大麻素受体调节剂的制作方法

专利名称：大麻素受体调节剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够调节大麻素受体(cannabinoid receptors)的化合物。
背景技术：
最近人们再次对医用大麻和合成大麻素的治疗用途产生了兴趣，比如大麻的活性组分-Δ9-四氢大麻酚(THC)[1]。
THC在多个主要医药领域中具有治疗优势，包括控制急性疼痛以及特别是慢性/神经性疼痛、恶心、食欲不振、AIDS、青光眼、哮喘和多发硬化症[Baker，D.et al，Nature 2000，404，84-87；Baker，D.et al FASEB J.2001，15，300-302；Schnelle，M.et al，Forsch.Komplementarmed.1999，6 Suppl 3，28-36]。
有关文献中已经报道了多种大麻素配体。概括地说，大麻素配体可以分成三大类包括(i)典型的大麻素，比如Δ9-四氢大麻酚，Δ9-THC[1]和CP55，940[9]；(ii)内型大麻素(endocannabinoids)，比如花生四烯酸乙醇胺(anandamide)[2]和2-花生四烯酰基甘油(arachidonoylglycerol)[3]；和(iii)以杂环为代表的非经典杂环类似物，比如WIN 55，212[7]和选择性CB1拮抗剂SR141716A[8][Pertwee，R.G，Pharmacology & Therapeutics 1997，74，129-180]。还报道过构象限定的花生四烯酸乙醇胺类似物[Berglund，B.A.etal，Drug Design and Discovery 2000，16，281-294]。然而迄今为止，大麻素药物的治疗效果由于它们具有不期望的神经活化性能(psychoactive properties)而受到了限制。
已知大麻素可以调节以急性、炎性和神经性疼痛形式表现的感受伤寒(nociceptive processing)[Pertwee，R.G，Prog.Neurobiol.2001，63，569-611]。更具体地说，现有研究集中在大麻素在神经性痛觉过敏[Herzberg，U.et alNeurosci.Lett.1997，221，157-160]和炎性痛觉过敏[Richardson，J.D.，Pain1998，75，111-119；Jaggar，S.I.et al，Pain 1998，76，189-199；Calignano，A.et al，Nature 1998，394，277-281；Hanus，L.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1999，96，14228-14233]的模型中的作用。还提出了大麻素受体表达和内原性大麻素浓度在炎症和痛觉过敏期间会发生改变[Pertwee，R.G，Prog.Neurobiol.2001，63，569-611]。
人们认为大麻素信号系统涉及两个克隆的大麻素受体(CB1和CB2)、内型大麻素配体(比如花生四烯酸乙醇胺[2]和2-花生四烯酰基甘油[3])和内型大麻素降解系统[Howlett，A.C.et al，International Union of PharmacologyXXVII，Pharmacol.Rev.2002，54，161-202；Pertwee，R.G，Pharmacology ofcannabinoid receptor ligands.Curr.Med.Chem.1999，6，635-664]。
大麻素系统的一个重要功能起到突触神经递质释放调节剂的作用[Kreitzer，A.C.et al，Neuron 2001，29，717-727；Wilson，R.I.et al，Neuron 2001，31，453-462]。CB1在CNS(特别是苍白球、黑质、小脑和海马)中进行高水平表达[Howlett，A.C.，Neurobiol.Dis.1998，5，405-416]。这与大麻在平衡和短时记忆处理(memory processing)中的已知副作用相一致[Howlett，A.C.et al，International Union of Pharmacology XXVII，Pharmacol.Rev.2002，54，161-202]。CB2通过白血球进行表达，并且它的调节不会引起神经活化作用(psychoactive effect)；此外，它不代表症状得到控制的显著目标，这是由CB1介导的主要作用。
虽然许多大麻素作用通过CNS中受体进行中枢介导[Howlett，A.C.et al，International Union of Pharmacology XXVII，Pharmacol.Rev.2002，54，161-202]，但是应当理解，外周CB受体也起着重要作用，特别是在疼痛和胃肠道中。例如，CB1还表达在外周组织(比如脊根神经节(dorsal rootganglia)、外周神经和神经肌肉末端)中，从而使得神经传递可以在CNS外进行调节[Pertwee，R.G，Life Sci.1999，65，597-605]。据此，在比如那些涉及疼痛[Fox，A.et al，Pain 2001，92，91-100]肠道运动过度(gut hypermotility)的情形中的治疗活性可以表现在非CNS位置。然而迄今为止，由于缺乏在CNS中选择性靶向作用于外周受体的药理学试剂，因此对外周大麻素系统的研究受到了阻碍。
为了消除不利的神经活化作用，需要将大麻素激动剂排除在CNS之外。存在两种将小分子试剂排除在CNS的已知方法。首先，一种方法包括通过小心地控制物理化学性能而将物质排除在CNS之外，从而防止它们穿过血脑屏障(BBB)。BBB由脑内皮细胞形成，具有紧密的细胞间连接并且很少开窗[Tamai，I.et al，J.Pharm.Sci.2000，89，1371-1388]。从而，物质必须通过被动扩散穿过胞质膜或者通过活性迁移机制进入脑内。由此，BBB对许多外周循环物质形成了有效屏障。
另一种将化合物排除在脑之外的方法是引入能够使它们主动泵过BBB的结构特征。一种能够实现上述目的的实例为鸦片样物质激动剂洛哌丁胺；虽然具有亲脂性，但是洛哌丁胺包含由p-糖蛋白转运体(MDR1)识别的结构特征，使得它可以主动泵过血脑屏障。[Wandel，C.et al，Anesthesiology 2002，96，913-920；Seelig，A.et al，Eur.J.Pharm.Sci.2000，12，31-40]。
本发明目的在于提供新的大麻素受体调节剂。更具体地说，本发明目的在于提供减轻和/或消除一些通常与现有技术调节剂相关的缺点的大麻素受体调节剂，所述缺点例如不期望的精神活性副作用。更具体的说但非仅仅如此而已，本发明目的在于提供选择性靶向作用于外周大麻素受体(peripheral cannabinoid receptors)的调节剂。

发明内容
本发明的第一方面涉及式(I)或者其药学上可接受的盐， 其中Z为OR1或者NR1R2，其中R1和R2各自独立地为H或者烃基；X为亚烷基、亚烯基或者亚炔基，它们各自可以任选被选自烷基、COOH、CO2-烷基、烯基、CN、NH2、羟基、卤素、烷氧基、CF3和硝基中的一个或者多个取代基所取代；Y为选自OH、NO2、CN、COR3、COOR3、NR3R4、CONR3R4、SO3H、SO2-R3、SO2NR3R4和CF3中的极性官能团，其中R3和R4各自独立地为H或者烃基；A为芳基或者杂芳基基团，它们各自可以任选被取代；和B为(CH2)n，其中n为0、1、2、3、4或者5；条件是(i)当A为苯基，n为0和Z为OH时，X-Y不是间-C≡C-(CH2)2CO2H、间-C≡C-(CH2)2OH、间-C≡C-(CH2)2CO2Me、间-(CH2)4CO2H、邻-CH2CO2H、邻-(CH2)2CO2H和邻-(CH2)4CO2H；和(ii)当A为苯基，n为0和Z为OMe时，X-Y不是间-C≡C-(CH2)4OH。
有利的是，同现有技术大麻素受体调节剂相比，优选本发明化合物显示出改良的水溶性和/或降低的亲油性。
本发明的第二方面涉及式(Ia)或者其药学上可接受的盐在制备用于治疗肌肉障碍(muscular disorder)的药物中的用途， 其中Z为OR1或者NR1R2，其中R1和R2各自独立地为H或者烃基；
X为亚烷基、亚烯基或者亚炔基，它们各自可以任选被取代；Y为极性官能团；A为芳基或者杂芳基基团，它们各自可以任选被取代；和B为(CH2)n，其中n为0、1、2、3、4或者5。
本发明的第三方面涉及如上所定义的式Ia化合物或者其药学上可接受的盐在制备控制痉挛状态(spasticity)和颤动(tremor)的药物中的用途。
本发明的第四方面涉及如上所定义的式Ia化合物或者其药学上可接受的盐在制备治疗胃肠道病症(gastrointestinal disorder)的药物中的用途。
本发明的第五方面涉及药物组合物，所述药物组合物包括如上定义的式I化合物，并且混有药学上可接受的稀释剂、赋形剂或者载体。
本发明的第六方面涉及式Ia化合物或者其药学上可接受的盐在测定(assay)中用于鉴定其它能够调节大麻素受体活性的化合物的用途。
具体实施例方式
大麻素大麻素是能够与大麻素受体(特别是CB1和/或CB2)结合的实体。典型的大麻素包括在印度大麻(大麻属)中发现的大约30种2-(2-异丙基-5-甲基苯基)-5-戊基间苯二酚衍生物，它们是植物或其提取物具有麻醉作用的原因。大麻素的实例为大麻二酚、大麻酚、反式-Δ9-四氢大麻酚、反式-Δ8-四氢大麻酚和Δ9-四氢大麻酚酸。其它大麻素的实例包括花生四烯酸乙醇胺、methanandamide和R(+)WIN55，212。
内型大麻素该术语是指在体内天然存在的大麻素——与外源性提供的大麻素(exogeneously supplied cannabinoid)相对应。内型大麻素在Di Marzo(1998)Biochimica et Biophysica Acta第1392卷第153-175页进行了讨论(其内容在此引入作为参考)。内型大麻素的一种实例为花生四烯酸乙醇胺。在US-A-5874459中可以得到有关这些实体和花生四烯酸乙醇胺酰胺酶的教导。该文件教导了将花生四烯酸乙醇胺酰胺酶抑制剂作为止痛剂的用途。
大麻素受体大麻素受体是与大麻酚和结构类似化合物结合从而介导其细胞内作用的几种膜蛋白质中的任何一种或多种。
已经发现了大麻Δ9-四氢大麻酚(THC)的神经活性成分的两种受体——CB1和CB2大麻素受体(Pertwee 1997 Pharmacol Ther vol 74，129-180)。这些受体都是七-跨膜结构域G-蛋白结合受体(seven-transmembranedomainG-protein-coupled receptors)。CB1受体发现于脑和睾丸中。CB2受体发现于脾中而非脑中。
对于这两种类型的受体，花生四烯酸乙醇胺为推定的内源性配体，这两种类型的受体都消极地与腺苷酸环化酶结合，降低了细胞内环磷腺苷(cyclic AMP)浓度。上述受体的序列实例源于小家鼠(Mus musculus)并且包括CB1，数据库编码CB1_MOUSE，473氨基酸(52.94kDA)；CB2，数据库编码CB2_MOUSE，347氨基酸(38.21kDa)。下面将对CB1和CB2进行更为详尽的说明。
大麻素受体1(CB1或者CNR1)关于CB1的背景教导已经由Victor A.McKusick et al记载在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim。以下关于CB1的信息源于此。
大麻素是作用神经的大麻(marijuana)成分，主要为Δ-9-四氢大麻酚以及合成类似物，Matsuda et al[Nature 346561-564，1990]从大鼠脑中克隆了大麻素受体。应用人类基因整个编码序列的粘粒克隆，Modi和Bonner[Abstract，Cytogenet.Cell Genet.581915，1991]通过原位杂交将人类CNR位点描绘至6q14-q15。Gerard et al[Biochem.J.279129-134，1991]从人类脑干cDNA库中分离了编码大麻素受体的cDNA。演绎的氨基酸序列编码了具有472个残基的蛋白质，所述蛋白质具有由Matsuda et al[同上，1990]克隆的大鼠大麻素受体享有97.3％的同一性。它们提供了存在于表达在人类睾丸中等同的大麻素受体的证据。Hoehe et al[New Biologist 3880-885，1991]通过组合遗传连锁映射(genetic linkage mapping)和染色体原位杂交确定了CNR基因的基因组定位。提出了紧密连锁(close linkage)，此时CGA位于6q21.1-q23；在θ＝0.0时，最大优势对数＝2.71。此外，连接CNR至限定位点D6Z1的标记物，唯一定位在所有染色体的着丝粒上并且富集在染色体6上的序列。Ledent et al[Science 283401-404，1999]通过分裂小鼠的基因，研究了中枢大麻素受体(CB1)的功能。变种小鼠不响应大麻素药物，表明CB1仅仅在介导痛觉缺失、增强、低体温(hypothermia)、低行进(hypolocomotion)和低血压中起作用。
大麻素受体2(CB2或者CNR2)
关于CB2的背景教导由Victor A.McKusick et al记载在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim。以下关于CB2的信息源于此。
除了具有著名的神经活化性质外，大麻或者其主要活性大麻素组分Δ-9-四氢大麻酚，还具有止痛、消炎、免疫抑制、抗惊厥和止吐作用以及减轻青光眼中眼内压的作用。表达在脑中而不是在外周中的G蛋白-偶合大麻素受体-1(CNR1；114610)，除去在睾丸以低浓度存在外，不会轻易解决大麻素的非精神活化作用(nonpsychoactive effects)。
使用具有简并引物的PCR筛选前髓细胞性白血病细胞cDNA库[Munro，Nature 36561-65，1993]获得了编码CNR2的cDNA，作者将其称为CX5。序列分析预测演绎的360-氨基酸7-跨膜-跨膜蛋白与CNR1总体具有44％的氨基酸同一性，与提出用于参照配体特异性的跨膜残基具有68％的同一性(identity)。
结合分析确定，CNR2编码对大麻素具有高亲和性的受体，其具有比CNR1对大麻酚具有更高的亲和性。Northern印迹分析显示HL60骨髓细胞系中2.5-和5.0-kb的转录表达促进了骨髓细胞或者粒细胞的分化。使用鼠CX5同系物，Munro[1993，同上]发现在脾中存在2.5-kb的转录，而非在脑、肾、肺、胸腺、肝或者鼻上皮细胞中存在。原位杂交分析表明在脾脏边缘区存在表达。PCR分析检测到CNR2表达在纯化的脾巨噬细胞而非CD5+T细胞中。Munro[1993，同上]推测CNR2的定位表明其内源性配体应当具有免疫调节作用。International Radiation Hybrid Mapping Consortium将CNR2基因绘制成了染色体(stSG90)。
化合物如上文所记载，同现有技术大麻素调节剂相比，本发明化合物优选显示出改良的水溶性和/或降低了的亲油性。优选地，本发明化合物没有穿透血脑屏障到任何显著的程度。
本发明涉及如本文中所定义的式I、Ia、Ib和Ic化合物。
在此所用的术语“烃基(hydrocarbyl)”是指至少包括C和H的基团，其任选包括一个或多个其它适宜的取代基。上述取代基的实例可以包括羟基、卤素、烷氧基、硝基、烷基或者环状基团。除了取代基为环状基团的可能性之外，这些取代基也可以联合形成环状基团。如果所述烃基含有超过一个碳，那么那些碳不必必须彼此连接。例如，其中至少两个碳可以经适宜的元素或者基团进行连接。也就是说，所述烃基基团可以包含杂原子。适宜的杂原子对于本领域熟练技术人员而言是显而易见的，并且包括例如硫、氮、氧、磷和硅。优选所述烃基为烷基、烯基、芳基或者环烷基，它们各自可以任选被取代。更优选所述烃基为烷基、烯基、环烷基或者苯基。
在此使用的术语“烷基”包括既可以包括饱和直链的烷基，又可以包括支链烷基，它们可以是未取代的或者取代的(单取代的或多取代的)。优选所述烷基为C1-20烷基，更优选为C1-15烷基，更优选为C1-10烷基，并且更优选为C1-6烷基。特别优选烷基包括，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。适宜的取代基包括，例如烷基、羟基、卤素-、烷氧基-、硝基-、COOH、CO2-烷基、烯基、CN、NH2、CF3或者环状基团。本领域熟练的技术人员应当理解，术语“亚烷基”可以这样来解释，即在本发明上下文中，术语“亚烷基”包括带有末端Y基团的直链或者支链、取代(单取代或者多取代)或者未取代的饱和碳链。
在此使用的术语“环烷基”是指可以被取代(单取代或者多取代)或者未被取代的环状烷基。适宜的取代基包括例如烷基、羟基、卤素、烷氧基、硝基、COOH、CO2-烷基、烯基、CN、NH2、CF3或者环状基团。
在此使用的术语“烯基”是指含有一个或者多个双键的基团，其可以为直链或者支链、并且可以被取代(单取代或者多取代)或者未被取代。优选烯基为C2-20烯基，更优选为C2-15烯基，更优选为C2-10烯基，或者优选为C2-6烯基。适宜的取代基包括，例如烷基、羟基、卤素-、烷氧基-、硝基-、COOH、CO2-烷基、烯基、CN、NH2、CF3或者环状基团。本领域熟练的技术人员应当理解，术语“亚烯基”可以相应得到解释，即在本发明上下文中，术语“亚烯基”包括含有一个或者多个双键并且带有末端Y基团的直链或者支链、取代(单取代或者多取代)或者未取代的不饱和碳链。
在此使用的术语“炔基”是指含有一个或者多个三键的基团，其可以为直链或者支链，并且可以被取代(单取代或者多取代)或者未被取代。优选所述炔基为C2-20炔基，更优选为C2-15炔基，更优选为C2-10炔基炔基，或者优选为C2-6炔基。适宜的取代基包括例如烷基、羟基、卤素、烷氧基、硝基、COOH、CO2-烷基、烯基、CN、NH2、CF3或者环状基团。本领域熟练的技术人员应当理解，术语“亚炔基”可以相应得到解释，即在本发明上下文中，术语“亚炔基”包括含有一个或者多个三键并且带有末端Y基团的直链或者支链、取代(单取代或者多取代)或者未取代的不饱和碳链。
在此使用的术语“芳基”是指可以被取代(单取代或者多取代)或者未被取代的C6-10芳基。芳基的典型实例包括苯基和萘基等等。适宜的取代基包括例如烷基、羟基、卤素、烷氧基、硝基、COOH、CO2-烷基、烯基、CN、NH2、CF3或者环状基团。
术语“杂芳基”是指包含一个或多个杂原子的如上所定义的芳基。适宜的杂原子对于本领域熟练技术人员而言是显而易见的，并且包括例如硫、氮、氧、磷和硅。适宜的取代基包括例如烷基、羟基、卤素、烷氧基、硝基、COOH、CO2-烷基、烯基、CN、NH2、CF3或者环状基团。
式Ia化合物(供本发明之用)包含极性官能团Y，其通过饱和或者不饱和的烃基连接基团X连接在芳基A上。适宜的极性官能团是本领域熟练技术人员所熟知的，并且包括例如任何含有一个或多个电负性原子(比如F、O、N、Cl或者Br等)的官能团。优选的极性官能团包括羟基、烷氧基、胺、亚胺、硝基、氰基、含羰基基团和含硫氧基基团(sulfoxy-containing group)。
对于式Ia化合物，特别优选的极性基团包括NO2、CN、OR3、COR3、COOR3、NR3R4、CONR3R4、SO3H、SO2R3、SO2NR3R4和CF3，其中R3和R4各自独立地为H或者烃基。
对于式Ia化合物，在一个特别优选的实施方案中，Y选自OR3、CN、COOR3、SO2NR3R4、CONR3R4，其中R3和R4各自独立地为H或者烃基。
对于式Ia化合物，在本发明更为优选的实施方案中，Y选自OR3、CN、COOR3、CONR3R4，其中R3和R4各自独立地为H或者任选被选自羟基、卤素-、烷氧基-、硝基-和环状基团中的一个或多个取代基所取代的烷基。
对于式Ia化合物，更优选Y选自OH、CN、COOMe、COOH、CONH2、CONHMe和CONMe2。
对于式Ia化合物，其中极性基团Y选自NO2、OH、CN、COR3、COOR3、NR3R4、CONR3R4、SO3H、SO2-R3、SO2NR3R4和CF3，其中R3和R4各自独立地选自H或者烃基。
对于式Ia化合物，优选极性基团Y选自OH、CN、COOR3、SO2NR3R4、CONR3R4，其中R3和R4各自独立地为H或者烃基。
对于式I化合物，在本发明更为优选的实施方案中，Y选自OH、CN、COOR3、CONR3R4，其中R3和R4各自独立地为H或者任选被选自羟基、卤素-、烷氧基-、硝基-和环状基团中的一个或多个取代基所取代的烷基。
对于式I化合物，更优选Y选自OH、CN、COOMe、COOH、CONH2、CONHMe和CONMe2。
对于所有上述实施方案，优选R1、R2、R3和R4各自独立地为H、烷基、芳基或者环烷基，它们各自可以任选被选自羟基、卤素-、烷氧基-、硝基-和环状基团中一个或多个的取代基所取代。。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，n为0；即，B不存在，和-C(＝)Z部分与芳基A直接连接。
对于式I和1a化合物，优选X-Y选自-C≡C-(CH2)p-Y；-C(R5)＝C(R6)-(CH2)q-Y；和C(R5)(R6)C(R7)(R8)-(CH2)r-Y；其中R5、R6、R7和R8各自独立地为H或者烷基，并且其中p、q和r各自独立地为1～6，更优选为2、3或者4。
对于式I和1a化合物，更优选X-Y选自-C≡C-(CH2)p-Y；和-CH＝CH-(CH2)q-Y；其中p和q各自独立地为1-6，更优选为2、3或者4。
在一个优选的实施方案中，R5和R6都为H。
对于式I和1a化合物，在一个特别优选的实施方案中，X-Y为顺式-C(R5)＝C(R6)-(CH2)q-Y。
对于式I和1a化合物，在另一优选的实施方案中，X-Y为-C(Me)2-CH2-(CH2)r-Y和r为1-6，更优选为2、3或者4。
在另一优选的实施方案中，X-Y为(CH2)s-Y，其中s为1-6，更优选为2、3、4或5。
对于式I和Ia化合物，优选A为任选取代的苯基或者吡啶基，更优选为苯基。
在另一优选的实施方案中，A为未取代的苯基或者吡啶基，更优选为未取代的苯基。
在一个特别优选的实施方案中，所述化合物为式Ib
其中A、B、X、Y和Z如上所定义。
在另一特别优选的实施方案中，所述化合物为式Ic 其中A、B、X、Y和Z如上所定义。
优选Z为OR1或者NR1R2，且R1和R2各自独立地为H、烷基或者环烷基，它们各自可以任选被一个或者多个OH或者卤素基团取代。
在一个优选的实施方案中，Z为NR1R2，且R1和R2各自独立地为H、烷基或者环烷基，它们各自可以任选被一个或者多个OH或者卤素基团取代。
在一个优选的实施方案中，Z为OR1，且R1为烷基或者环烷基，它们各自可以任选被一个或者多个OH或者卤素基团取代。
在一个优选的实施方案中，Z选自OH、OEt、NHCH2CH2F、NH-环丙基、NHCH(Me)CH2OH和NHCH2CH2OH。
在一个更为优选的实施方案中，Z选自OEt、NHCH2CH2F、NH-环丙基、NHCH(Me)CH2OH和NHCH2CH2OH。
本发明中的缩写Me表示甲基，Et表示乙基。
使用小鼠研究了本发明化合物体外对大麻素受体结合和活化以及体内神经活化的可能性。通过直接测定化合物的脑水平，对CNS浓度进行定量(对没有CNS作用的化合物)。使用肠道运动测定法(gut mobility assay)，对外周大麻素活化进行评价。进一步详述的结合研究可以参见随后的实施例部分。
本发明特别优选的化合物选自以下 更优选式I化合物为 有利地，化合物(16)显示了调节外周大麻素受体的作用，并没有产生显著的CNS作用。此外，对CREAE小鼠进行的试验表明化合物(16)能够实现痉挛状态的选择性抑制作用，不会产生CNS作用。
在更为优选的实施方案中，化合物(16)为外消旋混合物形式。
合成式I和1a化合物根据以下方案1进行合成。
方案1简言之，使用钯催化Songashira偶联反应将多种烷基侧链插入3-碘苯甲酸甲酯。目标化合物(S5)和相关类似物通过简单的四步路线进行合成。首先，在二酰亚胺(EDCI)存在下，使酸(S1)与DL丙氨醇(alaninol)反应，从而以良好的产率得到酰胺(S2)。在CuII和吡咯烷存在下，酰胺与炔酸的钯催化偶联[Hoye，R.C.et al，J.Org.Chem.1999，64，2450-2453；Hopper，A.T.et al，J.Med.Chem.1998，41，420-427]平稳地得到进行，从而给出炔(S3)。使用氯甲酸乙酯和二甲胺HCl，将酸(S3)定量地转化为(S4)。随后进行Lindlar催化还原，得到目标烯烃(S5)。该方法的适应性使得利用多种炔进行Sonogashira偶联，或者通过在第一步骤中利用不同的胺开始进行酰胺合成，可以合成许多不同的化合物。
治疗应用本发明的另一方面涉及本发明的式Ia化合物在制备用于治疗肌肉障碍(muscular disorder)的药物中的用途。优选的实施方案与上述通式I化合物的优选所述肌肉障碍为神经肌肉障碍(neuromuscular disorder)。
在此所用的措词“制备药物”是指除了用于其它试剂的筛选程序中或者用于制造上述药物的任何阶段之外，还包括直接将式I化合物用作药物。
术语“肌肉障碍”以广义进行使用，包括任何肌肉障碍或者疾病，特别是神经障碍或者疾病(neurological disorders and diseases)，更特别而言为神经变性疾病或者涉及神经肌肉控制的不利状态。
由此，该术语包括，例如CREAE、MS、痉挛状态、帕金森氏症(Parkinson’sdisease)、亨廷顿舞蹈病(Huntingdon′s Chorea)、脊髓损伤、癫痫症、图雷特综合征(Tourette’s syndrome)和膀胱痉挛(bladder spasm)。虽然外周大麻素受体在控制多发性硬化症(multiple sclerosis)和EAE痉挛状态中没有明显的作用，但是血液CNS屏障在损害区域受到了损害并且可以提供治疗剂的选择性选取[Butter，C.et al，J.Neurol.Sci.1991，104，9-12；Daniel，P.M.et al，J.Neurol.Sci.1983，60，367-376；Juhler，M.et al，Brain Res.1984，302，347-355]。
除了上述病症之外，本发明还适用于其它存在或者表现颤动或者肌肉痉挛的领域，比如失禁、哮喘、支气管痉挛、呃逆(hiccough)等等。
本发明的另一方面涉及根据本发明的式Ia化合物在制备用于控制痉挛状态和颤动的药物中的用途。
本发明化合物还在多种胃肠道病症的治疗中具有治疗用途。
已经知道外周CB1受体可以调节胃肠运动(gastrointestinal motility)、小肠分泌(intestinal secretion)和胃肠保护(gastroprotection)。消化道含有内源性大麻素(花生四烯酸乙醇胺和2-花生四烯酰基甘油)，大麻素CB1受体可以发现于肠肌神经层和粘膜下层神经上。接头前/突触前定位的肠内(肠)CB1受体的活化在多种分离的肠组织(包括人类回肠和结肠)中产生了电感应收缩(electrically-induced contraction)的抑制作用(一种与抑制乙酰胆碱从肠神经释放相关的作用)。在啮齿类动物中，大麻素激动剂体内抑制肠能动性，并且该作用至少部分地在上胃肠道传送[Izzo，A.A.et al，Br.J.Pharmacol.2000，129，1627-1632；Landi，M.et al，Eur.J.Pharmacol.2002，450，77-83]和在结肠中[Pinto，L.et al，Gastroenterology 2002，123，227-234]被外周(即肠)CB1受体的活化介导。由此，在肠能动性(intestinal mobility)的测定中，体内测定是评价作用外周大麻素药物的活性的有效模型。
本发明的另一方面涉及根据本发明的式Ia化合物在制备用于治疗肌肉胃肠道病症的药物中的用途。
优选所述胃肠道病症选自以下一种或者多种胃溃疡、克罗恩氏病、分泌性腹泻和麻痹性肠梗阻(paralytic ileus)。
在此使用的术语“麻痹性肠梗阻”是指阻止物质在肠管内通过的肠道麻痹或者不活动。这一般可能是抗胆碱能药物、损伤或者疾病所导致的结果。麻痹性肠梗阻在外科手术后经常发生。
优选对于所有上述治疗用途，所述调节剂选择性地调节外周大麻素受体。
更优选相对于中枢大麻素受体，所述调节剂选择性地调节外周大麻素受体。
在此使用的术语“选择性”是指对于外周大麻素受体具有选择性的调节剂。优选相对于中枢大麻素受体，它们是有选择性的。优选相对于中枢大麻素受体，本发明调节剂对于外周大麻素受体的选择性大于10∶1，更优选大于100∶1，更优选大于300∶1。选择性比例可以由熟练技术人员轻易进行确定。
对于一些应用，优选本发明调节剂的EC50值小于约1000nM，优选小于100nM，更优选小于约75nM，更优选小于约50nM，优选小于约25nM，优选小于约20nM，优选小于约15nM，优选小于约10nM，优选小于约5nM。
更优选所述调节剂基本上只结合到外周大麻素受体上。
在一个特别优选的实施方案中，所述调节剂为大麻素受体激动剂。在此使用的术语“激动剂”以其在本领域中的通常含义进行应用，即，功能性活化结合它的受体的化合物。
在一个特别优选的实施方案中，所述调节剂基本上不激动中枢大麻素受体。
更优选所述调节剂基本上排除在CNS之外。由此，所述调节剂能够调节外周大麻素受体，不会产生CNS作用，比如不希望的神经活化作用。
本发明的另一方面涉及治疗与外周大麻素受体调节有关的病症的方法，所述方法包括给药需要其的受试者(subject)治疗有效量的如上所定义的式I化合物。
优选所述病症与外周大麻素受体失活有关。
药物组合物本发明的另一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包括上述本发明化合物或者其药学上可接受的盐，以及混合有药学上可接受的稀释剂、赋形剂或者载体。
尽管本发明化合物(包括它们药学上可接受的盐、酯和药学上可接受的溶剂化物)可以单独给药，但是它们通常与药物载体、赋形剂或者稀释剂混合给药，特别是用于人类治疗时。对于人类或者动物应用，所述组合物可以用作人类和兽医学药品。
对于本文中描述的多种不同形式的药物组合物，上述适宜赋形剂的实例可以由“Handbook of Pharmaceutical Excipients，第2版，(1994)，Edited by AWade and PJ Weller”获得。
用于治疗用途的可接受载体或者稀释剂是制药领域所熟知的，并且描述在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit 1985)中。
适宜载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇和山梨醇等等。适宜稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
药物载体、赋形剂或者稀释剂的选择可以根据预定的给药途径和标准药物实践进行选择。除包括载体、赋形剂或者稀释剂之外，所述药物组合物还可以包括任何适宜的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂层剂、增溶剂。
适宜粘合剂的实例包括淀粉、凝胶、天然食糖(比如葡萄糖)、无水乳糖、自由流动乳糖(free-flow lactose)、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶(比如阿拉伯胶、西黄蓍胶或者海藻酸钠)、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
适宜润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠等等。
防腐剂、稳定剂、颜料(dye)以及甚至调味剂都可以提供在所述药物组合物中。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对-羟基苯甲酸酯。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
盐/酯本发明化合物可以以盐或者酯，特别是药学上可接受的盐或者酯的形式存在。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括该化合物的适宜酸加成盐或者碱加成盐。适宜的药物盐的综述公开于Berge et al，J Pharm Sci，66，1-19(1977)中。盐由化合物例如与无机强酸形成，比如无机酸，例如硫酸、磷酸或者氢卤酸；与有机强羧酸形成，比如未被取代或者被取代(例如，被卤素取代)的1～4个碳原子的链烷羧酸，比如乙酸；与饱和或者不饱和二羧酸形成，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、反丁烯二酸、邻苯二甲酸或者对苯二甲酸；与羟基羧酸形成，例如抗坏血酸、乙二醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或者柠檬酸；与氨基酸形成，比如天冬氨酸或者谷氨酸；与苯甲酸形成；或者与有机磺酸形成，比如未被取代或者被取代(例如，被卤素取代)的(C1-C4)-烷基-或者芳基-磺酸，比如甲磺酸或者对甲苯磺酸。
取决于进行酯化的官能团，酯可以或者利用有机酸或者利用醇/氢氧化物进行制备。有机酸包括羧酸，例如未被取代或者被取代(如被卤素取代)的1-12个碳原子的链烷羧酸，比如乙酸；与饱和或者不饱和二羧酸形成，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、反丁烯二酸、邻苯二甲酸或者对苯二甲酸；与羟基羧酸形成，例如抗坏血酸、乙二醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或者柠檬酸；与氨基酸形成，比如天冬氨酸或者谷氨酸；与苯甲酸形成；或者与有机磺酸形成，比如未被取代或者被取代(例如，被卤素取代)的(C1-C4)-烷基-或者芳基-磺酸，比如甲磺酸或者对甲苯磺酸。适宜的氢氧化物包括无机氢氧化物，比如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括可以未被取代或者被取代(例如，被卤素取代)的1～12个碳原子的链烷醇。
对映异构体/互变异构体在先前所述的本发明所有方面中，适当时本发明包括式I和Ia化合物的所有对映异构体和互变异构体。本领域熟练的技术人员可以识别具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或者互变异构特性的化合物。相应的对映异构体和/或互变异构体可以通过本领域已知的方法进行分离/制备。由此，本发明包括为其分离形式的对映异构体和/或互变异构体或者其混合物，比如，例如为对映异构体的外消旋混合物。
立体异构体和几何异构体本发明的一些具体试剂可以以立体异构体和/或几何异构体的形式存在——例如，它们可以具有一个或多个不对称中心和/或几何中心，并且由此它们可以以两种或者更多种立体异构体形式和/或几何异构体形式存在。本发明包括那些抑制剂的所有单一立体异构体和几何异构体及其混合物的用途。用于权利要求中的术语包括这些形式，条件是所述形式保持适当的功能活性(尽管不必需要达到相同的程度)。
本发明还包括所述试剂或者其药学上可接受的盐的所有适宜的同位素变体。本发明试剂或者其药学上可接受的盐的同位素变体的定义是，其中一个原子被具有相同原子序数但是原子质量不同于通常发现于自然界中的原子质量的原子所替换的化合物。可以包含在所述试剂和其药学上可接受的盐的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，比如分别为2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。所述试剂和其药学上可接受的盐的某些同位素变体，例如其中含有放射性同位素(比如3H或者14C)的那些同位素变体可以用于药物和/或基质组织分布研究中。由于易于制备和检测，因此氚(即3H)和碳14(即14C)是特别优选的同位素。此外，同位素取代基(比如氘，即2H)由于具有更强的新陈代谢稳定性(例如，延长的体内半衰期或者降低的需要剂量)，可能会提供某些治疗学优点，并且因此可能在一些情形下是优选的。本发明试剂和其药学上可接受的盐的同位素变体通常可以通过常规工艺，使用适宜试剂的适当同位素变体进行制备。
溶剂化物本发明还包括本发明化合物的溶剂化物形式。用于权利要求中的术语包括这些形式。
多晶型物本发明此外涉及为其多种结晶形式、多晶型物和含结晶水形式的本发明化合物。在制药工业中已经充分证实，通过轻微改变纯化方法和/或用于上述化合物合成制备中的溶剂的分离形式，化合物都可以以上述任意形式得到分离。
前药本发明还包括前药形式的本发明化合物。所述前药为通常的式I和1a化合物，其中一个或者多个适当基团已经被修饰，如此使得通过给药至人类或者哺乳动物受试者，所述修饰可以进行逆转。上述逆转通常通过天然存在于上述受试者中的酶进行，由此为了进行体内逆转，可以将第二试剂与上述前药一起给药。上述修饰的实例包括酯(例如，如上所述的任何酯)，其中所述逆转可以通过酯酶等等进行。其它所述系统是本领域熟练技术人员所熟知的系统。
给药本发明药物组合物可以适用于以下给药途径口服、直肠、阴道、胃肠外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、真皮内、静脉内、经鼻、口腔或者舌下给药。
对于口服给药，具体的应用形式由压制片剂、丸剂、片剂、gellules、滴剂和胶囊组成。优选这些组合物每个剂量中含有1～250mg活性成分，并且更优选10～100mg活性成分。
其它给药形式包括可以静脉内注射、动脉内注射、鞘内注射、皮下注射、真皮内注射、腹膜内注射或者肌内注射的溶液剂或者乳剂，以及它们是由无菌或者可杀菌溶液进行制备的。本发明药物组合物还可以为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳剂、洗剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂或者扑粉的形式。
另一种透皮给药的方法是利用皮肤贴片(skin patch)。例如，可以将所述活性成分结合入由聚乙二醇或者液体石蜡的水性乳液组成的乳膏剂中。还可以将所述活性成分以按重量计1～10％的浓度包含在由白蜡或者白色软石蜡基与可能需要的上述稳定剂和防腐剂组成的软膏剂中。
每剂量可注射形式可以含有10～1000mg活性成分，优选10～250mg的活性成分。
组合物可以配制成单元剂型，即含有单位剂量、或者多个单位剂量或者亚单位剂量的离散份额的形式。
剂量本领域熟练的技术人员不需要进行过量试验即可轻易确定本发明组合物给药至受试者的适当剂量。一般地，医师将确定最适用于个体患者的实际剂量，并且这将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、新陈代谢稳定性和该化合物的作用时间、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速率、药物联用、具体症状的严重程度和经受治疗的个体。在此公开的剂量是一般情形的示例性剂量。毫无疑问可以存在较高或者较低剂量范围是有益的个体情形，这都在本发明范围之内。
取决于需要，所述试剂可以以0.01-30mg/kg体重的剂量给药，比如0.1-10mg/kg体重，更优选0.1-1mg/kg体重的计量给药。
在一个示例性实施方案中，将一个或多个10-150mg/天的剂量给药至患者。
联用在特别优选的实施方案中，将本发明一种或多种化合物与一种或多种其它药学活性剂进行联合给药。在上述情形中，本发明化合物可以与一种或者多种药学活性剂连续、同时或者顺序进行给药。
测定法本发明利用并且还包括测定法，其中所述测定法用于筛选可以调节大麻素受体的试剂，更优选可以调节外周大麻素受体的试剂。下面对所述方法的细节进行说明。
因此，本发明的另一方面涉及式Ia化合物或者其药学上可接受的盐在测定法中用于鉴定其它能够调节大麻素受体活性的化合物的用途。优选所述测定法为竞争性结合测定法。
在上述测定法中，一种或者多种适当的靶(比如氨基酸序列和/或核苷酸序列)可以用来鉴定能够调节外周大麻素受体的试剂。用于上述测试的靶可以游离于溶液中、附着在固体载体上、结合细胞表面上或者定位于细胞内。可以测定靶活性的消除或者靶和进行试验的试剂之间结合配合物的形成。
本发明测定法可以是筛选法，由此测试了多种试剂。在本发明一方面，本发明的测定方法为高通量筛选(high through put screen)。
药物筛选的技术可以以公开于1984年9月13日的Geysen的欧洲专利申请84/03564中所述的方法为基础。概括而言，将许多不同的小肽试验化合物(small peptide compound)合成在固体基质上，比如塑料销(plastic pin)或者一些其它表面。使肽试验化合物与其适宜的靶或者片段反应，并且对其进行洗涤。然后监测结合的实体，比如通过本领域熟知的适当改造的方法进行检测。还可以将纯化的靶直接包衣到用于药物筛选工艺中的板上。另外，非中和抗体可以用于俘获肽并且将其固定在固体载体上。
本发明还包括应用竞争性药物筛选测定法，其中能够结合靶的中和抗体与用于结合靶的测试化合物特定地进行竞争。
另一筛选工艺提供了对所述物质具有适宜结合亲合力的试剂的高通量筛选(HTS)，并且该方法基于详述于WO-A-84/03564中的方法。
可以预期，本发明的测定方法将适用于试验化合物的小规模和大规模筛选以及定量测定。
在优选的方面中，本发明测定法应用了在其表面上显示CB1受体的细胞。这些细胞可以从具有这种细胞的受试者中分离。然而，优选所述细胞通过转染细胞可以得到制备，从而使得转染时那些细胞在它们表面上显示CB1受体。
本发明的一方面涉及一种方法，该方法包括以下步骤(a)进行上文所述的测定方法(assay method)；(b)鉴定能够调节一种或多种大麻素受体的一种或多种候选化合物(candidate compound)；和(C)制备大量的所述一种或多种候选化合物。
本发明的另一方面提供一种方法，该方法包括以下步骤(a)进行上文所述的测定方法；(b)鉴定能够调节一种或多种大麻素受体的一种或多种候选化合物；和(C)制备包括所述一种或多种候选化合物的药物组合物。
本发明的另一方面提供一种方法，该方法包括以下步骤(a)进行上文所述的测定方法；(b)鉴定能够调节一种或多种大麻素受体的一种或多种候选化合物；和(C)对所述能够调节一种或多种大麻素受体的一种或多种候选化合物进行修饰；(d)进行上文所述的测定方法；
(e)任选制备包括所述一种或多种候选化合物的药物组合物。
本发明还涉及通过上文所述方法鉴定的候选化合物。
本发明的另一方面涉及包括通过上文所述方法鉴定的候选化合物的药物组合物。
本发明的另一方面涉及通过上文所述的方法鉴定的候选化合物的用途，用于制备用于治疗肌肉障碍和/或胃肠道病症的药物组合物。
上述方法可以用于筛选用作一种或多种大麻素受体调节剂的候选化合物，更优选所述大麻素受体为外周大麻素受体。
指示器多种指示器(reporter)可以用于本发明的测定方法(以及筛选)中，同时优选指示器提供合宜的可检测信号(例如，通过光谱学)。例如，报道基因可以编码催化反应的酶，这将改变其光吸收性能。
其它记录包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选法(fluorescent activated cell sorting，FACS)。甚至可以使用基于双位点单克隆的免疫测定法，所述测定法利用对两种非干扰抗原决定部位活性的单克隆抗体。在其它位置中，这些以及其它测定法描述于HamptonR et al的[1990，Serological Methods，A Laboratory Manual，APS Press，StPaulMN]和Maddox DE et al[1983，J Exp Med 1581211]中。
报道分子的实例包括但不限于半乳糖苷酶、转化酶、绿色荧光蛋白、萤光素酶、氯胺苯醇(chloramphenicol)、乙酰基转移酶、葡糖苷酸酶、外葡聚糖酶和葡糖淀粉酶。另外，可以将放射性同位素标记或者荧光标签标记的核苷酸包括在初生转录中，然后当其结合至低聚核苷酸探针时对其进行鉴定。
作为其它实例，许多公司(比如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH))都提供了用于测定过程的商用试剂盒和记录。适宜的报道分子或者标记包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光或者生色的试剂以及基质、辅因子、抑制剂和磁粉等等。教导应用上述标记的专利包括US-A-3817837；US-A-3850752；US-A-3939350；S-A-3996345；US-A-4277437；US-A-4275149和US-A-4366241。
CB1受体和CB2受体结合测定CB1受体结合测定和CB2受体结合测定的详细情况可以得自于Petrocellis et al的[2000 FEBS Letter48352-56]。来自于该文献的关于那些测定的相关信息描述于以下。也可以应用其它测定法。
通过将[3H]SR141716A(0.4nM，55Ci/mmol，Amersham)用作高亲合力配体，和在100uM PMSF存在下，对冰冻雄性CD鼠脑(Charles River Italia)的膜制剂(0.4mg/管)应用先前所述[12-14]的过滤方法，进行CB1受体的置换测定(displacement assay)。用1μM SR 14176A(获赠于Sanofi Recherche，France)计算特异性结合，其值为84.0％。得自于CD大鼠的脾用于制备膜(0.4mg/管)，从而通过使用如先前所述[14]的[3H]WIN55，212-2(0.8nM，50.8CI/mmol，NEN-Dupont)，并且还在100μM PMSF存在下进行CB2结合测定。用1μM HU-348(获赠于Prof.R.Mechoulam and Pharmos)计算特异性结合，其值为75.0％。在所有情形中，为了通过增加测试化合物的浓度置换结合放射性配体，通过将Cheng-prusoff方程应用到IC50值(由GraphPad获得)上，计算KI值。
宿主细胞用于本发明(比如用作调节剂或者用于表达调节剂)的多核苷酸可以被引入到宿主细胞中。
对于本发明而言，术语“宿主细胞”包括可以含有本发明调节剂的任何细胞。
在本文中可以将多核苷酸引入到原核细胞或者真核细胞中，比如酵母、昆虫或者哺乳动物细胞中。
本发明的多核苷酸可以利用本领域已知的多种技术引入到适宜的宿主细胞中，比如转染、转化和电穿孔法。例如，可以用重组病毒载体(比如反转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒)对其进行转化、直接注入核酸和进行基因枪转化(biolistic transformation)。
由此，本发明的另一方面提供了利用多核苷酸转化或者转染的宿主细胞，所述多核苷酸为本发明靶向或者表达本发明靶向。优选所述多核苷酸携带在用于复制和表达作为靶向或者意欲表达靶向的多核苷酸的载体中。
选择所述细胞以与所述载体相容，并且例如为原核细胞(例如细菌细胞)、真菌细胞、酵母细胞或者植物细胞。
革兰氏阴性菌大肠埃希氏杆菌广泛用作异源基因表达的宿主。然而，大量的异源蛋白质易于积聚在该细胞内。随后，从大量大肠埃希氏杆菌胞内蛋白中纯化期望的蛋白质有时会存在困难。
与大肠埃希氏杆菌相对比，杆菌属细菌由于它们具有向培养基中分泌蛋白质的能力，非常适宜用作异源宿主。其它适宜用作宿主的细菌为链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属细菌(Pseudomonas)。
取决于编码本发明多肽的多核苷酸的本性，和/或对其它表达的蛋白工艺的期望，可以优选使用真核宿主(比如酵母或者其他真菌)。通常，与真菌细胞相比，更优选使用酵母细胞，因为它们更易于操作。然而，一些蛋白质要么在酵母细胞中分泌极少，要么在某些情形中没有正确地得到处理(例如，对酵母进行高糖基化)。在这些情形中，应当选择不同的真菌宿主有机体。
在本发明范围内的适宜的表达宿主的实例为真菌，比如曲霉种(Aspergillus species)(比如描述在EP-A-0184438和EP-A-0284603中的那些曲霉种)和木霉种(Trichoderma species)；细菌，比如杆菌种(Bacillus species)(比如描述在EP-A-0134048和EP-A-0253455中的那些杆菌)、链霉菌种和假单胞菌种；和酵母，比如克鲁维氏酵母种(Kluyveromyces species)(比如描述在EP-A-0096430和EP-A-0301670中的那些克鲁维氏酵母种)和酵母种(Saccharomyces species)。例如，一般的表达宿主可以选自黑曲霉(Aspergillusniger)、黑曲霉塔宾变种(Aspergillus niger var.tubigenis)、黑曲霉泡盛变种(Aspergillus niger var.awamori)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatis)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus orvzae)、木霉reesei(Trichodermareesei)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
广泛修饰的多肽可能需要适当进行处理以完全实现它们的功能。在那些情形中，需要哺乳动物细胞表达系统(比如HEK-293，CHO，HeLA)，并且所述多肽要么胞内被表达在细胞膜上，要么如果具有适当前导序列时分泌在培养基中。
为了使本发明重组表达产物具有最佳生物活性，可能会根据需要对翻译后修饰(比如豆蔻酰化、糖基化作用、切断、投石(lapidation)和酪氨酸、丝氨酸或者苏氨酸磷酸化作用)应用适宜的宿主细胞(比如酵母、真菌、植物和哺乳动物宿主细胞)。
有机体关于本发明的术语“有机体”包括任何可以含有根据本发明的靶向和/或由此得到的产品的有机体。有机体的实例可以包括真菌、酵母或者植物。
关于本发明的术语“转基因有机体”包括任何含有根据本发明的靶向和/或由此得到的产品的有机体。
宿主细胞/宿主有机体的转化如先前所述，宿主有机体可以为原核或者真核有机体。适宜的原核宿主的实例包括大肠埃希氏杆菌(E.Coli)和枯草芽孢杆菌。在现有技术中已经充分公开了原核宿主转化的教导，例如，参见Sambrook et al的[MolecularCloningA Laboratory Manual，2ndEdition，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press]和Ausubel et al，[Current Protocols in MolecularBiology(1995)，John Wiley & Sons，Inc]。
如果在此使用原核宿主，那么在转化之前可能需要对核苷酸序列进行适当修饰，比如除去内含子。
在另一个实施方案中，所述转基因有机体可以为酵母。就此而言，酵母还广泛用作异源基因表达的载体。人类酿酒酵母具有悠久的工业应用，包括其用于异源基因表达的应用。酿酒酵母中的异源基因的表达已经由Goodey et al[1987，Yeast Biotechnology，D R Berry et al，eds，pp 401-429，Allenand Unwin，London]和King et al[1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts，E F Walton and G T Yarronton，eds，pp 107-133，Blackie，Glasgow]进行了综述。
基于数个理由，酿酒酵母非常适用于异源基因表达。首先，它对于人类无致病力和它不能形成某些内毒素。第二，在为多种目的进行数个世纪商业开发后，它的安全应用历史长。这使得它具有广泛的公众接受性。第三，广泛的商业应用和致力于此有机体的研究形成了关于酿酒酵母的遗传学和生理学以及大规模发酵特性的大量知识。
酿酒酵母中异源基因表达的原理和基因产物分泌的原理综述由EHinchcliffe E Kenny[1993，″Yeast as a vehicle for the expression of heterologousgenes″，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2ndEdition，Academic Press Ltd.]给出。
可获得数种类型的酵母载体，包括整合载体，其需要与用于它们运转的宿主基因组和自主复制质粒载体再结合。
为了制备转基因酵母属，通过将本发明核苷酸序列插入到为在酵母中表达而设计的结构中，从制备表达结构(expression construct)。已经开发了数种用于异源表达的结构。所述结构含有对融合至本发明核苷酸序列的酵母有活性的启动子，通常使用酵母源的启动子，比如GAL1启动子。通常使用酵母源的信号序列，比如编码SUC2信号肽的序列。对酵母活性的终止子结束表达系统。
为了转化酵母，已经开发了数个转化草案。例如，根据本发明的转基因酵母属可以根据以下Hinnen et al[1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA 75，1929]；Beggs，J D[1978，Nature，London，275，104]；和Ito，H et al[1983，J Bacteriology 153，163-168]所述教导进行制备。
通过使用多种选择性标记物(marker)对转化酵母细胞进行选择。用于转化的标记物为营养缺陷型标记物(比如LEU2、HIS4和TRP1)和显性抗生素耐性标记物(asaminoglycoside antibiotic markers)(比如氨基糖苷抗生素标记物，例如G418)。
另一种宿主有机体为植物。构建基因修饰植物的基本原理是将遗传信息插入到植物基因组中，从而获得插入遗传物质的稳定保持。对于插入遗传信息存在数种工艺，其中两个主要原理是直接引入遗传信息和通过载体系统引入遗传信息。常规工艺的综述公开于Potrykus的论文[Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol 42205-225]和Christou[Agro-FoodIndustryHi-Tech March/April 1994 17-27]中。对于植物转化作用的其它教导可以发现于EP-A-0449375中。
适用于本发明核苷酸序列的其它宿主包括高级真核细胞(比如昆虫细胞或者脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞，包括人类细胞)或者来自于其它多细胞有机体的有核细胞。近年来，培养物(组织培养物)中的脊椎动物细胞的繁殖已经成为了一种常用方法。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括上皮细胞系或者成纤维细胞细胞系(fibroblastic cell lines)，比如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH 3T3细胞、HeLa细胞或者293T细胞。
本发明核苷酸序列可以利用本领域熟知的方法稳定地结合入宿主细胞中或者可以得到瞬时表达。例如，稳定转染的哺乳动物细胞可以通过以下方法得到制备用具有可选标记基因的表达载体转染细胞，和在细胞表达标记基因的选择性条件下培养转染细胞。为了制备瞬时转染子，用报道基因对哺乳动物细胞进行转染，从而监控转染率。
为了形成上述稳定或者瞬间转染的细胞，所述细胞应当用充分量的本发明核苷酸序列进行转染。本发明核苷酸序列的精确量可以针对特定的细胞核测定法凭经验进行确定和优化。
由此，本发明还提供了用核苷酸序列转化宿主细胞的方法，所述核苷酸为本发明靶向或者表达本发明靶向。可以在适于编码蛋白表达的条件下培养利用核苷酸序列转化的宿主细胞。由重组细胞产生的蛋白质可以显示在细胞表面上。如果需要并且正如本领域熟练技术人员将理解的，含有编码序列的表达载体可以利用信号序列进行设计，所述信号序列将所述编码序列直接分泌经过特定的原核或者真核细胞膜。其它重组细胞构造可以将编码序列结合至编码多肽域的核苷酸序列上，这将有利于可溶性蛋白质的纯化[Kroll DJ et al(1993)DNA Cell Biol 12441-53]。
本发明通过实施例并参考附图进行了进一步描述，其中

图1表示大鼠输精管的收缩抑制作用。更具体而言，在此测定中化合物(16)的IC50为约0.1nm。在相同测定中，R(+)WIN55，212显示出在CB1的IC50为约5nm，这与其熟知的结合亲合力一致。该测定表明了激动剂可能性以及化合物(16)的作用被CB1-拮抗剂SR141716A中和。
图2显示了野生型小鼠的胃肠运动不足(hypomotility)。
图3显示了野生型小鼠的低温症。在注射载体(乙醇，克列莫佛(cremophor)，PBS(1∶1∶18))、化合物(16)或者CNS-渗透剂CB1激动剂R(+)Win55，212前后，对活化室内的27cm2开放区域内的温度和5分钟运动性进行评估[Brooks et al2002]。后一种化合物诱发了典型的拟大麻素(cannabinmimetic)作用，然而，化合物(16)在1mg/kg(以上)并且甚至在20mg/kg i.v.时都是非活性的。
图4表示对CREAE小鼠痉挛状态的测定。通过在第0天与第7天将鼠脊髓匀桨注射入弗氏完全佐剂中而诱发的慢性EAE的发展，从而产生痉挛状态。这种状态在多型ABH.Cnr1+/+小鼠中在60～80天诱导后产生，在CB1受体基因(Cnr1-无效的ABH.Cnr1-/-小鼠中在诱导后30～40天产生。在用腹膜内注射的全CB1/CB2激动剂CP55，940或全CB1/CB2/“CB3”激动剂或者通过静脉内注射载体(乙醇∶克列莫佛∶PBS(1∶1∶18))中的化合物(16)进行处理前后，通过测定下肢完全弯曲对应变仪的阻力，来评价痉挛状态[Baker et al2000]。
所述结果表示在给药10分钟后根据基线的±SEM变化的百分比(在每组中n＜10～12)。对原始数据进行统计分析，并且根据基线水平(***P＜0.001)进行成对分析。在缺乏CB1的小鼠中CNS渗透激动剂(CNS-penetrant agonists)的抗痉挛作用消失，这表明CB2/“CB3”并非抗痉挛活性的靶。单独的载体是惰性的[Baker et al2000]。在野生型小鼠中化合物(16)显示出显著的抗痉挛活性，并且当只在PBS中给药时是活性的(未显示)。
实施例使用制备C-18柱(Hypersil PEP 100×21mm内径，5μm粒径和100A孔径)和在20分钟时间内使用等梯度，通过反相HPLC(Gilson)纯化化合物。
N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-3-碘苯甲酰胺(1) 在氮气气氛下，向3-碘苯甲酸(10.02g，40.30mmol)的无水二氯甲烷(180mL)室温溶液中加入EDCI(7.72g，40.30mmol)，随后加入三乙胺(8.0ml，60.45mmol)，将上述混合物在室温下再搅拌5分钟。然后，向其中加入DL丙氨醇(3.02g，40.3mmol)，该混合物在室温下搅拌16小时。上述反应混合物用饱和盐水和饱和碳酸氢钠的混合物(1∶1；2×150mL)洗涤，随后再用饱和盐水溶液(100mL)洗涤。有机物分离后，用硫酸镁干燥，并在真空下溶剂蒸发除取溶剂。所得残余物通过硅胶快速色谱法纯化(DCM:MeOH，1％～8％甲醇梯度)，得到为灰白色固体的化合物1(4.14g，13.6mmol，产率34％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.41(3H，d，J 6.8Hz)，3.70(1H，dd，J15.5，J210.9Hz)，3.80(1H，dd，J12.9，J210.9Hz)，4.38(1H，m)，6.46(1H，m)，7.27(2H，t，J 7.8Hz)，7.93(1H，d，J 7.88Hz)，8.21(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；17.49(CH3)，48.53(CH2)，67.19(CH2)，94.59(C)，126.79(CH)，129.58(CH)，130.62(CH)，136.37(CH)，136.83(C)，166.71(C)。
C10H11NO2I·1/2H2O计算值C 38.23％，H 3.85％，N 4.46％；实测值C38.95％，H 3.80％，N 4.08％[Drug Design and Discovery 2000，281-294]。
Sonogashira偶联反应的一般方法方法A[Tetrahedron 2000，56，4777-4792]将二(三苯基膦)氯化钯(II)(3.5％mol)、碘化铜(I)(8％mol)和三乙胺(4mmol)加入到N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-3-碘苯甲酰胺(1)(1mmol)的DMF(5mL)溶液中。在室温下，上述混合物在氮气气氛下搅拌1小时。向其中加入炔烃(1mmol)，反应混合物在60℃下搅拌2小时。反应混合物真空浓缩，所得残余物通过硅胶短柱快速色谱法纯化(DCM:MeOH，1％～4％甲醇梯度)纯化，得到所需的化合物。
N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-3-(5-羟基-戊-1-炔基)-苯甲酰胺(2) 使用方法A合成指定化合物(2)，使4-戊基-1-醇与化合物(1)(0.50g，1.64mmol)偶联，得到N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-3-(5-羟基-戊-1-炔基)-苯甲酰胺(2)(0.314g，1.20mmol；73％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.19(3H，d，J 6.8Hz)，1.68-1.81(3H，m)，2.45(2H，t，J 6.9Hz)，3.04-3.17(1H，m)，3.39-3.74(5H，m)，4.12-4.23(1H，m)，6.52(1H，d，J7.2Hz)，7.22(1H，dd，J16.3，J211.67Hz)，7.39(1H，d，J 7.7Hz)，7.60(1H，d，J7.8Hz)，7.68(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；16.30(CH3)，17.440(CH3)，31.66(CH2)，48.49(CH2)，61.92(CH2)，67.00(CH2)，80.64(C)，91.03(C)，124.66(C)，126.79(CH)，128.93(CH)，130.32(CH)，134.74(CH)，134.90(C)，167.79(C)。
MS(ES)m/z 262(M+H)。
3-庚-1-炔基-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(3) 使用方法A合成指定化合物(3)，使1-庚炔与化合物(1)偶联，获得为无色油的化合物(3)(0.236g，0.80mmol；95％)。
δ(1H)(CDCl3)；0.89(3H，t，J 6.8Hz)，1.22(3H，d，J 6.8Hz)，1.29-1.41(4H，m)，1.53-1.60(2H，m)，2.36(2H，t，J 7.1Hz)，2.81(2H，m)，2.89(1H，m)，4.15-4.19(1H，m)，6.67(1H，d，J 7.3Hz)，7.24(1H，t，J 7.7Hz)，7.44(1H，d，J7.7Hz)，7.63(1H，d，J 7.8Hz)，7.73(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；14.31(CH3)，17.40(CH3)，19.71(CH2)，22.57(CH2)，28.73(CH2)，31.49(CH2)，48.44(CH)，66.79(CH2)，67.00(CH2)，80.13(C)，92.04(C)，124.97(C)，126.53(CH)，128.90(CH)，130.33(CH)，132.45(CH)，134.95(C)，167,80(C)。
MS(ES)m/z 274(M+H)。
3-(5-氰基-戊-1-炔基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)苯甲酰胺(7) 使用方法A合成指定化合物(7)，使己-5-炔腈(119mg，1.28mmol)与化合物(1)(0.300g，0.983mmol)偶联，纯化后得到0.124g 3-(5-氰基-戊-1-炔基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)苯甲酰胺(7)，产率为46.6％。
δ(1H)(CDCl3)；1.29(3H，d，J 6.8Hz)，1.97(2H，m)，2.55-2.64(4H，m)，3.67(1H，m)，3.78(1H，m)，4.28(1H，m)，6.41(1H，m)，7.36(1H，t，J 7.8Hz)，7.51(1H，d，J 7.8Hz)，7.72(1H，d，J 7.8Hz)，7.80(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；16.68(CH2)，17.50(CH3)，18.94(CH2)，24.87(CH2)，48.52(CH)，67.22(CH2)，81.95(C)，88.5(C)，119.55(C)，124.13(C)，127.07(CH)，129.06(CH)，130.45(CH)，134.80(CH)，135.00(C)，167.61(C)。
MS(ES)m/z 271(M+H)。
方法B[J.Org.Chem.1999，64，4777-4792；J.Med.Chem.1998，41，420-427]将四(三苯基膦)钯(0)(2％mol)和碘化酮(I)(7％mol)加入到圆底烧瓶中的吡咯烷(15mL)中，在氮气气氛下将其在室温下搅拌5分钟。向上述溶液中加入N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-3-碘苯甲酰胺(1mmol)，在室温下再将其搅拌15分钟。向其中加入炔烃(1mmol)，反应混合物在60℃下搅拌3小时。所得反应混合物真空浓缩，残余物用DOWEX50 WX80(原料的10倍重量)处理；DOWEX50 WX80用乙腈(3×20mL)洗涤，然后将其悬浮在乙腈/水(3/1)混合物中。所得残余物溶于乙腈/水(1∶1，20mL)中，然后将其加入树脂悬浮液中振荡20分钟。滤出树脂，用乙腈/水(3/1)洗涤，并且在真空下将溶剂从滤液中除去。所得残余物通过短柱硅胶快速色谱法纯化(DCM:MeOH:AcOH，1％～8％乙酸梯度，其中含有1％乙酸)，得到所需的化合物。
方法B1在甲醇而非乙腈/水(3/1)存在下用DOWEX50WX80对原料进行处理。
6-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)苯基]-己-5-炔酸(4) 使用方法B，使碘苯甲酰胺(1)(2.00g，6.5mmol)与5-己炔酸偶联，得到产品(4)(1.87g，6.42mmol；产率99％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.49(3H，d，J 6.8Hz)，2.14(2H，t，J 7.2Hz)，2.67-2.76(4H，m)，3.83-3.90(2H，m)，4.39-4.45(1H，m)，7.64(1H，t，J 7.7Hz)，7.76(1H，d，J7.7Hz)，7.99(1H，d，J 7.8Hz)，8.10(1H，s)。
δ(13C)(CD3OD)；17.47(CH2)，19.99(CH3)，36.25(CH2)，66.54(CH2)，81.82(C)，91.53(C)，126.03(C)，128.05(CH)，129.99(CH)，131.75(CH)，135.69(CH)，136.58(C)，168.538(C)。
MS(CI)m/z 290(M+H)。
6-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)-苯基]-己-5-炔酸甲酯(20) 如果在后处理(work-up)中使用方法B1，则得到6-[3-9(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)-苯基-己-5-炔酸甲酯(20)，而非酸(4)。将化合物(1)(0.100g，0.32mmol)与5-己炔酸(5-hexynoic acid)(0.091g，0.276mmol)偶联，得到化合物(20)(0.091g，0.27mmol，产率85％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.31(3H，d，J 6.8Hz)，1.96(2H，t，J 7.2Hz)，2.03(3H，s)，2.39-2.59(4H，m)，3.61-3.72(2H，m)，4.19-4.27(1H，m)，7.46(1H，t，J 7.7Hz)，7.48(1H，d，J 7.6Hz)，7.94(1H，d，J 7.8Hz)，8.05(1H，s)。
5-3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)苯基]-己-4-炔酸(5) 使用方法B，使碘苯甲酰胺(1)(2.00g，6.5mmol)与5-己炔酸偶联，得到化合物(4)(1.87g，6.42mmol；产率99％)。
δ(1H)(CD3OD)；1.40(3H，d，J 6.8Hz)，2.70-2.824(2H，m)，2.87-2.89(2H，m)，3.74-3.77(2H，m)，4.30-4.36(1H，m)，7.54(1H，t，J 7.7Hz)，7.6(1H，d，J 7.6Hz)，7.91(1H，d，J 7.8Hz)，7.99(1H，s)。
δ(13C)(CD3OD)；16.21(CH2)，17.03(CH3)，34.94(CH2)，66.08(CH2)，81.05(C)，90.53(C)，125.46(C)，127.70(CH)，129.56(CH)，131.39(CH)，135.27(CH)，136.19(C)，169.28(C)，175.80(C)。
7-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)苯基]-己-6-炔酸(6) 使用方法B，使碘苯甲酰胺(1)(0.50g，1.64mmol)与6-庚炔酸(0.212g，1.64mmol)偶联，得到7-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)苯基]-己-6-炔酸(6)(0.487g，1.60mmol；产率98％)。
δ(1H)(CD3OD)；1.22(3H，d，J 6.8Hz)，1.44-1.68(2H，m)，1.73-1.80(2H，m)，2.30-2.46(2H，m)，3.54-3.63(2H，m)，4.12-4.39(1H，m)，7.36(1H，t，J7.7Hz)，7.49(1H，d，J 7.7Hz)，7.72(1H，d，J 7.8Hz)，7.82(1H，s)。
δ(13C)(CD3OD)；17.06(CH3)，19.70(CH2)，25.39(CH2)，29.23(CH2)，49.16(CH2)，66.14(CH2)，81.16(C)，91.55(C)，125.75(C)，127.53(CH)，129.54(CH)，131.32(CH)，135.24(CH)，136.20(C)，169.34(C)。
3-(5-羧基-戊-1-炔基)-苯甲酸乙酯(14) 使用方法B，使碘苯甲酰胺(1)(1.50g，5.4mmol)与5-己炔酸偶联，得到3-(5-羧基-戊-1-炔基)-苯甲酸乙酯(14)(0.903g，3.4mmol；产率64％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.39(3H，d，J 7.1Hz)，1.83-1.99(2H，m)，2.44-2.59(4H，m)，4.37(2H，q，J 7.1Hz)，7.35(1H，t，J 7.8Hz)，7.58(1H，d，J 7.6Hz)，7.82(1H，d，J7.8Hz)，7.92(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；14.28(CH3)，18.79(CH2)，23.59(CH2)，61.13(CH2)，80.72(C)，89.67(C)，124.07(C)，128.28(CH)，128.72(CH)，130.69(C)，132.22(CH)，135.65(CH)，166.03(C)。
酰胺的合成方法C在氮气气氛下，向炔酸(1mmol)的无水THF(6mL)溶液中加入三乙胺(2mmol)，冷却至-10℃。向上述反应混合物中加入氯甲酸乙酯(1mmol)，然后在-10℃下再将其搅拌15分钟。同时准备胺类盐酸化物(3mmol)、水(0.88mL)、三乙胺(0.63mL，6mmol)和THF(1.76mL)溶液，将其滴加至上述反应混合物中。在1.5小时内，使上述反应升温至5℃，然后在室温下再搅拌30分钟。上述混合物倒入饱和盐水和饱和碳酸氢钠的1∶1混合物(50mL)中，用DCM(5×50mL)萃取。有机层真空蒸发后，所得残余物用硅胶短色谱法纯化(DCM:MeOH，1％～10％甲醇梯度)，得到所需的化合物。
3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)苯甲酰胺8) 使用方法C，使6-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)苯基]-己-5-炔酸(4)(0.109g，0.377mmol)与盐酸二甲胺反应，得到化合物(8)(0.115g，0.363mmol；产率96％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.29(3H，d，J 6.8Hz)，1.81-1.94(2H，m)，2.37-2.47(4H，m)，2.91(3H，s)，3.00(3H，s)，3.38-3.64(2H，m)，4.19-4.43(1H，m)，6.78(1H，d，J7.2Hz)，7.29(1H，t，J 7.7Hz)，7.42(1H，d，J 7.7Hz)，7.68(1H，d，J 7.8Hz)，7.75(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；17.42(CH3)，19.36(CH2)，24.45(CH2)，32.30(CH2)，35.83(CH3)，37.67(CH3)，48.51(CH)，66.90(CH2)，80.91(C)，90.92(C)，124.60(C)，126.85(CH)，128.85(CH)，130.39(CH)，134.58(CH)，135.13(C)，167.63(C)，172.87(C)。
MS(ES)m/z 317(M+H)。
3-(4-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)苯甲酰胺(9) 使用方法C，使5-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)苯基]-己-4-炔酸(5)(0.100g，0.36mmol)与盐酸二甲胺反应，得到化合物(9)(0.084g，0.28mmol；产率77％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.26(3H，d，J 6.8Hz)，2.58-2.75(4H，m)，2.91(3H，s)，3.01(3H，s)，3.40-3.77(2H，m)，4.19-4.43(1H，m)，6.72(1H，d，J 7.1Hz)，7.29(1H，t，J 7.8Hz)，7.44(1H，d，J 7.7Hz)，7.67(1H，d，J 7.8Hz)，7.96(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；15.39(CH2)，16.98(CH3)，32.43(CH2)，35.49(CH3)，37.15(CH3)，48.13(CH)，66.64(CH2)，80.14(C)，90.19(C)，123.99(C)，126.60(CH)，128.43(CH)，129.95(CH)，134.19(CH)，134.75(C)，167.26(C)，171.14(C)。
3-(6-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)苯甲酰胺(10)
使用方法C，使7-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)苯基]-己-6-炔酸(6)(0.100g，0.32mmol)与盐酸二甲胺反应，得到化合物(10)(0.091g，276mmol；产率85％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.26(3H，d，J 6.8Hz)，1.59-1.80(4H，m)，2.31-2.43(4H，m)，2.91(3H，s)，2.98(3H，s)，3.60(1H，dd，J111.1Hz，J215.3Hz)，3.74(1H，dd，J111.1Hz，J213.5Hz)，6.85(1H，d，J 7.2Hz)，7.27(1H，t，J 7.7Hz)，7.43(1H，d，J7.7Hz)，7.69(1H，d，J 7.8Hz)，7.76(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；16.99(CH3)，19.15(CH2)，24.30(CH2)，28.19(CH2)，32.45(CH2)，35.46(CH3)，37.33(CH3)，48.12(CH)，66.50(CH2)，80.37(C)，90.85(C)，124.26(C)，126.55(CH)，128.44(CH)，129.98(CH)，134.06(CH)，134.74(C)，167.24(C)，172.98(C)。
3-(5-甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)苯甲酰胺(22) 使用方法C，使6-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)苯基]-己-5-炔酸(4)(0.400g，1.37mmol)与盐酸甲胺(0.609g)反应，得到3-(5-甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)苯甲酰胺(22)(0.221g，0.724mmol；产率53％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.29(3H，d，J 6.8Hz)，1.88-1.97(2H，m)，2.33-2.44(4H，m)，2.79(3H，s)，2.81(3H，s)，3.65(2H，dd，J15.6，J211.1Hz)，3.79(2H，dd，J13.6，J211.1Hz)，4.23-4.31(1H，m)，5.93(1H，bs)，6.55(1H，d，J 7.3Hz)，7.33(1H，t，J7.7Hz)，7.7(1H，d，J 7.7Hz)，7.69(1H，d，J 7.7Hz)，7.77(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；17.44(CH3)，19.29(CH2)，26.70(CH3)，35.58(CH2)，48.57(CH)，67.20(CH2)，80.91(C)，90.69(C)，124.60(C)，126.81(CH)，128.95(CH)，130.41(CH)，134.68(CH)，134.98(C)，167.63(C)，173.47(C)。
3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-炔基)苯甲酸乙酯(23) 使用方法C，使3-(5-羧基-戊-1-炔基)-苯甲酸乙酯(4)(0.900g，3.4mmol)与盐酸二甲胺反应，得到3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-炔基)-苯甲酸乙酯(23)(0.873g，3.04mmol；产率89％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.39(3H，d，J 7.1Hz)，1.87-2.00(2H，m)，2.43-2.54(4H，m)，2.95(3H，s)，3.03(3H，s)，4.37(2H，q，J 7.1Hz)，7.32(1H，t，J 7.8Hz)，7.55(1H，d，J 7.6Hz)，7.92(1H，d，J 7.8Hz)，8.04(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；14.28(CH3)，18.97(CH2)，24.01(CH2)，31.87(CH2)，35.39(CH3)，37.20(CH3)，61.10(CH2)，80.39(C)，90.60(C)，124.26(C)，128.27(CH)，128.60(CH)，130.69(C)，132.62(CH)，135.58(CH)，166.0(C)，172.26(C)。
3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-苯甲酸(24) 用1M氢氧化钠溶液(6mL)处理3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-炔基)苯甲酸乙酯(0.800g，2.78mmol)过夜。向上述反应混合物中加入7mL 1M HCI溶液，真空除去溶剂。所得残余物用乙酸乙酯研磨，得到为灰白色粉末的3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-苯甲酸(24)(0.590g，2.05mmol；产率74％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.85-2.00(2H，m)，2.48-2.58(4H，m)，2.93(3H，s)，3.08(3H，s)，7.40(1H，t，J 7.8Hz)，7.58(1H，d，J 7.6Hz)，7.91(1H，d，J 7.8Hz)，7.97(1H，s)。
N-环丙基-3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)苯甲酰胺(25) 在室温和氮气气氛下，向3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-苯甲酸(0.100g，0.38mmol)的无水二氯甲烷(1.5mL)溶液中加入EDCI(0.0728g，0.38mmol)，随后向其中加入三乙胺(0.162mL，1.14mmol)，上述混合物在室温下再搅拌5分钟。然后向其中加入环丙胺(0.027g，0.38mmol)，混合物在室温下搅拌16小时。上述反应混合物用饱和盐水和饱和碳酸氢钠的混合物(1∶1；2×150mL)洗涤，随后用饱和盐水溶液(100mL)洗涤。分离有机层，用硫酸镁干燥，真空蒸发除去溶剂。所得残余物通过硅胶快速色谱法纯化(DCM:MeOH，95％至5％甲醇梯度)，得到N-环丙基-3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)苯甲酰胺(25)(0.10g，0.34mmol，产率91％)。
δ(1H)(CDCl3)；0.59-0.64(2H，m)，0.83-0.90(2H，m)，1.90-2.00(2H，m)，2.49-2.53(4H，m)，2.87-2.93(1H，m)，2.95(3H，s)，3.03(3H，s)，6.25(1H，bs)，733(1H，t，J 7.8Hz)，7.44-7.49(1H，m)，7.63-7.72(1H，m)，7.84(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；6.76(CH2)，18.98(CH2)，23.16(CH)，24.02(CH2)，31.87(CH2)，35.39(CH3)，37.22(CH3)，80.39(C)，90.75(C)，124.38(C)，126.13(CH)，128.40(CH)，128.53(C)，129.84(CH)，134.25(CH)。
3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-N-(2-氟-乙基)苯甲酰胺(26)
在室温和氮气气氛下，向3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-苯甲酸(0.100g，0.38mmol)的无水二氯甲烷(1.5mL)溶液中加入EDCI(0.0728g，0.38mmol)，随后向其中加入三乙胺(0.162mL，1.14mmol)，上述混合物在室温下再搅拌5分钟。然后向其中加入2-氟乙胺(0.189g，1.9mmol)，混合物在室温下搅拌16小时。上述反应混合物用饱和盐水和饱和碳酸氢钠的混合物(1∶1；2×150mL)洗涤，随后用饱和盐水溶液(100mL)洗涤。分离有机层，用硫酸镁干燥，并且真空蒸发除去溶剂。所得残余物通过硅胶快速色谱法纯化(DCM:MeOH，95％至5％甲醇梯度)，得到3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-N-(2-氟-乙基)苯甲酰胺(26)(0.103g，0.34mmol，产率91％)。
δ(1H)(CDCl3)；1.83-2.00(2H，m)，2.48-2.52(4H，m)，2.94(3H，s)，3.02(3H，s)，3.68-3.72(1H，m)，3.73-3.82(1H，m)，4.50(3H，t，J 4.8Hz)，4.66(3H，t，J 4.8Hz)，6.69(1H，bs)，7.34(1H，t，J 7.7Hz)，7.44-7.46(1H，m)，7.62-7.68(1H，m)，7.93(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；18.97(CH2)，24.01(CH2)，31.87(CH2)，35.40(CH3)，37.23(CH3)，40.35(CH2)，40.62(CH2)，80.37(C)，81.57(CH2)，81.57(CH2)，90.75(C)，124.48(C)，126.24(CH)，128.40(CH)，130.05(CH)，131.94(CH2)，134.45(C)，167.04(C)，172.30(C)。
Lindlar氢化的一般方法方法D将喹啉(143μL，1.3mmol)、硫酸钡上的还原钯(palladium on bariumsulphate reduced)(5％)(143mg)和炔(1mmol)合并在甲醇(14mL)中，在常压氢气下搅拌至原料1HNMR显示完全还原。通过硅藻土垫过滤除去催化剂，硅藻土垫用甲醇洗涤几次。真空除去滤液，产品通过制备HPLC纯化。
方法E
将喹啉(25μL，0.21mmol)、硫酸钡上的还原钯(5％)(360mg)和炔(1mmol)合并在甲醇(15mL)中，在常压氢气下搅拌至原料1HNMR显示完全还原。通过硅藻土垫过滤除去催化剂，硅藻土垫用甲醇洗涤几次。真空除去滤液，产品通过制备HPLC纯化。
3-庚-1-烯基-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(11) 应用方法D氢化炔3(0.050g，0.18mmol)，得到两种产品，它们通过制备反相用HPLC色谱法纯化(55％乙腈/45％水，在等梯度程序下进行20分钟)得到分离，即为化合物11(12mg)和得到完全还原的化合物3-庚基-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(12)(7mg)。
δ(1H)(CDCl3)；0.88(3H，t，J 7.0Hz)，1.30(3H，d，J 6.8Hz)，1.33-1.52(4H，m)，2.26-2.34(2H，m)，3.66-3.81(2H，m)，4.25-4.35(1H，m)，5.69-5.78(1H，m)，6.22(1H，bs)，6.43(1H，d，J 11.7Hz)，7.26(1H，s)，7.36(1H，d，J 7.5Hz)，7.55-7.65(1H，m)，7.71(1H，s)。
3-庚基-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(12) δ(1H)(CDCl3)；0.808(3H，t，J 6.6Hz)，1.21(3H，d，J 6.8Hz)，1.24(4H，m)，1.52-1.57(2H，m)，2.53-2.58(2H，m)，3.56(1H，dd，J15.7，J210.9Hz)，3.69(1H，dd，J13.6，J210.9Hz)，4.15-4.23(1H，m)，6.22(1H，bd，J 5.6Hz)，7.25(2H，d，J7.7Hz)，7.50(1H，m)，7.70(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；14.24(CH3)，17.52(CH3)，23.01(CH2)，29.50(CH2)，29.63(CH2)，31.77(CH2)，32.15(CH2)，36.23(CH2)，48.57(CH)，67.49(CH2)，124.47(CH)，127.52(CH)，128.79(CH)，132.09(CH)，134.72(C)，134.72(C)，143.97(C)，168.78(C)。
MS(ES)m/z277(M+H)。
3-(5-氰基-戊-1-烯基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(15) 如方法E所述对炔7(0.030g，0.1mmol)进行氢化，得到3-(5-氰基-戊基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(15mg)，该化合物通过反相HPLC色谱法纯化(20％乙腈/80％水，进行等梯度程序20分钟)纯化。
δ(1H)(CDCl3)；1.29(d，J＝6.9Hz，3H)，1.82(m，2H)，2.38(t，J＝7.0Hz，2H)，2.48(m，2H)，2.78(m，1H)，3.65(m，1H)，3.79(m，1H)，4.29(m，1H)，5.65(m，1H)，6.38(m，1H)，6.56(d，J＝11.5Hz，1H)，7.34-7.44(m，2H)，7.64-7.68(m，2H)。
δ(13C)(CDCl3)；17.00(CH2)，17.45(CH3)，25.67(CH2)，27.50(CH2)，48.60(CH)，67.20(CH2)，120.00(C)，125.90(CH)，127.50(CH)，129.00(CH)，130.77(CH)，131.10(CH)，132.22(CH)，135.04(CH)，137.83(C)，168.4(C)。
MS(ES)m/z273(M+H)。
3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-烯基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(16) 通过应用方法E的Lindlar催化还原合成炔8(0.100g，0.3mmol)，得到化合物(16)和3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(13)的混合物，该混合物通过反相HPLC色谱法纯化(20％乙腈/80％水，等梯度程序进行20分钟)分离(16，34mg)。
δ(1H)(CDCl3)；1.31(3H，t，J 6.8Hz)，1.81-1.91(2H，m)，2.26-2.39(4H，m)，2.90(3H，s)；(3H，s)；3.65(2H，dd，J15.5，J211.2Hz)，3.83(2H，dd，J13.2，J211.2Hz)，4.27-4.30(1H，m)，5.68-5.77(1H，m)，6.46(1H，d，J 11.6Hz)，7.24-7.33(1H，m)，7.38(1H，d，J 7.6Hz)，7.74-7.79(2H，m).
δ(13C)(CDCl3)；16.93(CH3)，24.80(CH2)，28.22(CH2)，32.51(CH2)，35.73(CH)，37.45(CH)，48.32(CH2)，66.73(CH2)，126.20(CH)，126.35(CH)，128.58(CH)，129.12(CH)，131.88(CH)，132.63(CH)，134.70(C)，137.5(C)，168.00(C)，173.11(C)。
MS(ES)m/z319(M+H)。
3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(13) δ(1H)(CDCl3)；1.28-1.36(5H，m)，1.64(2H，m)，2.29(2H，t，J 7.3Hz)，2.63(2H，t，J 7.4Hz)，2.91(3H，s)，2.98(3H，s)，3.63(1H，m)，3.78(2H，m)，4.19-4.30(2H，m)，6.94(1H，m)，7.26-7.32(2H，m)，7.45-7.67(3H，m)。
δ(13C)(CDCl3)；17.43(CH3)，25.09(CH2)，28.81(CH2)，31.14(CH2)，33.52(CH2)，35.54(CH)，35.89(CH)，37.80(CH)，48.55(CH)，67.08(CH2)，125.05(CH)，127.50(CH)，128.81(CH)，132.00(CH)，134.93(C)，143.13(C)，168.70(C)，173.73(C)。
MS(ES)m/z321(M+H)。
3-(6-二甲基氨基甲酰基-己-1-烯基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(17)
通过应用方法D的Lindlar催化还原合成3-(6-二甲基氨基甲酰基-己-1-烯基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(17)(0.037g，0.11mmol)，得到化合物(17)和饱和化合物加上20％的反式异构体的混合物，通过制备HPLC分离，遗憾的是，顺式和反式异构体的分离并不非常成功，化合物17(15mg)含有部分反式异构体(10％反式)。
6-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)苯基]-己-5-烯酸甲酯(21) 通过利用方法D对炔20进行Lindlar催化还原，合成6-[3-(2-羟基-1-甲基-乙基氨基甲酰基)-苯基]-己-5-烯酸甲酯(21)(0.100g，1.7mmol)，得到化合物(21)和5％的反式异构体的混合物，对混合物没有分离。上述混合物以所得粗产物形式应用。
δ(1H)(CD3OD)；1.15(3H，t，J 6.7Hz)，1.52-1.71(2H，m)，2.19-2.29(4H，m)，3.47-3.56(2H，mz)，4.06-4.12(2H，m)，5.59-5.67(1H，m)，5.46(2H，bs)，5.62-5.68(1H，m)，6.39(1H，d，J 11.6Hz)，7.25-7.33(1H，m)，7.41(1H，d，J 8.0Hz)，7.52-7.61(2H，m)。
3-(5-氨基甲酰基-戊-1-烯基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(19)
将化合物21(0.030g，0.10mmol)溶于2mL 33％氨水溶液中，在室温下搅拌8小时。除去溶剂，产品通过反相HPLC色谱法纯化(18％乙腈/82％水，运行等梯度程序20分钟)，得到化合物19(7mg)。
δ(1H)(CDCl3)；1.22(3H，t，J 6.8.0Hz)，1.75-1.79(2H，m)，2.20-2.32(4H，m)，3.65(2H，dd，J15.8，J211.2Hz)，3.83(2H，dd，J12.9，J211.2Hz)，4.24-4.32(1H，m)，5.46(2H，bs)，5.62-5.68(1H，m)，6.39(1H，d，J 11.6Hz)，7.20-7.22(1H，m)，7.32(1H，d，J 7.6Hz)，7.68(1H，s)，7.74(1H，d，J 7.7Hz).
MS(CI)m/z 291(M+H)。
BER/Ni氢化的一般方法将聚合物负载的硼化氢(硼化氢承载在amberlite IRA-400上，2.5mmolBH4-/1g树脂)(BER)(0.750g)和醋酸镍四水合物(0.046g，1.9mmol)悬浮在7mL甲醇中，向该悬浮液中鼓泡通入氢气，直至在树脂上能够观察到黑色镍涂层为止，然后在氢气下将溶于7mL甲醇的炔(1mmol)加入到上述混合物中。上述混合物振荡9小时，然后过滤。用甲醇洗涤上述树脂数次，合并滤液随后真空蒸发。所得残余物溶于适当溶剂中，通过硅藻土过滤除去镍。所得产品通过制备反相HPLC色谱法纯化。
3-(4-二甲基氨基甲酰基-丁-1-烯基)-N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-苯甲酰胺(27) 利用BER/Ni催化剂氢化炔9(0.055g，0.18mmol)，得到40％化合物(27)、5％饱和化合物和55％原料。所得混合物通过反相HPLC色谱法纯化(20％乙腈/80％水，运行20分钟等梯度程序)分离，得到化合物(27)(15mg)。
δ(1H)(CDCl3)；1.30(3H，d，J 6.8Hz)，2.53-2.70(4H，m)，2.99(3H，s)，3.07(3H，s)，3.65-3.69(IH，m)，3.81-3.95(1H，m)，3.98-3.40(1H，m)，4.30-4.31(1H，m)，5.68-5.77(1H，m)，6.47(1H，d，J 11.6Hz)，7.29(1H，m)，7.37-7.46(1H，m)，7.85-7.95(1H，m)，8.22(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；16.84(CH3)，24.68(CH2)，32.59(CH2)，35.89(CH3)，37.96(CH3)，48.33(CH)，66.76(CH2)，125.67(CH)，126.90(CH)，128.71(CH)，130.03(CH)，131.15(CH)，131.88(CH)，134.46(C)，136.70(C)，167.23(C)，173.30(C)。
N-(2-羟基-1-甲基-乙基)-3-(5-甲基氨基甲酰基-戊-1-烯基)-苯甲酰胺(18) 利用BER/Ni催化剂氢化炔22(0.055g，0.16mmol)，得到化合物(18)45％和原料55％的混合物。所得混合物通过反相HPLC色谱法纯化(18％乙腈/82％水，运行等梯度程序20分钟)分离，得到化合物18(19mg)。
δ(1H)(CDCl3)；1.29(3H，t，J 6.8.0Hz)，1.88-1.97(2H，m)，2.35(2H，d，J7.4Hz)，2.47(1H，d，J 6.8Hz)，2.80(3H，d，J 4.8Hz)；3.65(2H，dd，J15.5，J211.0Hz)，3.79(2H，dd，J13.5，J211.2Hz)，4.23-4.31(1H，m)，5.73(1H，bs)，6.53(1H，bd，J 6.2Hz)，7.33(1H，t，J 7.7Hz)，7.45(1H，d，J 7.7Hz)，7.69(1H，d，J7.8Hz)，7.76(1H，s)。
δ(13C)(CDCl3)；17.07(CH3)，18.91(CH2)，24.44(CH2)，26.32(CH3)，35.19(CH2)，48.19(CH)，66.87(CH2)，1224.23(C)，126.41(CH)，128.57(CH)，129.99(CH)，134.31(CH)，134.59(C)，167.00(C)，178.00(C)。
3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-烯基)-N-(2-氟-乙基)-苯甲酰胺(28) 利用BER/Ni催化剂氢化3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)-N-(2-氟-乙基)苯甲酰胺(26)(0.040g，0.13mmol)，得到40％化合物(28)和55％原料。
上述混合物通过反相HPLC色谱法纯化(30％乙腈/70％水，运行20分钟等梯度程序)分离，得到3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-烯基)-N-(2-氟-乙基)-苯甲酰胺28(5mg)。
δ(1H)(CDCl3)；1.80-1.89(2H，m)，2.31-2.41(4H，m)，2.88(3H，s)，2.97(3H，s)，3.68-3.72(1H，m)，3.74(1H，dd，J15.4，J210.7Hz)，3.82(1H，dd，J15.4，J210.7Hz)，5.72-5.78(1H，m)，6.43(1H，d，J 11.7Hz)，7.31(1H，d，J 7.7Hz)，7.40(1H，t，J 7.7Hz)，7.81(1H，d，J 7.9Hz)，8.02(1H，s)。
N-环丙基-3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-烯基)-苯甲酰胺(29) 利用BER/Ni催化剂氢化3-(N-环丙基-3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-炔基)苯甲酰胺(25)(0.040g，0.13mmol)过夜，得到90％的化合物(28)和10％的原料。上述混合物通过反相HPLC色谱法纯化(30％乙腈/70％水，运行20分钟等梯度程序)分离，得到N-环丙基-3-(5-二甲基氨基甲酰基-戊-1-烯基)-苯甲酰胺28(10mg)。
δ(1H)(CDCl3)；0.64-0.69(2H，m)，0.78-0.84(2H，m)，1.78-1.83(2H，m)，2.28-2.36(4H，m)，2.88(3H，s)，2.89-2.93(1H，m)，2.97(3H，s)，5.65-5.75(1H，m)，6.43(1H，d，J 11.7Hz)，7.33(1H，t，J 7.8Hz)，7.44-7.49(1H，m)，7.63-7.72(1H，m)，7.84(1H，s)。
对CB1激动剂具有外周作用的证实体外放射性配体结合研究使用CB1受体拮抗剂[3H]SR141716A(0.5nM)或者[3H]CP55940(0.5nM)在脑和脾脏膜中进行放射性配体结合测定[Ross，R.A.et al，Br.J.Pharmacol.1999，128，735-743]。所述测定在含有1mg/mL BSA的测定缓冲液中进行，总测定体积为500μL。通过加入膜(100μg)启动结合。在整个过程中0.1％DMSO的载体浓度保持不变。所述测定在37℃下进行60分钟，在此之后利用12孔取样歧管(Brandel Cell Harvester)和Whatman GF/B玻璃纤维滤纸向其中加入冰冷洗涤缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris buffer)，1mg/mL BSA)并进行真空过滤，从而终止测定，所述GF/B玻璃纤维滤纸已经在4℃浸入洗涤缓冲液中24小时。每个反应试管用4mL等分的缓冲液洗涤五次。将所得滤出物烘干60分钟，然后将其置入5mL闪烁流体(UltimaGold XR，Packard)中，通过液体闪烁光谱测定法对放射性强度进行定量。特异性结合定义为存在和不存在1μM未标记配体时发生的结合的差异，在脑和脾脏中分别为总放射配体结合的71％和40％。利用GraphPad Prism(GraphPad Software，San Diego)，计算在特异性结合位点上产生50％放射性配体置换的竞争性配体(测试化合物)的浓度(IC50)。使用Cheng & Prusoff[Cheng，Y.and Prusoff W.H.，Biochem.Pharmacol.1973，22，3099-3108]方程计算抑制常数(Ki)值。
体外大麻素受体调节活性使用鼠输精管制剂，对化合物用于大麻素调节的可能性进行评定[WardS，Mastriani D，Casiano F和Arnold R(1990)J Pharmacol ExpTher2551230-1239]，这为CB激动提供了证据，而不仅是简单受体结合，简单受体结合通常不能反映激动剂可能性。
与已知的全激动剂R(+)WIN55，212(IC50～5nM)相比，化合物(16)在此系统(图1)中显示了显著作用，IC50为～1nM。上述作用被选择性CB1拮抗剂SR141716A抑制，这表明观测到的收缩经外周CB1受体进行介导。
体内外周CB1受体活化上胃肠道转运利用活性炭方法对胃肠转运进行测量。使鼠口服接受0.1mL(10g/鼠)黑色标记物(black marker)(10％活性炭的5％阿拉伯树胶悬浮液)，20分钟之后通过用CO2窒息将鼠处死并且将其小肠取出。对标记物移动的距离进行测量，并且将其表示为从幽门到盲肠的小肠总长度的百分数[Izzo，A.A.et al，Br.J.Pharmacol.2000，129，1627-1632]。大麻素激动剂在给药活性炭30分钟之前施用。
结肠推进试验根据Pinto et al[Gastroenterology 2002，123，227-234]对末端结肠推进进行测量。在给药大麻素药物30分钟之后，将一个3mm玻璃珠插入各个鼠远端结肠内2em。确定各只动物排出玻璃珠所需要的时间。较高的平均排出时间值为较强结肠推进抑制作用的标志。
外周活性大麻素影响精神(psychotrophic)的活性许多CB1激动剂由于中枢结合CB受体，已经知道会诱发与影响精神相关的“四素组效应(tetrad effect)”[Howlett，A.C.et al，International Union ofPharmacology.XXVII，Pharmacol.Rev.2002，54，161-202]。在此还对本发明化合物是否可以与中枢CB1受体结合进行了研究。这是通过测量化合物通过静脉注射(i.v.)、腹膜内注射(i.p)和口服给药后在正常鼠中诱发镇静、上睑下垂、胃肠运动不足、僵住症和低温症的能力[Brooks，J.W.et al，Eur.J.Pharmacol.2002，439，83-92]进行评估的。
化合物脑水平的测定对脑和脊髓渗透力的定量化合物的脑/脊髓渗透可以按如下所述得到测量。利用Ohno et al所述的标准方法[Ohno，K.et al，Am.J.Physiol 1978，235，H299-H307]对吸取于麻醉大鼠中的脑和脊髓摄取测定。简而言之，以单次推注方式或者逐步输液的方式将化合物注射入静脉内(股)。取几个血浆样品(股动脉)以计算血浆浓度随时间的变化(曲线下的积分面积)。取末端脑和脊髓样品以测定脑渗透(brain penetration)(通过盐水冲洗或者通过使用惰性弱渗透性标记物(比如[14C]蔗糖)短循环测量含有的血液体积，对残余血液中的化合物作校正)。PS(cm.s-1)等于C脑/整体C血浆，其中对脑摄取PS＝渗透性×表面积(em2)的积，C为浓度。另外，测定稳态组织/血浆的比例作为更近似的指标，同样进行血液冲洗或者校正。与熟知具有弱BBB渗透性的对照化合物进行对比，例如，在相同条件下试验的放射性同位素标记的蔗糖或者胰岛素。
CB1激动的生物学初步表征外周活性大麻素的伤害感受活性存在CB1在外周介导伤害感受的证据[Fox，A.et al，Pain 2001，92，91-100]。由此，在大鼠和基因敲除小鼠(knockout mice)中进行部分坐骨神经结扎研究。
痉挛状态的评定使用大麻素敲除小鼠(包括CB1、CB2、VR-1、FAAH和条件CB1敲除小鼠)进行进一步研究。在ABH(在3～4次疾病发作之后，在80天内有50～60％的动物发作显著的痉挛状态)或者ABH.CB1-/-(在1～2次疾病发作之后，在30～40天内有80～100％的动物发生显著的痉挛状态)中可以诱发痉挛状态。化合物最初通过静脉注射(以限制首过效应)、腹膜内注射或者口服给药。痉挛状态通过使用应变仪测定下肢弯曲抗性进行评价(n＝6～7/组)[Baker，D.et al，Nature 2000，404，84-87]。
将动物作为其自身对照，通过成对的方式进行分析。为了减少动物的数目、节省人力和费用，在无药物期间(drug-free period)(痉挛状态在24小时内恢复)之后，使这些动物接受不同的剂量和/或载体。
将作为对照的低剂量CB1激动剂和CNS活性CP55，940局部(皮下，肌内)给药入痉挛ABH小鼠中，其在对侧肢分析中缺乏活性[Fox，A.et al，Pain2001，92，91-100]。
CB1在外周神经系统(包括脊根神经节，CB介导伤害感觉的非CNS位置)的表达可通过利用peripherin-Cre转基因鼠来消除[Zhou，L.et al，FEBSLett.2002，523，68-72]。这些条件性的敲除小鼠都保持在C57BL/6背景下。这些小鼠在用髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白残基35-55肽诱导后产生EAE[Amor，S.et al，J.Immunol.1994，153，4349-4356]。
正常和CREAE小鼠的体内评价CNS排斥化合物(CNS excluded compound)提供了一个手段来考察大麻素抗痉挛作用组分是否通过外周CB受体介导。在正常鼠中测定化合物(16)的CNS作用，如图2和3所示。在1mg/kg剂量时没有观察到低温症或者胃肠运动不足。在CREAE小鼠中，观察到了对痉挛状态的显著作用(图4)，这提供了选择性的痉挛状态抑制作用可以在不产生CNS作用的情况下得到实现的强有力证据。如上所述，外周大麻素受体在痉挛状态中并没有已证实作用，然而，痉挛状态可能是脊髓中(至少在EAE中)神经损伤的产物[Baker，D.et al，FASEB J.2001，15，300-302；Baker，D.et al，J.Neuroimmunol.1990，28，261-270]，去往肌肉系统或者从肌肉系统获得异常信号可能至少部分地对痉挛状态中发生的肌肉痉挛起贡献。
本发明所述方法的多种变型和变体对于本领域熟练技术人员是显而易见的，它们并不背离本发明的范围和精神。虽然本发明已经结合具体优选的实施方案进行了描述，但是，用于实现本发明的对化学或者相关领域熟练技术人员显而易见的所述方式的多种变型都意图包括在以下权利要求的范围之内。
权利要求
1.式I化合物或者其药学上可接受的盐， 其中Z为OR1或者NR1R2，其中R1和R2各自独立地为H或者烃基；X为亚烷基、亚烯基或者亚炔基，它们各自可以任选被选自烷基、COOH、CO2-烷基、烯基、CN、NH2、羟基、卤素、烷氧基、CF3和硝基中的一个或者多个取代基所取代；Y为选自OH、NO2、CN、COR3、COOR3、NR3R4、CONR3R4、SO3H、SO2-R3、SO2NR3R4和CF3中的极性官能团，其中R3和R4各自独立地为H或者烃基；A为芳基或者杂芳基基团，它们各自可以任选被取代；和B为(CH2)n，其中n为0、1、2、3、4或者5；条件是(i)当A为苯基，n为0和Z为OH时，X-Y不是间-C≡C-(CH2)2CO2H、间-C≡C-(CH2)2OH、间-C≡C-(CH2)2CO2Me、间-(CH2)4CO2H、邻-CH2CO2H、邻-(CH2)2CO2H和邻-(CH2)4CO2H；和(ii)当A为苯基，n为0和Z为OMe时，X-Y不是间-C≡C-(CH2)4OH。
2.根据权利要求1的化合物，其中Y选自CN、OH、COOR3、SO2NR3R4、CONR3R4，其中R3和R4各自独立地为H或者烃基。
3.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为H、烷基、芳基或者环烷基，它们各自可以任选被取代。
4.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其中Y选自OH、CN、COOR3、CONR3R4，其中R3和R4各自独立地选自H或者任选被取代的烷基。
5.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其中Y选自OH、CN、COOMe、COOH、CONH2、CONHMe和CONMe2。
6.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其中n为0。
7.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其中X-Y选自-C≡C-(CH2)p-Y；-C(R5)＝C(R6)-(CH2)q-Y；和-C(R5)(R6)C(R7)(R8)-(CH2)r-Y；其中R5、R6、R7和R8各自独立地为H或者烷基，并且其中p、q和r各自独立地为2、3或者4。
8.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其中X-Y选自-C≡C-(CH2)p-Y；和-CH＝CH-(CH2)q-Y；其中p和q各自独立地为2、3或者4。
9.根据权利要求7的化合物，其中X-Y为顺式-C(R5)＝C(R6)-(CH2)q-Y，且q为2、3或者4。
10.根据权利要求1-7或权利要求9中任一项的化合物，其中X-Y为-C(Me)2-CH2-(CH2)r-Y，和r为2、3或者4。
11.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其中A为苯基或者吡啶基。
12.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其为式Ia的化合物
13.根据权利要求1-11中任一项的化合物，其为式Ib的化合物
14.根据权利要求12或者权利要求13的化合物，其中A是苯基。
15.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其中Z为OR1或者NR1R2，且R1和R2各自独立地为H、烷基或者环烷基，它们各自可以任选被一个或者多个OH或者卤素基团取代。
16.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其中Z选自OH、OEt、NHCH2CH2F、NH-环丙基、NHCH(Me)CH2OH和NHCH2CH2OH。
17.根据前述权利要要求中任一项的化合物，其选自
18.权利要求17的化合物，其为
19.权利要求18的化合物，其为外消旋混合物形式。
20.式Ia化合物或者其药学上可接受的盐在制备用于治疗肌肉障碍的药物中的用途， 其中Z为OR1或者NR1R2，其中R1和R2各自独立地为H或者烃基；X为亚烷基、亚烯基或者亚炔基，它们可以各自任选被取代；Y为极性官能团；A为芳基或者杂芳基基团，它们各自可以任选被取代；和B为(CH2)n，其中n为0、1、2、3、4或者5。
21.根据权利要求20的用途，其中所述肌肉障碍为神经肌肉障碍。
22.式Ia化合物或者其药学上可接受的盐在制备用于控制痉挛状态和颤动的药物中的用途， 其中Z为OR1或者NR1R2，其中R1和R2各自独立地为H或者烃基；X为亚烷基、亚烯基或者亚炔基，它们各自可以任选被取代；Y为极性官能团；A为芳基或者杂芳基基团，它们各自可以任选被取代；和B为(CH2)n，其中n为0、1、2、3、4或者5。
23.式Ia化合物或者其药学上可接受的盐在制备用于治疗胃肠道病症的药物中的用途， 其中Z为OR1或者NR1R2，其中R1和R2各自独立地为H或者烃基；X为亚烷基、亚烯基或者亚炔基，它们各自可以任选被取代；Y为极性官能团；A为芳基或者杂芳基基团，它们各自可以任选被取代；和B为(CH2)n，其中n为0、1、2、3、4或者5。
24.根据权利要求23的用途，其中所述胃肠道病症为胃溃疡。
25.根据权利要求23的用途，其中所述胃肠道病症为克罗恩氏病。
26.根据权利要求23的用途，其中所述胃肠道病症为分泌性腹泻。
27.根据权利要求23的用途，其中所述胃肠道病症为麻痹性肠梗阻。
28.根据权利要求20-27中任一项的用途，其中所述调节剂选择性地调节外周大麻素受体。
29.根据权利要求20-28中任一项的用途，其中相对于中枢大麻素受体，所述化合物选择性地调节外周大麻素受体。
30.根据权利要求20-29中任一项的用途，其中所述化合物基本上只与外周大麻素受体结合。
31.根据权利要求20-30中任一项的用途，其中所述化合物为大麻素受体激动剂。
32.根据权利要求20-31中任一项的用途，其中所述化合物基本上不激动中枢大麻素受体。
33.根据权利要求20-32中任一项的用途，其中所述化合物基本上排除在CNS之外。
34.根据权利要求20-33中任一项的用途，其中Y选自NO2、CN、OR3、COR3、COOR3、NR3R4、CONR3R4、SO3H、SO2-R3、SO2NR3R4和CF3，其中R3和R4各自独立地选自H或者烃基。
35.根据权利要求20-34中任一项的化合物用途，其中Y选自CN、COOR3、SO2NR3R4、CONR3R4，其中R3和R4各自独立地选自H或者烃基。
36.根据权利要求20-35中任一项的用途，其中所述化合物如权利要求1-19中任一项所定义。
37.治疗与调节外周大麻素受体有关的病症的方法，所述方法包括向有该需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-19中任一项的化合物。
38.根据权利要求37的方法，其中所述病症与外周大麻素受体失活相关。
39.根据权利要求37或者权利要求38的方法，其中所述化合物基本上不激动中枢大麻素受体。
40.根据权利要求37-39中任一项的方法，其中所述化合物基本上只与外周大麻素受体结合。
41.根据权利要求37-40中任一项的方法，其中所述化合物基本上排除在CNS之外。
42.药物组合物，其中含有根据权利要求1-19中任一项的化合物或者其药学上可接受的盐，以及混合有药学上可接受的稀释剂、赋形剂或者载体。
43.权利要求20所定义的式Ia化合物或者其药学上可接受的盐在测定中用于鉴定其它能够调节大麻素受体活性的化合物的用途。
44.根据权利要求43的用途，其中所述测定为竞争性结合测定。
全文摘要
本发明涉及式(I)化合物或者其药学上可接受的盐，其中Z为OR
文档编号C07C69/78GK1956946SQ200580012480
公开日2007年5月2日 申请日期2005年2月21日 优先权日2004年2月20日
发明者奥山正弘, 戴维·塞尔伍德, 克里斯蒂纳·维辛廷, 戴维·巴克, 加雷斯·普赖斯 申请人:Ucl生物医学公司