.B.等(2005)生物化学杂志2807519-29]，然而这个结果可能归因于所应用的方法学，该方法不能够使药物在中性粒细胞中得到足够的积累(数据未示出)。尽管有关于通过抑制cPLA2而治疗炎症状况的方法的报道，但这些方法涉及了使用诸如导致呼吸道炎症的剂量依赖性衰减[美国专利申请号20020165119，USSN 062730]的三氟甲基酮(trifuoromethylketone)(TFMK)，或抑制各种形式的PLA2[US6,797,708]的吲哚化合物之类的物质，但用于治疗炎症的特异针对cPLA2的抑制剂至今未有报道。目前，还未有有效的胞液型PLA2抑制剂可供人和动物的临床应用。迄今针对cPLA2的所有抑制剂都被设计成与底物的竞争。由于所有类型的PLA2都在磷脂的顺-2位切开脂肪酸，因此它们均被相同的抑制剂所抑制(尽管有时效率更低)。尽管有报道显示数个化合物作为cPLA2的特异抑制剂，但发现它们也能抑制其它PLA2酶，反之亦然。因为缺少对于每一PLA2亚型的特异抑制剂，反义技术提供了一种抑制特定类型的PLA2的有效途径。诚然，此处表明的结果提示，直接靶向cPLA2的药物将特异性地抑制cPLA2的活性。此外，它也导致对产生促炎脂质介质和过氧化物的cPLA2和NADPH氧化酶两者的调节。
过去已经有报道靶向cPLA2mRNA序列的反义寡核苷酸能抑制cPLA2的转录表达[US6,008,344]。然而，这些寡核苷酸没有证实不抑制cPLA2的蛋白表达的抑制，并且其在脂质体lipofectin的存在下被导入细胞。
此外，已有文献描述了靶向cPLA2的其它三个反义寡核苷酸P1(表1，序列8(SEQ.ID.No.8))[Roshak，A.(1994)生物化学杂志269(42)25999-26005；Muthalif，M.M.等(1996)生物化学杂志271(47)30149-30157；Marshall，L(1997)生物化学杂志272(2)759-765；Anderson，K.M.等(1997)生物化学杂志272(48)30504-30511]；P2(表1，序列9)[Li，Q.和Cathcart，M.K.(1997)生物化学杂志272(4)2404-2411；Zhao，X.等(2002)生物化学杂志277(28)25385-25392]；以及P3(5’-GTGCTGGTAAGGATCTAT-3’；序列12)[Locati，M.(1996)生物化学杂志271(11)6010-6016]，主要评估了抑制cPLA2在平滑肌细胞和人单核细胞功能中的影响。P1与lipofectin一起使用。P1和P2，其所有碱基都用硫代磷酸(phosphorothioate)修饰，仅在5μM使用时才会有显著作用，而本发明人发现这个浓度对细胞有毒性。P3在10μM下使用(或甚至更高的浓度下，比本发明人使用的浓度高10倍)因此，本发明的一个目的在于提供针对cPLA2mRNA的新型反义寡核苷酸，以及它们在抑制cPLA2表达和过氧化物产生中的应用，以抑制促炎过程。因而，本发明所权利要求的反义寡核苷酸也寻求作为抗炎剂。
随着说明书的进程，本发明其它的应用和目的将得到阐明。
发明内容
在第一方面，本发明提供了针对胞液型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA序列的开放阅读框(ORF)的反义寡核苷酸，以及其功能类似物(functionalanalogs)、衍生物或片断，其中所述反义寡核苷酸的互补性(complementarity)在所述ORF的核苷145至400之间的区域内，且其中所述反义寡核苷酸能抑制cPLA2蛋白的表达。
在一个实施方案中，本发明的反义寡核苷酸的长度从15至达30个核苷酸，优选地长度为17至21个核苷酸。
所述针对cPLA2mRNA序列的开放阅读框的5’区域的反义寡核苷酸的序列具有如序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6中的任一序列表示的序列，详情见表1。
本发明的反义寡核苷酸的序列可以被化学修饰，以便于获得更好的核酸内切酶抗性。
从而，在本发明反义寡核苷酸的另一实施方案中，硫代磷酸化修饰可以存在于所述寡核苷酸的最前三个和/或最后三个核苷上。此外，可在所述寡核苷酸的第十个核苷上发现另一硫代磷酸化修饰，正如在如序列4和序列5表示的寡核苷酸中。
在本发明反义寡核苷酸序列的另一实施方案中，进一步的修饰，诸如2-O-甲基化，可在所述寡核苷酸的最前三个和/或最后三个核苷上发现。
作为本研究所带来的特性的结果，反义寡核苷酸可用于与cPLA2表达相关的炎症过程的抑制剂。
从而，本发明反义寡核苷酸用作治疗和/或预防风湿性关节炎、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤(trauma)、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病，以及神经退化性疾病，诸如阿兹海默氏症(AD)、帕金森氏症(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)以及缺血性和创伤性脑损伤中的任一种，即在发病机理中氧化胁迫(oxidative stress)具有显著作用，以及由于活性小胶质细胞而具有类花生酸(eicosanoid)和过氧化物的加速释放的所有疾病。
从而，本发明的反义寡核苷酸可以用于抑制过氧化物的产生和释放。尤其是，所述抑制在中性粒细胞、单核细胞和吞噬细胞，优选在中性粒细胞中实现。
可选地，本发明反义寡核苷酸可用荧光、放射性物质、金属颗粒，以及任何适用的标记方法之一标记。
在第二方面，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包括至少一种如本发明定义的反义寡核苷酸，或其功能类似物、衍生物或片断作为活性成分。
从而，本发明反义寡核苷酸大致以药物组合物的形式提供。所述组合物用于通过注射、局部给药，或者口服使用。
或者，本发明的药物组合物可包括至少两种如本发明定义的反义寡核苷酸，或其功能类似物、衍生物或片断的组合作为活性成分。优选地，所述组合包括下述寡核苷酸序列1与序列3，或序列1与序列2，或者序列1与序列6，或者序列1与序列2和序列3，或者序列4与序列6，或者序列2与序列6，或者序列2与序列3，或者序列3与序列6。
本发明的药物组合物意在医疗应用。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物意在治疗表达和/或噬细胞NADPH氧化酶的自由基释放的炎症过程。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物意在治疗炎症状况，其中所述炎症状况可以是风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病，CNS相关的疾病诸如神经退化性疾病AD、PD、ALS，以及缺血性和创伤性脑损伤中的任一种，即在在发病机理中氧化胁迫具有显著作用，以及由于活性小胶质细胞而具有类花生酸和过氧化物的加速释放的所有疾病。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物意在治疗与Aβ斑积聚相关的状况。所述状况是通常的CNS相关的疾病，尤其是神经退化性疾病阿兹海默氏症、帕金森氏症、ALS，或脑缺血性和创伤性头部损伤。
本发明的药物组合物可选地可进一步包括缓冲液、添加剂、稳定剂、稀释剂和/或赋形剂。
另一方面，本发明提供了如本发明定义的反义寡核苷酸在制备用于治疗和/或预防炎症状况的药物组合物中的应用，其中所述炎症状况可以是风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病，神经退化性疾病诸如AD、PD和ALS，以及缺血性和创伤性脑损伤中的任一种，即在发病机理中氧化胁迫具有显著作用，以及由于活性小胶质细胞而具有类花生酸和过氧化物的加速释放的所有疾病。
在另一方面，本发明提供了如本发明定义的反义寡核苷酸在与cPLA2激活相关的状况治疗中的应用。
在另一方面，本发明提供了如本发明定义的反义寡核苷酸在与Aβ斑积聚相关的状况治疗和/或预防中的应用。通常所述状况是选自由阿兹海默氏症、帕金森氏症、ALS，脑缺血损伤和创伤性头部损伤组成的CNS相关疾病，在另一方面，本发明提供了一种与cPLA2激活相关的状况的治疗方法；包括对所需受试者施以至少一种如本发明定义的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。
因此，在另一方面，本发明提供了一种炎症状况的治疗方法，其中所述炎症状况是风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病，神经退化性疾病诸如AD、PD和ALS，以及缺血性和创伤性脑损伤中的任一种，即在发病机理中氧化胁迫具有显著作用，以及由于活性小胶质细胞而具有类花生酸和过氧化物的加速释放的所有疾病中的任一种，包括对需要的受试者给药治疗学有效量的至少一种如本发明定义的反义寡核苷酸，或包括它的组合物。
在另一方面，本发明提供了一种与Aβ斑积聚相关的状况的治疗方法，包括对所需受试者施以至少一种如本发明定义的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。所述状况是通常的神经退化性疾病，尤其是阿兹海默氏症和帕金森氏症。
最后，本发明提供了一种在体内、离体转移(ex vivo)或体外抑制cPLA2表达和/或活性的方法，包括用本发明描述的反义寡核苷酸或含有它的组合物接触细胞，优选吞噬细胞，即中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和/或小胶质细胞，一段适宜量的时间。这些反义寡核苷酸在成纤维细胞、神经元细胞(neuronal cell)和内皮细胞中抑制cPLA2活性，但与吞噬细胞相比活性更低，很可能由于前者细胞对于反义寡核苷酸的渗透性更低(数据未示出)。
图1cPLA2的cDNA序列(序列7)，其反义寡核苷酸的C2，C3，C4，C8，C9和C10的位置突出表示。
C2包括核苷347-366；C3包括核苷155-174；C4包括核苷379-399；C8包括核苷330-346；C9包括核苷183-202；以及C10包括核苷290-306。
图2两种抗-cPLA2抗体(Ab)之间的比较图2ALevy’s Ab[Hazan等(1997)id ibid(同一著者，同一出处)]图2B商业抗体。
Dil＝稀释。
图3A-图3BcPLA2反义PPS寡核苷酸对人外周血单核细胞中的cPLA2表达和过氧化物产量的影响。
图3AWestern印迹分析显示，与对照以及反义P1[Roshak，A等(1994)id ibid；Marshall，L等(1997)id ibid；Muthalif，M.M.等(1996)id ibid；Anderson，K.M.等(1997)id ibid]和P2[Li，Q和Cathcart，M.K.(1997)id ibid]相比，在用反义PPS寡核苷酸C2，C3，C4，C9，以及C2+C4(2+4)的组合处理后，经抗-cPLA2抗体检测，cPLA2表达得到抑制。不同处理中的cPLA2水平通过光密度分析法定量，并表示在Western印迹分析下方。Lev.＝水平；dens＝光密度分析。
图3B直方图显示了与对照以及反义P1[Muthalif，M.M.等(1996)id ibid；Anderson，K.M.等(1997)id ibid]和P2[Li，Q和Cathcart，M.K.(1997)id ibid]相比，cPLA2反义PPS寡核苷酸C2，C3，C4，C9，以及C2+C4(2+4)对过氧化物产量(SO prod.)的抑制。
特别要注意，本发明反义PPS寡核苷酸(记为2，3，4和9)与前述的反义寡核苷酸P1和P2相比，具有更高的效率。
图4A-图4BcPLA2反义PPS寡核苷酸对外周血人单核细胞中的cPLA2表达和过氧化物产量的影响。
图4AWestern印迹分析显示，与对照以及寡核苷酸IS1和IS2[US6,008,344]相比，在用反义的部分硫代磷酸化(PPS)的寡核苷酸C2，C8，C9，C10以及C3+C10的组合和C8+C10的组合处理后，经抗-cPLA2抗体检测，cPLA2表达得到抑制。不同处理中的cPLA2水平通过光密度分析法定量，并表示在Western印迹分析下方。Lev.＝水平；dens.＝光密度分析。
图4B直方图显示了与对照(cont.)以及寡核苷酸IS1和IS2[US6,008,344]相比，cPLA2反义PPS寡核苷酸C2，C8，C9，C10以及C3+C10的组合和C8+C10的组合对过氧化物产量(SO prod.)的抑制。
特别要注意，本发明反义PPS寡核苷酸(记为2，3，4和9)与在US6,008,344中描述的反义寡核苷酸[IS1和IS2]相比，具有更高的效率。
图5A-图5CcPLA2反义PPS寡核苷酸对腹膜鼠巨噬细胞中的cPLA2表达和过氧化物产量的影响。
图5AWestern印迹分析显示，在用反义PPS寡核苷酸C3和C4以及C3+C4的组合处理后，经抗-cPLA2抗体检测，cPLA2表达得到抑制。
图5B直方图显示了cPLA2反义PPS寡核苷酸C3和C4以及C3+C4的组合对过氧化物产量的抑制。
图5C直方图显示了cPLA2反义PPS寡核苷酸C2，C3，C4，C10和C2+C10组合，C3+C10组合，C4+C10组合，以及C3+C4组合对过氧化物产量的抑制。
缩写cont.，对照；SO gen.，过氧化物产量。
图6用cPLA2反义PPS寡核苷酸处理后，cPLA2表达(exp.)抑制和过氧化物产量(SO prod.)抑制之间的关联性。Cont.＝对照。
图7A-图7CcPLA2反义PPS寡核苷酸对外周血人中性粒细胞中的cPLA2表达和过氧化物产量的影响。
图7AWestern印迹分析显示，在用反义PPS寡核苷酸C2或C4以及C2+C4的组合处理后，经抗-cPLA2抗体检测，cPLA2表达得到抑制。
图7B直方图显示了PMA处理后，cPLA2反义PPS寡核苷酸C2，C4或C10以及C2+C4的组合，C2+C10组合，C4+C10组合，C2+C4+C10组合，对过氧化物产量的抑制。
图7C直方图显示了OZ处理后，cPLA2反义PPS寡核苷酸C2，C4或C10以及C2+C4的组合，C2+C10组合，C4+C10组合，C2+C4+C10组合，对过氧化物产量的抑制。
缩写Lev.，水平；dens.，光密度分析；cont.，对照；SO gen.，过氧化物产量。
图8A-图8F中性粒细胞和巨噬细胞经cPLA2反义PPS寡核苷酸处理后由生理激动剂刺激的过氧化物产量的抑制。
图8A直方图显示了用cPLA2反义PPS寡核苷酸C3或C4孵育6小时后，经PMA刺激的中性粒细胞中过氧化物产量的抑制。
图8B直方图显示了用cPLA2反义PPS寡核苷酸C3或C4孵育4小时后，经fMLP刺激的中性粒细胞中过氧化物产量的抑制。
图8C直方图显示了用cPLA2反义PPS寡核苷酸C3或C4孵育4小时后，经OZ刺激的中性粒细胞中过氧化物产量的抑制。
图8D直方图显示了用cPLA2反义PPS寡核苷酸C3或C4孵育16小时后，经PMA刺激的单核细胞中过氧化物产量的抑制。
图8E直方图显示了用cPLA2反义PPS寡核苷酸C3或C4孵育16小时后，经fMLP刺激的单核细胞中过氧化物产量的抑制。
图8F直方图显示了用cPLA2反义PPS寡核苷酸C3或C4孵育16小时后，经OZ刺激的单核细胞中过氧化物产量的抑制。
缩写SO gen.，过氧化物产量；Act.，活性。
图9A-图9DcPLA2反义PPS寡核苷酸对刺激大鼠(rat)小胶质细胞过氧化物产量的抑制。
图9AWestern印迹分析显示，在用反义PPS寡核苷酸C2或C4处理后，经抗-cPLA2抗体检测，cPLA2表达得到抑制。
图9B曲线图表明了经PMA激活的大鼠小胶质细胞中用cPLA2反义寡核苷酸C2，C4，C8或C10，以及C2+C10组合或C4+C10组合处理后，过氧化物产量被抑制的动力学。
图9C直方图显示了大鼠小胶质细胞经PMA刺激后，cPLA2反义PPS寡核苷酸(C2，C4，C8和C10，以及C2+C10组合和C4+C10组合)对过氧化物产量的影响。
图9D直方图显示了大鼠小胶质细胞经β淀粉样蛋白刺激后，cPLA2反义PPS寡核苷酸(C2，C4，C8和C10，以及C2+C10组合和C4+C10组合)对过氧化物产量的影响。
缩写rest.，静止的(resting)；act.，刺激的；as.，反义；kin.，动力学；T.，时间；min.，分钟。
图10A-图10C胶原诱导的关节炎(CIA)的动物模型图10A实验性的恶化CIA与对照(cont.)小鼠的比较图。
图10BCIA小鼠与对照(cont.)相对比的整爪上的关节的组织病理学代表性切片的组织学评估(X100)。
图10CCIA小鼠中炎性细胞的渗透(X400)。
图11A-图11B采用3种cPLA2反义PPS寡核苷酸的组合(“混合物(Cocktail)”)治疗致使关节炎的消退。
图11ACIA小鼠肿胀的肢体(上方，art.＝关节炎)和用cocktail治疗后的CIA小鼠肢体(下方，as＝反义治疗)的照片。两张照片都在相同的放大倍数下拍摄，且与动物距离相同。
图11B用cocktail静脉注射(i.v.)治疗后，疾病严重性得分(dis.sev.sc.)、血清(ser.)IL-6和血清TNFα的降低(平均±SEM，来自每一组中的5只小鼠)。
图12A-图12B在无菌性腹膜炎诱导后腹膜细胞种群的数目和组成。
图12A在无菌性腹膜炎小鼠中腹膜细胞计数的变化(平均±SEM，来自每一组中的6只小鼠)。
图12B在无菌性腹膜炎小鼠中腹膜细胞种群组成的变化。
缩写ce.no.，细胞数；T.，时间；h，小时；neu，中性粒细胞；mac，巨噬细胞；lymp，淋巴细胞。
图13A-图13B在无菌性腹膜炎诱导后LTB4(白三烯B4)的水平。
图13A血清(ser.)中LTB4的水平。
图13B腹膜腔(per.cav.)中LTB4的水平。
平均±SEM来自每一组中的5只小鼠，T.，时间；h，小时。
图14A-图14C诱导24小时后，反义PPS寡核苷酸cocktail治疗对于腹膜细胞种群和活性的影响。
图14A细胞种群(ce.pop.)组成的FACS(荧光激活细胞分选法)分析。Neu＝中性粒细胞。
图14B表明细胞计数(ce.co.)的图表。
图14C对照健康小鼠(H)、无菌性腹膜炎小鼠(P)以及无菌性腹膜炎小鼠经cocktail法静脉(i.v.)注射24h后(P+AS)的激活腹膜细胞的过氧化物产量(SO prod.)。
图15A-图15B腹膜炎诱导24小时后，cPLA2反义PPS寡核苷酸cocktail治疗减少了炎症位点的中性粒细胞数目以及过氧化物产量。
图15A表明经过或未经过反义治疗的中性粒细胞(neu)的百分数。
图15B表示经过或未经过反义治疗，从无菌性腹膜炎小鼠中分离的腹膜细胞的经PMA刺激导致的过氧化物产量(SO prod.)。
图16腹膜炎诱导24小时后，cPLA2反义PPS寡核苷酸cocktail治疗减少了炎症位点的静止的腹膜细胞的未被刺激的过氧化物产量。
显示的是经过或未经过反义治疗，从无菌性腹膜炎小鼠中分离的静止的腹膜细胞经1μM二氢若丹明-123(dihydrorhodamine-123)评估，检测其过氧化物产量的的一个实施例。(Co.＝计数)。
图17A-图17BcPLA2反义PPS寡核苷酸cocktail治疗对无菌性腹膜炎小鼠中腹膜细胞组成的影响。
图17A在无菌性腹膜炎期间的腹膜细胞组成。
图17B在反义治疗后的腹膜细胞组成。
缩写ce.no.，细胞数；T.，时间；h，小时；neu，中性粒细胞；mac，巨噬细胞；lymp，淋巴细胞。
缩写Neu，中性粒细胞；mac，巨噬细胞；lymp，淋巴细胞(每一组中5只小鼠的平均值)。
图18A-图18BcPLA2反义PPS寡核苷酸cocktail治疗对在无菌性腹膜炎期间的腹膜细胞的被刺激的过氧化物产量(SO prod.)的影响。
图18A无菌性腹膜炎小鼠中腹膜细胞的被刺激的过氧化物产量。
图18B无菌性腹膜炎且经反义寡核苷酸治疗的小鼠中腹膜细胞的受刺激的过氧化物产量。
平均±SEM来自每一组中的5只小鼠。T.，时间；h，小时。
图19A-图19BcPLA2反义PPS寡核苷酸cocktail治疗降低了腹膜LTB4的水平。
图19A无菌性腹膜炎小鼠腹膜中的LTB4的水平。
图19B经cocktail治疗的无菌性腹膜炎小鼠腹膜中的LTB4的水平。
平均±SEM来自每一组中的5只小鼠。T.，时间；h，小时。
图20A-图20BcPLA2反义PPS寡核苷酸cocktail治疗降低了腹膜中性粒细胞的计数。
图20A无菌性腹膜炎小鼠腹膜中中性粒细胞的数目。
图20B经cocktail治疗的无菌性腹膜炎小鼠腹膜中中性粒细胞的数目。
平均±SEM来自每一组中的5只小鼠。T.，时间；h，小时。
图21A-图21B在注射24小时后腹膜血细胞中的反义寡核苷酸的积聚。
图21A腹膜血细胞，未治疗。
图21B用反义(as)寡核苷酸治疗后的腹膜血细胞。
上方图片光学显微镜；下方图片共聚焦显微镜。
具体实施例方式
在本研究中，发明人设计了六种不同的针对胞液型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA的反义寡核苷酸。如下述实施例所示，每一反义寡核苷酸自身对抑制cPLA2的表达作用非常有力，而不同的寡核苷酸组合完全抑制了不同的吞噬细胞以及来自人、小鼠和大鼠的小胶质细胞的cPLA2表达。此外，反义寡核苷酸对cPLA2表达的抑制和NADPH氧化酶产生过氧化物的抑制之间具有非常显著的关联性，这在以前没有表明过。
从而，本发明提供了针对cPLA2mRNA序列开放阅读框(ORF)的反义寡核苷酸以及其功能类似物、衍生物或片断，其中所述反义寡核苷酸的互补性位于所述ORF的核苷145至400之间的区域内，且其中所述反义寡核苷酸能抑制cPLA2蛋白的表达。
如下述实施例所示，本发明提供的反义寡核苷酸还能通过抑制NADPH氧化酶的活性而抑制过氧化物的产生。
如此处提及，序列7涉及相应于cPLA2mRNA序列的cDNA序列[GenBank号M68874]。
所述在cPLA2mRNA的核苷145至400之间的区域对于靶向尤其有用，因为一旦蛋白合成过程开始，阻止蛋白合成比中断蛋白合成更加高效(对于大部分的cPLA2反义序列，后者为US6,008,344中使用的策略)。因此，反义寡核苷酸设计为靶向翻译点的区域(ORF的起始处)。
不过，有必要提起注意反义靶向仍然是非常经验性的，为了最有效靶向需要大量实验来发现特定序列和的优条件。例如，如此处描述的，本发明人原先设计了十四条靶向cPLA2序列核苷145-400之间的区域，即相应于该ORF的开始的反义寡核苷酸，但仅仅其中的六条能有效地起作用，而并得到更详细地研究。
所述针对cPLA2mRNA序列的开放阅读框5’区域的反义寡核苷酸的序列具有如序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6中的任一序列表示的序列，这些序列在表1中详细列出。
如上文提及的，本发明反义寡核苷酸可以被化学修饰，以获得改进的核酸内切酶抗性。可以采用任何对核酸内切酶提供抗性的化学修饰，诸如，但不限于硫代磷酸化或者2-O-甲基化。
这样，硫代磷酸化修饰可以存在于本发明寡核苷酸的最前三个和/或最后三个核苷上。此外，可在所述寡核苷酸的第十个核苷，一个内嘧啶(inner pyrimidine)，上发现另一硫代磷酸化修饰，正如在如序列4和序列5表示的寡核苷酸中。内嘧啶的硫代磷酸化显示出能增加稳定性并防止被核酸内切酶切断[Pirollo，K.F.等(2003)药理学和治疗学(Pharmacology&Therapeutics)9955-77]。本发明的反义寡核苷酸被部分硫代磷酸化，因而比在所有核苷上都具有硫代磷酸化修饰的反义寡核苷酸毒性更小。
可在所述寡核苷酸的最前三个和/或最后三个核苷上仍然可发现进一步的修饰，诸如2-O-甲基化[EP260,032]。
如实施例5至实施例7所示，本发明的反义寡核苷酸可以用做涉及cPLA2表达和活性的炎症过程的抑制剂。
因而，本发明反义寡核苷酸适用于在治疗和/或预防风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病、神经退化性疾病，诸如AD、PD、ALS，以及缺血性和创伤性脑损伤中的任一种，即在发病机理中氧化胁迫具有显著作用，以及由于活性小胶质细胞而具有类花生酸和过氧化物的加速释放的所有疾病中使用。
尽管有一个关于人单核细胞的研究表明对cPLA2表达的抑制也抑制NADPH氧化酶的活性[Li，Q和Cathcart，M.K.(1997)id ibid.]，另一报道显示，在正常刺激下，来自cPLA2缺陷的小鼠的定植在腹膜的巨噬细胞释放过氧化物[Gijon，M.A.等(2000)生物化学杂志27520146]。相对之下，本发明人证实在小鼠巨噬细胞中，能有效抑制cPLA2表达的反义寡核苷酸，也能有效抑制过氧化物产量，在单核细胞、中性粒细胞和小胶质细胞中也一样。这种不一致可以用这样的事实解释，即通常“敲除”动物模型具有正常的表型是由于，例如同功酶的过量表达和代偿，从而不能精确地反映所研究基因(即蛋白或酶)缺失的影响。最重要的是，本结果是在使用1μM(终浓度)的低水平的寡核苷酸下获得的。重要的是，本反义寡核苷酸在低、无毒性浓度下有效，这使其适于临床目的的应用，即作为用于治疗如此处讨论的，需要抑制cPLA2的状况的治疗剂。
此外，本发明反义寡核苷酸适用于在治疗和/或预防小胶质细胞被活化，例如被LPS，以及例如释放活性氧(ROS)和/或促炎介质的状况中使用。所述状况选自由炎症、感染，以及缺血性疾病组成的组。
本发明反义寡核苷酸也可用于抑制过氧化物产生和释放。通常，所述抑制在中性粒细胞、单核细胞和吞噬细胞，优选在中性粒细胞中实现。
激活的中性粒细胞是最先到达炎症位点的细胞，随后其释放高水平的加速炎症进程的类花生酸和过氧化物。因此，中性粒细胞是各种炎症疾病的发病机理的直接效应物(effector)，而直接抑制其功能是减少炎症过程的有效途径。单核细胞(和巨噬细胞)是到达炎症位点的第二细胞种群，从而对其抑制对阻止炎症也很重要。
另外，本发明反义寡核苷酸可用于抑制由小胶质细胞释放的类花生酸和ROS的产生，所述释放由β淀粉样(Aβ)斑形成或其它因子诸如LPS或细胞因子诱导。有研究已显示ROS形成是神经元细胞功能障碍或死亡的原因，其在各种神经疾病的发病机理中发挥作用。
“类似物和衍生物”意思是所述核酸分子的“片断”、“变型”、“类似物”或“衍生物”。诸如本发明的反义寡核苷酸序列的任一个的分子的“片断”，意思是指该分子的任一核苷子集(subset)。此类分子的“变型”意思是指一种基本类似于整个分子或其片断的天然存在的分子。分子的“类似物”可以是但不限于旁系同源(paralogous)或同系同源(orthologous)，例如分别来自相同种(species)或不同种的同源(homologous)分子，即与不同种中基因的平行区域互补的反义寡核苷酸，因而可以在序列上具有细微差别。
本发明反义寡核苷酸的进一步衍生物标记有或配合(conjugate)有一个报告分子，以使本发明反义寡核苷酸可以在生物体内被示踪和/或被检测。可以适用任何可以被检测的标记或报告分子，诸如生物素、荧光蛋白、若丹明(rhodamine)，4-(4′-二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸(“Dabcyl”)；4-(4′-二甲基氨基叠氮苯)磺酸(磺酰氯)(“Dabsyl”)；5-((2-氨乙基)-氨基)-萘-1-磺酸(“EDANS”)；补骨脂素(Psoralene)衍生物、半抗原、青色素、吖啶、荧光对甲氨基酚衍生物、胆固醇衍生物、放射性标记，以及金属颗粒(例如金)。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的至少一种如本发明定义的反义寡核苷酸，或其功能类似物、衍生物或片断。
从而，本发明反义寡核苷酸大致以药物组合物的形式提供。所述组合物通过注射、局部给药，或者口服使用。
或者，本发明的药物组合物可包括至少两种如本发明定义的反义寡核苷酸，或其功能类似物、衍生物或片断的组合作为活性成分。优选地，所述组合包括下述寡核苷酸序列1与序列3，或序列1与序列2，或者序列1与序列6，或者序列1与序列2和序列3，或者序列4与序列6，或者序列2与序列6，或者序列2与序列3，或者序列3与序列6。
在此处下文描述的实施例中，清楚表明，在同一反应中，当两种或者三种反义寡核苷酸一起组合使用时，对cPLA2表达和过氧化物产生两者的抑制是如何更为有效。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物意在治疗与cPLA2表达和/或通过吞噬细胞NADPH氧化酶释放自由基相关的炎症过程。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物意在治疗炎症状况，其中所述状况可以是风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病，神经退化性疾病诸如AD、PD、ALS，以及缺血性和创伤性脑损伤中的任一种，即在发病机理中氧化胁迫具有显著作用，以及由于活性小胶质细胞而具有类花生酸和过氧化物的加速释放的所有疾病。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物意在治疗与Aβ斑积聚相关的状况。所述状况是通常的神经退化性疾病，优选是阿兹海默氏症、帕金森氏症、ALS，或缺血性和创伤性脑损伤。
本发明药物组合物还意在在治疗和/或预防一些状况中使用，例如暴露在LPS中，其中小胶质细胞被活化并释放ROS和/或促炎介质(类花生酸)。所述状况选自由炎症、感染，以及缺血性疾病组成的组。
本发明的药物组合物通过注射的优选应用是皮下注射、腹膜内注射、静脉注射和肌肉注射。
本发明的药物组合物通常进一步包括稀释剂，和/或缓冲剂，即调节其克分子渗透压浓度的因子，以及可选地，一种或多种载体、稳定剂、赋形剂和/或本领域已知的添加剂，例如，用于在药物组合物中增加风味、颜色、润滑性，或类似性质。
优选的缓冲剂是由10mM Tris，pH7.5-8.0组成的Tris，该溶液也用于调节克分子渗透压浓度。
对于体内应用，反义寡核苷酸悬浮在无菌蒸馏水或无菌盐水中。
载体可包括淀粉及其衍生物，纤维素及其衍生物，例如微晶纤维素、黄原胶，以及类似物。润滑剂可包括氢化篦麻油以及类似物。
药物组合物的制备在本领域是熟知的，且在许多论文和教科书中有描述，例如参见Remington’s制药学，Gennaro A.R.编辑，Mack出版公司，伊斯顿(Easton)，宾夕法尼亚州，1990，尤其在其1521-1712页。
用于局部给药的药物组合物可包括透皮贴剂(transdermal patches)、软膏(ointment)、洗液、乳膏(creams)、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体，水、粉末或油基质，增稠剂以及类似物是必需的或是合适的。
用于口服给药的组合物包括粉末或粒剂、在水或非水介质中的悬浮液或溶液，胶囊、小袋(sachets)或片剂。最好具有增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂(dispensing aids)或粘合剂。
用于非肠道、鞘内(intrathecal)或心室内给药的组合物和配方可包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可含有缓冲液、稀释剂和其它适用的添加剂，诸如但不限于，渗透促进剂(penetration enhancer)、载体化合物以及其它制药学可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于，溶液、乳化液，以及含脂质体(liposome-containing)的配方。这些组合物可产生于各种成分，包括但不限于，预制液体(preformed liquid)、自乳化固体和自乳化半固体。
本发明的药物组合物可方便地以单位剂量形式提供，并可以依据制药工业中熟知的常规技术制备。此类技术包括将活性成分与制药载体或赋形剂联合(association)的步骤。通常，配方的制备是通过均匀、紧密地将活性成分与液体载体或微细固体载体或两者共同联合，随后，如果需要的话，形成产品。这类组合物可以配制成许多可能剂型的任何一种，诸如但不限于，片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可配制成在含水、不含水或混合介质中的悬浮液。含水悬浮液可进一步含有增加悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可含稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可配置成并作为泡沫使用。药物泡沫(pharmaceutical foams)包括但不限于乳化液、微乳化液、乳膏、胶冻(jellies)和脂质体配方。尽管其性质基本类似，这些配方在终产物的成分和稳定性上有所差别。
本发明的药物组合物还可以进一步包括其他活性因子，例如抗生素、止痛剂，以及类似物。
在另一方面，本发明提供了一种如本发明定义的反义寡核苷酸在用于制备治疗和/或预防炎症状况的药物组合物中的应用，其中所述炎症状况可以是风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病，神经退化性疾病诸如AD、PD和ALS，以及缺血性和创伤性脑损伤中的任一种，即在发病机理中氧化胁迫具有显著作用，以及由于活性小胶质细胞而具有类花生酸和过氧化物的加速释放的所有疾病。
此外，本发明提供了一种如本发明定义的反义寡核苷酸在用于治疗与cPLA2激活相关的状况，以及用于治疗和/或预防与Aβ斑积聚相关的状况中的应用。通常所述状况是神经退化性疾病，选自由阿兹海默氏症、帕金森氏症、ALS，以及脑缺血和伤性脑损伤组成的组。
因此，本发明提供了一种治疗与cPLA2激活相关的状况的方法，包括对所需受试者施以至少一种如本发明定义的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。
所述治疗学有效量，或给药剂量，依赖于待治疗的疾病的严重程度和敏感度，治疗的过程持续时间从数天至数月，或直至实现治愈或实现疾病状态的消退。最佳给药进度表可以从病人体内的药物积累的测量来计算。本领域技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复频率。最佳剂量可以根据各个寡核苷酸的相对效能而变化，通常可以基于EC50值估计，其在体外以及动物模型的体内同样有效。通常，剂量从0.01μg至10mg每kg体重，且可以每天、每周、每月或每年给药一次或多次，或者甚至每2至20年一次。本领域技术人员可以基于测量反义寡核苷酸在体液或组织中的停留时间(residence time)和浓度而容易地估计出重复频率。
在进行成功治疗后，最好对病人进行维持疗法(maintainancetherapy)，以防止疾病状态的复发，其中寡核苷酸以维持剂量给药，范围在从0.01μg至10mg每kg体重，每天一次或多次。
如下述的实施例5至实施例7所示，用于治疗炎症状况的最佳剂量是1-2mg/kg/天，每天给药，共5至14天(实施例5)，或在发炎后1-2mg/kg/天的一或两剂(实施例6和7)。
对于局部炎症疾病而言应用反义寡核苷酸抑制cPLA2表达是一种创新疗法，因为它特异性地抑制在炎症位点升高的cPLA2而不影响正常的cPLA2表达。当同时影响在这类疾病的发病机理中涉及的激活的或预致敏的吞噬细胞的活性时，这种治疗潜在性地甚至更加有效，因为这些细胞分泌高水平的加速炎症过程的类花生酸和过氧化物。
从而，本发明还提供了一种治疗炎症状况的方法，其中所述炎症状况可以是风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病，神经退化性疾病诸如AD、PD和ALS，以及缺血性和创伤性脑损伤中的任一种，即在发病机理中氧化胁迫具有显著作用，以及由于活性小胶质细胞而具有类花生酸和过氧化物的加速释放的所有疾病，包括对所需受试者施以至少一种如本发明定义的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效剂量。
此外，由于小胶质细胞中的NADPH氧化酶的过氧化物产生的调节涉及cPLA2提示了cPLA2反义寡核苷酸可以用于神经退化性疾病的治疗，所述神经退化性疾病选自由阿兹海默氏症、帕金森氏症、ALS，以及缺血性和创伤性脑损伤组成的组。
同样地，本发明还提供了一种用于治疗和/或预防例如暴露在LPS中而引起的小胶质细胞活化，以及释放ROS和/或促炎介质的状况，且其中所述状况选自由炎症、感染，以及缺血性疾病组成的组。所述方法包括对所需受试者施以至少一种如本发明定义的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。
最后一方面，本发明提供了一种治疗神经退化性疾病，以及脑损害(例如由中风或损伤引起)的方法，包括对所需受试者施以至少一种如本发明定义的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。所述状况是通常的神经退化性疾病，优选是阿兹海默氏症和帕金森氏症，或缺血性和创伤性脑损伤，其中具有通过活性小胶质细胞的类花生酸和过氧化物的加速释放。
可以用各种给药方法对所需受试者施以本发明的反义寡核苷酸。寡核苷酸可以通过静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)注射，口服(以液体形式或以例如胶囊、药丸、锭剂等的剂量单位形式制备)而施药。为了在治疗学上更有效，寡核苷酸应该以一种在注射后，或更优选地在口服给药后能使其在系统内稳定的形式制备。
或者，本发明的寡核苷酸也可通过使用贴剂、软膏或乳膏的透皮施药而释放。
此外，包括以本发明描述的反义寡核苷酸的药物组合物作为活性剂可以以许多方式给药，取决于需要局部还是全身治疗以及待治疗的区域。给药可以是局部的(topical)(包括眼睛以及包括阴道和直肠黏膜的给药)，肺部的，例如通过吸入或吹入粉末和气溶胶，包括通过喷雾器；气管内，鼻内，表皮以及透皮)，口服的或肠胃外的。肠胃外给药包括静脉内，动脉内，皮下，腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内，例如鞘内，或心室内，给药。具有至少一个2’-O-甲氧乙基修饰的寡核苷酸据信对口服给药尤其有益。
如下述实施例中所述，在用小鼠和大鼠中的三种不同的炎症模型(关节炎、ARDS和腹膜炎)的初步试验证实了特定的cPLA2反义寡核苷酸作为抗炎治疗的有效性。
本发明由其权利要求限定，权利要求的内容应理解为说明书公开中所包括的内容。
如此处所公开和描述的，应该理解到，本发明不限于此处公开的特定的实施例、工艺步骤，以及原料，因为这些工艺步骤和原料可以在某种程度上变化。也应该理解到，此处使用的术语仅用于描述特定实施方案的用途，而不意在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求和其等同物所限定。
必须注意，除非其内容明显地指明，如本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数的指代物。
除非其上下文要求其他情形，通篇本说明书和随后的权利要求中的词“包括(comprise)”，以及其诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”的变型，应该理解成意指包括所述的整体或步骤，或整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤，或整体或步骤的组。
下述的实施例是本发明人在实施本发明各方面时采用的代表性技术。应该理解，尽管这些技术对于实施本发明的优选实施方案是示例性的，本领域技术人员根据本公开，将认识到可以进行不偏离本发明预期范围的大量修改。
实施例实验步骤分子生物学的一般方法分子生物学领域的许多方法在此不再赘述，因为它们对本领域技术人员是熟知的。这类方法包括PCR、cDNA表达、哺乳动物细胞的转染，以及类似的技术。描述这些方法的教科书为，例如Sambrook等(1989)分子克隆实验指南，冷泉港实验室，ISBN0879693096；F.M.Ausubel(1988)分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，ISBN047150338X，John Wiley&Sons公司。此外，一些免疫学技术在此处不是在每一情况下都得到详细描述，例如Western印迹，因为它们对本领域技术人员是熟知的。参见，例如，Harlow和Lane(1988)抗体技术实验指南，冷泉港实验室。
寡核苷酸表1下述实施例中使用的寡核苷酸
注意下划线显示的是硫代磷酸化的核苷。
实施例1抗-cPLA2反义寡核苷酸的合成原始合成了十四条针对cPLA2的部分硫代磷酸化[Stein等(1988)核酸研究163209-3221]的寡核苷酸。在使用前，寡核苷酸用HPLC纯化并通过质谱分析(Sigma，英国)测试纯度。在选择前，通过使用Blast程序筛选唯一性而分析序列，并同时使用Mulfold对没有二级结构和寡核苷酸配对进行检验[Jaeger，J.A.(1989)酶学方法183281-306]。
初步实验(未示出)表明，从这些十四条寡核苷酸中，发现仅有六条寡核苷酸能有效地抑制cPLA2的表达，它们的序列在上表1中详细列出。
仅六条反义寡核苷酸显示出显著活性的事实提示它们具有对靶序列的更高的特异性。剩余的八条寡核苷酸在实验中用作对照。
寡核苷酸在5’和3’两个末端的最后3个碱基上都具有硫代磷酸化修饰(如表1中的下划线所示)，并通过计算机基于采用RNADraw V1.1的方法对cPLA2mRNA的最先的400百碱基对(N端)进行设计(表1)。
部分硫代磷酸化的寡核苷酸(PPS)毒性更小，且比硫代磷酸化的寡核苷酸特异性更好，但却具有类似的稳定性和细胞吸收。一些PPS含有已显示为能增加细胞吸收的GGGG(C10)和GGG(C8和C9)(参见表1)。PPS C8、C9在内嘧啶(t)上也含有已显示为能增加稳定性和保护核苷酸免于核酸内切酶切断的硫代磷酸化(表1，下划线标记)。反义寡核苷酸中的五条不含有已显示为刺激免疫反应的CpG。和已发表的，利用不同的给药系统以增加反义寡核苷酸的吸收的体外研究形成对照，在此处所示的所有实验中，施以裸露的PPS(naked PPS)，因为它们可以以这种形式用于体内治疗[Pirollo，K.F.等2003id ibid.]。因此，反义寡核苷酸的所有临床试验都用裸寡核苷酸进行。例如，与在组织培养中进行的实验[Jansen，B.等(2000)柳叶刀3561728-1733]形成对照，针对癌症病人的Bcl-2的体内临床试验的寡核苷酸释放不需要阳离子脂质(cationic lipid)。在体内分析中通常如此，且到目前为止还不是很清楚为什么不需要载体。一个假设是寡核苷酸与循环蛋白(circulating protein)相互作用，这既保护了它们免于降解，也以未知方式作为载体[Dias，N.和Stein.C.A.(2002)欧洲制药学和生物制药学杂志54263-269]。
如图3-图7所示，PPS反义寡核苷酸对cPLA2表达的抑制和受刺激的过氧化物产生的抑制之间具有明显的关联性。每种PPS寡核苷酸在不同的吞噬细胞类型中产生对cPLA2蛋白表达的显著抑制，且它们的组合产生显著增强的抑制。
如图3和图4所示，本发明PPS反义寡核苷酸远比以前报道的寡核苷酸更加有效[US6,008,344；Roshak等(1994)id ibid.；Muthalif等(1996)id ibid.；Marshall等(1997)id ibid.；Anderson等(1997)id ibid.；Li，Q.和Cathcart，M.K.(1997)id ibid.；Zhao，X等(2002)id ibid.]。此外，在先前的报道中，仅仅测试了这些反义寡核苷酸抑制mRNA合成的能力[US6,008,344]。
还评估了寡核苷酸两端修饰的数量(和种类)的影响(数据未示出)。所观察到的抑制cPLA2表达和NADPH氧化酶的效率排序如下具有3个修饰的PPS＞具有2个修饰的PPS＞具有1个修饰的PPS＞无修饰。
PPS反义寡核苷酸在吞噬细胞中，如所示的单核细胞，对cPLA2蛋白表达的抑制比在内皮细胞或上皮细胞中更加有效(数据未示出)。尤其是涉及直接影响炎症位点的吞噬细胞，而不影响器官的炎症治疗的时候，这种现象具有优势。
实施例2cPLA2反义寡核苷酸在外周血人单核细胞中对cPLA2表达和过氧化物产生的影响cPLA2蛋白的表达通过Western印迹分析，利用本发明人制备的抗cPLA2的抗体，该抗体比市场上商业可利用的抗体更为有效(图2)。
在外周血人单核细胞(图3和图4)和鼠巨噬细胞(图5)中研究了不同的PPS反义寡核苷酸和其组合物对cPLA2表达和过氧化物产生的影响。将裸(无诸如lipofectin等的转染溶液)PPS反义寡核苷酸(终浓度1μM)加入含10％FCS的RPMI中的细胞悬浮液中37℃下16h。分析这些细胞的由5ng/ml PMA刺激的过氧化物产量(通过细胞色素c还原)并分析细胞裂解液中的cPLA2的表达(通过Western印迹分析)。如所示，每一PPS反义寡核苷酸产生50-75％之间的过氧化物产量的抑制，这与它们抑制cPLA2表达的作用相符合。cPLA2的水平通过反射模式的光密度定量分析(Hoefer，Hoefer科学仪器公司，美国旧金山)。这两个参数的相关性表示在图6中。
分别如图3和图4所示，P1[Roshak等(1994)id ibid.；Muthalif等(1996)id ibid.；Marshall等(1997)id ibid.；Anderson等(1997)id ibid.]和P2[Li，Q.和Cathcart，M.K.(1997)id ibid.]，以及IS1和IS2[US6,008,344]对cPLA2表达或过氧化物产生没有任何影响。最重要的是，在US6,008,344中报道的寡核苷酸IS1和IS2分别对mRNA表达产生100％和92％的抑制。然而，它们的影响的分析仅仅通过mRNA表达的抑制而不是cPLA2蛋白表达的抑制。
在其原始公布的文献中，P1、P2、IS1和IS2合成时在所有碱基中都具有硫代磷酸化修饰。本发明人发现，当这些寡核苷酸完全硫代磷酸化时，会对细胞产生毒性，且在16小时孵育后杀死大约60-70％的细胞(数据未示出)。这些结果与一个先前的报道是一致的，该报道显示在所有碱基中都具有硫代磷酸化修饰的寡核苷酸的毒性大得多[Pirollo，K.F.等2003id ibid.]。因而，特别要注意，在本研究中，与其原始的寡核苷酸不同，P1、P2、IS1和IS2在其合成时仅在最前和最后三个碱基中有硫代磷酸化修饰，以为了与本发明人合成的PPS反义寡核苷酸的作用进行更精确地比较。
显示在图2和图3中的结果表明，本发明人合成的(和权利要求的)反义寡核苷酸要优于文献中描述的寡核苷酸。尤其是，要强调前者a.毒性更小b.抑制cPLA2蛋白表达更加有效。
与P1、P2、IS 1和IS2相比，本反义寡核苷酸尤其是优选的，因为它们可以在不用像lipofectin这样的细胞释放系统(cell delivery system)的情况下导入细胞并发挥其活性。
实施例3cPLA2反义寡核苷酸在外周血人中性粒细胞中对cPLA2表达和过氧化物产生的影响研究了不同的PPS反义寡核苷酸和其组合对在外周血人中性粒细胞中的cPLA2表达和过氧化物产生的影响。在，将裸反义寡核苷酸(终浓度1μM)加入2×105个中性粒细胞中37℃下6h。中性粒细胞(纯度95％)通过Ficoll/Hypaque离心、葡聚糖沉淀和红细胞低渗裂解而分离[Levy，R.等(2000)血液95660-665]。如图7所示，甚至在与中性粒细胞6小时孵育后，还是具有对过氧化物产生的少量但显著(P＜0.05)的抑制。在另一实验中，在16h孵育后表现出了类似的结果(数据未示出)。
当细胞用生理激动剂刺激时，各种反义寡核苷酸对过氧化物产生的抑制得到了显著的提高，所述生理拮抗剂的实例有fMLP、调理的酵母多糖(opsonized zymosan)(OZ)(图8)、LTB4、血管紧缩素II或AGEs(糖化终末产物(advanced glycation end production))(数据未示出)，它们结合细胞膜上的特异性受体。
PPS对从炎症疾病病人(例如风湿性关节炎、哮喘活脓血症，数据未示出)提纯的中性粒细胞的作用要显著高于从健康对照获得的中性粒细胞。这种现象与本发明人的先前研究[Levy，R.等(2000)id ibid.]一致，该研究报道了在疾病期间中性粒细胞中的cPLA2水平更高，表明其合成的速率更高，从而更易于被靶向。
特别要注意，图3至图6描述的实验采用了非生理刺激物PMA，一种极强的NADPH氧化酶激活剂，该酶绕过受体而作用于PKC。这使得能分析反义寡核苷酸直接对NADPH氧化酶的作用，因为在这种情况下，消除了不同受体的表达和其结合刺激物的影响。
实施例4cPLA2反义寡核苷酸在大鼠小胶质细胞中对cPLA2表达和过氧化物产生的影响研究了反义寡核苷酸和其组合对大鼠脑中分离的小胶质细胞的作用。将PPS反义寡核苷酸(终浓度1μM)加入小胶质细胞中16h(与用于单核细胞的条件类似)。对cPLA2蛋白表达具有显著的抑制。细胞用2mg/ml PMA或用10μMβ淀粉样蛋白刺激，其过氧化物产量用荧光探针安普莱克司红(Amplex Red)分析。如图9所示，反义寡核苷酸产生了对过氧化物产量的显著抑制，与cPLA2蛋白表达相符。有趣的是，有1个碱基与大鼠序列不配对的反义寡核苷酸C8，不产生对过氧化物产量的抑制，显示了反义寡核苷酸作用的高度特异性。当细胞用β淀粉样蛋白刺激时，抑制要强烈得多。将反义寡核苷酸与小胶质细胞一起孵育48h产生cPLA2表达和过氧化物产量的更强抑制(数据未示出)。这个结果尤其重要，因为β淀粉样蛋白在诸如阿兹海默氏症的脑和神经退化性疾病的发病机理中发挥了重要作用。
所有细胞类型在X150的反义寡核苷酸浓度时的孵育对细胞无毒性，且不影响不受cPLA2调节的细胞功能(数据未示出)。
实施例5炎症的动物模型胶原诱导的关节炎胶原诱导的关节炎(CIA)是自免疫关节炎的实验模型，它与风湿性关节炎(RA)具有许多临床和病理的类似之处。如文献所述[Bendele，A.M.等(2000)关节炎和风湿病，432648-58]，由免疫敏感的(immunizingsusceptible)动物用II型胶原(CII)诱导CIA。所有小鼠都被维持在一特定的无胶原环境中，用标准的鼠食和水喂养。鸡CII(Sigma-Aldrich，2mg/ml)在4℃下在10mM醋酸和等体积的CFA(完全弗氏佐剂(completeFreund′s adjuvant))的液体中过夜溶解。通过将100mg的热灭活的结核分枝杆菌(heat-killed M.tuberculosis)(H37Ra，Difco，美国密歇根州底特律)与20ml不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)混和制备CFA。小鼠(7至10周龄)在尾巴的根部皮内注射并在第7天或第21天加强注射(boost)。对照小鼠用无CII的CFA处理。关节炎的严重性通过用一脚趾测径器依据下述等级直接检查监视等级0，无肿胀；1，稍肿胀和红斑；2，显著发炎；以及3，关节僵直。评定每一肢，给出每一动物的最大可能分数12。从动物爪吸取液体，以测定细胞因子(mRNA和蛋白水平)和白细胞。处死小鼠后，收集爪子、固定、脱钙，并用石蜡包埋。切片用苏木精和曙红染色，并依据下述等级评分0，无炎症；1，滑膜细胞层的稍微增厚和/或衬里下层(sublining)有一些炎性细胞；2，滑膜衬里层(synovial lining)增厚，衬里下层的渗透，以及局部软骨腐蚀；以及3，滑液空间的渗透，关节翳形成，软骨损坏，以及骨腐蚀。
抗CII抗体的检测HRP结合的(HRP-conjugated)特异性抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgM和IgA的第二抗体用于对CII的抗体检测的ELISA。
细胞分离利用特异的结合生物素的抗CD11b、CD3、CD4，和CD8的抗体，以及生物素结合物Dynabeads(biotin binder Dynabeads)进行滑膜细胞脾细胞子集(splenocyte subsets of synovial cells)的正向选择。在正向选择CD11b+和CD3+后，用生物素CD45孵育滑膜细胞并用过量的抗生物素蛋白-磁珠反向选择。剩余的CD45阴性细胞用作RNA提取。滑液白细胞从滑液渗出物中获得，并用Ficoll-Hypaque密度梯度离心纯化。
本发明人成功地开发了CIA模型，例如对恶化的CIA小鼠的肿胀肢体与对照小鼠的肢体的比较所论证的(图10A)。CIA小鼠肢体的组织学评估(图10B)与如图10A所示的对肢体的直接观察监视的关节炎的严重性相关。在一CIA小鼠的关节切片中可见炎性细胞(尤其是中性粒细胞)的渗透(图10C)。CIA小鼠表现出严重的行走困难(数据未示出)。
基于用各种PPS浓度和组合进行的初步实验，对于3种不同的PPS的组合(2，4和10)，限定了最佳浓度为2mg/kg，所述组合在此处也称之为cocktail。这个浓度处于用于人治疗和动物模型的范围内。
在治疗炎症状况下，无菌的反义寡核苷酸储液(stock)(100μM)以合适的浓度溶解在无菌盐水中，并在尾巴根部或在肿胀的关节处，通过静脉注射或皮内注射注入病鼠中。
如图11所示，每天静脉注射2mg/kg的“cocktail”共14天使关节炎显著消退，这一点通过通过肢体肿胀度的减小(图11A)，通过疾病严重性分数的降低，通过小鼠自由运动和跑动能力的恢复(数据未示出)，以及通过血清IL-6和TNFα水平的降低而检测到。
实施例6炎症的动物模型腹膜炎如以前所述[Levy，R.等(1989)3生物调节剂和稳态剂杂志(J.Biol.Regul.Homeost.R Agents)5-12]，通过对CD1小鼠注射Candia建立小鼠腹膜炎模型，或者通过注射不同剂量的革兰氏阳性菌，腹膜炎可以用致使动物死亡的致死剂量的或产生中度疾病的中等剂量的candida或细菌(表皮葡萄球菌(S.epidermitis))或革兰氏阴性菌(大肠杆菌)诱导。50％致死剂量确定为表皮葡萄球菌6×108CFU，大肠杆菌1.5×107CFU。感染和/或炎症的标志为腹膜炎区域的血细胞的数目和种群，血液中炎性细胞因子诸如TNFα、IL1和IL6的浓度，以及腹膜切片的组织学分析。注射了致死量细菌的小鼠在注射后2h用反义寡核苷酸处理，随后在不同时间间隔注射反义寡核苷酸。在这些实验中，评估了反义寡核苷酸对小鼠存活的影响。对注射更低剂量细菌的小鼠，通过感染和/或炎症的标志评估反义寡核苷酸对病理的作用(如所述注射)。
实施例7炎症的动物模型无菌性腹膜炎如先前所述[Segal，B.H.等(2002)白细胞生物学杂志(JLeukoc Biol)71410]，无菌性腹膜炎的模型在ICR小鼠中通过腹膜内注射3ml无菌4％硫乙醇酸盐(thioglycollate)(TG)建立。炎症的评估通过腹膜炎腔中的血细胞数目和种群、LTB4的浓度以及炎性细胞因子TNFα和IL6在无细胞的腹膜液和血清中的存在度确定。将10ml无菌PBS注射进腹膜腔内，以收集细胞。细胞数在台盼蓝染色后通过显微镜方法测定。细胞种群的组成利用抗小鼠中性粒细胞(MCA771F)、抗小鼠巨噬细胞(F4/80)以及抗小鼠淋巴细胞(CD3)的抗体，通过FACS测定。细胞种群的组成还在姬姆色素(Giemsa)染色后在显微镜下确定。图12A-图12B表示了在无菌性腹膜炎4天期间血液白细胞计数(图12A)和细胞种群(图12B)的变化。在TG注射后24h检测到高水平的中性粒细胞，随后被单核细胞-巨噬细胞代替。在腹膜炎诱导后受刺激的吞噬细胞过氧化物产量具有显著的提高，其最高速率在腹膜炎诱导后24h。
在无菌性腹膜炎24h期间，血清和腹膜腔中LTB4的水平显示在图13A-图13B中。在腹膜炎诱导1小时后，LTB4水平在血液中具有显著的提高。在5h期间LTB4保持高水平，随后在8小时后降至一半。在腹膜炎诱导后16小时，不能在血液中检测到LTB4。在腹膜腔内观察到类似的模式，但是衰减更慢，且仅在24h后不再检测到LTB4。
依据本结果并与文献一致，在腹膜炎模型中最先积聚的细胞是中性粒细胞。从而，在第一组实验中，反义寡核苷酸的作用主要对无菌性腹膜炎诱导24h后中性粒细胞的积聚和活性进行分析。将针对cPLA2的PPS反义寡核苷酸的特定组合(“cocktail”)的两个剂量溶解在无菌水(0.2ml)中，并在腹膜炎诱导1h和4h后静脉注射进小鼠的尾巴中给药。如图14A-图14c所示(两只小鼠的结果)，这种处理使得腹膜腔内存在的中性粒细胞数显著减少(表示为通过FACS分析检测的细胞数和细胞种群分布)，且在炎症诱导24h后稍微抑制腹膜细胞的经刺激的过氧化物的产生。Cocktail在34只小鼠中导致腹膜聚集的中性粒细胞和过氧化物产生的减少功效与34只未处理的无菌性腹膜炎小鼠的比较表示在图15A-图15B中。未受刺激的细胞的过氧化物释放非常重要，因为它反映了腹膜腔内的腹膜细胞的行为。因而，从静止细胞释放的过氧化物用荧光探针二氢若丹明-123(1mM)估定，该方法非常敏感，能检测非常低水平的过氧化物。如图16中的代表性结果所示，腹膜炎诱导后用cocktail处理24h后，显著降低了腹膜细胞的过氧化物释放。
研究了4天的无菌性腹膜炎期间反义寡核苷酸处理对腹膜细胞种群的影响。在4天的腹膜炎期间，在处理的小鼠的腹膜中聚集的中性粒细胞数大大减少且巨噬细胞数显著降低(图17A-图17B)。在四天的腹膜炎期间，反义寡核苷酸处理的小鼠的腹膜细胞的受刺激的过氧化物产量显著低于未处理小鼠(图18A-图18B)。
反义寡核苷酸cocktail处理降低了腹膜腔内的在腹膜炎诱导后24小时期间测得的LTB4水平(图19A-图19B)，与聚集至腹膜腔的中性粒细胞的减少相符。
用荧光标记的反义寡核苷酸(在最后的核苷酸上用FITC标记)检测了静脉注射24小时后反义寡核苷酸在腹膜血液细胞中的积聚(图21A-图21B)。同时通过组织切片分析了荧光反义寡核苷酸在不同器官中的分布(数据未示出)。在进一步的实验中，进行了不同的反义寡核苷酸过量用药，以确定其毒性。X100的cocktail对于小鼠没有毒性(数据未示出)。
实施例8炎症的动物模型实验性急性肺损伤，由1-LPS/酵母聚糖给药诱导。
将小鼠麻醉并机械通风。在实验期间，向通风系统持续供应氧气。在静脉(i.v.)给药前一分钟，释放两次深吸气(deep inhalation)(3×潮容量(tidal volume))，至标准化体积历史(standardize volume history)并将测量设定为基线。然后通过静脉注射使小鼠接受3mg/kg的来自大肠杆菌O111B4的LPS(Sigma化学公司，密苏里州圣路易斯)。两小时后，静脉给药10mg/kg的来自酿酒酵母(Sigma)的酵母聚糖A。在盐水处理组，动物以相同的方式接受盐水而不是LPS和酵母聚糖，并用作对照。在所有组中，测量以30分钟的间隔进行4小时。在一些动物中，观察延长至达6小时。为了对肺损伤的发展进行生理性评估，测量了EL(肺的顺应性(lung compliance)的倒数)。并测量气管压(Ptr)、流量和容量(V)。EL和肺阻力(lung resistance)(RL，数据未示出)通过校正运动方程计算Ptr＝ELV+RL(dV/dt)+K，其中K是常数。EL的变化反映了肺实质的改变和肺的硬化。
2-HCl吸入诱导。
在基线测量后，麻醉的、机械通风的小鼠通过鞘内注射(i.t.)接受2mg/kg的HCl(pH＝1.5)随之以一个空气药丸(3mg/kg)。在盐水处理组，动物以相同的方式接受盐水而不是HCl，并用作对照。在所有组中，测量以30分钟的间隔进行2小时。在一些动物中，观察延长至达5小时。为了评估急性肺损伤，EL测量值作为一个生理参数。
肺水肿的评估-在实验结束时，计算了肺的干/湿质量比，以评估肺水肿。对离体肺排干血液后，进行肺湿重的测量。然后在重力对流炉(gravityconvection oven)中将肺在90℃加热72h至恒重，对残余物称重作为肺的干质量。
支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid)-在实验结束时，在每组进行支气管肺泡灌洗(BAL)(用5×1ml磷酸盐缓冲液)。在每一动物中，一致性地回收了90％(4.5ml)的总注射体积。BAL液在450g离心10分钟后，从细胞组份中测定BAL液的总细胞计数和分类细胞计数(differential count)。在测定蛋白含量前将上清液储存在-70℃。蛋白浓度以牛血清白蛋白做标准物用Lowry法测定。
凝血噁烷(thromboxane)和白三烯的测量-用酶免疫分析(EIA)试剂盒测定。
序列表<110>莫尔伊萨姆研究有限公司<120>针对PLA2的反义寡核苷酸、组合物及其应用<130>16790-WO-03<160>12<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成反义寡核苷酸<400>1ttcaaaggtc tcattccaca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>P3<400>12gtgctggtaa ggatctat18
权利要求
1.一种针对胞液型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA序列的开放阅读框(ORF)的反义寡核苷酸，以及其功能类似物、衍生物或片断，其中所述反义寡核苷酸的互补性在所述ORF的核苷145至400之间的区域内，且其中所述反义寡核苷酸能抑制cPLA2蛋白的表达。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸还能够抑制NADPH氧化酶的活性。
3.一种针对胞液型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA序列的开放阅读框5’区域的反义寡核苷酸，以及其功能类似物、衍生物或片断，其特征在于，所述反义寡核苷酸具有如序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6中的任一序列表示的序列。
4.根据权利要求1至3之任一权利要求所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸的长度从15至达30个核苷酸，优选长度为17至21个核苷酸。
5.根据权利要求1至4之任一权利要求所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的最前三个和/或最后三个核苷上具有硫代磷酸化修饰。
6.根据权利要求1至5之任一权利要求所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的第十个核苷上具有硫代磷酸化修饰。
7.根据权利要求1至4之任一权利要求所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的最前三个和/或最后三个核苷被2-O-甲基化。
8.根据权利要求1至7之任一权利要求所述的反义寡核苷酸，用于抑制过氧化物的产生和释放。
9.根据权利要求8所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述抑制发生在中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中的任一种中，优选在中性粒细胞中。
10.根据权利要求9所述的反义寡核苷酸，用于治疗与Aβ斑积聚相关的状况。
11.根据权利要求8至10之任一权利要求所述的反义寡核苷酸，用于治疗和/或预防与中枢神经系统(CNS)相关的疾病，其中，所述疾病选自由阿兹海默氏症，或帕金森氏症，肌萎缩侧索硬化症(ALS)，脑缺血性损伤和创伤性头部损伤组成的组。
12.根据权利要求1至7之任一权利要求所述的反义寡核苷酸，用作与cPLA2表达相关的炎症过程的抑制剂。
13.根据权利要求12所述的反义寡核苷酸，用于在治疗和/或预防炎症状况中的应用。
14.根据权利要求13所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述状况是风湿性关节炎、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病中的任一种。
15.根据权利要求1至7之任一权利要求所述的反义寡核苷酸，用于在治疗和/或预防小胶质细胞被活化以及释放活性氧(ROS)和/或促炎介质的状况中的应用。
16.根据权利要求15所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述状况选自由炎症、感染，以及缺血性疾病组成的组。
17.根据任一前述权利要求所述的反义寡核苷酸，可选地标记有荧光、放射性物质、金属颗粒，以及任何适用的标记方法中的一种。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包括至少一种根据权利要求1至9之任一权利要求限定的反义寡核苷酸作为活性剂。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包括至少两种根据权利要求1至9之任一权利要求限定的反义寡核苷酸的组合作为活性剂。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述组合包括下述寡核苷酸序列1与序列3，或序列1与序列2，或者序列1与序列6，或者序列1与序列2和序列3，或者序列4与序列6，或者序列2与序列6，或者序列2与序列3，或者序列3与序列6。
21.根据权利要求18至20之任一权利要求所述的药物组合物，用于医疗用途。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，用于治疗与cPLA2表达和/或通过吞噬细胞NADPH氧化酶的自由基释放相关的炎症过程。
23.根据权利要求21所述的药物组合物，用于治疗炎症状况。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述状况是风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病中的一种。
25.根据权利要求21所述的药物组合物，用于在治疗和/或预防小胶质细胞被活化以及释放活性氧(ROS)和/或促炎介质的状况中的应用。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其特征在于，所述状况选自由炎症、感染，以及缺血性疾病组成的组。
27.包括作为活性剂的至少一种根据权利要求1至11之任一权利要求限定的反义寡核苷酸的药物组合物，用于治疗与Aβ斑积聚相关的状况。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，用于治疗和/或预防CNS相关的疾病，其中，所述疾病选自由阿兹海默氏症、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)，以及脑缺血损伤和创伤性头部损伤组成的组。
29.根据任一前述权利要求所述的药物组合物，可选地进一步包括缓冲液、添加剂、稳定剂、稀释剂和/或赋形剂。
30.根据权利要求1至7和12至14之任一权利要求限定的反义寡核苷酸在制备用于治疗和/或预防炎症状况的药物组合物中的应用，其中所述状况可以是风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病中的任一种。
31.根据权利要求1至7、15和16之任一权利要求限定的反义寡核苷酸在制备用于治疗和/或预防小胶质细胞被活化以及释放活性氧(ROS)和/或促炎介质的状况的药物组合物中的应用，其中所述状况选自由炎症、感染，以及缺血性疾病组成的组。
32.根据权利要求1至7和12至14之任一权利要求限定的反义寡核苷酸在治疗与cPLA2激活相关的状况中的应用。
33.根据权利要求1至11之任一权利要求限定的反义寡核苷酸在治疗/或预防与Aβ斑积聚相关的状况中的应用。
34.根据权利要求33所述的应用，用于治疗/或预防神经退化性疾病，尤其是阿兹海默氏症和帕金森氏症。
35. 一种治疗与cPLA2激活相关的状况的方法，包括对所需要的受试者施以给药治疗学有效量的至少一种根据权利要求1至7和12至14之任一权利要求限定的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。
36. 一种治疗炎症状况的方法，包括对所需受试者施以至少一种根据权利要求1至7和12至14之任一权利要求限定的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述炎症状况可以是风湿性关节炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病中的任一种。
38.一种用于治疗和/或预防小胶质细胞被活化以及释放活性氧(ROS)和/或促炎介质的状况的方法，包括对所需受试者施以至少一种根据权利要求1至7、1 5和16之任一权利要求限定的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于所述状况选自由炎症、感染，以及缺血性疾病组成的组。
40.一种治疗与Aβ斑积聚相关的状况的方法，包括对所需受试者施以至少一种根据权利要求1至11之任一权利要求限定的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。
41.一种治疗神经退化性疾病，优选地是阿兹海默氏症和帕金森氏症的方法，包括对所需受试者施以至少一种根据权利要求1至11之任一权利要求限定的反义寡核苷酸，或包括它的组合物的治疗学有效量。
42.一种在体内或体外抑制cPLA2表达的方法，包括用根据权利要求1至8之任一权利要求所述的反义寡核苷酸或含有它的组合物接触细胞一段适宜的时间量。
43.一种在体内或体外抑制cPLA2活性的方法，包括用根据权利要求1至8之任一权利要求所述的反义寡核苷酸或含有它的组合物接触细胞一段适宜的时间量。
44.根据权利要求42和43所述的方法，其特征在于，所述细胞是吞噬细胞。
全文摘要
本发明提供了针对cPLA
文档编号C07H21/04GK101072788SQ200580012674
公开日2007年11月14日 申请日期2005年4月17日 优先权日2004年4月22日
发明者拉黑尔·利维 申请人:莫尔研究应用有限公司, 内盖夫研究发展机构本古里大学