有取代的有机硫化合物及其使用方法

专利名称：有取代的有机硫化合物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及有机硫化合物及其使用方法。
本发明的背景癌症目前仍然是危害人类生命健康的最主要疾病之一。治疗癌症的现有手段包括手术切除，放射疗法，化学疗法，或这些方法的任何合并使用。在所有这些方法中，化学疗法是应用最广而且已经用于多种不同的癌症，尤其是那些用其他方法几乎无法治疗，或已转移的癌症。尽管不少具有化学治疗作用的化合物已经用于临床，大多数化学疗法都只限于延缓癌症的恶化而并非治愈。由于肿瘤细胞对药物的耐药性，肿瘤及其转移常常无法用化学疗法治疗。有些肿瘤对一些种类的化疗药物具有内在的抗药性。在另一些情况下，肿瘤对化疗药物的耐药性是在治疗过程中逐渐产生的。因此，现有的化疗药物在治疗不同种类的肿瘤时的效果受到极大的限制。进而，很多不同种类治疗癌症的化疗药物都产生很严重的副作用，从而导致化学治疗不能继续进行下去。所以，寻找新的而且有效的化学抗癌药物对维护人类健康仍然是迫切需要的。从亚热带灌木植物(Petiveria alliacea L.(Phytolaccaceae))中提取出来的天然产物二苄基三硫醚(DBTS)是具有生物活性的多硫二级代谢物。据报道，二苄基三硫醚具有免疫调节功能(“Petiveria alliacea的免疫调节活性”，Williams，L.A.D.，Gardner，T.L.，Fletcher，C.K.，Naravane，A.，Gibbs，N.，Fleischhacker，R.Phytother.Res.，vol.11，pages 251-253，1997；“二苄基三硫醚的磺酰酐衍生物及其农业化学活性”，Williams，L.A.D.，Vasquez，E.，Klaiber，I.，Kraus，W.，Rosner，H.Chemosphere，vol.51，pages 701-706，2003)。在研究二苄基三硫醚在细胞分子机理水平上的免疫调节活性时，Rosner及其合作者报道，二苄基三硫醚倾向于结合到BSA的芳香区，而且减弱在神经母细胞瘤SH-SY5Y中MAP激酶erk1/erk2上酪氨酰残基的去磷酸化作用(“Disassembly of microtubules and inhibition of neuriteoutgrowth，neuroblastoma cell proliferation，and MAP kinase tyrosinedephosphorylation by dibenzyl trisulphide”，by Rosner，H.，Williams，L.A.D.，Jung，A.and Kraus，W.Biochim.Biophy.Acta，2001，1540，166-177)。此文还报道，二苄基三硫醚引起微管可逆性的分解，而且不影响在神经母细胞瘤SH-SY5Y和人肺Wistar 38成纤维母细胞中肌动原的动态。该文还进而报道，二苄基三硫醚还抑制神经母细胞瘤细胞繁殖和由脊髓外肢体中神经纤维突出的延伸。Mata-Greenwood与其合作者还研究了大量天然萃取物的抗增生和变异作用(“Discovery of novel inducers of cellulardifferentiation using HL-60 promyeolocytic cells”，by Mata-Greenwood，E.，Ito A.，Westernburg，H.，Cui，B.，Mehta，R.G.，Kinghorn，A.D.and Pezzuto，J.M.Anticancer Res.2001，21，1763-1770)。文中报道，Petiveria alliacea L.植物根部的亲脂性萃取物及其中的活性组分对HL-60前髓细胞具有抗增生和变异活性。该作者还从该活性组分中分离出来了两种活性有机硫化合物2-[(苯基甲基)二硫代]乙醇和二苄基三硫醚。这两种有机硫化合物诱导类似于单核白细胞的变异并引起较强的细胞毒性。但这两种化合物对HL-60细胞不具有抗增生活性。
本发明的简要说明本发明涉及有机硫化合物，药物组合物，方法及其应用。更具体的讲，本发明涉及有取代二硫、三硫、四硫和五硫化合物，包括其药学上可接受的盐及其部分氧化所形成的砜衍生物。本发明所述化合物具有抗肿瘤，抗癌，抗炎，抗传染和/或抗增生等方面的活性。本发明还涉及有机硫化合物的制备及制剂方法。一方面，本发明提供具有下列结构通式(1)或(2)的化合物
或 其中，A和B相同或不同，并且独立地是任选取代的芳基，杂芳基或一种5～14员、可以是单环或多环的而且任选地含有杂原子的环；每一个S都任选地呈氧化物的形式；S1和S2独立地是S，SO或SO2；每一个R是H，卤素，羧基，氰基，氨基，酰胺基，氨基酸，无机取代基，SR1，OR1或R1，其中每一个R1是烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，碳环基或杂环，而且其中每一个都任选地有取代且可含有杂原子；m，n和p独立地是0-3；或有下述通式(3)或(4)的化合物 其中，A，B，R，S，n和p定义如上；或有下述通式(5)的化合物 其中，A，B，S，n和p定义如上；并且Z是(CR12)q或(CR1＝CR1)q*，其中”q”是0-3，而“*”代表碳碳双键C＝C可代之以炔基、O、S、NR；或Z是任选地有取代的芳基、杂芳基或杂环基；其中，A和B一起可以形成环状系统；及其药物上可接受盐、酯、药物前体或代谢物；先决条件是所述化合物不是二苄基三硫醚，二(对-氯苄基)三硫醚，(对-氯苄基)苄基三硫醚，二(对-硝基苄基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙烯基)三硫醚，二苯基三硫醚或二(对-叔丁基苯基)三硫醚。在上述通式1-5中，每一个Z均可是 或 其中，每个W均独立地为一个健，CR，N，NR，S或O；每个R均如以上定义。上述通式1-5中，每个R均可是H，卤素，OR1，SR1，CO2R1，CONR12，C＝O，CN，CF3，OCF3，NO2，NR1R1，OCOR1；或R是C1-10烷基，C3-10环烷基，C2-10烯基，C2-10炔基，芳基，杂芳基，碳环或杂环，其中每一个都可以含杂原子。在上述通式1-5中，每个A和B都可以是苯，吡啶，哒嗪，嘧啶，吡嗪，三嗪，异唑，异噻唑，恶二唑，[1，2，4]二唑，三唑，噻二唑，吡唑，咪唑，噻唑，恶唑，苯并唑，吡咯，呋喃，噻吩，中氮茚，吲哚，异吲哚，二氢吲哚，苯并呋喃，苯并噻吩，吲唑，苯并咪唑，苯并噻唑，嘌呤，喹喔啉，喹啉，异喹啉，噌啉，2，3-二氮杂萘，喹唑啉，喹喔啉，1，5-二氮杂萘，蝶啶，吖啶，吩嗪，吩噻嗪，茚，萘，苯并二唑，或苯并[1，2，5]二唑。另一方面，每个A和B都独立地是
或 其中，X和W独立地是S，O，NR7，CR7；或者在六员的单环或双环中一个W可以是一个键；并且每个R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7都是氢原子，卤素原子，羧基，氰基，氨基，氨基酸，酰胺基，无机取代基，SR1，OR1或R1，其中每个R1均为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，并且其中每一个均是任选地有取代的且可含有杂原子。例如，每个R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7均可是氢原子，卤素原子，OR1，SR1，CO2R1，CONR12，C＝O，CN，CF3，OCF3，NO2，NR1R1，OCOR1；或每个R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7均可是C1-10烷基，C3-10环烷基，C2-10烯基，C2-10炔基，芳基，杂芳基，碳环基或杂环基，其中每一个均可含有杂原子。芳基、杂芳基或杂环基的实例包括但不限于哌嗪基，哌啶基，吗啉基，硫代吗啉基，苯基，呋喃基，噻吩基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基，喹喔啉基，噻唑基，唑基，咪唑基，喹啉基，萘基，哒嗪基，吡唑并嘧啶基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，苯并噻吩基，吡唑基，吡咯基，吲哚基，异吲哚基，喹嗪基，喹啉基，异喹啉基，喹唑啉基等；其中每个基团都任选地有一个选自N、O、S和卤素的杂原子取代，或有C1-10烷基、C3-10环烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、芳基、或杂环基取代，而且每个都任选地含有杂原子。上述通式1-5中，每个S均可是一氧化物或二氧化物。另一方面，本发明还包括通式(6)所代表的化合物 其中每个n是1-3；而且R是氢，卤素，烷基或卤代烷基。又另一方面，本发明还包括通式(7)所代表的化合物 其中，Ar是任选地有取代的噻吩、苯并噻吩、吡啶或吡嗪。通式1-5的化合物的实例包括但不限于二(氟苄基)三硫醚，二(邻-氯苄基)三硫醚，二(甲基苄基)三硫醚，二(三氟甲基苄基)三硫醚，二(2-苯基乙基)三硫醚，二(噻吩-2-甲基)三硫醚，二(吡啶-4-乙基)三硫醚，二(嘧啶-2-乙基)三硫醚，或二(苯并噻吩-3-甲基)三硫醚。二(对-氟苄基)三硫醚，二(间-甲基苄基)三硫醚或二(对-甲基苄基)三硫醚是其中最典型的实例。在另一种实施方案中，本发明提供包含上述通式1-5的化合物的组合物的制造方法，也提供按照这样的方法制备的组合物。本发明所提供的组合物制造方法包含a)将权利要求1的化合物溶解到水溶性有机溶剂，非离子性的溶剂，水溶性类脂，各种环糊精，维生素，脂肪酸，脂肪酸酯，磷脂或其组合溶剂中，提供一种溶液；b)加入食盐水或含有1-10％碳水化合物的溶液的缓冲剂。所述有机溶剂包括聚乙二醇(PEG)，乙醇，丙二醇，N-甲基-2-吡咯酮，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，二甲亚砜或这些溶剂的组合溶剂。在以上方法中，非离子型表面活性剂可以是聚氧乙烯甘油蓖麻醇酸酯35、PEG-琥珀酸酯、polysorbate 20、polysorbate 80、聚乙二醇-660 12-羟基硬脂酸酯、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(poloxamer)、乙氧基化杏核油、辛基-己酰macrogol-8-甘油酯、甘油酯、PEG-6辛酸甘油酯、甘油、glycol-polysorbate、或其组合。非离子型表面活性剂的具体实例是聚乙二醇改性CREMOPHOR(聚氧乙烯甘油三菌麻醇酸酯35)、CREMOPHOREL、氢化CREMOPHORRH40、氢化CREMOPHORRH60、SOLUTOLHS(聚乙二醇-660 12-羟基硬脂酸酯)、LABRAFIL(乙氧基化杏核油)、LABRASOL(辛基-己酰macrogol-8-甘油酯)、GELUCIRE(甘油酯)、和SOFIGEN(PEG-6辛酸甘油酯)。上述方法中所述类脂包括菜籽油，甘油三酸酯，植物油，或其组合。其中包括蓖麻油，聚氧乙烯基化蓖麻油，玉米油，橄榄油，棉子油，花生油，薄荷油，红花油，芝麻油，大豆油，氢化菜籽油，氢化豆油，椰子油甘油三酸酯，棕榈籽油以及其氢化油，或这些油的组合。上述维生素可以是生育酚(也叫维生素E)。脂肪酸和脂肪酸酯可以是油酸，单酸甘油酯，二酸甘油酯，聚乙二醇的单或二脂肪酸酯，或它们的组合。上述环糊精指α-环糊精，β-环糊精，羟丙基化的β-环糊精，或磺基丁基醚化的β-环糊精。磷脂可以是大豆磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰甘油及它们的氢化物，或它们的组合。进而，碳水化合物包括葡萄糖。在又另一种实施方案中，本发明提供上述通式1-2化合物的制备方法，包含a)N-三甲基甲硅烷基咪唑和二卤化硫在卤代溶剂中反应制得二咪唑基硫化物；然后b)上述二咪唑基硫化物与相应的硫醇反应。二氯甲烷是所用典型的卤代溶剂之一。一个方面，N-三甲基甲硅烷基咪唑在己烷中的溶液与二氯化硫在二氯甲烷中的溶液反应。而另一个方面，纯态二氯化硫与N-三甲基甲硅烷基咪唑在己烷和二氯甲烷中的溶液反应。在又另一个方面，上述方法进一步包含该三硫化物/的重结晶。作为例子，所述三硫化物用正己烷，混合己烷，庚烷，石油醚或其组合溶剂重结晶。在另一种实施方案中，本发明提供包含上述通式1-5的化合物以及医药上可接受赋形剂的组合物。这样的化合物及其医药组合物可用来治疗和缓解神经母细胞瘤。所以，本发明也提供治疗和缓解神经母细胞瘤的方法，包含，将有效量的通式1-5的化合物或其医药组合物及任选地与一种抗增殖剂一起给药于有其需要的体系或对象，从而所述神经母细胞瘤可以得到治疗或缓解。本发明也提供疾病的缓解和治疗方法，包含对有其需要的对象成体系给药任何一种有式1-5的化合物或其医药组合物，其中所述化合物可以是二苄基三硫醚，二(对-氟苄基)三硫醚，二(对-氯苄基)三硫醚，二(对-硝基苄基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙炔基)三硫醚，二苯基三硫醚，或二(对-叔丁基苯基)三硫醚。该对象可以是人体或动物体例如哺乳动物。该体系可以是细胞或组织，或化合物可以离体给药的其他体系。在一种实施方案中，本发明提供除神经母细胞瘤外各种细胞增殖紊乱的治疗和缓解方法包含对有其需要的体系或对象给药有效量的任何一种有式1-5的化合物或其医药组合物及任选地一种抗增殖剂，从而使所述体系或对象中的所述细胞增生紊乱得到治疗和缓解。本发明同时提供减缓或抑制细胞增生或诱导细胞死亡的方法。本发明进一步提供诱导细胞凋亡的方法。具体来说，本发明方法中使用的化合物是二苄基三硫醚，二(对-氟苄基)三硫醚，二(对-甲基苄基)三硫醚或二(间-甲基苄基)三硫醚，且任选地与一种抗增殖剂联合使用。另一方面，减缓细胞增殖，或诱导所述细胞死亡。细胞增殖紊乱可以是一种肿瘤或癌症，包括但不限于白血病，淋巴瘤，肺癌，结肠癌，中枢神经系统癌症，黑色素瘤，卵巢癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，头颈部癌，胰腺癌等。在另一方面，细胞凋亡得到诱导；在另一方面，可中断微管蛋白的聚合和解聚过程，或抑制细胞分裂周期的G2/M过程或细胞有丝分裂，或两者兼而有之。在另一方面，还抑制了内皮细胞增殖、血管形成、或其组合。在另一种实施方案中，本发明提供血管再狭窄的缓解或治疗方法，包含对其需要的对象给药有效量的任何一种有式1-5的化合物或其医药组合物，从而使所述对象中的血管现狭窄得到缓解或治疗。该血管狭窄症可伴随新内膜增生。该化合物可以口服，或非肠道途径给药，或通过血管支架给药。在又另一种实施方案中，本发明提供用于治疗细胞增生性紊乱的医药组合物，包含任何一种有式1-5的化合物和医药上可接受赋形剂。


图1A-C显示人非小细胞肺癌细胞株H460分别对不同浓度DBTS、乙酰甲基秋水仙碱、和紫杉醇的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图2显示人肺癌细胞株MV522对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图3显示人乳腺癌细胞株MCF7对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图4显示人肺癌细胞株A549对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图5显示人前列腺癌细胞株PC3对不同浓度DBTS(图6A)和5氟脲嘧啶(图6B)的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图6显示人表皮细胞癌细胞株A431对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图7显示人成纤维母细胞瘤细胞株HT1080对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图8显示人乳腺癌细胞株MDA231对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图9显示人结肠癌细胞株HT29对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图10显示人结肠癌细胞株HC-2998对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图11显示人卵巢癌细胞株OVCAR4对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图12显示人结肠癌细胞株A2780对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图13显示人肝癌细胞株HepG2对不同浓度DBTS的反应，该反应采用实时微电子细胞传感器系统(RT-CES系统)检测。
图14显示DBTS处理的小鼠体内抗S180皮下实体移植肉瘤的效果。
图15显示DBTS处理的小鼠体内抗Lewis肺癌皮下实体移植瘤的效果。
图16显示ACEA100108化合物处理的在免疫缺陷裸鼠体内抗人乳腺癌Bcap-37皮下移植肿瘤的效果。
图17显示ACEA100108化合物处理的免疫缺陷裸鼠体内抗人乳腺癌Bcap-37皮下移植肿瘤的动态效果(肿瘤体积随时间的变化)，裸鼠移植瘤由人乳腺癌Bcap-37皮下接种免疫缺陷裸鼠产生。
图18显示ACEA100108化合物处理的有人乳腺癌Bcap-37株移植肿瘤的裸鼠体重动态变化。
图19显示ACEA100108化合物处理的免疫缺陷裸鼠体内抗人结肠癌HCT-8细胞皮下移植肿瘤效果(肿瘤体积随时间的变化)。
图20显示ACEA100108化合物在裸鼠体内抗人结肠癌HCT-8细胞移植瘤的动态效果(肿瘤体积随时间的变化)，裸鼠移植瘤由人结肠癌HCT-8细胞株皮下接种免疫缺陷裸鼠产生。
图21显示ACEA100108化合物治疗人结肠癌HCT-8细胞裸鼠移植瘤时小鼠体重变化。
图22显示ACEA100108化合物在免疫缺陷裸鼠体内抗人卵巢癌AO 10/17细胞移植瘤的动态效果(肿瘤体积随时间的变化)，裸鼠移植瘤由人卵巢癌AO 10/17细胞株皮下接种免疫缺陷裸鼠产生。
图23显示ACEA100108化合物在裸鼠体内抗人卵巢癌AO 10/17细胞移植瘤的动态效果(肿瘤体积随时间的变化)，裸鼠移植瘤由人卵巢癌AO 10/17细胞株皮下接种免疫缺陷裸鼠后获得。
图24显示ACEA100108化合物治疗人卵巢癌AO 10/17细胞裸鼠移植瘤时小鼠体重变化。
图25显示ACEA100108化合物治疗后人乳腺癌Bcap-37皮下移植肿瘤的动态效果(肿瘤体积随时间的变化)，裸鼠移植瘤由皮下接种人乳腺癌Bcap-37后所产生。
图26显示ACEA100108对不同肿瘤细胞株作用效果，该作用由RT-CES系统检测。
图27显示HT1080细胞在体外对DBTS不同衍生化合物的反应。细胞化合物反应采用RT-CES系统检测。
图28显示未经任何药物处理的对照COS细胞内微管结构图。
图29显示不同浓度紫杉醇(Paclitaxel)处理4小时的COS细胞内微管结构图。
图30显示不同浓度紫杉醇(Paclitaxel)处理24小时的COS细胞内微管结构图。
图31显示不同浓度长春花碱处理4小时的COS细胞内微管结构图。
图32显示不同浓度长春花碱处理24小时的COS细胞内微管结构图。
图33显示不同浓度DBTS处理4小时的COS细胞内微管结构图。
图34显示不同浓度DBTS处理24小时的COS细胞内微管结构图。
图35显示不同浓度ACEA100108处理4小时的COS细胞内微管结构图。
图36显示不同浓度ACEA100108处理24小时的COS细胞内微管结构图。
图37显示不同浓度ACEA100116处理4小时的COS细胞内微管结构图。
图38显示不同浓度ACEA100116处理24小时的COS细胞内微管结构图。
图39a显示DBTS抑制纯化的微管蛋白的体外聚合结果。
图39b显示未经任何药物处理的体外微管蛋白聚合电子显微镜结构图。
图39c显示在3μM DBTS处理后体外微管蛋白聚合电子显微镜结构图。
图40显示ACEA100108抑制纯化微管蛋白(无MAP)体外聚合结果。
图41显示ACEA100116抑制纯化微管蛋白(无MAP)体外聚合结果。
图42显示人肺癌细胞A549在分别用1μMACEA100108、50nM紫杉醇、10nM长春新碱、或DMSO处理24小时后采用6-CFDA(上图)和AnnexinV(下图)染色后的图象。
图43显示人肺癌细胞A549在用25μM ACEA100108，7.8nM紫杉醇，或DMSO处理24小时后采用流式细胞仪检测的细胞分裂周期分布图。
本发明详细说明 为了清晰起见但并非限制本发明，本发明的详细说明由下述几部分组成。
A.定义 除另外说明之外，本发明中使用的所有科学技术术语和在本发明领域内科技专家常使用和理解的意义相同。本发明中引用的专利、申请、已发表的申请及其他出版物均以参考文献的方式整合到本专利申请中。如本节中所述定义与列为本文参考文献的其他文献和专利上的定义不一致，则以本节中所述定义为准。
本发明中所用“一”或“一个”或“一种”或“一类”意指至少一个/种/类或一个/种/类或一个/种/类以上。
本发明中所用“烷基”指各种直链的、带支链的或环状的饱和烃基，特别包括含有十个或十个碳以下的低级烷基。例如，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，异戊基，己基等仅为本定义中的一些典型例子。所用“烯基”或“烯烃基”与上述“烷基”定义相同但其中必须有最少一个碳碳双键(C＝C)，所以本发明所用的烯基包括含有两个到十个碳原子的直链的、带支链的或环状的并含有至少一个碳碳双键的烃基，如乙烯基，丙烯基，丁烯基，戊烯基等。以此类推，本发明所用的“炔基”或“炔烃基”为上述烷基或烯基并含有至少一个碳碳三键。所以，炔基包括含有两个到十个碳原子并含有至少一个碳碳三键的直链的、带支链的或环状的炔烃基或炔基，如乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基等。
本发明所用“环烷基”为环状的烷烃基团并优先选用含有三到八个碳的环烷基。因此，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基均为本定义下的典型例子。环烷基中含有一个或两个碳碳双键即形成“环烯基”。环烷基上还可以有烷基、烯基、炔基、卤原子和其他基团取代。
本发明所使用的“芳基”或“芳香族片断”为芳香族环系并可在环中含有一个或一个以上的非碳原子(除碳以外的其他杂原子如氮，硫，磷等)如苯基，萘基和吡啶基等。这些芳基还可通过两个共价键与其他五员或六员芳基或杂环基团相稠合而形成“稠合芳基”。
本发明中还常用到的“杂环基”，“杂环烷基”和“杂环片断”可互换使用且系指任何多个原子通过共价键构成的环状基团和化合物并且含有至少一个非碳原子。特指杂环基团包括含有氮、硫或氧作为非碳原子的五员和六员环状系统如咪唑，吡咯，三唑，二氢嘧啶，吲哚，吡啶，噻唑，四唑等。这些杂环基团进而与单环或双环或杂环稠合而成“稠合杂环基”或“稠合杂环碱基”或“稠合杂环片断”。
本发明中的“烷氧基”指与氧原子连接的直链或带支链的烷基，也称为烷氧化物或醇盐。本基团中烃部分可含有任何数目的碳原子并可包括一个或两个氧、硫或氮原子，还可含有双键或三键。此类烷氧基团的例子包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，甲氧乙氧基等。同样“烷硫基”指与硫原子连接的直链或带支链的烷基，也称为烷硫化物或硫醇盐。本基团中烃部分可含有任何数目的碳原子并可包括一个或两个氧、硫或氮原子，还可含有双键或三键。此类烷硫基团的例子包括甲硫基，乙硫基，丙硫基，异丙硫基，甲氧乙硫基等。
同样“烷胺基”指直链或带支链的烷基胺，其中氨基氮原子可以有一个或两个烷基取代，其中烃部分可含双键或三键，且可含有任何数目的碳原子并可包括一个或两个氧、硫或氮原子。此类烷胺基的例子包括甲胺基，二甲胺基，乙胺基，二乙胺基等。
本发明所用的“芳氧基”指与氧原子连接的芳基，其中芳环可以有进一步取代，苯氧基即是常用的例子之一。“芳硫基”是与硫原子连接的芳基，而且芳环可以有进一步取代。苯硫基即是实例之一。
本发明中的“卤素”为氟，氯，溴，碘。
本发明中的“氨基酸”指取代的天然和非天然的氨基酸，纯的L-或D-构型或外消旋混合物，其中氨基和羧基用来衍生所期待的化合物。
应进一步认识到的是，上述所定义的各种取代基还可以有一个或多个取代基进一步取代，其中这些新的取代基也可以有取代。例如，烷基或芳香基上的氢原子被氨基、卤素或其他基团取代即成为新的属于上述各定义中的基团。
本发明中所用的“取代”系指一个原子或化学基团(如H，NH2或OH等)由一个官能团取代。特别期待的官能团包括亲核基团(如-NH2，-OH，-SH，-NC等)，亲电基团(如C(O)OR，C(X)OH等)，极性基团(如-OH)，非极性基团(如杂环，芳基，烷基，烯烃基，炔烃基等)，离子型基团(如-NH3+)，卤素(如氟，氯等)，NHCOR，NHCONH2，OCH2COOH，OCH2CONH2，OCH2CONHR，NHCH2COOH，NHCH2CONH2，NHSO2R，OCH2-杂环，PO3H，SO3H，氨基酸以及业内已知的各种组合。本发明中的“取代”还指多取代，即有多个本发明中所选定的取代基，而且该有取代的化合物还可分别且独立地有一个或更多个所选的取代基。
本发明中所用的“有机硫衍生物”或“有机硫化合物”指含有两个或两个以上“S”原子的有机化合物。本发明所用“二硫化物”或“二硫醚”、“三硫化物”或“三硫醚”、“四硫化物”或“四硫醚”或“五硫化物”或“五硫醚”指两个、三个、四个或五个硫原子连在一起构成的多硫片断，而且其中的一个、两个、三个、四个或五个硫原子可被氧化成S＝O或SO2。这些二硫、三硫、四硫或五硫化物或醚的衍生物是由两个官能团、芳基、杂环基团或其他取代基在其两端取代而成(R-S-(S)0-3-S-R)。两个或三个三硫化物或醚单元(-S-S-S-)用芳环或线性链连在一起也称之为三硫化物或三硫醚或有机硫化物。一个或两个三硫化物单元亦可连在一起构成环状多硫化物。
B.有取代的有机硫衍生物及其医药组合物 本发明提供有下式的化合物 或 其中，A和B相同或不同，并且独立地是任选取代的芳基、杂芳基或一种5～14员、可以是单环或多环的而且任选地含有杂原子的环；每一个S任选地呈氧化物的形式；S1和S2独立地是S，SO或SO2；每一个R是H，卤素，羰基，氰基，氨基，酰胺基，氨基酸，无机取代基，SR1，OR1或R1，其中每一个R1是烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，碳环基或杂环基，其中每一个都任选地有取代且可含有杂原子；m，n和p独立地是0-3；或有下述通式(3)或(4)的化合物 或 其中，A，B，R，S，n和p定义如上；或有下述通式(5)的化合物
其中，A，B，S，n和p定义如上；并且Z是(CR12)q或(CR1＝CR1)q*，其中“q”是0-3，而“*”代表的碳碳双键(C＝C)可代之以炔基、O、S、NR；或Z是任选地有取代的芳基、杂芳基或杂环基；其中，A和B可以一起形成环状系统；及其药物上可接受盐、酯、药物前体或代谢物；先决条件是所述化合物不是二苄基三硫醚，二(对-氯苄基)三硫醚，(对-氯苄基)苄基三硫醚，二(对-硝基苄基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙烯基)三硫醚，二苯基三硫醚或二(对-叔丁基苯基)三硫醚。
在其它实施方案中，在上述通式1-5中，每个R均可是非干扰基团。本发明中的非干扰基团定义为在一个化合物中该基团的存在并不破坏此化合物作为医学治疗剂所使用的性能，而且可能缓解药物动力学性质或降低毒性。适宜的非干扰基团包括卤素，硝基，羰基，烷基，烯基，炔基，芳基，芳烷基，芳烯基，烷氧基，烷硫基，芳炔基，各种不同杂环，氨基酸等，而且每个基团均可有一个或更多个非干扰基团取代。非干扰基团还包括COOR，SR，OR，其中，R也是如上定义的非干扰取代基。
在上述通式1-5中，A和B可独立地是
或 其中，X和W独立地是S，O，NR7，CR7；或在六员单环或双环中一个W可以是一个健；并且每一个R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7同上述定义。
在其它实施方案中，每个R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7均可为极性或非极性的取代基。在其他例子中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7是亲核性或亲电性的非干扰性基团。
本发明还涵盖通式1-5中的化合物及其盐和药物前体。此类盐可以是由化合物上带正电荷的基团(如A和/或B上的氨基)与医药上适用的阴离子形成的。适宜的阴离子包括但并不限于氯根，溴根，碘根，硫酸根，硝酸根，磷酸根，柠檬酸根，甲磺酸根，三氟乙酸根，马来酸根，乙酸根等。医药上可接受盐还可以由化合物上带负电荷取代基(如A和/或B上的羧基)与阳离子形成。有众多带正电荷离子可以用于本目的，比如钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，和有机铵离子如四甲铵离子，四丁铵离子及其他的有机阳离子。
该三硫醚化合物可按照流程1中所示程序合成。例如，芳香环或杂环亚甲基卤(X＝I或Br或Cl)与硫脲反应。所得到的异硫脲卤化物中间体再与氢氧化钠反应而得到相应的硫醇衍生物(Furniss，B.S.；Hannaford，A.J.；Rogers，V.；Smith，P.W.G.；Tatchell，A.R.Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry，Longman GroupLimited，London，1978，pp 582-83)。
硫醇衍生物合成 方法A对称三硫化物合成 方法B不对称或对称三硫化物合成 流程1对称和不对称三硫化物的合成方法 对称的三硫醚化合物可用方法A来合成。在方法A中，N-三甲基甲硅烷基咪唑与二氯化硫反应。所生成的硫化二咪唑中间产物随后与硫醇反应而生成相应的三硫化物。在方法B中，一个硫醇分子先在低温下与二氯化硫发生定量反应。所生成的氯化二硫化合物中间体(R-S-S-Cl)再与第二分子的硫醇反应，根据第二步所用相同或不同的硫醇，而生成相对应的对称或不对称的三硫醚化合物。
典型的芳香族亚甲基硫醇1-6(流程2)可以用《Vogel’s实用有机化学》第582-583页所描述的类似程序合成。对称三硫醚化合物7-32(流程2)是用方法A来合成的。此方法与所报道的方法类似(Banerii，A.；Kalena，G.P.Tetrahedron Letters 1980，21，3003-3004)。合成本类三硫醚化合物的通用过程如下在室温和搅拌下，将二氯化硫(14毫摩尔)的无水己烷或二氯甲烷溶液滴加到含有N-三甲基甲硅烷基咪唑(28毫摩尔)的己烷溶液中。搅拌所得反应混合物30分钟后冷却到0℃。在搅拌下，在大约30分钟内将相应硫醇(28毫摩尔)的无水己烷溶液慢慢滴加到反应混合物中。继续搅拌30分钟并使温度升到室温。过滤出沉淀的咪唑副产品。用水和饱和食盐水在分液漏斗中洗涤上述滤液。用无水硫酸钠干燥有机相。除去溶剂后所得粗产品用硅胶色谱柱分离提纯。用己烷-乙酸乙酯100∶1到20∶1洗脱剂淋洗。所得产品7-32的收率为60-90％。芳香族三硫醚化合物33-39是用类似方法从相应的芳香族或杂环硫酚合成的，其收率为30-70％。
二(对-氟苄基)三硫醚(8)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色针状晶体8，收率77％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.46(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ4.00(s，4H)，7.01(t，4H，J＝8.8Hz)，7.27(dd，4H，J＝8.8，5.4Hz)；13C核磁共振谱(125.7MHz，CDCl3)δ42.4，115.6，115.8，131.2，131.3，132.4，162.5(C-F，J＝250Hz)；19F核磁共振谱(376.5MHz，CDCl3)δ-114.2；ES质谱m/z 337/338(M+Na)+；元素分析C14H12F2S3计算值(％)C，53.48；H，3.85；S，30.59；实验值(％)C，53.16；H，4.22；S，30.24。
二(对-氯苄基)三硫醚(9)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色晶体9，收率90％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.45(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ3.98(s，4H)，7.22(d，4H，J＝8.4Hz)，7.29(d，4H，J＝8.4Hz)。
流程2用方法A合成对称三硫化合物 二(间-三氟甲基苄基)三硫醚(12)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色晶体12，收率99％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.33(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ4.04(s，4H)，7.41-7.49(m，4H)，7.51-7.58(m，4H)。
二(苯并[B]噻吩-3-甲基)三硫醚(22)硅胶色谱柱提纯后得到白色固体22，收率45％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.45(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ3.74(s，4H)，7.01(s，2H)，7.34-7.45(m，4H)，7.75(d，2H，J＝7.4Hz)，7.85(dd，2H，J＝7.8，1.1Hz)；ES质谱m/z 391(M+H)+，413(M+Na)+。
二(对-溴苄基)三硫醚(25)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色晶体25，收率84％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.55(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ3.96(s，4H)，7.17(d，4H，J＝8.3Hz)，7.45(d，4H，J＝8.3Hz)。
二(对-甲基苄基)三硫醚(26)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色晶体26，收率99％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.66(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ2.33(s，6H)，4.01(s，4H)，7.14(d，4H，J＝8.0Hz)，7.21(d，4H，J＝8.0Hz)。
二(对-叔丁基苄基)三硫醚(28)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色晶体28，收率96％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.50(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ1.30(s，18H)，4.02(s，4H)，7.25(d，4H，J＝8.3Hz)，7.35(d，4H，J＝8.3Hz)。
二(邻-氯苄基)三硫醚(30)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色晶体30，收率77％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.44(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ4.17(s，4H)，7.23-7.28(m，4H)，7.35-7.43(m，4H)。
流程3用方法B合成对称或不对称三硫化合物 二(2，4，6-三甲基苄基)三硫醚(32)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色晶体32，收率59％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.65(40∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ2.27(s，6H)，2.42(s，12H)，4.23(s，4H)，6.87(s，4H)。
二(对-甲氧基苯基)三硫醚(33)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色晶体33，收率98％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.32(20∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ3.80(s，4H)，6.81(d，4H，J＝8.8Hz)，7.47(d，4H，J＝8.8Hz)。
二(4-三氟甲基吡啶-2-基)三硫醚(34)硅胶色谱柱提纯后并用己烷重结晶得到白色晶体34，收率53％；硅胶薄板层析色谱分析(TLC)Rf＝0.61(10∶1己烷-乙酸乙酯)。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ 7.70(d，4H，J＝8.4Hz)，7.84(dd，4H，J＝8.4，2.4Hz)，8.73(s，2H)。
表1-8中所列的不对称有机三硫醚化合物可以遵照化合物41-68的类似方法，由相应的硫醇来合成。
表1各种代表性的二取代三硫衍生物
表2各种代表性的二取代三硫衍生物 表3各种代表性的二取代三硫衍生物
表4各种代表性的二取代三硫衍生物 表5各种代表性的二取代三硫衍生物
表6各种代表性的二取代三硫衍生物
表7各种代表性的二取代三硫衍生物
表8各种代表性的二取代三硫衍生物 流程4和5中所列的二取代三硫醚衍生物可以通过与方法B类似的程序合成。典型的合成过程如下将二氯化硫(20毫摩尔)的无水乙醚(80mL)溶液冷却到-78℃。在搅拌下向该溶液中在三十分钟内滴加1，3-苯二甲基二硫醇或2-丁烯基-1，4-二硫醇(10毫摩尔)和无水吡啶(20毫摩尔)的乙醚(30毫升)溶液。继续搅拌三十分钟。在三十分钟内将第二个相应的硫醇(20毫摩尔)和吡啶(20毫摩尔)在40毫升乙醚中的溶液滴加到反应液中。继续保持反应液温度在-78度并继续搅拌三十分钟。所得反应混合物用水洗涤的两次，用1N的氢氧化钠水溶液洗涤两次，再用水洗涤两次直到水溶液呈中性。所得有机相用二氯化钙或无水硫酸钠干燥，过滤出干燥剂，滤液用旋转蒸发器浓缩。所得粗产品通过一个短的硅胶色谱柱提纯，己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂，所得产品收率为40-90％。
流程4双三硫衍生物的合成
流程5双三硫衍生物的合成 流程6三，四，五硫衍生物的合成 流程6所述方法也用来合成了有机三硫醚衍生物。四硫醚和五硫醚衍生物是用基于文献报道的程序的类似战略合成的[Sinha，P.；Jundu，A.；Roy，S.；Prabhakar，S.；Vairamani，M.；Sankar，A.R.；Kunwar，A.C.Organometallics 2001，20，157-162]。
流程7次磺酸-磺酸硫代酐，硫代磺酸酯和二磺酸硫代酐衍生物的合成 对称的或不对称的次磺酸-磺酸硫代酐衍生物(流程7)可以根据文献报道的程序合成[Karpp，D.N.；Gleason，J.G.；Ash，D.K.J.Org.Chem.1971，36，322-326；和Harpp，D.N.；Ash，D.K.；Smith，R.A.J.Org.Chem.1979，44，4135-4140]。
本发明也提供的药剂配伍包含有效剂量的通式1-5化合物。该药剂配伍可任选地含有一种有效的抗增生化学成份和医药上可接受赋形剂。此处的“有效剂量“指的是对于所治疗对象能产生治疗效果所需要该化合物的用量。该有效量或剂量可以像业内技术人员认识到的那样因情况而异。比如，所治疗的肿瘤种类不同，给药途径不同，是否与其它治疗方法如其他抗肿瘤药物或放射治疗共用等，剂量均可发生改变。
此处所用“抗细胞增生剂”指可以用来治疗或缓解肿瘤或癌症这样的细胞增生病变的治疗剂。抗细胞增生药物的实例包括但并不限于抗肿瘤剂、烷基化剂、植物生物碱、抗微生物剂、磺酰胺类药物、抗病毒药、铂类药物及业内已知的其它抗癌药物。具体的抗细胞增生药物包括但不限于顺铂，卡铂，白消安，甲氨蝶呤，柔红霉素，多柔比星，环磷酰胺，甲胺蝶呤片(mephalan)，长春新碱，长春碱，苯丁酸氮芥，紫杉醇(paclitaxel)，吉西他滨及业内已知的其它药物(见例如，Goodman&Gilman′s，The Pharmacological Basis of Therapeutics(9th Ed)(Goodman，et al.，eds.)(McGraw-Hill)(1996)；和1999Physician′s Desk Reference(1998))。
本发明化合物可以制成任何适用配方。如果某些化合物具有足够的碱性或酸性并生成无毒性的酸加成盐或碱加成盐，可以使用该化合物的盐的形式。医药上可接受的有机酸盐包括生理上可接受的阴离子盐，如对甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，乙酸盐，柠檬酸盐，丙二酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，苯甲酸盐，抗坏血酸盐，α-酮戊二酸盐及α-甘油磷酸盐等。可使用的无机盐包括盐酸盐，硫酸盐，硝酸盐，碳酸氢盐，和碳酸盐等。这些盐可以通过业内众所周知的标准程序制成，如具有像胺这样充分碱性的化合物与合适的酸可以制成所述的盐的形式。羧酸类的化合物可以与碱金属或碱土金属形成可使用的盐。
本发明通式1-5的化合物一般可溶于有机溶剂例如氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醇，甲醇，异丙醇，乙氰，甘油，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，二甲亚砜等中。本发明化合物可以与医药上可接受载体混合而制成配方。制剂通过包含下列步骤的方法制得a)将权利要求1的化合物溶解于水溶性有机溶剂，非离子性溶剂，水溶性类脂，环糊精，生育酚等维生素，脂肪酸，脂肪酸酯，磷脂或这些溶剂的组合溶剂中而制得药物溶液；b)再加入生理盐水或含1-10％碳水化合物如葡萄糖的水溶液。由此而制得的配方稳定并可用于动物和临床用途。
本方法中所用的典型水溶性溶剂包括但不限于聚乙二醇，醇类，乙氰，N-甲基-2-吡咯啉酮，N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，二甲基亚砜以及其组合。醇类的例子包括但不限于甲醇，乙醇，异丙醇，丙三醇或丙二醇。
本方法中所用的典型的水溶性非离子性表面活性剂包括但不限于三蓖麻醇酸聚氧乙烯甘油酯35，琥泊酸聚乙二醇酯，polysorbates 20，polysorbates 80，12-羟基硬脂酸聚乙二醇660酯，失水山梨醇单油酸酯，聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物，乙氧基化杏核油，辛基己酰macrogol-8-甘油酯，甘油酯，PEG 6辛酸甘油酯，甘油，乙二醇失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚(glycol-polysorbate)或其合用。典型的非离子性表面活性剂包括聚乙二醇改性CREMOPHOR(三蓖麻醇酸聚氧乙烯甘油酯35)，CREMOPHOREL，氢化CREMOPHORRH40，氢化CREMOPHORRH60，SOLUTOLHS(12-羟基硬脂酸聚乙二醇660酯)，LABRAFIL(乙氧基化杏核油)，LABRASOL(辛基己酰macrogol-8-甘油酯)，GELUCIRE(甘油酯)，和SOFTIGEN(PEG 6辛酸甘油酯)。
本方法中所用的典型非水溶性类脂包括但不限于菜籽油，甘油三酸酯，植物油或其合用。类脂油类包括但不限于蓖麻油，聚烃氧基蓖麻油，玉米油，橄榄油，棉子油，花生油，薄荷油，红花油，芝麻油，大豆油，氢化菜籽油，氢化大豆油，椰子油三酸甘油酯，棕榈籽油以及其氢化形式或其合用。
本方法中所用的典型脂肪酸和脂肪酸酯包括但不限于油酸，各种甘油单酸酯，甘油二酸酯，PEG的单或二脂肪酸酯，或其合用。
本方法中所用的典型环糊精包括但不限于α-环糊精，β-环糊精，羟丙基-β-环糊精，磺基丁基醚-β-环糊精等。
本方法中所用的典型磷脂包括但不限于大豆卵磷脂，二硬酯酰磷脂酰甘油及其氢化形式或其合用。
业内普通技术人员可以在本说明书教诲之内改进该配方以提供适用于特定给药途径的众多配方。这些化合物还可以进一步改性以使其更易溶解到水或其他溶剂中。为了使这些化合物具有好的药物动力学参数从而在患者身上具有最好的效果，业内普通技术人员也可以改进特定化合物的给药途径和剂量方案。
C.有取代有机硫衍生物及其医药组合物的使用方法 本文中所述的化合物可用来作为细胞毒剂和/或细胞分裂抑制剂，从而用于治疗癌症或其它细胞增生性疾病。这些化合物可通过以下任何一种机理来起作用。例如，该化合物可抑制细胞分裂周期的G2/M期，从而最终诱导肿瘤细胞凋亡。(见如Weung，et al.Biochim.Biophys.Res.Comm.1997，263，398-404)。其中一些化合物可破坏微管蛋白聚合，另一些化合物则可破坏微管蛋白解聚。这些化合物可抑制细胞有丝分裂及诱导细胞凋亡(见如Panda，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，94，10560-10564)。这些化合物也可抑制血管内皮细胞增生，和血管形成效应(见如Witte，et al.Cancer Metastasis Rev.1998，17，155-161)。
本发明同时提供治疗细胞增生紊乱的医药组合物，包含任何一种有上述通式1-5的化合物，其中包括但不限于二苄基三硫醚，二(对-氯苄基)三硫醚，对氯苄基苄基三硫醚，二(对硝基苄基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙烯基)三硫醚，二苯基三硫醚，或二(对叔丁基苯基)三硫醚。
为实施本发明方法，有通式1-5的化合物及其医药组合物可以经口或非肠道途径给药。同时也可以通过雾化吸入，或经局部，经直肠，经鼻，经颊，经阴道给药。同时也可通过体内移植药物源(泵)以及其他方法给药。此处所指的非肠道途径给药是指皮下、皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、心房内、滑膜内、胸骨内、鞘内、创伤部位内、颅内注射或滴注技术。
无菌注射组合物，例如无菌注射水性或油脂性悬浮液可采用常规使用的胶体剂，亲水性制剂和悬液制剂来配方。无菌注射制剂的制备可采用无毒性非肠道途径给药用的稀释剂或溶剂。在这些可采用的媒介质和溶媒包括甘露醇，水，生理食盐水，等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油也通常可被用于溶剂或悬浮液(例如合成的甘油单或双酸酯)。药用植物油，脂肪酸如油酸及甘油衍生物，也可用于注射剂的配制，以及其他药用植物油如橄榄油，蓖麻油。特别是在这些植物油的聚氧乙基化后使用。这些油溶液或悬浮液可以同时含有长链醇稀释剂或分散剂或羟甲基纤维素，或类似分散剂。商业中常用来产生固体、液体或其他药用制剂的各种乳化剂或生物有效度增强剂也可用于配方。
本化合物可制作成口服制剂，其剂型可包括但不限于片剂，胶囊剂，乳状液剂，或水悬浮液、分散液和溶液。口服片剂的常用配料为乳糖和玉米淀粉。诸如硬酯酸镁类的润滑剂，也可用于口服片剂的制备。口服胶囊的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当制备口服用乳状液或水悬浮液时，可在油相中结合乳化剂或悬浮剂在一起，加入一种活性成份，按需可同时加入一些增甜剂，香料，或色素。鼻腔雾化吸入给药制剂成份可以用目前常规运用的药用制剂技术制备。制剂溶液中可含盐，防腐剂(如苄醇)、吸收增强剂来促进生物吸收，以及其他已知的促溶或分散剂。
此外，在对不同肿瘤的治疗中，通式1-5中的化合物可单独给药，也可以与其他抗肿瘤药物联合用药。本发明所指的联合用药治疗过程中，包括运用至少一种本发明所例举的化合物以及其活性衍生物。联合用药时，不同的活性成份或药用成份可以同时使用也可以分别使用。联合用药时的药量和给药时间应根据不同的情况下所取得的最合理治疗效果而定。
在一种实施方案中，本发明涉及使用治疗有效量的通式1-5中的化合物治疗或缓解某一组织或器官的癌症的方法。所指癌症包括但不限于白血病，淋巴瘤，肺癌，结肠癌，中枢神经系统肿瘤，黑素瘤，卵巢癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌，及其它类型增生疾病。
在另一个实例中，本发明涉及使用通式1-5中的化合物例如二苄基三硫醚以及其他硫代衍生物来治疗冠状动脉病病人因冠状动脉支架术后的血管狭窄症。冠状动脉病病人在冠状动脉支架术后所患的血管狭窄症主要是由于血管内皮细胞及细胞外基质增生所致的血管内膜增生。(见例如“Pathology of acute and chronic coronarystenting in humans”，by Farb，A.，Sangiorgi，G.，Certer，A.J.，et al.Circulation，1999，99，44-52)。合理应用具有抗细胞增生活性的化合物有降低临床病人血管性狭窄的危险(见例如“A polymer-based，paclitaxel-eluting stent in patients with coronary artery disease”，byStone，G.W.，Ellis，S.G.，Cox，D.A，et al.New Engl.J.Med.，2004，350，221-231)。因此，DBTS(二苄基三硫醚)和在通式中所列的其他化合物也可以被用来抑制血管内膜增生，从而降低血管内膜增生和血管狭窄。
可用不同的方法来有效地输送通式1-5的化合物到治疗靶位，如细胞。例如，包含DBTS(二苄基三硫醚)或其他通式1-5中的化合物的制剂可以通过口服，非肠道途径或移植药源(泵)等方法给药。另一种情况下，在下面的参考文献中所例举的方法也可以用于本发明所例举的化合物的给药方法“A polymer-based，paclitaxel-eluting stent in patients with coronary artery disease”，by Stone，G.W.，Ellis，S.G.，Cox，D.A.et al.New Engl.J.Med.2004，350，221-231；“A randomized comparison of a sirolimus-eluting stent with astandard stent for coronary revascularization”，by Morice，M.-C.，Serruys，P.W.，Sousa，J.E.，et al.New Engl.J.Med.2002，346，1773-1780；“Sirolimus-eluting stents versus standard stents in patientswith stenosis in a native coronary artery”，by Moses，J.W.，Leon，M.B.，Popma，J.J.，et al，New Engl.J.Med.2003，349，1315-1323。
DBTS(二苄基三硫醚)和其硫代化合物的衍生物的抗肿瘤效果可以用传统的体外肿瘤细胞系和终端细胞存活检测方法来测定。同时也可以用实时微电子细胞传感器系统动态检测细胞反应的方法来测定。现用的几种终端细胞检测方法已广泛用于抗肿瘤药物的开发。例如，美国国家肿瘤研究所提供的终端检测方法对60种肿瘤细胞系的检测。该方法可提供大范围细胞水平的抗肿瘤药物的筛选。(见例如Monks，A.，et al.J Natl.Cancer Inst.1991，83，757-766；Alley，M.C.，et al.Cancer Res.1988，48，589-601；Shoemaker，R.H.，etal.Proc.Clin.Biol.Res.1988，276，265-286；和Stinson，et al.Proc.Am.Asso.Cancer Res.1989，30，613)。
这种筛选方法包括，将含有上千或上万个细胞的细胞悬浮液100微升加入96孔微孔板的一个微孔中，每孔中所加入的特定细胞数因不同细胞类型、细胞体积、细胞生长特性而异。细胞板内的细胞在37℃，饱和湿度和5％二氧化碳条件下培养24小时，然后加入倍数稀释后的所测化合物。例如，连续倍数稀释的倍数可以是10倍，2，3，4倍或5倍(或6-10倍)不等，以达到最高和最低化合物浓度差为10,000。也可运用另一种倍数稀释方法或不同的稀释浓度。典型的稀释例子为，最高化合物浓度为10-4M。在细胞培养24小时后，每孔加入约100微升测试溶液，并作复孔对照。化合物可用有机溶媒DMSO溶解。100微升被测溶液可以是有机相，悬浮液相，以及水相溶液的混合液。
加入化合物后，细胞可在37℃，饱和湿度，5％二氧化碳条件下连续培养48小时。细胞的存活率可用不同的方法来检测。例如，用磺基若丹明B检测方法(如Rubinstein，L.V.，et al.J.Natl.Cancer Inst.1990，82，1113-1118；和Skehan，P.，et al.J.Natl.Cancer Inst.1990，82，1107-1112中所述)。细胞存活可用微孔板计数器测定的光密度来确定。化合物引起50％细胞抑制的浓度IC50可通过不同化合物浓度处理细胞的光密度值来计算(或用GI50值，即用细胞在给化合物前的细胞的光密度值来校正给化合物后测得的数值)。因此，GI50用来测定所测化合物抑制细胞生长的效果。见Boyd，et al，Cytotoxic AnticancerDrugsModels and Concepts for Drug Discovery and Development；Vleriote，F.A.，Corbett T.H.，Baker L.H.(Eds.)；Kluwer AcademicHingham，Mass.，1992，pp 11-34。
另一种检测方法用终端分析法检测化合物对特定肿瘤细胞株细胞毒性作用和/或细胞生长抑制作用。采用NCI所例举的肿瘤细胞株用于检测。细胞在经培养一段时间后(如8小时或24小时)，加入被测连续倍数稀释的化合物，(例如5个连续的10倍稀释)。加化合物后24小时和/或48小时(或一个给定的处理时间)，化合物的计量依赖性细胞毒及细胞生长抑制作用，可用MTT方法检测[例如，如Boyd所述的溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT)试验方法](In Principle of Practice of Oncology，Devita，J.T.，Hellman，S.and Rosenberg S.A.(Eds)，1989，Vol，3，PPO Update，No.10)。
另一种体外检测方法可用于评估化合物对细胞分裂周期的抑制作用。具体来说，向不同浓度的被测化合物加入细胞中，然后培养一段时间，化合物处理过的细胞用propidium iodide染色，并用流式细胞计数仪检测。处在不同细胞周期，如亚G0/G1，G0/G1，S期和G2/M期的细胞亚群数可被流式细胞计数仪定量。诸如所有上述的体外检测方法是细胞水平的、单一时间点及终端数据分析方法。
被检测化合物也同时可以用一种基于细胞电极间电阻抗检测的新的细胞检测方法。不同于常规终端检测法，这种新的检测系统可对化合物的抗肿瘤效果进行实时的动态检测，而且检测是非标记性的。这种方法被用于大规模的抗肿瘤化合物筛选。这种方法集细胞分子生物学和微电子学为一体，是一个基于电子信号检测的生物学分析方法。
有关这一新的实时微电子传感器细胞监测方法技术(RT-CES)和其相关的器件，系统和应用方法已在以下美国专利申请中描述US临时专利申请申请号60/397,749.申请日2002年7月26日；US临时专利申请申请号60/435,400，申请日2002年12月20日；US临时专利申请申请号60/469,572，申请日2003年5月9日；PCT专利申请申请号PCT/US03/22557，申请日2003年7月18日；PCT专利申请申请号PCT/US03/22537，申请日2003年7月18日；PCT专利申请申请号PCT/US04/37696，申请日2004年11月12日；PCT专利申请申请号PCT/US05/04481，申请日2005年2月9日；US专利申请申请号10/705,447，申请日2003年11月10日；US专利申请申请号10/705,615，申请日2003年11月10日；US专利申请申请号10/987,732，申请日2004年11月12日；US专利申请申请号11/055,639，申请日2005年2月9日。
以上专利申请都以参考文献的方式整合到本申请中。有关RT-CES技术进一步相关资料例举在以下专利及专利申请中。
US临时专利申请临时申请号60/519,567，申请日2003年11月12日；US临时专利申请临时申请号60/542,927，申请日2004年2月9日；US临时专利申请临时申请号60/548,713，申请日2004年2月底27日；US临时专利申请临时申请号60/598,608，申请日2004年8月4日；
US临时专利申请临时申请号60/598,609，申请日2004年8月4日；US临时专利申请临时申请号60/613,749，申请日2004年9月27日；US临时专利申请临时申请号60/613,872，申请日2004年9月27日；US临时专利申请临时申请号60/614,601，申请日2004年9月29日；US临时专利申请临时申请号60/630,071，申请日2004年11月22日；US临时专利申请临时申请号60/630,131，申请日2004年11月22日。
以上专利申请都以参考文献的方式整合到本申请中。
采用RT-CES技术来进行细胞电极间阻抗测定，在微孔板底部安置了特定几何形状的微电极，该微电极是面向测试孔。当细胞加入带有微电极的微孔时，细胞便粘附在微电极表面。细胞是否粘附在电极表面以及粘附在电极表面的细胞特性改变均会影响通过电极表面的电子流或离子流。测定电极间的电阻抗变化提供了反映生长在电子传感器上细胞的生物状态重要信息。当细胞状态改变时，这些微电子信号可直接、实时和自动地检测到，并同时转化成数字信号进行处理和分析。RT-CES系统采用细胞指数作测量单位。细胞指数指将所测得的电极电阻抗自动转化成的一个参数。在给定一个微孔中的细胞指数提示(1)该微孔中粘附在电极表面的细胞数量；(2)该微孔中粘附在电极表面的细胞的粘附质量。因此，具同一类型且同一生理特性的细胞及细胞数决定细胞指数的大小。即细胞数越多，细胞指数就越大。另外，细胞粘附力越强(如细胞伸展覆盖电极表面大或粘着力强)，其相应的细胞指数就越大。
通过应用RT-CES，DBTS(二苄基三硫醚)显示出抗多种肿瘤细胞生长的特性。曾经用常规的终端检测方法来检测DBTS(二苄基三硫醚)抗肿瘤细胞生长，但所得出的结论是该化合物不具有抗增生效果。(“Discovery of novel inducers of cellular differentiation using HL-60 promyelocytic cells”，Mata-Greenwood，E.，Ito，A.，Westernburg，H.，Cui，B.，Mehta，R.G.，Kinghorn，A.D.and Pezzuto，J.M.Anticancer Res.2001，21，1763-1770)。
采用与10种作用机理不同的化合物以及测试12种肿瘤细胞株来比较DBTS(二苄基三硫醚)，从而评估其抗肿瘤效果和预测可能的作用机理。从时间依赖性的细胞反应图谱来看，DBTS(二苄基三硫醚)具有和紫杉醇、长春碱或秋水仙素相同的作用机理。也不排除同时DBTS(二苄基三硫醚)具有和紫杉醇、长春新碱或秋水仙素不同的作用机理。
除了体外细胞模型，各种检测方法所得出的该化合物的抗肿瘤特性外，该化合物的体内动物模型试验也提示其抗肿瘤效果。所指的动物体内模型指小鼠动物模型。
使用实时细胞微电子传感系统(RT-CES)进行基于细胞的体外筛选 RT-CES系统包含三个部分一个电子传感器分析仪，一个检测台，和一个16X或96X微滴定板。应用光蚀微刻技术(lithographical micro fabrication method)将微电极传感器阵列制成微电极玻片，在此电极玻片上装配酶标板成为带电极的孔。每个RT-CES系统所使用的16X或96X微滴定板都包含16个(或96个)这样带电极的孔。检测台可与16X或96X微滴定板连接，并可将每个孔开关选接到传感器分析仪进行电阻抗测量。实际操作时，在各个孔中加有细胞的检测板放置在检测台上，并与检测台一同置于二氧化碳培养箱中。在检测台与分析仪之间有电缆线连接。在RT-CES软件的操作下，分析仪可自动选择所需测量的孔并持续测量电阻值。由分析仪所测得的电阻抗数据传输至计算机并由软件系统对数据进行分析处理。
各个孔中电极之间阻抗的测量取决于电极的形状、孔中的离子浓度、以及孔中是否有细胞贴附于电极上。当电极上无细胞贴附时，电极阻抗主要取决于在电极/溶液接触面的和溶液中的离子环境。当有细胞时，细胞贴附于电极传感器表面，改变电极/溶液接触面的离子环境，引起阻抗的增高。贴附于电极的细胞越多，细胞-电极的阻抗越大。而且，阻抗的改变还依赖于细胞的形状和贴附在电极上的细胞的伸展状态。
为基于测量到的细胞-电极阻抗量化细胞状态，推导了一个称为细胞指数(Cell Index，CI)的参数，由下式计算出CI=maxl=1,···,N(Rcell(f1)Rb(f1)-1)]]>其中Rb(f)和Rcell(f)分别表示有细胞贴附和无细胞贴附时的相应频率的电极电阻(阻抗的一个成分)。N为测量阻抗时的频率点数。因此，细胞指数是带有电极的孔中的细胞状态的定量测量。在相同的生理状态下，贴附于电极上的细胞越多，则Rcell(f)值越大，细胞指数也就越大。而且，当孔中有相同的细胞数目时，细胞状态改变(如细胞形态改变)会引起细胞指数的变化。例如，细胞贴附或细胞伸展增加会引起细胞-电极接触面积增加，而引起Rcell(f)值增大，因此，细胞指数的值变大。细胞指数也可用另外的公式来计算。其余基于阻抗测量细胞指数的计算方法见PCT申请号为PCT/US04/37696，递交于2004年11月12日；PCT申请号为PCT/US05/04481，递交于2005年2月9日；US专利申请号10/987,732，递交于2004年11月12日和US专利申请号11/055,639，递交于2005年2月9日。
不同类型的人体肿瘤细胞，包括NCI-H460(非小细胞肺癌)，MV522SW(非小细胞肺癌)，MCF7(乳腺癌)，A549(非小细胞肺癌)，PC3(前列腺癌)，A431(表皮癌)，HT1080(纤维肉瘤)，MDA.MB2321(乳腺癌)，HT29(结肠癌)，HCC2998(结肠癌)，OVCAR4(卵巢癌)，A2780(卵巢癌)，HepG2(肝癌)，将上述各个细胞以不同的细胞数(4000到20,000细胞每孔)接种到16X或96X微滴定板上，并以RT-CESTM系统监测。在加入溶于DMSO的DBTS(二苄基三硫醚)溶液前让细胞在板上生长24小时，(DMSO的终浓度0.2％，DBTS的终浓度1.5625μM和100μM之间)。经持续测量细胞-电极的阻抗，即可获得时间-细胞指数曲线，并被记录下来。
图1-5，6A和7-12显示一定细胞数时，在加入不同浓度的DBTS之前和加入DBTS之后的时间-细胞指数曲线。如图所示，DBTS对肿瘤细胞增生呈现抑制作用。DBTS对不同类型的肿瘤细胞作用不同。对于某些细胞类型，较低剂量的二苄基三硫醚已经明显抑制肿瘤细胞的增生，而对于另一些细胞类型，则需较高剂量才能获得相似的抑制肿瘤的结果。
在一个实例中，图1B和1C显示H460细胞(非小细胞肺癌)在加入不同浓度的秋水仙素和紫杉醇之前和之后的时间-细胞指数曲线。如图1B和1C所示，秋水仙素和紫杉醇在不同浓度梯度时都可抑制A431细胞增生。而且，如图所示，在加入药物(秋水仙素或者紫杉醇)后，H460的细胞指数随时间先下降然后升高，显示H460对于秋水仙素或者紫杉醇有复杂的动力学反应。值得一提的是，图1A中细胞在浓度为25μM以上的二苄基三硫醚(DBTS)的影响下，与图1B和1C(即加入25μM以上的二苄基三硫醚(DBTS)中的曲线相似，H460的细胞指数也是首先随时间降低然后升高。
在另一个实例中，图6B显示A431(上皮癌)在加入不同浓度的5-氟尿嘧啶之前和之后的时间-细胞指数曲线。如图6B所示，5-氟尿嘧啶在浓度为12.5μM以上抑制A431细胞增生。图6A显示的时间-细胞指数曲线与图6B显示的有显著不同。
在另一个实例中，图13显示HepaG-2细胞在DBTS作用下的细胞指数。图13中DBTS未显示有抑制HepG-2细胞增生的能力。
抗肿瘤活性的体内检测 为了评测化合物DBTS以及ACEA100108(DBTS的一种衍生物，见表33)的体内抗肿瘤活性，使用了多种小鼠动物模型，包括小鼠肉瘤S180模型，小鼠Lewis肺癌模型，P388白血病模型，以及三种人体肿瘤在免疫缺陷裸鼠体内的异种移植模型Bcap-37乳腺癌，HCT-8结肠癌，ao12/17卵巢癌。被测化合物的体内抗肿瘤活性详述如下。
化合物DBTS以及ACEA100108的急性毒性作用的评估 为评估DBTS以及ACEA100108(DBTS的一种衍生物，见表33)在静脉注射后体内的急性毒性反应，试验在无肿瘤状态下进行。正常昆明小鼠单剂量静脉注射(i.v.)一次剂量的DBTS或ACEA100108，并观察急性毒性反应。观察用药后所死亡的小鼠数量并作记录。计算这些化合物的LD50值。详细记录如下。
下述实例用以举例说明，但不限定本发明。
例1DBTS对小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤活性 为了评价被测化合物的体内抗肿瘤活性，使用两个移植肿瘤模型进行体内评测一个是小鼠肉瘤S180模型，另一个是小鼠Lewis肺癌模型。试验用小鼠饲养于上海医药工业研究院(Pharmacology Labof Shanghai Pharmaceutical Industry Institute)。小鼠来源与规格如下所述。小鼠为C57BL/6昆明种，由Academic Sinica动物试验中心提供，证书号Academic Sinica实验动物证书，5号。小鼠体重介于18-20g。所用小鼠雌雄皆有。但同一次试验所用动物的性别是相同的。实验动物的数量如下被测化合物组(test compound group)小鼠30只，其中10只为高剂量组(high dose group)，10只为中等剂量组(middle dosegroup)，10只为低剂量组(low dose group)；化合物阳性对照组(positivecontrol group)10只小鼠；阴性对照组(negative control group)20只小鼠，其中10只为生理盐水(Saline)组，10只为溶剂(溶剂)组。所用高、中、低剂量的DBTS分别为50、25和12.5mg/kg/d。
实验对照。阴性对照组分为两组给予溶剂的对照组，和给予生理盐水的对照组。在给予溶剂的对照组中，每只小鼠每天静脉注射与高剂量DBTS组相同体积相同浓度(鼠肉瘤S180模型10％DBTS；小鼠Lewis肺癌模型5％DBTS)的溶剂，连续给药7到10天。生理盐水对照组每只小鼠每天给予0.5ml生理盐水，连续7到10天。阳性对照组，使用抗肿瘤药物环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)30mg/kg每天静脉注射，连续7到10天。
被测化合物制备和使用。用于肿瘤模型中检测其抗肿瘤作用的化合物按照下述方法配制。小鼠肉瘤S180模型中，200mgDBTS首先溶解于10ml蓖麻油(氢化蓖麻油)中，再加入90ml生理盐水。DBTS在溶液中的浓度是0.2％，最终溶剂浓度是10％。每只小鼠分别静脉注射0.5ml(高剂量)，0.3ml(中等剂量)和0.15ml(低剂量)药物溶液。
小鼠Lewis肺癌模型中，200mgDBTS溶解于5ml蓖麻油(氢化蓖麻油)中。每次使用前，此溶液用生理盐水稀释DBTS至终浓度分别为0.2％(高剂量)，0.1％(中等剂量)，0.05％(低剂量)。在本例中，每只小鼠(重约20g)静脉注射0.5ml所需剂量的药物溶液。静脉注射速度为0.5ml/0.5min。
被测化合物的给药剂量和方法依据药理学常规。例如，被测药物静脉注射每天两次，连续7天。或者，静脉注射每天一次，连续10天。
移植用肿瘤细胞的制备和药效的确定。肿瘤细胞的制备，将快速生长的肿瘤从被移植了肿瘤的小鼠中取出(小鼠肉瘤S180模型和小鼠Lewis肺癌模型)，将肿瘤组织切碎，制成肿瘤细胞浓度为2-4×107/ml的肿瘤细胞悬液。0.2mL肿瘤细胞悬液(约4-8百万肿瘤细胞)经皮下注射移植到试验小鼠。肿瘤细胞移植24小时后，小鼠经静脉注射一定剂量的DBTS，生理盐水或者溶剂作为阴性对照组，或者腹膜下注射50mg/kg CTX作为阳性对照组。肿瘤移植两周后，处死小鼠取出移植的肿瘤组织。称取每次取出的固体肿瘤重量，经DBTS处理的实验组的和CTX处理的对照组的抑瘤率由下列算式得出。
抑瘤率％＝(阴性对照组的肿瘤平均重量-药物治疗组肿瘤平均重量)/阴性对照组的肿瘤平均重量×100(2) 小鼠肉瘤S180模型，每只小鼠皮下注射约5百万S180细胞。移植后24小时，实验组每只小鼠每天分别静脉注射DBTS 50、25、或12.5mg/kg，连续7到10天。阳性对照组每天每只小鼠经腹膜注射环磷酰胺(CTX)50mg/kg，连续7天。阴性对照组每只小鼠每天静脉注射生理盐水或DBTS中相同浓度的所用溶剂，连续7天。每个实验组小鼠数量都为10只。
小鼠Lewis肺癌模型，每只小鼠Lewis皮下注射约5百万肺癌细胞。移植后24小时，实验组每只小鼠每天分别静脉注射DBTS50、25、或12.5mg/kg，连续7到10天。阳性对照组每天每只小鼠经腹膜注射CTX 50mg/kg，连续10天。阴性对照组每只小鼠每天静脉注射生理盐水或DBTS中相同浓度的所用溶剂，连续7天。每个实验组小鼠数量都为10只。
结果。小鼠肉瘤S180模型显示，给药剂量为50，25和12.5mg/kg的DBTS平均肿瘤抑制率(average tumor inhibition rate)分别是63.30％，54.68％和48.69％(相对生理盐水对照组)。详细结果见表9和图1，显示0.2％DBTS在小鼠肉瘤S180模型中体内药效。在图14中显示，此7行(分别为1-7)显示下列给药成分(iv×7qd)1)阴性对照组；2)生理盐水组；3)DBTS(25ml/kg)；4)DBTS(15ml/kg)；5)DBTS(7.5ml/kg)；6)溶剂对照组(15ml/kg)；和7)阳性对照组CTX(30mg/kg)。
在静脉注射DBTS后立刻可见小鼠呈现一些一过性非正常反应，包括跳跃、呼吸加速，随后活动减少并卧倒。如此反应常持续10-15分钟。在静脉注射溶剂的小鼠中也可观察到相同的非正常反应。因此，导致小鼠出现此类非正常反应的原因为注射的速度以及溶剂浓度较高而不是DBTS。
小鼠Lewis肺癌模型显示，给药剂量为50，25和12.5mg/kg的DBTS平均肿瘤抑制率(average tumor inhibition rate)分别是67.05％，51.34％和45.21％(相比于生理盐水对照组)。详细结果见表10和图15，显示0.2％DBTS Lewis肺癌模型中体内药效。在图15中显示，此7行(分别为1-7)显示如下给药成分1)阴性对照组；2)生理盐水组；3)DBTS(25ml/kg)；4)DBTS(15ml/kg)；5)DBTS(7.5ml/kg)；6)溶剂对照组(15ml/kg)；和7)阳性对照组CTX(30mg/kg)。DBTS和溶剂对照组的给药时间为iv×10 qd；阳性对照组的给药时间为ip×7qd.相对小鼠肉瘤S180试验，在本试验中静脉注射DBTS或者溶剂的小鼠都未显示明显的一过性异常反应。
当使用溶剂作为阴性对照时，如表11显示，给药剂量为50、25和12.5mg/kg的DBTS对小鼠肉瘤S180的体内肿瘤抑制率分别为50.25％，38.58％和30.46％。如表12显示，给药剂量为50、25和12.5mg/kg的DBTS对小鼠Lewis肺癌的体内肿瘤抑制率分别为62.28％，44.30％和37.38％。
由上述两种肿瘤移植模型所得出结果可见，静脉注射DBTS对所移植的肿瘤在小鼠体内的生长有特异性抑制作用。当静脉注射高剂量DBTS(50mg/kg/d，连续7到10天)，当使用生理盐水为对照组时，在两个肿瘤模型中肿瘤抑制率都可达65％。DBTS所用溶剂在小鼠肿瘤移植模型中显示微弱抑制作用，静脉注射此溶剂也可能引起小鼠的一些一过性异常反应。
表9DBTS对小鼠肉瘤S180模型体内抗肿瘤活性(皮下移植肉瘤)

p＜0.01，相比于阴性对照。
表10DBTS对小鼠Lewis肺癌模型体内抗肿瘤活性(皮下移植肿瘤)

p＜0.01，相比于阴性对照。
表11DBTS对小鼠肉瘤S180模型体内抗肿瘤活性(皮下肉瘤移植)

p＜0.01，相对于阴性对照溶剂组(10％)。
表12DBTS对小鼠Lewis肺癌模型体内抗肿瘤活性(皮下移植肿瘤)

p＜0.01，相对于阴性对照溶剂组(10％)。
例2DBTS在小鼠Lewis肺癌中的抗肿瘤作用 本实验是二苄基三硫醚(DBTS)在小鼠Lewis肺癌模型的体内抗肿瘤作用的重复实验。实验所用小鼠饲养于上海医药工业研究院(Pharmacology Lab of Shanghai Pharmaceutical IndustryInstitute)。实验所用小鼠种类为C57BL/6，由Academic Sinica动物实验中心提供，证书号SCXK(Shanghai)2003-0003。小鼠重量为18-20g。使用小鼠性别皆为雌性。试验用小鼠数量如下每个剂量组10只，阳性对照组10只，阴性对照组10只(10只为生理性对照组，10只为溶剂对照组)。
实验对照组。阴性对照组分为两组一组为给予溶剂对照组，另一组为给予生理盐水对照组。对于溶剂对照组，每只小鼠静脉注射与高剂量组DBTS中相同体积相同浓度(5％溶剂溶于生理盐水中)，每日一次，连续7-10天。对于生理盐水组，每只小鼠给予0.5ml生理盐水，每日一次，连续10天。对于阳性对照组，使用抗肿瘤药物CTX(腹膜内注射)腹膜内注射每日30mg/kg，连续7天。另外，作为参考组，使用抗肿瘤药物紫杉醇(Taxol)，分别给予静脉注射每天15、10和7.5mg/kg，连续给药5天。
被测化合物制备和使用。400mg DBTS溶解于10mL蓖麻油(溶剂)中，使DBTS在溶剂中的浓度达到40mg/ml。每次使用时，将此溶液用生理盐水稀释以达到所需浓度，分别为0.2％(高剂量)、0.1％(中等剂量)和0.05％(低剂量)。每只小鼠静脉注射药物溶液0.5mL，注射速度为0.5ml/0.5min。肿瘤移植24h后，将药物溶液静脉注射到带瘤小鼠体内，每天一次，连续7或10天。
移植肿瘤细胞准备和药效确定。肿瘤细胞的制备，将快速生长的肿瘤从被移植了肿瘤的小鼠中取出(小鼠肉瘤S180模型和小鼠Lewis肺癌模型)，将肿瘤组织切碎，制成肿瘤细胞浓度为2-4×107/ml的肿瘤细胞悬液。0.2mL肿瘤细胞悬液(约4-8百万肿瘤细胞)经皮下注射移植到试验小鼠。肿瘤细胞移植24小时后，小鼠经静脉注射一定剂量的DBTS，生理盐水或者溶剂作为阴性对照组，或者腹膜下注射50mg/kg CTX作为阳性对照组。肿瘤移植两周后，处死小鼠取出移植的肿瘤组织。称取每次取出的固体肿瘤重量，各个剂量组的肿瘤抑制率由实例1种算式(2)求得。(例1DBTS对小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤活性)。
小鼠Lewis肺癌模型，Lewis肺癌细胞经皮下注射约6百万细胞到每只小鼠。移植后24小时，实验组每只小鼠每天分别静脉注射DBTS 50、25或12.5mg/kg，连续10天。阳性对照组每天每只小鼠经腹膜注射CTX 30mg/kg，连续7天。阴性对照组每只小鼠每天静脉注射生理盐水或DBTS中相同浓度的所用溶剂，连续7或10天。每个实验组小鼠数量都为10只。紫杉醇(Taxol)参照组(reference group)，每只小鼠每天静脉注射紫杉醇(Taxol)15、10或7.5mg/kg，连续5天。
结果。小鼠Lewis肺癌模型，给药剂量为50，25和12.5mg/kg的DBTS平均肿瘤抑制率(average tumor inhibition rate)分别是65.77％、51.61％和43.10％(相对生理盐水对照组)。详细结果见表13。当使用溶剂作为阴性对照时，相应剂量DBTS的体内肿瘤抑制率分别为61.02％，46.94％和35.10％(如表14显示)。在静脉注射DBTS后立刻可见小鼠呈现一些一过性非正常反应，包括跳跃、呼吸加速，随后活动减少并卧倒。如此反应常持续10-15分钟。在静脉注射溶剂的小鼠中也可观察到相同的非正常反应。
在参照实验组中，注射紫杉醇剂量为15、10和7.5mg/kg的小鼠紫杉醇(Taxo)的平均抑制肿瘤率为48.94％、36.97和30.28％(相对于生理盐水组)。详细结果见表15。
由小鼠Lewis肺癌肿瘤移植模型所得出结果可见，静脉注射DBTS对所移植的肿瘤在小鼠体内的生长有特异性抑制作用。相比较于生理盐水对照组静脉注射高剂量DBTS(50mg/kg/d，连续10天)，在肿瘤模型中的肿瘤抑制率可达65％。此数据具可重复性。DBTS所用溶剂在小鼠抑制肿瘤模型中显示微弱抑制作用，静脉注射此溶剂也可能引起小鼠的一些一过性异常反应。因此DBTS的结构在将来的体内研究中将会被进一步改良。
表13DBTS对小鼠Lewis肺癌模型体内抗肿瘤活性(皮下移植肿瘤)

***P＜0.01，相比于阴性对照。
表14DBTS对小鼠Lewis肺癌模型体内抗肿瘤活性(皮下移植肿瘤)

***P＜0.01，相对于阴性对照溶剂组(10％)。
表15紫杉醇(Taxol)对小鼠Lewis肺癌模型体内抗肿瘤活性(皮下移植肿瘤)本数据在此作为参考

***P＜0.01，相比于阴性对照组。
注意紫杉醇(Taxo1)常在抗肿瘤能力检测中用于阳性对照。
剂量为10mg/kg/d，iv×7qd。
例3ACEA100108对小鼠lewis肺癌模型和小鼠P388白血病模型，裸鼠Bcap-37人体乳腺癌和HCT-8人体结肠癌模型的体内抗肿瘤活性 采用小鼠体内移植肿瘤模型以检测化合物ACEA100108(DBTS的一种衍生物，见表33)的体内抗肿瘤活性。小鼠体内肿瘤移植模型包括小鼠lewis肺癌模型和小鼠P388白血病模型，以及用免疫缺陷的裸鼠做的两种人体肿瘤异体移植模型Bcap-37人体乳腺癌和HCT-8人体结肠癌模型。所有小鼠模型都在上海医药工业研究院药理实验室(Pharmacology Lab of Shanghai Pharmaceutical IndustryInstitute)进行。人体肿瘤异体移植模型，肿瘤细胞在裸鼠体内传代两次后被移植到裸鼠体内进行试验。也就是说，在培养瓶中培养的人体肿瘤细胞首先被异体移植到裸鼠体内，直至肿瘤细胞在裸鼠体内生长成为一定体积的肿瘤后，将肿瘤组织从体内取出，并将其切碎。从切碎的肿瘤组织中获得的细胞悬浮液被重新移植回免疫缺陷的裸鼠体内(人体肿瘤异体移植模型中肿瘤细胞的二次传代)。肿瘤细胞生长至一定体积后，将肿瘤组织从体内取出，并将肿瘤组织切碎。从切碎的肿瘤组织中获得的细胞悬浮液用于在此描述的人体肿瘤异体移植模型。
实验用小鼠类型为C57BL/6，DBF1和BALB/c裸鼠。由Academic Sinica动物实验中心提供，证书号SCXK(Shanghai)2003-0003。小鼠体重18-22g。所用小鼠雌雄皆有。但是，同一次试验所用动物的性别是相同的。小鼠肿瘤移植模型的实验动物数量如下每个剂量组各10只，阳性对照组10只，阴性对照组20只。人体肿瘤异体移植模型的数量为每个剂量组各6只，阳性对照组6只，阴性对照组12只。
实验对照组。阴性对照组，小鼠静脉注射每只小鼠静脉注射与高剂量组ACEA100108中相同体积相同浓度的溶剂，每日一次，连续7天。对于阳性对照组，使用抗肿瘤药物紫杉醇(Taxol)静脉注射每日10mg/kg，连续7天。使用DBTS静脉注射每天50mg/kg，连续给药7天，作为参考组。
待测化合物的制备和使用。ACEA100108溶解于蓖麻油(溶剂)中，使ACEA100108在溶剂中的浓度达到20mg/ml。每次使用前，将此溶液用生理盐水稀释以达到所需浓度。每只小鼠(重约20g)静脉注射药物溶液0.5mL，注射速度为0.5ml/0.5min。肿瘤移植24h后，将药物溶液静脉注射到带瘤小鼠体内，每天一次，连续7或10天。所使用的ACEA100108剂量减递梯度由100mg/kg到6.25mg/kg。
移植肿瘤细胞的制备和药效确定。肿瘤细胞的制备，将快速生长的肿瘤从被移植了肿瘤的小鼠中取出(小鼠Lewis肺癌模型，异体移植人体乳腺癌和人体结肠癌模型)，将肿瘤组织切碎，制成肿瘤细胞浓度为2-4×107/ml的肿瘤细胞悬液。0.2mL肿瘤细胞悬液(约4-8百万肿瘤细胞)在右侧腋下经皮下注射被移植到试验小鼠。肿瘤细胞移植24小时后，小鼠经静脉注射一定剂量的ACEA10010，或者溶剂作为阴性对照组，或者腹膜下注射10mg/kg紫杉醇(Taxol)作为阳性对照组，或者50mg/kg DBTS作为参照组。肿瘤移植两周到四周内，处死小鼠取出移植的肿瘤组织。称取每次取出的固体肿瘤重量，各个剂量组的肿瘤抑制率由实例1中算式(2)求得(DBTS对小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤活性)。
人体异体移植肿瘤模型中，所有使用的物品，包括动物食物，动物饲养笼，支持物，以及所有接触动物的器具，都经过高压消毒。裸鼠饲养于SPF条件下的层流环境中。肿瘤移植后，动态测量每个剂量组的小鼠重量和肿瘤体积，并绘图。测量肿瘤的长轴(a)和短轴(b)，肿瘤的体积由下式得出肿瘤体积＝a×b2/2(3) P388鼠类白血病模型的肿瘤细胞制备。在无菌条件下取出获得白血病小鼠的腹水，用生理盐水稀释至所需细胞浓度(腹水与生理盐水比为1∶6)。将细胞悬浮液0.2ml腹膜注射。肿瘤细胞移植至小鼠体内24小时后，给小鼠注射给定剂量的ACEA100108或者注射溶剂作为阴性对照组，或者10mg/kg紫杉醇(Taxol)以及注射2mg/kgMMC(mitomycin C)作为阳性对照组，或者注射50mg/kg DBTS作为参照组。携瘤小鼠的存活时间控制在30天内。各个用药组的存活率与阴性对照组相比的计算方法如下存活时间率％＝药物治疗组平均存活率/阴性对照组平均存活率×100％(4) 结果。Lweis肺癌肿瘤模型显示，ACEA100108的平均体内抑瘤率在不同给药剂量组100mg/kg(因毒性作用注射次数仅为5次)、25mg/kg和12.5mg/kg分别为60.15％、55.35％和34.32％(相比较于溶剂对照组)。在同一个实验中，DBTS的平均体内抑瘤率在不同剂量组100mg/kg(因毒性作用注射次数仅为5次)、25mg/kg分别为63.10％和57.93％；紫杉醇(Taxol)的体内抑瘤率在常规剂量为10mg/kg时为43.91％。结果见表16。
在鼠类白血病模型中，药物ACEA100108剂量组为50、25mg/kg和12.5mg/kg治疗平均延长寿命时间分别为106.18％、107.22％和109.28％。在同一个实验中，用药物剂量为50mg/kg的DBTS治疗后平均延长寿命时间为109.28％，用药物剂量为10mg/kg的紫杉醇(Taxol)治疗后平均延长寿命时间为109.28％。详细记录见表17。
Bcap-37人体乳腺癌裸鼠异体移植模型中，药物ACEA100108剂量组为50、25mg/kg和8mg/kg体内平均抑制肿瘤率分别为64.13％、56.10％和31.40％。在同一个实验中，用药物剂量为50mg/kg的DBTS治疗后体内平均抑制肿瘤率为66.98％，用药物常规剂量为10mg/kg的紫杉醇(Taxol)治疗后平均抑制肿瘤率为48.84％。详细记录见表18，图16，表明化合物DBTS和ACEA100108对Bcap-37人体乳腺癌裸鼠异体移植模型的药效。在图16中，此7行(分别为1-7)显示了下列成分的使用结果1)阴性对照组；2)溶剂组；3)ACEA100108组(50mg/kg)；4)ACEA100108组(20mg/kg)；5)ACEA100108组(8mg/kg)；6)DBTS组(50mg/kg)；和7)阳性对照组(紫杉醇(Taxol)，10mg/kg)。所用药物和对照药物为静脉注射，共7天。肿瘤尺寸的动态改变见表19和图17。携带肿瘤小鼠体重的动态变化见表20和图18。
在裸鼠HCT-8人肠癌异体移植模型中，ACEA100108显示体内平均肿瘤抑制率在剂量浓度为50、25和8mg/kg时分别为45.62％、28.10％和15.03％。在相同的实验中，DBTS显示体内平均肿瘤抑制率在剂量浓度为50mg/kg时为46.08％；紫杉醇(Taxol)显示体内平均肿瘤抑制率在常规剂量浓度为10mg/kg时为33.33％。详细记录见表21，图19，描述了在裸鼠HCT-8人肺癌异体移植模型中DBTS和ACEA100108的作用效果。图19中，此7行(分别为1-7)显示使用下列药物的结果1)阴性对照组；2)溶剂组；3)ACEA100108组(50mg/kg)；4)ACEA100108组(20mg/kg)；5)ACEA100108组(8mg/kg)；6)DBTS组(50mg/kg)；和7)阳性对照组(紫杉醇(Taxol)，10mg/kg)。所用药物和对照药物为静脉注射，共7天。肿瘤尺寸的动态改变见表22和图20。携带肿瘤小鼠体重的动态变化见表23和图21。
基于上述两个小鼠肿瘤模型和两种人体肿瘤异体移植模型的体内评估，ACEA100108在使用剂量为50mg/kg，iv.7天时有明显效果。另外，ACEA100108在Lewis小鼠肺癌和Bcap37人体乳腺癌模型中的抗肿瘤作用强于HCT-8人肠癌异体移植模型中的抗肿瘤作用。但是，ACEA100108在P388小鼠白血病模型中无明显抗肿瘤作用。而且，对于使用相同时间和相同剂量的药物，上述各模型中ACEA100108和DBTS的抗肿瘤作用相似，且优于常规使用方法的紫杉醇(TAXOL)的抗肿瘤作用。
表16化合物ACEA100108对小鼠Lewis肺癌皮下接种模型的体内抗肿瘤活性

***P＜0.01，相对于阴性对照组。
表17化合物ACEA100108对小鼠P388白血病模型体内抗肿瘤活性(肿瘤腹膜注射移植至宿主小鼠)

***p＜0.01，相对于阴性对照组。
注意一般说来，当经化合物处理后的携瘤小鼠的存活率超过125％即可认为此化合物有抗肿瘤能力。
表18化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体皮下移植Bcap-37人乳腺癌的体内抗肿瘤活性

***P＜0.01，相对于阴性对照组。
表19化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体皮下移植Bcap-37人乳腺癌的体内抗肿瘤测试肿瘤大小的动态变化

10/12在12只小鼠中，有10只小鼠的肿瘤足够大至手可触及肿瘤。
表20化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体皮下移植Bcap-37人乳腺癌的体内抗肿瘤测试携瘤小鼠体重的动态变化

表21化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体皮下移植HCT-8人结肠癌的体内抗肿瘤活性

***P＜0.01，相对于阴性对照组。
表22化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体皮下移植HCT-8人结肠癌的体内抗肿瘤测试及肿瘤体积的动态变化

4/6在6只小鼠中，有4只小鼠的肿瘤足够大至手可触及肿瘤。
表23化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体皮下移植HCT-8人结肠癌的体内抗肿瘤测试携瘤小鼠体重的动态变化

例4ACEA100108在裸鼠ao10/17人体卵巢肿瘤的体内抗肿瘤活性 使用免疫缺陷的裸鼠ao10/17人体卵巢肿瘤异体移植模型检测ACEA100108的体内抗肿瘤活性。细胞株和小鼠被存放于上海药物研究所药理实验室(Pharmacology Lab of Shanghai PharmaceuticalIndustry Institute)。ao10/17人体卵巢肿瘤异体移植模型，肿瘤细胞在裸鼠体内传代两次后被移植到裸鼠体内进行试验。也就是说，在培养瓶中培养的人体肿瘤细胞首先被异体移植到裸鼠体内，直至肿瘤细胞在裸鼠体内生长成为一定体积的肿瘤后，将肿瘤组织从体内取出，并将其切碎。从切碎的肿瘤组织中获得的细胞悬浮液被重新移植回免疫缺陷的裸鼠体内(即肿瘤细胞在人体肿瘤异体移植模型中的二次传代)。至肿瘤细胞生长至一定体积，将肿瘤组织从体内取出，并将肿瘤组织切碎。从切碎的肿瘤组织中获得的细胞悬浮液用于在此描述的人体肿瘤异体移植模型。
实验用小鼠类型为C57BL/6，DBF1和BALB/c裸鼠。由Academic Sinica动物实验中心提供，证书号SCXK(Shanghai)2003-0003。小鼠体重18-22g。所用小鼠为雌性。人体肿瘤异体移植模型的试验裸鼠数量为每个剂量组各6只，阳性对照组6只，阴性对照组12只。ACEA100108的高中低剂量分别为50mg/kg/d、25mg/kg/d和8mg/kg/d。
实验对照。阴性对照组，每只小鼠静脉注射与高剂量组ACEA100108中相同体积相同浓度的溶剂，每日一次，连续7天。对于阳性对照组，使用抗肿瘤药物紫杉醇(Taxol)静脉注射每日10mg/kg，连续7天。作为参考组，使用DBTS静脉注射每天50mg/kg，连续给药7天。
待测化合物的制备和使用。ACEA100108溶解于蓖麻油(溶剂)中，使ACEA100108在溶剂中的浓度达到20mg/ml。每次使用前，将此溶液用生理盐水稀释以达到所需浓度。每只小鼠(重约20g)静脉注射药物溶液0.5mL，注射速度为0.5ml/0.5min。肿瘤移植24h后，将药物溶液静脉注射到带瘤小鼠体内，每天一次，连续7天。ACEA100108的高中低剂量分别为50、25和8mg/kg/d。
肿瘤移植细胞的制备和药效确定。人体卵巢肿瘤异体移植模型中肿瘤细胞的制备，将快速生长的肿瘤从被移植了肿瘤的小鼠中取出，将肿瘤组织切碎，肿瘤组织中加入生理盐水(肿瘤组织体积和生理盐水体积比1∶6)制成肿瘤细胞悬液。0.2mL肿瘤细胞悬液在右侧腋下经皮下注射移植到试验小鼠。肿瘤细胞移植24小时后，小鼠经静脉注射一定剂量的ACEA100108，或者溶剂作为阴性对照组，或者腹膜下注射10mg/kg紫杉醇(Taxol)作为阳性对照组，或者50mg/kg DBTS作为参照组。肿瘤移植两周到四周内，处死小鼠取出移植的肿瘤组织。称取每次取出的固体肿瘤重量，各个剂量组的肿瘤抑制率由例1中算式(2)求得(例1DBTS对小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤活性)。
人体卵巢肿瘤异体移植模型中，所有使用的物品，包括动物食物，动物饲养笼，支持物，以及所有接触动物的器具，都经过高压消毒。裸鼠饲养于SPF条件下的层流环境中。肿瘤移植后，各个剂量组的小鼠重量和肿瘤体积都被动态测量，并绘图。肿瘤体积大小由测量肿瘤的长轴(a)和短轴(b)，由例三中等式(3)得出(ACEA100108对小鼠Lewis肺癌模型和小鼠P388白血病模型，裸鼠Bcap-37人体乳腺癌和HCT-8人体结肠癌模型的体内抗肿瘤活性)。
结果。裸鼠Ao10/17人体卵巢肿瘤异体移植模型显示，ACEA100108的平均体内抑瘤率在不同剂量组50、25和8mg/kg分别为53.40％、46.67％和33.19％。在同一个实验中，DBTS的平均体内抑瘤率在剂量组50mg/kg为57.30％；紫杉醇(Taxol)的体内抑瘤率在常规剂量为10mg/kg时为45.39％。详细记录见表24，图22，描述了在裸鼠人体卵巢肿瘤异体移植模型DBTS和ACEA100108的作用效果。图22中，7行(分别为1-7)显示使用下列药物的结果1)阴性对照组；2)溶剂组；3)ACEA100108组(50mg/kg)；4)ACEA100108组(20mg/kg)；5)ACEA100108组(8mg/kg)；6)DBTS组(50mg/kg)；和7)阳性对照组(紫杉醇(Taxol)，10mg/kg)。所用药物和对照药物为静脉注射，共7天。
肿瘤体积的动态改变见表25和图23。携带肿瘤小鼠体重的动态变化见表26和图24。当使用相同时间和相同剂量的药物，ACEA100108在ao10/17人体卵巢肿瘤异体移植模型中的抗肿瘤作用与化合物ACEA100101的抗肿瘤作用相似，且优于常规使用方法的紫杉醇(TAXOL)的抗肿瘤作用。
表24化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体移植ao10/17人卵巢癌的体内抗肿瘤活性(皮下移植肿瘤)

***P＜0.01，相对于阴性对照组。
表25化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体移植ao10/17人卵巢癌体内抗肿瘤测试肿瘤体积的动态改变(皮下移植肿瘤)

7/12在12只小鼠中，有7只小鼠的肿瘤足够大至手可触及肿瘤。
表26化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体移植ao10/17人卵巢癌体内抗肿瘤测试携瘤小鼠体重的动态变化(皮下移植肿瘤)

例5ACEA100108对裸鼠Bcap37人体乳腺癌的体内抗肿瘤活性 使用免疫缺陷的裸鼠Bcap37人体乳腺癌异体移植模型检测ACEA100108的体内抗肿瘤活性。细胞株和小鼠被存放于上海医药工业研究院药理实验室(Pharmacology Lab of ShanghaiPharmaceutical Industry Institute)。Bcap37人体乳腺癌异体移植模型，肿瘤细胞在体内传代两次后被移植到裸鼠体内进行试验。也就是说，在培养瓶中培养的人体Bcap37肿瘤细胞首先被异体移植到裸鼠体内，直至乳腺癌细胞在裸鼠体内生长成为一定体积的肿瘤后，将肿瘤组织从体内取出，并将其切碎。从切碎的肿瘤组织中获得的细胞悬浮液被重新移植回免疫缺陷的裸鼠体内(即肿瘤细胞在人体肿瘤异体移植模型中的二次传代)。至肿瘤细胞生长至一定体积，将肿瘤组织从体内取出，并将肿瘤组织切碎。从切碎的肿瘤组织中获得的细胞悬浮液用于在此描述的人体肿瘤异体移植模型。
实验用小鼠类型为BALB/c裸鼠。由Academie Sinica动物实验中心提供，证书号SCXK(Shanghai)2003-0003。小鼠体重18-22g。所用小鼠为雌性。人体肿瘤异体移植模型的试验裸鼠数量为每个剂量组各6只，阳性对照组6只，阴性对照组12只。ACEA100108的高中低剂量分别为50mg/kg/d、25mg/kg/d和8mg/kg/d。
实验对照。阴性对照组每只小鼠静脉注射与高剂量组ACEA100108中相同体积相同浓度的溶剂，每日一次，连续7天。阳性对照组，使用抗肿瘤药物紫杉醇(Taxol)静脉注射每日10mg/kg，连续7天。
待测药物的制备和使用。ACEA100108溶解于蓖麻油(溶剂)中，使ACEA100108在溶剂中的浓度达到20mg/ml。每次使用前，将此溶液用生理盐水稀释以达到所需浓度。每只小鼠(重约20g)静脉注射药物溶液0.5mL，注射速度为0.5ml/0.5min。肿瘤移植24h后，将药物溶液静脉注射到带瘤小鼠体内，每天一次，连续7天或10天。ACEA100108的高中低剂量分别为50，20和8mg/kg/d。
移植肿瘤细胞的制备和药效确定。人体乳腺癌异体移植模型中肿瘤细胞的制备，将快速生长的肿瘤从被移植了肿瘤的小鼠中取出，将肿瘤组织切碎，肿瘤组织中加入生理盐水(肿瘤组织体积和生理盐水体积比1∶6)制成2-4×107细胞/ml的肿瘤细胞悬液。0.2mL肿瘤细胞悬液在右侧腋下经皮下注射移植到试验小鼠。肿瘤移植7天后，小鼠体内的肿瘤体积长至足够大至用手触摸动物时能够触及肿瘤。从此时起，小鼠经静脉注射一定剂量的ACEA100108，或者溶剂作为阴性对照组，或者腹膜下注射10mg/kg紫杉醇(Taxol)作为阳性对照组。肿瘤移植三周到四周内，处死小鼠取出移植的肿瘤组织。称取每次取出的固体肿瘤重量，各个剂量组的肿瘤抑制率由例1中算式(2)求得(DBTS对小鼠肉瘤S180和小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤活性)。基于肿瘤体积，用下式计算另一参数，即肿瘤体积抑制率T/C(％)＝药物作用组肿瘤的平均体积/阴性对照组肿瘤的平均重量×100％(5) 人体乳腺癌异体移植模型中，所有使用的物品，包括动物食物，动物饲养笼，支持物，以及所有接触动物的器具，都经过高压消毒。裸鼠饲养于SPF条件下的层流环境中。肿瘤移植后，每个剂量组的小鼠重量和肿瘤体积都被动态测量，并绘图。肿瘤体积大小由测量肿瘤的长轴(a)和短轴(b)，由例三中等式(3)得出(ACEA100108对小鼠lewis肺癌模型和小鼠P388白血病模型，裸鼠Bcap-37人体乳腺癌和HCT-8人体结肠癌模型的体内抗肿瘤活性)。
结果。裸鼠Bcap37人体乳腺癌异体移植模型显示，ACEA100108的平均体内抑瘤率在不同剂量组50mg/kg，20mg/kg和8mg/kg，iv×7 qd中，分别为52.24％、47.31％和28.21％。另外，显示药物剂量为50mg/kg，连续使用10天，体内肿瘤平均抑制率为56.92％。在同一个实验中，紫杉醇(Taxol)的体内抑瘤率在常规剂量为10mg/kg，使用10天时为44.33％。详细记录见表27，图25，描述了在裸鼠Bcap37人体乳腺癌异体移植模型DBTS和ACEA100108的作用效果。图25中，此7行(分别为1-7)显示使用下列药物的结果1)阴性对照组；2)溶剂组；3)ACEA100108组(50mg/kg)；4)ACEA100108组(20mg/kg)；5)ACEA100108组(8mg/kg)；6)DBTS组(50mg/kg)；和7)阳性对照组(紫杉醇(Taxol)，10mg/kg)。除了ACEA100108组50mg/kg以外的被测化合物和对照药物为静脉注射，共7天。ACEA100108 50mg/kg使用时间为静脉注射10天。肿瘤体积抑制率的结果见表28。肿瘤大小的动态改变状况见表26。携带肿瘤小鼠体重的动态变化见表27。
裸鼠Bcap37人体乳腺癌异体移植模型中，当肿瘤大小可以手触及时，经药物疗程治疗后，ACEA100108的肿瘤抑制率可达到50％以上。对裸鼠用药次数增加，可见肿瘤抑制率增加，但是对小鼠的毒性并未增加。而且，对裸鼠使用中等剂量的ACEA100108与使用常规剂量的紫杉醇(TAXOL)相比有更好的治疗效果。
表27化合物ACEA100108对免疫缺陷裸鼠Bcap-37人体乳腺癌异体移植模型体内抗肿瘤活性(皮下移植肿瘤)(基于肿瘤重量)

***P＜0.01，与阴性对照组相比。
表28化合物ACEA100108对免疫缺陷裸鼠Bcap37人体乳腺癌异体移植模型体内抗肿瘤活性(皮下移植肿瘤)(基于肿瘤体积)

***P＜0.01，与阴性对照组相比。
表29化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体移植Bcap-37人乳腺癌体内抗肿瘤测试及动态肿瘤体积的改变(皮下移植肿瘤)

12/12在12只小鼠中，所有12只小鼠的肿瘤都足够大至手可触及肿瘤。
表30化合物ACEA100108对免疫缺失裸鼠异体移植Bcap-37人乳腺癌体内抗肿瘤测试携瘤小鼠体重的动态改变(皮下移植肿瘤)

例6DBTS和化合物ACEA100108的急性毒性作用试验确定小鼠静脉注射的LD50 用小鼠检测DBTS和化合物ACEA100108的急性毒性作用。试验用小鼠随机分为六组(其中五组为给药组，一组为对照组)。每组为20只昆明鼠，其中50％为雌性，50％为雄性。当静脉注射(i.v.)单倍剂量的DBTS或化合物ACEA100108后观察小鼠对DBTS或化合物ACEA100108的急性反应，监测并记录用药后前两周死亡小鼠的数量。使用Bliss法计算LD50值。小鼠静脉注射(i.v.)单倍剂量的DBTS的LD50为258.53mg/kg(234.96至284.46mg/kg)，小鼠静脉注射(i.v.)单倍剂量的ACEA100108的LD50为316mg/kg(284.26-351.28mg/kg)。
材料和方法。用于检测的化合物为DBTS和ACEA100108，溶解于温热的纯化蓖麻油中，浓度为20mg/ml。使用时溶液用生理盐水稀释至所需浓度。每只小鼠静脉注射(i.v.)量0.5ml，注射速度0.5ml/0.5min。
实验用小鼠为昆明鼠，由上海医药工业研究院(ShanghaiPharmaceutical Industry Institute)动物实验室(the ExperimentalAnimal Department)提供。证书号为107。小鼠的平均体重为18-20g。每个实验组为20只，其中10只为雌性，10只为雄性。使用5组不同的剂量组的化合物，分别为400mg/kg，320mg/kg，256mg/kg，204.8mg/kg和163.8mg/kg。对照组小鼠给予相同体积的氢化蓖麻油溶剂。所有实验用小鼠给与静脉注射单倍剂量的DBTS和ACEA100108，或者作为对照用的溶剂，注射速度为0.5ml/0.5min。监测并记录使用DBTS和ACEA100108后的各种急性反应，重量改变，以及使用后两周内的死亡情况。使用Bliss法计算静脉注射的LD50值。
结果。静脉注射后，小鼠立即显出行为异常，包括跳跃、奔跑、痉挛、呼吸急促(呼吸加快)等等。高剂量组的一些小鼠在注射后3分钟即死于痉挛，死亡发生于1小时内，并在注射后第12小时达到高峰。死亡小鼠经尸体解剖后未发现器官的病理异常。存活小鼠未出现明显的毒性症状，但出现了活动减少及脱发现象，这些现象逐渐得到恢复。经14天监测未发现延迟性的毒性反应。虽然存活小鼠的健康状况和行为显示正常，但是体重出现了不同程度的下降。小鼠静脉注射(i.v.)单剂量的DBTS的LD50为258.53 mg/kg(234.96至284.46mg/kg)，小鼠静脉注射(i.v.)单剂量的ACEA100108的LD50为316mg/kg(284.26-351.28mg/kg)。雌性小鼠和雄性小鼠之间LD50值无明显差异(P＞0.05)。DBTS和化合物ACEA100108的急性毒性作用结果见表31和32。为了评估溶剂对小鼠的毒性作用，对照组的小鼠使用相同剂量的溶剂。使用溶剂的小鼠显示早期的行为异常和体重降低的程度低于使用DBTS和化合物ACEA100108的小鼠。说明使用药物的小鼠所出现的急性毒性反应与DBTS和化合物ACEA100108有关。
表31昆明鼠单倍剂量静脉注射(intravenous injection)DBTS的急性毒性作用

表32昆明鼠单剂量静脉注射(intravenous injection)ACEA100108的急性毒性作用

例7DBTS，秋水仙素(Colcemid)和紫杉醇(Paclitaxel抑制细胞增殖作用 H460细胞(人肺癌细胞)以8000细胞每孔的浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育22小时。之后在孔中加入以不同浓度溶于DMSO中的Dibenzvl trisulfide(DBTS)秋水仙素(Colcemid)，和紫杉醇(Paclitaxel)。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数DBTS和秋水仙素(Colcemid)达到1.7至1.9之间，紫杉醇(Paclitaxel)达到1.4至1.9之间时加入化合物。图1A-C显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后23小时)。
例8DBTS抑制MV522细胞增殖的作用 MV522细胞(人肺癌细胞)以10000细胞每孔的浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育22小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到1.0至1.6之间时加入化合物。图2显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后23小时)。
例9DBTS抑制MCF-7细胞增殖的作用 MCF-7细胞(人体乳腺癌细胞)以10000细胞每孔的浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育44小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到1.2至1.5之间时加入化合物。图3显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后44.5小时)。
例10DBTS抑制A549细胞增殖的作用 A549细胞(人肺癌细胞)以8000细胞每孔的浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育17小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到0.72至1.26之间时加入化合物。图4显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后18小时)。
例11DBTS抑制PC3细胞增殖的作用 PC3细胞(人前列腺癌细胞)以10000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育22.5小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到0.34至0.54之间时加入化合物。图5显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数(normalized cellindex)。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后23.5小时)。
例12DBTS和5-氟尿嘧啶抑制A431细胞增殖的作用 A431(人表皮肿瘤细胞)以10000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育22.3小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数DBTS达到0.6至1.2之间，5-氟尿嘧啶达到0.6至1.2之间时加入化合物。图6A-B显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后22.6小时)。
例13DBTS抑制HT1080细胞增殖的作用 HT1080细胞(人纤维瘤细胞)以4000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育18.6小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到0.72至1.45之间时加入化合物。图7显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后20小时)。
例14DBTS抑制MDA-231细胞增殖的作用 MDA-231细胞(人乳腺癌细胞)以5000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronicplates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育18.7小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到0.65至0.82之间时加入化合物。图8显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后19.6小时)。
例15
DBTS抑制HT-29细胞增殖的作用 HT-29细胞(人结肠癌细胞)以10000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育25小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到0.95至1.13之间时加入化合物。图9显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后26小时)。
例16DBTS抑制HC-2998细胞增殖的作用 HC-2998细胞(人结肠癌细胞)以10000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronicplates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育24.7小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到0.33至0.68之间时加入化合物。图10显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后25.7小时)。
例17DBTS抑制OVCAR4细胞增殖的作用 OVCAR4细胞(人卵巢癌细胞)以10000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育27小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到1.4至1.7之间时加入化合物。图11显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后28小时)。
例18DBTS抑制A2780细胞增殖的作用 A2780细胞(人结肠癌细胞)以20000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育16.4小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到2.2至3.7之间时加入化合物。图12显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后17.5小时)。
例19HepG2细胞对DBTS的反应 HepG2细胞(人肝癌细胞)以15000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，并预先在常规细胞培养条件下置于培养箱中孵育22小时。之后在孔中加入溶于DMSO中的DBTS。在加入化合物前后用RT-CES系统监测细胞状态。各个孔中的细胞指数达到0.7至0.97之间时加入化合物。图13显示加入化合物之前和加入化合物之后的作为时间函数的归一化细胞指数。加入化合物后的时间点为细胞指数归一化的时间点(大约接种细胞后22.7小时)。从细胞指数显示的数据可见，DBTS对HepG2细胞的增生无抑制作用，所使用的剂量范围对HepG2细胞无毒性作用。
例20DBTS及其衍生物对肿瘤细胞增殖的抑制作用 使用RT-CES系统和MTT法检测DBTS及其衍生物对8种不同类型的人体肿瘤细胞的抗肿瘤活性。这8种肿瘤细胞株分别为HT1080(人纤维瘤细胞株)、H460细胞(人非小细胞肺癌细胞株)、OVCAR4细胞(人卵巢癌细胞株)、MCF-7细胞(人体乳腺癌细胞)、MDA-MB231(M231，人体乳腺癌细胞株)、A2780细胞(人结肠癌细胞株)、Jurkat细胞(人体T细胞白血病细胞株)。用于检测的DBTS及其衍生物包括ACEA100107，ACEA100108，ACEA100109，ACEA100111，ACEA100115，ACEA100116，ACEA100117，ACEA100118，ACEA100119，和ACEA100120。ACEA100129使用细胞HT1080和MCF-7测得IC50值分别为0.82μM，0.42μM和2.3μM。衍生物的化学结构式见表33和表34。
使用RT-CES系统进行检测时，细胞以从5000到15000细胞每孔初始浓度范围接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)，细胞置于37℃、5％CO2中孵育过夜，直至细胞指数达到对数生长期，此时细胞指数介于0.8到1.2之间。将一系列不同稀释浓度的化合物加入细胞中，并对化合物对细胞增生影响和毒性作用进行动态监测。各个化合物时间依赖性的IC50值经由化合物处理后的不同时间点剂量反应的细胞指数来计算。表35显示的IC50值是经化合物处理后达到最大抑制作用的时间点。
对于MTT法，细胞以从5000到15000细胞每孔初始浓度范围接种于16X或96孔板上的孔中，细胞置于37℃、5％CO2中孵育过夜，将一系列不同稀释浓度的化合物加入细胞中。孵育48小时后加入MTT染色剂终止药物处理。4小时后，用终止液终止染色，用分光光度计在两个波长段(650nm和550nm)进行测量。用分光光度计测得的待测衍生物的IC50值见表36。
表33各种三硫衍生物的结构 DBTS衍生物 RDBTS(ACBA100101)HACEA100108 p-FACEA10018 p-ClACEA100115 o-ClACEA100116 m-MeACEA100117 m-CF3ACBA100129 p-Me表34各种双芳香取代三硫化物的结构 DBTS衍生物名称ArACEA100111 ACEA100107 ACEA100109 ACEA100120 ACEA100119
表35使用RT-CES system在7种肿瘤细胞株中测得的DBTS及其衍生物的IC50值(uM)


表36使用MTT检测法在8种肿瘤细胞株中测得的DBTS及其衍生物IC50值(uM)


例21ACEA100108对肿瘤细胞增生的动态抑制作用 使用RT-CES系统检测DBTS衍生物ACEA100108对7种细胞株的抗肿瘤活性。细胞株为HT1080，H460，OVCAR4，MCF7，MDA-MB231，HepG2，和A2780。肿瘤细胞以从5000到15000细胞每孔初始浓度范围接种于16X或96X的微滴定板上的孔(微滴定板electronic plates，即孔中带有微电子传感器阵列的检测板)中，细胞置于37℃、5％CO2中孵育。肿瘤细胞的生长过程与状态经RT-CES系统动态观测，直至细胞达到对数生长期，共持续约20小时。将一系列不同稀释浓度(浓度范围50uM到0.38uM之间)的ACEA100108加入细胞中，RT-CES系统动态观测ACEA100108对肿瘤细胞增生的抑制作用，及各个细胞株对ACEA100108毒性作用的反应。记录细胞-化合物相互反应的动态曲线，见图26。加入化合物时的细胞指数值经归一化获得归一化细胞指数曲线(细胞接种后约18-24小时)。
例22DBTS衍生物对肿瘤细胞增生的动态抑制作用 使用RT-CES系统检测DBTS衍生物对HT1080肿瘤细胞增生的抑制作用及其对HT1080的毒性作用。DBTS衍生物为ACEA100107，ACEA100109，ACEA100111，ACEA100114，ACEA100115，ACEA100116，ACEA100117，ACEA100118，ACEA100119，和ACEA100120。HT1080细胞(人纤维肉瘤)以5000细胞每孔的初始浓度接种于16X或96X的微滴定板上的孔中。细胞置于37℃、5％CO2中孵育20小时至细胞达到对数生长期，将一系列不同稀释浓度(浓度范围50μM到0.38μM之间)的DBTS衍生物加入细胞中，RT-CES系统动态观测和记录细胞对DBTS衍生物的反应。记录细胞-化合物相互反应的动态曲线，见图26。加入化合物时的细胞指数值经归一化获得归一化细胞指数曲线(大约细胞接种后18-24小时)。
例23DBTS的衍生物ACEA100108和ACEA100116对微管动力学抑制作用 微管是细胞增殖过程中，如有丝分裂，的重要成分，当细胞分裂成两个子细胞前，染色体复制成为相同的两套染色体。微管及其动力学在有丝分裂和细胞分裂中扮演的重要角色决定了其成为抗肿瘤药物的作用靶。细胞在分裂间期时，微管蛋白与细胞质中单体球蛋白之间交换所需的半衰期为3分钟至数小时。有丝分裂开始后，间期微管分解成为纺锤体微管并改变染色体。有丝分裂纺锤体微管比分裂间期微管的运动性高20-50倍，一些纺锤体微管蛋白与单体球蛋白之间交换所需的半衰期达到15秒。
有丝分裂纺垂体微管的活动非常容易被微管活性药物所控制和破坏。以微管为靶的药物可以多种方式改变微管的合成和运动过程。三种ACEA化合物DBTS，ACEA100108，和ACEA100116的作用机制为(1)影响培养细胞的微管网，(2)影响体外微管合成，(3)影响体外微管动力学，见下述。
方法 细胞培养和细胞组织免疫化学COS细胞生长于加有非必需氨基酸，10％FBS，抗生素和抗真菌素的DMEM培养基中，培养条件37℃、5.5％CO2。在免疫荧光显微镜下，细胞置于多聚赖氨酸包被的板上，并加入不同浓度的三种ACEA化合物、紫杉醇(paclitaxel)或长春碱(vinblastine)2-4小时(见各实验图中的浓度值)。细胞用温PBS冲洗一遍，用冷甲醇(methanol)固定，再用PBS冲洗，置于4℃PBT(PBS，1％BSA，0.5％Triton X-100)中中断反应并过夜。若非特别指出，所有的染色和冲洗都在室温下使用PBT。细胞使用1∶1000抗微管小鼠抗体DM-1染色1小时，冲洗4次每次15分钟，在暗室用1∶100 Cy-3接合山羊抗鼠抗体处理1小时。然后，在暗室用PBT冲洗标本4次每次15分钟，最后用PBS洗15分钟。标本置于激光扫描共焦显微镜下观察。
微管合成(Microtubule Assembly)检测微管合成核心(Microtubule seeds)的合成方法如下将纯化的牛脑微管蛋白在35℃，含1mM GTP，10％甘油和10％DMSO的溶液中孵浴30分钟，接着让合成好的微管通过一个27号测量针6次。微管合成检测在事先加入含纯化牛脑微管蛋白的PEM-100缓冲液(100mM Pipes pH＝6.8，1mM EDTA，1mM MgSO4，补加1mM GTP)247.5ul的分光光度计石英皿(保持35℃)中加入27.5ul微管组装核心，监测OD4002小时。由于化合物溶解在DMSO中，而DMSO对微管的组装有很大影响，因此在每个石英皿中加入与最大用药量相同的DMSO。需要注意的是微管组装反应初始速度的上升相不是总能捕捉到的，因为样品准备过程中这一步骤已发生。但是所有样品在加入药物前的初始光学密度是相同的。
微管蛋白纯化(Tubulin Purification)和微管动力学(Microtubule Dynamics)检测微管的纯化如此文所述(“Kineticstabilization of microtubule dynamic instability in vitro byvinblastine”，Toso，R.J.，Jordan，M.A.，Farrell，K.W.，Matsumoto，B.and Wilson，L.，Biochemistry，1993，32，1285-1293)。简而言之，通过三个合成(assembly)-分解(disassembly)的循环过程制备微管相关富含蛋白牛脑微管蛋白。微管蛋白是使用PEM50(50mMPipes，1mM MgSO4，1mM EGTA，0.1mM GTP)平衡的Whatman P-11磷酸纤维素层析，洗脱其它微管蛋白而纯化。纯化的微管蛋白(纯度＞99％)通过液氮速冻并保存在-70℃。37℃下，在加有或没有加ACEA100101，ACEA100108或者ACEA100116的PMEM缓冲液(87mM Pipes，36mM MES，1.4mM MgCl2，1mM EDTA，pH6.8)以及2mM GTP的体系中，纯化的微管蛋白(15μM微管蛋白二聚体)聚合到海胆鞭毛子的端点(Strongylocentrotus purpuratus)axonemal seeds。在37℃，使用相差摄像显微镜(differential interference contrastenhanced video microscopy)记录单个微管的动态聚合过程。末端的正负极是通过以下因素确定的微管增长的速率；种子另一端长出的微管数；微管的相对长度(Panda，D.，Goode，B.L.，Feinstein，S.C.andWilson，L.，Kinetic stabilization of microtubule dynamics at steady stateby tau and microtubule-binding domains of tau，Biochemistry，1995，34，11117-11127；WaIker，R.A.，O′Brien，E.T.，Pryer，N.K.，Soboeiro，M.F.，Voter，W.A.，Erickson，H.P.and Salmon，E.D.，Dynamic instability of indiVidual microtubules analyzed by Video lightmicroscopyrate constants and transition frequencies，J.Cell Biol.1988，107，1437-1448)。在微管聚合的稳态(聚合开始后大约45分钟)以10分钟每片的速度记录负极。单个微管的动画记录是按照修改后的由Panda等于1995年创立的方法(Panda，D.，Goode，B.L.，Feinstein，S.C.and Wilson，L.，Kinetic stabilization of microtubuledynamics at steady state by tau and microtubule-binding domains oftau，Biochemistry，1995，34 11117-11127)。数据点的采集时间间隔为1-3秒。
如果一根微管的长度以大于5μm/min的速率增加或减少就认为它在增长或缩短。如果微管以小于0.5μm/min的速率增长的时间大于30秒即认为其处于衰减状态。平均速率、长度和持续时间都是独立而不相关值的平均值。崩解频率的计算是以长度减短的微管数除以增长和衰减状态的总时间，新增长频率是重新增长的微管数除以总的减短时间。为控制试验误差，每种条件都使用至少两种不同的微管蛋白/GTP(每种2-3片)混合物并记录多天。在给定的条件下，使用不同的混合物没有发现微管的动力学有差异。在动力学不稳定性测试中使用的药物浓度通过以下方法确定预先使用微管组装测试中所用药物浓度的一半，观察微管的稳定性。如果一个片子上的多数微管都很稳定，药物浓度就要降低，直至在10分钟内至少观察到两个增长或缩短的微管。
图28-38显示DBTS和有机硫化合物ACEA100108和ACEA100106对于培养细胞微管的作用。图28显示对照组细胞无药物时微管的图像。微管显示正常状态。图29显示细胞的微管置于紫杉醇(Taxol)中4小时的图像。微管显示在某些区域呈束状；随着浓度的增加，呈束状况增加且微管比对照组细胞微管短。图30显示细胞的微管置于紫杉醇(Taxol)中24小时的图像。随着剂量的增加，微管损伤增加。正如图中所示，束状增多微管持续缩短。另外，细胞显示畸形。
图31显示细胞中的微管置于长春碱中4小时。随着剂量的增加，微管束崩解微管明显变短。图32显示显示细胞中的微管置于长春碱中24小时。如图所示，主要的细胞异常为微管异常。
图33显示细胞中的微管置于DBTS中4小时。微管被完全破坏；仅有少数短微管存留，所有的微管蛋白显著减少。此作用可用非离子去垢剂萃取法和免疫印记法定量。图34显示细胞中的微管置于DBTS中24小时。在低浓度时，相比于细胞置于药物中4小时只显示一些微管恢复，经药物处理24小时后在6uM或18μM的DBTS中无存活细胞。
图35显示细胞中的微管置于ACEA100108中4小时。与DBTS相似，所有浓度时微管都明显破坏。微管非常短，所有微管都减少。在最高浓度时，细胞大多变圆。图36显示细胞中的微管置于ACEA100108中24小时。在浓度为1μM和3μM时这些细胞在4小时和24小时期间有一些恢复。在此两种情况下微管网显得相对正常。然而，在9μM时，微管显得短微管网异常。
图37显示细胞中的微管置于ACEA100106中4小时。当浓度为1uM时，可见残存微管。在另外两个高浓度时，微管变短并被破坏。细胞不再呈长型而随剂量变圆。图38显示细胞中的微管置于ACEA100106中24小时。加入1μM ACEA100116的细胞相对正常，加入9 uM ACEA100116的细胞在24小时后死亡。
图39-41显示DBTS和有机硫化合物ACEA 100108和ACEA 100116体外对微管合成的作用。如图39a所示，所有剂量的DBTS都明显抑制微管的合成。当剂量为9μM时作用尤其显著。对照组(图39b)和药物组(图39c)样品的微管结构置于显微镜下观察。如图40所示，低剂量ACEA100108对微管合成的影响非常小。反之，27μM ACEA100108对微管合成有明显抑制作用。
如图41所示，ACEA100116的作用与DBTS和ACEA100108不同。DBTS和ACEA100108抑制微管合成，ACEA100116则促进微管合成。此作用在浓度为9μM和27μM时出现。此图也显示了一种常见的但不能理解的现象，称作“边辐射现象”，即光散射图样不呈平台状，而是呈持续下降状态。无论如何，ACEA100116清楚地呈现体外促进微管合成而不是抑制作用。
而且，DBTS，ACEA100108和ACEA100116体外影响微管性能。如表37所示，这三种化合物改变微管动力学模式。DBTS不影响微管生长速率但是增加了生长的持续时间，导致微管增长状态时平均长度增加。相应的微管缩短状态时平均长度减短。
ACEA100108增加微管增长持续时间和增长状态的平均长度，对缩短状态的长度也有明显作用。此作用比DBTS和ACEA100116更显著，且呈现与这两种化和物不同的作用。ACEA100116增加伸长率，但是对增长状态的长度影响不大。它对缩短率无作用，但是却影响缩短状态的长度。因为细胞图像数据无法区分药物所连接的微管蛋白或微管结合蛋白，因此体外微管合成和体外微管动态检测都使用纯化无MAP的微管蛋白。这些观察结果证明，这三种化合物直接相互作用与微管蛋白。
表37DBTS及其衍生物ACEA100108和ACEA100116抑制微管动力学

例24ACEA100108引起肿瘤细胞凋亡 为检测化合物ACEA100108诱导肿瘤细胞凋亡，在A549细胞中加入1uM ACEA100108和50nM紫杉醇(Paclitaxel)和10nM长春碱(Vinblastine)。两种微管活动抑制剂紫杉醇(Paclitaxel)和长春碱(VinblastiHe)作为阳性对照组。A549细胞以浓度为10000细胞/孔接种于孔中，18小时后加入抗有丝分裂所需浓度的化合物ACEA100108，紫杉醇和长春碱。细胞在药物中孵育24小时然后用PBS洗两遍，用缓冲液洗3遍(10mM HEPES，pH7.5，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)。细胞用1ug/mL Annexin V-Cy3 conjugate(开始凋亡的细胞染为红色)和500uM 6-CFDA(活细胞染为绿色)染色20分钟。细胞用1x缓冲液轻洗3次，在免疫荧光显微镜下观察计数，并用CCD照相机照片。记录被6-CFDA染绿色的存活细胞，而坏死细胞仅被Annexin V-Cy3染为红色。开始凋亡的细胞被AnnexinV-Cy3和6-CFDA同时染色。
如图42显示，经ACEA100108，紫杉醇，和长春碱处理的细胞被Annexin V强染色，仅用DMSO处理的对照细胞无Annexin V染色。这说明，ACEA100108诱导A549人肺癌细胞凋亡。
例25ACEA100108引起肿瘤细胞分裂周期终止在G2/M期 微管在有丝分裂中尤其重要，在此过程中，在细胞分裂为两个子细胞之前，细胞的染色体复制并分裂成两套相同的染色体，作用于微管的药物如紫杉醇，和长春碱抑制微管的动力作用阻断有丝分裂的过程，导致细胞停止于G2/M细胞周期。为检测ACEA100108在肿瘤细胞分裂过程中是否影响有丝分裂过程，A549人肺癌细胞加入25μM ACEA100108和7.8nM紫杉醇，使用流式细胞仪检测化合物对细胞周期的作用。
A549以500000细胞的浓度接种在60mm的组织培养板中，18小时后，在细胞中加入抗有丝分裂所需浓度的化合物并继续孵育24小时。细胞用PBS洗后，消化并计数，用70％冰甲醇固定后储存于4℃。细胞用PBS清洗，用propidium iodide染色，置于冰上直至使用流式细胞仪检测。
如图43所示，相比于仅加入了DMSO的细胞，加入ACEA100108和紫杉醇的细胞在G2/M期时的细胞群明显增多。
例26二(对-氯苄基)三硫醚(9)的合成(用二氯化硫溶液) 在室温下向250毫升干燥的园底烧瓶中加入N-三甲基硅基嘧唑(10.67毫升，97％，d＝0.956，实际重量＝9.89克，70.54毫摩尔)和70毫升的无水己烷。在氮气保护下搅拌该溶液。在40-50分钟内将二氯化硫的二氯甲烷溶液(35.3毫升，1.0M，35.3毫摩尔)慢慢滴加到上述搅拌的溶液中。继续搅拌反应液50分钟。在氮气保护下将反应液冷却到0℃。在搅拌和氮气保护下并在40-50分钟内将4-氯苄基硫醇(9.5毫升，96％，实际重量＝11.19克，70.53毫摩尔)在50毫升无水己烷中的溶液慢慢滴加到反应液中。在0℃搅拌反应液一小时，然后在室温下搅拌三小时。用放有一层硅藻土的过滤漏斗过滤掉反应液中的白色到淡黄色固体并用少量己烷滤洗固体。所得滤液在分液漏斗中用水洗涤两次(200毫升，100毫升)，然后再用饱和食盐水洗滴一次(200毫升)。所得有机相用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸掉滤去干燥剂后所得滤液中的溶剂。
所得白色固体粗产品用硅胶色谱柱提纯。硅胶色谱柱用己烷-乙酸乙酯(60∶1)淋洗剂洗脱。用薄层色谱板(TLC)检测(己烷-乙酸乙酯40∶1；Rf＝0.45)。收集含产品的部分并蒸去溶剂，所得白色固体产品再用己烷重结晶得到11.06克白色针状晶体产品9，收率90％。1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ3.98(s，4H)，7.23(d，4H，J＝8.4Hz)，7.30(d，4H，J＝8.4Hz)；ES质谱m/z 345(M-1)-。
例27二(对-氟苄基)三硫醚(8)的大规模合成 在室温下向500毫升干燥的园底烧瓶中加入N-三甲基硅基嘧唑(21.42毫升，97％，d＝0.956，实际重量＝19.86克，141.6毫摩尔)和140毫升的无水己烷。在氮气保护下搅拌该溶液。在40-50分钟内将二氯化硫的二氯甲烷溶液(70.8毫升，1.0M，70.8毫摩尔)慢慢滴加到上述搅拌的溶液中。继续搅拌反应液50分钟。在氮气保护下将反应液冷却到0℃。在搅拌和氮气保护下并在50分钟内将4-氟苄基硫醇(18.04毫升，96％，实际重量＝20.0克，140.8毫摩尔)在100毫升无水己烷中的溶液慢慢滴加到反应液中。在0℃搅拌反应液一小时，然后在室温下搅拌三小时。用放有一层硅藻土的过滤漏斗过滤掉反应液中的白色到淡黄色固体并用少量己烷滤洗固体。所得滤液在分液漏斗中用水洗涤两次(400毫升，300毫升)，然后再用饱和食盐水洗涤一次(400毫升)。所得有机相用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸掉滤去干燥剂后所得滤液中的溶剂。
所得白色固体粗产品用硅胶色谱柱提纯。硅胶色谱柱用己烷-乙酸乙酯(60∶1)淋洗剂洗脱。用薄层色谱板(TLC)检测(己烷-乙酸乙酯40∶1；Rf＝0.46)。收集含产品的部分并蒸去溶剂，所得白色固体产品再用己烷重结晶得到14.7克白色针状晶体产品8，收率67％。熔点61.5-62.1℃；紫外可见光谱(UV-VIS，正己烷)λ＝218nm(ε，63700)，λ＝283nm(ε，12000)；1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ4.00(s，4H)，7.01(t，4H，J＝8.8Hz)，7.27(dd，4H，J＝8.8，5.4Hz)；13C核磁共振谱(125.7MHz，CDCl3)δ42.4，115.6，115.8，131.2，131.3，132.4，162.5(C-F，J＝250Hz)；19F核磁共振谱(376.5MHz，CDCl3)δ-114.2；ES质谱m/z 337/338(M+Na)+；元素分析C14H12F2S3计算值(％)C，53.48；H，3.85；S，30.59；实验值(％)C，53.16；H，4.22；S，30.24。
例28二(对-氟苄基)三硫醚(8)的大规模合成(用纯二氯化硫) 在室温下向3000毫升干燥的园底烧瓶中加入N-三甲基硅基嘧唑(226.6毫升，97％，d＝0.956，实际重量＝205.7克，1467毫摩尔)，1200毫升用分子筛干燥过的正己烷和460毫升用分子筛干燥过的二氯甲烷。在氮气保护下搅拌该溶液。在40-50分钟内将纯的二氯化硫(55.9毫升，90.63克，880毫摩尔，0.6eq)慢慢滴加到上述搅拌的溶液中。此时大量固体产生。继续搅拌反应液50分钟。在氮气保护下将反应液冷却到0℃。在搅拌和氮气保护下并在40-50分钟内将4-氟苄基硫醇(176毫升，96％，实际重量＝200.17克，1408毫摩尔)在250毫升无水二氯甲烷和100毫升无水正己烷中的溶液慢慢滴加到反应液中。在0℃继续搅拌反应液一小时，然后在室温下搅拌三小时。用放有一层硅藻土的过滤漏斗过滤掉反应液中的白色到淡黄色固体并用少量正己烷滤洗固体。所得滤液在分液漏斗中用水洗涤两次(2×1000毫升)，然后再用饱和食盐水洗涤一次(1000毫升)。所得有机相用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸掉滤去干燥剂后所得滤液中的溶剂。所得白色固体粗产品用硅胶色谱柱提纯。硅胶色谱柱用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(80∶1，60∶1，40∶1和20∶1)淋洗剂洗脱。用薄层色谱板(TLC)检测(己烷-乙酸乙酯40∶1；Rf＝0.46)。收集含产品的部分并蒸去溶剂，所得白色固体产品再用正己烷重结晶得到131.0克白色针状晶体产品8，收率59.2％。熔点61.5-62.1℃；紫外可见光谱(UV-VIS，正己烷)λ＝218nm(ε，63700)，λ＝283nm(ε，12000)；1H核磁共振谱(499.1MHz，CDCl3)δ4.00(s，4H)，7.01(t，4H，J＝8.8Hz)，7.27(dd，4H，J＝8.8，5.4Hz)；13C核磁共振谱(125.7MHz，CDCl3)δ42.4，115.6，115.8，131.2，131.3，132.4，162.5(C-F，J＝250Hz)；19F核磁共振谱(376.5MHz，CDCl3)δ-114.2；ES质谱m/z 337/338(M+Na)+；元素分析C14H12F2S3计算值(％)C，53.48；H，3.85；S，30.59；实验值(％)C，53.16；H，4.22；S，30.24。
不对称的有机硫衍生物41-68(Scheme 3)是用类似于文献报道的方法合成的(Derbesy，G.；Harpp，D.N.Tetrahedron Letters，1994，35，5381-5384)。典型过程如下将10mmol的二氯化硫溶解到50毫升的五水乙醚中并将该溶液冷却到-78℃。慢慢地将10mmol的一种苄基硫醇和10mmol的无水吡啶在25毫升的乙醚中的溶液滴加到上述不断搅拌的冷却溶液中。约30分钟滴加完毕。在该温度下继续搅拌反应混合物30分钟。将10mmol第二种硫醇和10mmol无水吡啶在25毫升的乙醚中的溶液慢慢的滴加到上述不断搅拌的冷却溶液中。约30分钟滴加完毕。继续搅拌反应混合物30分钟。反应混合物的温度升到室温后用水洗涤两次，用1N的氢氧化钠水溶液洗涤两次，之后再用水洗涤两次直到水溶液显示中性为止。用无水氯化钙或硫酸钠干燥有机相，滤去催化剂并除去溶剂。所得促产品通过一个短的硅胶柱提纯，用己烷-乙酸乙酯淋洗得纯产品41-68，收率在40-100％范围内。
值得一提并需要理解的是，上述具体描述和例子均属于举例说明而并不限制本发明专利的范围。很明显，上述各实例均可进行改变和修改。这些改变和修饰可无限制的包括在化学结构上的，取代基的，衍生物的，中间体的，合成方面，制剂方面，使用方法上等改变和修饰。任何如此修改后不违反本文的精神和范畴。有关的美国专利以及有关公开发表文献，在此以参考文献的方式被整合到本专利申请中。
权利要求
1.一种具有以下通式的化合物 或 其中，A和B相同或不同，并且独立地是任选取代的芳基，杂芳基或一种5～14员、可以是单环或多环的而且任选地含有杂原子的环；每一个S都任选地呈氧化物的形式；S1和S2独立地是S，SO或SO2；每一个R是H，卤素，羧基，氰基，氨基，酰胺基，无机取代基，SR1，OR1或R1，其中每一个R1是烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，碳环或杂环，其中每一个都任选地有取代且可含有杂原子；m，n和p独立地是0-3；或有下述通式(3)或(4)的化合物 或 其中，A，B，R，S，n和p定义如上；或有下述通式(5)的化合物 其中，A，B，S，n和p定义如上；并且Z是(CR12)q或(CR1＝CR1)q*，其中“q”是0-3，而“*”代表碳碳双键C＝C可代之以炔基、O、S、NR；或Z是任选地有取代的芳基，杂芳基或杂环基；其中，A和B一起可以形成环状系统；及其药物上可接受盐、酯、药物前体或代谢物；先决条件是所述化合物不是二苄基三硫醚，二(对-氯苄基)三硫醚，(对-氯苄基)苄基三硫醚，二(对-硝基苄基)三硫醚，二(3-苯基-2-丙烯基)三硫醚，二苯基三硫醚或二(对-叔丁基苯基)三硫醚。
2.权利要求1的化合物，其中Z具有下述通式 或 其中，每个W均独立地为一个健，CR，N，NR，S或O；每个R均如权利要求1所定义。
3.权利要求1的化合物，其中R独立地是H，卤素，OR1，SR1，CO2R1，CONR12，C＝O，CN，CF3，OCF3，NO2，NR1R1，OCOR1；或R是C1-10烷基，C3-10环烷基，C2-10烯基，C2-10炔基，芳基，杂芳基，碳环或杂环，其中每一个都可以含杂原子。
4.权利要求1的化合物，其中A和B独立地是苯，吡啶，哒嗪，嘧啶，吡嗪，三嗪，异唑，异噻唑，二唑，[1，2，4]二唑，三唑，噻二唑，吡唑，咪唑，噻唑，唑，苯并唑，吡咯，呋喃，噻吩，中氮茚，吲哚，异吲哚，二氢吲哚，苯并呋喃，苯并噻吩，吲唑，苯并咪唑，苯并噻唑，嘌呤，喹喔啉，喹啉，异喹啉，噌啉，2，3-二氮杂萘，喹唑啉，喹喔啉，1，5-二氮杂萘，蝶啶，吖啶，吩嗪，吩噻嗪，茚，萘，苯并二唑，或苯并[1，2，5]二唑。
5.权利要求1的化合物，其中A和B独立地是 其中，X和W独立地是S，O，NR7，CR7；或在一个六员单环或双环中一个W可以是一个键；并且每个R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7是氢原子，卤素原子，羧基，氰基，氨基，酰胺基，无机取代基，SR1，OR1或R1，其中每个R1均为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，其中每一个均是任选地有取代的且可含有杂原子。
6.权利要求5的化合物，其中每个R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7独立地是H、卤素、OR1、SR1、CO2R1、CONR21、C＝O、CN、CF3、OCF3、NO2、NR1R1、OCOR1；或每个R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7是C1-10烷基、C3-10环烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、芳基、杂芳基、碳环基或杂环基，其中每一个都可以含有杂原子。
7.权利要求6的化合物，其中所述芳基、杂芳基、或杂环基是哌嗪基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、苯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹喔啉基、噻唑基、唑基、咪唑基、喹啉基、萘基、哒嗪基、吡唑并嘧啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、吡唑基、吡咯基、吲哚基、异吲哚基、喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、或喹唑啉基，其中每一个都任选地有选自O、N、S和卤素的杂原子取代，或有C1-10烷基、C3-10环烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、芳基、或杂环基取代，每一个都任选地含有杂原子。
8.权利要求1的化合物，其中每个S是一氧化物或二氧化物。
9.权利要求1的化合物，其中所述化合物有通式(6) 其中，每个n是1-3；而且，R是氢原子，卤素，烷基，或卤代烷基。
10.权利要求1的化合物，其中所述化合物有通式(7) 其中，Ar是任选地有取代的噻吩，苯并噻吩，吡啶或吡嗪。
11.权利要求1的化合物，其中所述化合物是二(氟苄基)三硫醚，二(邻-氯苄基)三硫醚，二(甲基苄基)三硫醚，二(三氟甲基苄基)三硫醚，二(2-苯基乙基)三硫醚，二(噻吩-2-甲基)三硫醚，二(吡啶-4-乙基)三硫醚，二(嘧啶-2-乙基)三硫醚或二(苯并噻吩-3-甲基)三硫醚。
12.权利要求1的化合物，其中所述化合物是二(对-氟苄基)三硫醚，二(间-甲基苄基)三硫醚，或二(对-甲基苄基)三硫醚。
13.一种减缓或治疗神经母细胞瘤的方法，包含对有其需要的系统或对象给药有效剂量的权利要求1化合物或其医药组合物，且任选地与一种抗细胞增生剂联合使用，从而治疗或缓解所述神经母细胞瘤。
14.一种减缓或治疗除神经母细胞瘤外的细胞增生紊乱的方法，包含对有其需要的系统或对象给药有效剂量的下式化合物 或 其中，A和B可以相同或不同，且独立地是任选取代的芳基，杂芳基或一种5～14员、可以是单环或多环、且任选地含有杂原子的环；每个S都任选地呈其氧化物形式；S1和S2独立地是S，SO或SO2；每个R是氢原子，卤素，羧基，氰基，氨基，酰胺机，无机取代基，SR1，OR1或R1，其中每个R1是烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，碳环基或杂环基，其中每一个都任选地有取代且可含有杂原子；m，n和p独立地是0-3或有通式(3)或(4)的化合物 或 其中，A，B，R，S，n和p与上述定义相同；或有通式(5)的化合物 其中，A，B，S，n和p与上述定义相同；并且Z是(CR12)q或(CR1＝CR1)q*其中，q是0-3；并且“*”号代表C＝C可以代之以炔基，O，S，NR；或Z是任选地有取代的芳基，杂芳基或杂环基；其中，A和B一起可以形成环状基团；或其医药组合物，且任选地并用一种抗细胞增生剂；从而使所述系统或对象中的所述细胞增生紊乱得到治疗或缓解。
15.权利要求14的方法，其中使所述细胞增生减少，或诱导所述细胞死亡。
16.权利要求14的方法，其中所述对象是人或动物，且所述系统是细胞或组织。
17.权利要求14的方法，其中所述细胞增生紊乱病变是肿瘤或癌症。
18.权利要求17的方法，其中所述癌症是白血病，淋巴癌，肺癌，结肠癌，中枢神经系统癌，黑素瘤，卵巢癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，头颈癌，或胰腺癌。
19.权利要求14的方法，其中所述化合物是二苄基三硫醚，二(对-氟苄基)三硫醚，二(对-甲基苄基)三硫醚，或二(间-甲基苄基)三硫醚。
20.一种减少或抑制细胞增生或诱导细胞死亡的方法，包含对一个系统或一个对象给药有效剂量的一种权利要求14中定义的化合物或其医药组合物，且任选地与一种抗细胞增生剂联合使用，从而减少或抑制所述系统或对象中的细胞增殖或诱导所述系统或对象中的细胞死亡。
21.权利要求20的方法，其中诱导细胞凋亡。
22.权利要求20的方法，其中破坏微管蛋白的聚合和解聚，或抑制细胞分裂周期中的G2/M进一步发展、细胞有丝分裂，或其组合。
23.权利要求20的方法，其中抑制内皮细胞增生、血管形成、或其组合。
24.权利要求20的方法，其中所述对象是人或动物，而所述系统是细胞或组织。
25.权利要求20的方法，其中所述化合物是二苄基三硫醚，二(对-氟苄基)三硫醚，二(对-甲基苄基)三硫醚，或二(间-甲基苄基)三硫醚。
26.一种缓解或治疗血管狭窄的方法，包含对有其需要的对象给药有效剂量的一种权利要求14中定义的化合物或其医药组合物，从而缓解或治疗所述对象中的血管狭窄症。
27.权利要求26的方法，其中所述血管狭窄症与血管内膜增生密切相关。
28.权利要求26的方法，其中所述给药步骤是经口或非经肠给药，或通过血管内支架给药。
29.权利要求26的方法，其中所述化合物是二苄基三硫醚，二(对-氟苄基)三硫醚，二(对-甲基苄基)三硫醚，或二(间-甲基苄基)三硫醚。
30.一种医药组合物，包含权利要求1的化合物，和医药上可接受赋形剂。
31.治疗细胞增生紊乱的医药组合物，包含如下通式的化合物 或 其中，A和B可以相同或不同，并且独立地是任选取代的芳基，杂芳基或一种5～14员、可以是单环或多环的而且任选地含有杂原子的环；每个S都任选地呈其氧化物的形式；S1和S2独立地是S，SO或SO2；每个R是氢，卤素，羧基，氰基，氨基，酰胺基，无机取代基，SR1，OR1或R1，其中每个R1是烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，碳环基或杂环基，其中每一个都任选地有取代且可含有杂原子；m，n和p独立地是0-3或有通式(3)或(4)的化合物 或 其中，A，B，R，S，n和p与上述定义相同；或有通式(5)的化合物 其中，A，B，S，n和p与上述定义相同；并且Z是(CR12)q，(CR1＝CR1)q*其中，q是0-3；并且，“*”号代表C＝C可以代之以炔基，O，S，NR；或Z是任选地有取代的芳基，杂芳基或杂环基；其中，A和B一起可以形成环状基团；和医药上可接受赋形剂。
32.权利要求31中的通式1-2的化合物的制备方法，包含a)N-三甲基甲硅烷基咪唑和二氯化硫在卤代溶剂中反应制得硫化二咪唑；b)所述硫化二咪唑与硫醇反应。
33.权利要求32的方法，其中所述溶剂是二氯甲烷。
34.权利要求32的方法，其中让己烷中的N-三甲基甲硅烷基咪唑与二氯甲烷中的二氯化硫反应。
35.权利要求32的方法，其中让作为净相化合物的二氯化硫与己烷和二氯甲烷中的N-三甲基甲硅烷基咪唑反应。
36.权利要求32的方法，进一步包含使所述三硫醚重结晶。
37.权利要求36的方法，其中所述三硫醚是用正己烷、己烷、庚烷、石油醚或其组合重结晶的。
38.一种包含权利要求1的化合物的组合物的制备方法，包含a)将权利要求1的化合物溶解到水溶性有机溶剂、非离子性溶剂、水溶性类脂、环糊精、维生素、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂或其组合中，提供一种溶液，之后b)加入食盐水或含有0-10％碳水化合物溶液的缓冲剂。
39.权利要求38的方法，其中所述有机溶剂是聚乙二醇(PEG)、一种醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、或其组合。
40.权利要求38的方法，其中所述非离子型表面活性剂是聚氧乙烯甘油三蓖麻醇酸酯35、PEG-琥珀酸酯、多乙氧基醚20、多乙氧基醚80、12-羟基硬脂酸聚乙二醇660酯、脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、乙氧基化杏核油、辛基己酰macrogol-8-甘油酯、甘油酯、PEG6辛酸甘油酯、甘油、乙二醇多乙氧基醚，或其组合。
41.权利要求38的方法，其中所述类脂是一种菜籽油、甘油三酸酯、植物油、或其组合。
42.权利要求41的方法，其中所述类脂是蓖麻油、聚烃氧基蓖麻油、玉米油、橄榄油、棉子油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化菜籽油、氢化大豆油、甘油三椰子油酸酯、棕榈籽油、及其氢化形式、或其组合。
43.权利要求38的方法，其中所述维生素是生育酚。
44.权利要求38的方法，其中所述脂肪酸是油酸。
45.权利要求38的方法，其中所述脂肪酸酯是甘油单酸酯、甘油二酸酯、PEG的一或二脂肪酸酯、或其组合。
46.权利要求38的方法，其中所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精，或磺丁基醚-β-环糊精。
47.权利要求38的方法，其中所述磷脂是大豆卵磷脂胆碱、或二硬脂酰卵磷脂甘油、及其氢化形式或其组合。
48.权利要求38的方法，其中所述碳水化合物包含葡萄糖。
49.一种诱导细胞凋亡的方法，包含对有其需要的对象或系统给药有效剂量的权利要求14中定义的化合物或其医药组合物，且任选地并用一种抗增生剂，从而诱导所述对象或系统中的细胞凋亡。
50.权利要求49的方法，其中诱导细胞管状蛋白或微管蛋白。
51.按照权利要求38的方法制备的组合物。
全文摘要
本发明涵盖有取代的二、三、四和五硫化合物和组合物，和使用这些化合物治疗和/或预防细胞增生紊乱的方法。本发明还涵盖制备三硫化合物及其组合物的方法。
文档编号C07D277/00GK1997278SQ200580012460
公开日2007年7月11日 申请日期2005年4月20日 优先权日2004年4月20日
发明者徐晓, 安浩云, 王小波 申请人:美国艾森生物科学公司