通过药理学抑制amp-活化的蛋白激酶的神经保护的新方法

专利名称：：通过药理学抑制amp-活化的蛋白激酶的神经保护的新方法通过药理学抑制AMP-活化的蛋白激酶的神经保护的新方法发明背景中风，被定义为由脑循环破坏导致的脑功能异常，在美国是主要的死亡原因之一。即使中风不导致死，它强加于患者的代价包括严重的身体和情绪损伤，可以导致生产能力的丧失。这些代价源自中风对患者的脑造成的巨大损伤。在氧和糖减少时，细胞显示出蛋白质合成的快速破坏、细胞内能量贮藏的耗尽、细胞膜的去稳定化和NMDA受体的激活，导致脑中兴奋性中毒和氧化性细胞损伤。在免受和修复氧化性损伤并使细胞回到体内稳态的尝试中，许多补偿能量消耗过程被激活。然而，这些途径的过度激活可以是有害的、进一步耗尽细胞能量并导致进一步的脑损伤。这样的脑损伤通常是不可逆的。因此，保护中风过程中脑组织免受损伤(神经保护)的方法将是非常重要的。AMP-激活的蛋白激酶(AMPK)(代谢物感觉性蛋白激酶家族的一员)是外周能量平衡的已知传感物(CarlingD.，"TheAMP-activatedproteinkinasecascade-aunifyingsystemforenergycontrol."7>eMtfo肠c/r飾6:314(2):笫580-585页，2004年)。AMPK是一种异源三聚体蛋白，由催化a亚基(al或a2)和2个调控亚基(p和力组成。当细胞能量水平低时，AMPK纟皮磷酸化并激活。AMPK依次调节细胞代谢和不断地调节基因表达以恢复ATP水平。已知AMP/ATP比的增加、细胞pH和氧化还原状态的改变、以及肌酸/磷酸肌酸比的增加激活AMPK(HardieDG，SaltIP,HawleySA，DaviesSP，"AMP-activatedproteinkinase:anultrasensitivesystemformonitoringcellularenergycharge",/338:第717-722页，1999年；HawleySA，DavisonM，WoodsA，等人，"CharacterizationoftheAMP-activatedproteinkinasefromratliverandidentificationofthreonine172asthemajorsiteatwhichitphosphorylatesAMP-activatedproteinkinase",/5/o/C7^附271:第27879-87页，1996年)。在增加能量耗竭细胞中ATP水平的尝试中，AMPK增加脂肪酸氧化并限制脂肪酸合成。然而，在具有受限的脂肪酸氧化能力的神经元中，这种效应可能是有害的(AlmeidaA，MoncadaS，BolanosJP，"NitricoxideswitchesonglycolysisthroughtheAMPproteinkinaseand6-phosphofructo-2-kinasepathway",iV",/*eCW/6:第45-51页，2004年)。使用C75(公开于美国专利第5，981，575号(通过参考将其并入本文)中的一种合成的FAS抑制剂)抑制脂肪酸合酶(FAS)(负责棕榈酸的从新合成)增加了大量细胞类型包括神经元中的ATP7JC平。AMPK在下丘脑的神经元中高度表达，其中其似乎在食物摄取的调节中起作用。下丘脑磷酸化的AMPK(pAMPK)随饥饿而增加；C75治疗使AMPK灭活和去磷酸化，并引起显著的食欲缺乏。在不能实现能量供应的神经元中AMPK激活的结果是未知的。直到本发明以前，应激过程中的AMPK激活是保护性的还是损害性的仍不清楚。不存在调查AMPK在中风中的作用的现有研究。发明概述申请人发明了一种神经保护的方法，其包括给予正经受或经历过中风的患者一种为AMPK抑制剂的化合物。使用这些物质的治疗显著地减少了梗塞的面积，并因此使脑组织和神经元的损失最小化。因此，可以在中风或脑中缺血损伤后保护功能。相似地，在变性疾病中可以使神经元的损失最小化，所述变性疾病通过扰乱神经元中的能量利用和有效性引起神经元的危害。附图筒要说明图.1—AMPK和pAMPK在缺血的小鼠脑中的免疫组织化学定位。图.2—PAMPK和NeuN在缺血的小鼠皮质和海马中的免疫组织化学定位。图.3—中风后pAMPK升高的时间过程。图.4—显示在体外氧-葡萄糖丧失(OGD)后AMPK磷酸化升高的蛋白质印迹分析。图.5—TTC染色和蛋白质印迹分析显示在缺血和非缺血的脑半球中pAMPK升高。图.6—化合物C治疗引起局部和总的中风体积的显著下降。图.7—给予C75产生显著的神经保护。图.8—给予AICAR(—种AMPK激活剂)加重中风。图.9一野生型(\￥11和神经元一氧化氮合酶缺乏的小鼠(11]\08-/-)中的AMPK和pAMPK水平。图.10—野生型(WT)和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP-1)缺乏的小鼠中的AMPK和pAMPK水平。发明详述"神经保护"，意思是指保护脑细胞，优选神经元，在中风过程中和中风后免受由中风引起的永久损伤。"中风"，意思是指由脑循环破坏导致的脑功能异常。"AMPK抑制剂"，意思是指抑制AMPK的化合物，如通过Witters等人，/ow"flr/必/o/(g/c"/Ore附/s^j;，267，第2864-2867页(1992年)描述的方法测定的。优选地，AMPK抑制剂选自这样的化合物它不是肽或其它生物(或生物学衍生的)物质，而是小分子。本发明的组合物可以单位剂型呈现，用于给人和其它动物给药，该单位剂型如片剂、胶嚢、丸剂、散剂、颗粒剂、无菌胃肠外溶液或悬浮液、口服溶液或悬浮液、含有适合量化合物的水包油和油包水乳液、栓剂和流体悬浮夜或溶液。如本说明书中所用的，术语"药用稀释剂"和"药用载体"具有相同的含义。对于口服给药而言，可以制成固体或流体单位剂型。为制备固体组合物如片剂，可将化合物与作为药用稀释剂或载体的常规成分如滑石粉、硬脂酸镁、磷酸二钙、硅酸铝镁、硫酸钙、淀粉、乳糖、阿拉伯胶、甲基纤维素和功能上相似的物质混合。可以通过将化合物与无活性的药用稀释剂混合并将混合物装入合适大小的硬明胶胶嚢中，制备胶嚢剂。通过将化合物与可接受的植物油、轻液体石蜡或其它无活性的油的浆液进行机器包封，制备软明胶胶囊。可以制备流体单位剂型或口服给药如糖浆剂、酏剂和混悬剂。可以将该形式溶于具有糖、芳香调味剂和防腐剂的水性媒介物中以形成糖浆。可以借助于悬浮剂如阿拉伯胶、西黄蓍胶、甲基纤维素等等，用水性媒介物制备混悬剂。利用化合物和无菌的媒介物可以制得供胃肠外给药的流体单位剂型。在制备溶液时，可以将化合物溶于注射用水中，并在将其装入适宜的小瓶或安瓿和封口前滤器灭菌。可以将辅助剂如局部麻醉剂、防腐剂和緩沖剂溶于载体中。组合物在装入小瓶后可以被冷冻并在真空下除去水。然后可以将冻干的粉末称量到小瓶中，并在使用之前重构。受试者优选是哺乳动物，更优选是人。治疗的剂量和持续时间将取决于多种因素，包括(l)受试者的年龄、体重和器官功能(例如，肝和肾功能)；(2)要治疗的疾病过程的性质和程度，以及任何存在的显著共病态和服用的伴随药物，以及(3)药物有关的参数如给药途径、实现治愈必需的给药的频率和持续时间，以及药物的治疗指数。通常，将选择剂量以达到lng/ml至100ng/ml的血清水平，目标是在靶点获得大约1jtg/ml至10jig/ml的有效浓度。理想地，将在中风发作后尽可能快地给予所述化合物。在本发明之前，神经元代谢在对脑伤的响应中的作用是未知的。不愿受理论束绰，用本发明，目前已知在小鼠病灶再灌注模型中缺血中风后pAMPK升高。AMPK在缺血损伤的90分钟内升高，在早期的再灌注中增加了4倍。用本发明，目前还知道给予AMPK抑制剂不仅减少AMPK的激活(如由减少AMPK的磷酸化显示的)，而且还提供了显著的神经保护作用。还发现，给予AMPK激活剂可以加重中风损伤。尽管不愿受理论束缚，据认为AMPK除了在生理学能量调节上起主要作用外，还对缺血应激后的细胞存活具有深远的影响。在缺血应激期间能量需求高时，由于缺少底物(氧和葡萄糖)而能量供应低。通过干扰细胞能量感受和AMPK激活，细胞的缺血阈值可以增大，使细胞在能量不足但是静止状态时存活，直到恢复能量产生。用合成的FAS抑制剂/CPT-l刺激剂如C75调节代谢途径，可以改变神经元代谢并产生积极的能量平衡。C75在皮质培养物和体内下丘脑中抑制AMPK，这表明AMPK对神经元能量平衡有反应。给予C75导致在培养的神经元中的神经元ATP水平的持续增加。在缺血的条件下，连续的ATP耗尽可以超过能量恢复途径，通过细胞凋亡的能量-消耗过程致使无能的细胞死亡，将细胞分流到坏死细胞死亡中。因此，在对缺血的神经元响应中感觉性ATP水平可能是重要的，并且AMPK抑制剂可以ATP和神经元。AMPK激活在脑缺血后发生；在这样的背景下，其激活对于神经元的存活是有害的。在缺血后的脑中，AMPK集中于神经元，并保持这种分布模式(与神经胶质的定位相反)。在体内脉管阻塞的卯分钟内以及在体外氧葡萄糖缺乏(OGD)后2小时内，AMPK被快速激活。AMPK增加的水平在整个脑中可见，在半影区和在远离缺血创伤的部位。最初，这种增加祐j人为表示对神经元应激的适应性响应，作为在增加能量需求时引起脑能增加ATP生成的机理。令人意外的是，然而，我们的药理学研究清楚地证明在神经元缺血的情况下抑制AMPK激活减少了中风损伤。在我们的模型中给予AMPK抑制剂化合物C或FAS抑制剂C75，提供了显著的神经保护作用。与此相反，给予AMPK激活剂AICAR加重了中风损伤。最后，nNOS缺乏的小鼠在中风后具有较少的梗塞和较低的pAMPK水平，然而尽管有更少的梗塞，PARP-1缺乏的小鼠相对于WT具有相似的AMPK水平。这提示在神经元应激的情况下，在体内nNOS和ONOO途径是重要的AMPK激活剂。在缺血和再灌注损伤的体内模型中，神经元AMPK的激活是有害的，并且防止中风诱导的AMPK磷酸化是神经保护性的。在缺血的细胞中形成的一个充分表征的细胞毒素是过亚硝酸盐(ONOO)，当超氧化物和NO以近等摩尔量产生时，形成强作用的氧化副产物。存在超氧化物从线粒体呼吸链中不断的渗漏，其被内源性抗氧化剂如超氧化物歧化酶(SOD)灭活。在增加NO生成的情况下，NO能够超过SOD竟争超氧化物，导致ONOO生成。ONOO不可逆地抑制酶、损伤DNA和激活能量消耗性的、NAD-耗尽性的DNA修复酶聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP-1)。牛内皮细胞接触化学合成的ONOO，激活AMPK,AMP浓度无变化，一种用缺氧/复氧复制的效果。这些效应通过SOD的腺病毒的过度表达或给予NOS抑制剂得到改善，这提示ONOO介导的AMPK激活是由NO介导的。最近，据发现抗糖尿病药二甲双胍通过相似的才几理也可以独立于AMP水平而激活AMPK。这表明NO/ONOO途径对于AMPK激活可能是重要的刺激。我们在111\08-/-小鼠中的研究支持这种假设，因为在这些动物中所见的NO和ONOO生成的减少，导致i秀导中风i秀导的AMPK激活显著地减少。然而，雄性nNOS小鼠与它们的WT对应物相比具有显著更少的中风。可能是任何减少缺血损伤的操作将导致pAMPK激活的降低，这是因为施加于脑的"更轻微的"缺血应激所致。AMPK的升高可能简单地表示增加的缺血损伤的标记。我们通过检查具有PARP-1定向缺失的雄性小鼠的pAMPK水平，解决了这些问题。令人意外的是，尽管有显著更小的(>50%)梗塞，PARP-1棵鼠和它们的WT相比，具有相等的中风诱导的/^Afi，IT升高。这提示pAMPK升高不但是缺血损伤增加的标记，而且在机理上可能与ONOO和nNOS有关。在体内缺血损伤后AMPK激活对细胞存活的影响，先前是未知的。大多数的研究是在体外进行的，常用转化的细胞系。在培养的海马神经元中在减少能量利用度(葡萄糖缺乏和谷氨酸兴奋性中毒)的情况下，用AICAR激活AMPK提高了存活率。然而，多数的研究者目前已证实了通过c画jun-N-末端激酶(JNK)、c-myc和capsase3的刺激，AICAR对多数细胞系包括肝细胞、成神经细胞瘤细胞和小鼠MMIN细胞的前细胞凋亡效应。与此相反，AICAR在缺血的心肌细胞中是保护性的并且防止神经酰胺诱导的星形胶质细胞凋亡，这提示AICAR的作用取决于细胞类型和所用的模型系统。AICAR被吸收进入细胞中并在细胞质中蓄积，如同单磷酸化的核苷酸，ZMP，其模拟AMP的效应并激活AMPK,而没有改变细胞ATP水平。然而，AICAR是非特异性的，并在细胞内具有很多的其它效应，包括腺苷的诱导，腺苷是一种已知的通过竟争核苷转运的血管扩张药。AICAR减少了沙土鼠整体缺血后海马中延迟细胞死亡，但在这种情况下，AICAR被用作腺苷激活剂。此外，缺血损伤的模型和我们的缺血-再灌注损伤的模型是完全不同的。我们的数据证明在中风中存在AMPK的激活，并且这种响应，当由于AICAR增强时，加重了组织的损害。在体内研究中对于使用AICAR的限制是由我们的生理学数据证明的，其显示在AICAR-处理的小鼠中MAP的暂时、但显著的下降。通过减少外周梗塞区域的灌注，MAP的减少可能增加梗塞形成，与对AMPK的作用无关。即使短暂的下降，用AMPK的药理学抑制看到CBF的维持(通过LDF(激光多普勒流量))和显著的神经保护作用，这不太可能是主要的解释。此外，近来的数据提示AMPK激活对缺血的心脏也是有害的，因为11202诱导的心脏损伤通过使用化合物C治疗部分地得到改善，这与我们在CNS中的发现是相似的。然而，AMPK的激活在对于缺氧有响应的一些外周组织中可能是有益的，在CNS中的情形可能不一样。例如，在含氧量低的内皮细胞中，eNOS由AMPK直接磷酸化激活，以推测改变血管紧张度来增加血流量。然而，在中风中AMPK的这种推测上的有益效果可能具有有限的用途，因为在急性阻塞(通过细丝造成)过程中脑血流量(CBF)剧烈地减少，使得eNOS-诱导的血管舒张成为无效的、能量消耗的过程。而且，在缺氧的情况下，增加的NO产生(通过eNOS)可以导致扩散自由基损伤的ONOO水平的增加。在体内和体外系统中的考察在测定AMPK激活的生理学结果方面是极其重要的。体外神经元中过度的NO接触的严重ATP-耗尽效应是由对线粒体呼吸的抑制作用和糖酵解的抑制介导的，其导致氧化的和糖酵解的能量生成的减少。然而，在星形胶质细胞中，NO-诱导的呼吸的抑制导致星形胶质细胞糖酵解的增加和细胞凋亡的减少。这种快速NO-依赖的星形胶质细胞糖酵解的激活是由AMPK激活和随后磷酸果糖-2-激酶(PFK-2)的激活介导的。因此，星形胶质细胞对应激和缺氧有响应，糖酵解补偿增加，提供能量并防止细胞死亡。用AMPKsiRNA转染星形胶质细胞致使星形胶质细胞不能够增加对NO以及细胞凋亡水平的增加起反应的糖酵解。神经元，和星形胶质细胞不用，缺少增强糖酵解的酶机器，因为它们具有非常低的PFK2水平和有限的脂肪酸氧化能力。因此，在病理条件如中风下，AMPK的激活可能不增加神经元的存活。尽管病灶性中风涉及脑的离散区域，补偿机制(包括脑血流量(CBF)和代谢需求的变化)在远离缺血"核心"的区域中发生。例如，大的单侧病灶损伤后，在对侧的"未受影响的"半球发现脑水肺，这提示在远离最初受伤的区域中脑含水量可以变化。与非-缺血的脑的通讯可以通过其发生，经胼胝体的或内半球的"神经机能联系不能"发生，其导致CBF、电生理学活性和代谢的损伤。如由pAMPK水平的显著对侧升高所提示的，可能AMPK激活的信号被传递遍及整个脑。AMPK的激活增加了已受损害的神经元中的应激。干扰细胞能量感受可以增加缺血阈值，使细胞在能量不足但是静止状态中存活，直到恢复能量产生。在缺血的级联反应的早期，减少AMPK激活可能促进"神经元冬眠，，，防止完全的神经元的能量缺乏，延长神经元的生存力，直到可以恢复血液和养分供应。改善缺血神经元中的能量动力学使延长临床中风的"治疗窗"成为可能。我们的发现证明了这样的启示神经元的代谢途径可能表示一种重要的和新的神经保护的靶。通过下面的非限制性实施例进一步说明本发明。实验动物按照NIH研究中管理和使用动物的指南并根据由约翰霍普金斯(JohnsHopkins)大学的动物管理和使用委员会批准的方案进行了下面的实验。缺血的模型如McCullough等人，S^Y/^,32，第796-802页(2001年)和McCullough等人，/iVe"f7wc,ewce，24，第257-268页(2004年)分别描述的，通过雄性C57B6小鼠(CharlesRiver)或雄性大鼠在氟烷麻醉下可逆右中脑动脉闭塞(MCAO)120分钟，接着再灌注多次来诱导脑缺血。内-缺血和再灌注后22小时神经学缺陷(NDS)评分如下0，没有缺陷；1，前肢无力并且当抓住尾巴提起时，躯干转向同侧；2，向受影响的侧面旋转；3,在受影响的侧面不能负重；以及4，无自发的运动活性或桶式翻滚。将任何没有缺陷的动物排除在研究之外。在末端缺血时，短暂地再麻醉动物，通过收回细丝开始再灌注。假手术动物接受相同的手术操作，但是不将缝线推进到内颈动脉。为了药理学神经保护研究，小鼠在再灌注后存活22小时，在这段时间进行行为评分。然后采集脑用TTC组织学进行病理学检查(参见组织病理学部分)。在单独的动物群组中，如上文参考的2001McCullough论文中描迷的，在整个MCAO和早期再灌注中评价生理学量度、股动脉血压和皮质灌注(激光多普勒血流仪)。另外的动物在药理学或媒介物处理后经受缺血或假手术，并在第4或24小时处死进行蛋白质印迹分析。雄性nNOS和PARP-1缺乏的小鼠(参见，Huang等人，Science,265，第1883-1885页(1994年)；Eliasson等人，A^.MW，3，第1089-1095页(1997年))接受2-小时右MCAO或假手术，并与另外的WT群组(C57-BL6用于nNOS-Z-和SVEV用于PARP-Z-)比较。^t^^jg织病理孛在5个2毫米切片中通过2，3，5-三苯基四唑鎗染色分析梗塞体积。如先前由McCullough,等人，/7Ve"rw"e/ice23，第8701-8705页(2003年)描述的，通过视频显微术和成像分析(Inquiry3，LoatsAssociates)测定梗塞体积。蛋冷I伊遂为V,通过快速从颅骨中除去脑获得小鼠和大鼠中风以及假中风脑样本，切除小脑，接着立即解剖成右(R)和左(L)半球。样品在液氮中急冻。将从大鼠中得到的样品再进一步解剖成两个半球的核心和半影区。将样品保存在-80。C下，直到使用。每个样品在200jiL的溶胞緩冲液(50mM的Tris-HCl、pH7.5、250mM的蔗糖、5mM的焦磷酸钠、50mM的NaF、lmM的EDTA、lmM的EGTA、lmM的DTT、0.5mM的PMSF、0.1mM的苯曱脒、50jig/ml的亮肽素、50jig/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂)中匀化。添加SDS洗涤剂至最终浓度为0.2%，并将溶胞产物煮沸5分钟。收集上清液后，使用BCA试剂盒(BioRad)测定蛋白质浓度。在4-15%梯度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上每条电泳泳道装载40jig蛋白质，并转移至聚偏二氟化乙烯膜。连续探查、剥离和再探查印迹，用于抗原检测。AMPKa的磷酸化釆用抗-磷酸-AMPKa(al和a2苏氨酸)抗体(1:1000，CellSignaling)进行测定。ACC(1:500)、p-ACC(l:1000)、pAkt(l:500)和Akt(l:500)抗体从Upstate,LakePlacid,NY得到。抗-AMPKa抗体(抗國al和a2，1:1000;CellSignaling),热震蛋白(hsp)-70(1:1000;SantaCmz)和0-肌动蛋白(1:5000;Sigma)用作装载对照。将所有的印迹在4。C在含有5%的BSA和0.1%的Triton-X-100的TBS緩冲液中的一抗中孵育过夜。将二抗(山羊抗-兔IgG，Chemicon)稀释至1:5,000，并使用ECL(pico)检测试剂盒进行信号检测。漂浮的脑切片按照Kim等人，/.jB/o/.C&附.，279，第19970-19976页(2004年)所述的方法(有修改)进行制备。将自由浮动的切片在室温下封闭于含有5%山羊血清、1mg/mlBSA、0.05%Triton-X100和1mMNaF的PBS中1小时，接着在4'C下在含1%山羊血清、1mg/mlBSA、0.05%Triton-X-lOO、1mMNaF的PBS中用抗-磷酸-AMPKa抗体(1:100)、GFAP(1:1000，DAKO;用于星形胶质细胞)、NeuN(Chemicon1:100;成熟神经元的标记)或VWF(SantaCruz;1:400用于内皮细胞)孵育过夜。将二抗(1:200;VectorLaboratories;Burlingame，CA)在含l。/。山羊血清的PBS中培养1小时30分钟(TexasRed,FITC)。使用Zeiss影像获取软件(ZeissLSM510)，用免疫荧光共聚焦显微术使信号显影。漆马勿^潜券參和OGZ)海马器官型切片培养物根据McCullough等人，&ro/^，32,第796-802页(2001年)所述的方法进行制备。使用组织切片机(McILwain组织切片机；VibratomeCompany,St.Louis,MO)从出生后7天的大鼠幼崽获得350微米的冠状半球切片。将海马切片转移至6孔板中30mm的Millicell可渗透膜嵌入物(0.4jim;Millipore，Bedford,MA)上，每孔含有1ml培养基(50。/。的MEM、25%的HBSS、25。/。的热灭活的马血清、6.5mg/ml的D画葡萄糖、5U/ml的青霉素G和5ng/ml的硫酸链霉素)。在5%C02和37。C下，在加湿的培养箱中保持培养物13天。一周2次完全更换培养基。第13天在体外进行缺氧的诱导。切片培养物用温的BSS(以mM计125NaCl、5KC1、1.2NaH2P04、26NaHC03、1.8CaCl2、0.9MgCl2、10HEPES和10葡萄糖)漂洗两次，并返回培养箱中平衡30分钟。切片培养物用温的脱氧的不含葡萄糖的BSS漂洗两次、转移至密闭腔中、用不含氧的气体(5%(:02、85%N2和10%112)沖洗，并在37。C下保持60分钟。对照用BSS漂洗并转移到正常充气的培养箱中1小时。通过将培养物返回至新鲜的培养基(50%MEM、25%HBSS、25%热灭活的马血清、6.5mg/ml的D画葡萄糖、5U/ml的青霉素G和5ng/ml的硫酸链霉素)中终止缺氧期，并制备样品在第2、4、6和24小时进行蛋白质印迹分析(如上所述)。在每个实验中包括对照和OGD-处理的切片，所述实验有三个重复孔或每个实验组每种条件15个切片。鍵^夢》浙将所有数据表达为平均值土SEM。生理学变量和组织学通过1-因素ANOVA进行分析，用post-hocNewman-Keuls校正多重比较。通过Mann-WhitneyU检验分析缺血后的神经学得分。在*,p<0.05;**,p<0.01;***，p〈0.001时，认为数值统计学显著。链ja/p/jt在缺j&^^一^无中的^这从接受2小时MCAO,接着2小时再灌注的小鼠中获得的脑组织切片显示出明显的神经元AMPK和pAMPK染色(图1，n-5/组)。它们也用NeuN(用于成熟神经元)、GFAP(用于星形胶质细胞)染色。共聚焦显微检查证明了NeuN和AMPK/pAMPK的共定位，在星形胶质细胞中不存在共定位。共聚焦显微检查证明了AMPK(图1A-C)和pAMPK(图D-F)集中在大脑中动脉(MCA)分布的皮质神经元，如4吏用成熟神经元标记物NeuN的双标记免疫荧光法所显示的。NeuN的pAMPK免疫染色的皮质神经元的更高放大率(图1G-I)显示了a同种型的核和细胞质的免疫染色。虽然AMPK可能仅仅在完整脑中未受刺激的星形胶质细胞中最小表达，但先前的研究在培养的星形胶质细胞中发现了AMPK免疫反应性。为了弄清楚体内AMPK和pAMPK的定位，我们检查了梗塞后4和24小时(再灌注的2或22小时)采集的正常非-缺血组织以及脑，以测定中风后AMPK是否在星形胶质细胞中表达。MCAO后4小时，仅有最少的GFAP与AMPK或pAMPK的共定位(分别为图1J-L和图1M-O)。与4小时的组织相似，在中风后24小时在皮质中没有看到AMPK或pAMPK与GFAP的共定位(图1P-R)。此外，在完整或缺血脑中没有看到AMPK或pAMPK与内皮标记vonWillebrand因子(VWF)的共标记(没有显示数据)。为了测定这种模式的pAMPK免疫定位是否区域保留，在梗塞后24小时(再灌注的22小时)获得了pAMPK和NeuN双重标记的低功率影像(图2)。在皮质(图2A-C)和海马(图2D-F)看到相似水平的染色，在两个区域具有明显的pAMPK和NeuN的共标记。在没有添加一抗的对照切片中没有看到信号(没有显示数据)。这些结果表明，在缺血的和非-缺血的脑中AMPK主要在神经元中表达，其中它可以细胞-自发的方式发挥功能以影响神经元的能量平衡。^藩授潜*雄性野生型(WT)C57B16小鼠接受2小时的右侧MCAO或假手术，采用不同的再灌注次数。保持生理学参数如温度恒定。在C75和化合物C(CpdC)处理的动物中，与各自媒介物相比，每个治疗組之间的生理学量度没有显著的差异。在2小时的缺血内，显示MAP和LDF是平均的。AICAR处理的动物在15分钟MAP显著地减少(p0.05)，在监测的2小时内没有整体上的差异。内缺血LDF的减少在媒介物和AICAR动物中是相等的，然而在再灌注的30分钟时LDF显著地的减少(p〈0.05)(n-4/组)表l:每个实验组的内-缺血生理学变量和激光多普勒流量(LDF)值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如在图3中所见的，与接受假手术的动物(假)相比，早在缺血后90分钟，pAMPK(如通过对苏氨酸(Thr)砩酸化位点的全(pan)a亚基抗体检测的(参见，Hawley等人，C/^附271，第27879-2788"7页(1996年))在缺血的脑(中风)中升高(对于缺血的动物，每个时间点n=6;对于假手术的对照，每个时间点4)。PAMPK水平在右，缺血的半球(R)和左，非-缺血的半球(L)中升高，并在缺血的右半球和非-缺血的左半球中保持升高持续24小时(再灌注的22小时)。与之相反，在假手术脑中的pAMPK水平在24-小时期间内保持稳定。总的AMPK水平表现了最小的变化。在缺血的半球中看到热震蛋白-70的适当升高，尽管这些在较后的时间点(即，6、12和24小时)最显著。将p-肌动蛋白用作装载对照。pAMPK水平的整体增加提示，不仅在缺血的区域而且在对侧非缺血的侧面中，继发于代谢紊乱和补偿反应，激活了AMPK。除了在体内的发现，我们还测定氧-葡萄糖缺乏(OGD)(—种体外的中风模型)后AMPK在体外海马切片培养物中是否被激活。我们发现与含氧量正常的血糖正常的对照培养物比较，OGD后2小时pAMPK水平显著增加(图4A)。pAMPK的这种增加在6小时时持续，但是直到24小时正常化，如在我们的体内研究中所见的。AMPK激活的下游区靶是乙酰辅酶A羧化酶(ACC),其在脂肪酸的从新合成中是调速(pace-setting)酶；当被激活时，AMPK介导ACC的磷酸化，因此使ACC失活，并在能量缺乏时限制脂肪酸合成的合成代谢过程。OGD后4小时切片样品的评价证明了磷酸化的或失活的乙酰辅酶A羧化酶(pACC)的水平的增加(图4B),这支持这样的观点观察到的pAMPK增加是生理学上相关的。在OGD或对照切片中所有的检查时间点，总的AMPK和ACC水平变化最小。在^j^的羊教^发现^m户it并葛假定中风中的代谢紊乱在梗塞的坏死核心中可以是更严重的，然而在抢救边缘地发挥作用的脑的尝试中，在半影中存活前(pro-survival)途径可以被激活，我们在中风后6小时从大鼠脑(n-6/组)的缺血右半球(ih，缺血的半球)或非缺血左半球(nih;非缺血的半球)分割出核心(CC)和半影(PC)组织，用于蛋白质印迹分析(图5)。大鼠用于这个实验，因为使用较大的大鼠脑，更快和更可靠地剥离核心和半影；这也允许我们证实在不同物种中我们的发现。在24小时，使用TTC染色使缺血和剥离的区域显影(图5A)。同假手术脑(PC和CC)中任一半球的pAMPK水平相比，在皮质半影非缺血半球和在对侧的非缺血半球(PCNIH和CCNIH，分别地)中pAMPK水平显著地提高(图5B)。在缺血的核心(缺血半球中CC)中的pAMPK水平低于脑的其它区域中的水平，但是相对于假手术的动物(假CC和PC)是提高的。可能核心中的较低水平的AMPK表示在梗塞的缺血核心中蛋白质合成和能量依赖的磷酸化的不足。然而，看到了热震蛋白70的期望的增加f参见，Kury等人，E"尸/A^"my"'19，第1708-1720页(2004年))。选择性地，在半影中AMPK激活可以表示补偿保护途径。在受损的神经元中pAMPK可以被正调节，但是保持有活力，作为增加有效能量供应的策略。对侧AMPK的升高提示远离损害的区域的神经元还可以接受信号以增加能量利用度。因此，pAMPK水平的增加和因此活性可以表示适当的、内源性的神经保护途径。为了解决这个问题，我们进行药理学操作AMPK水平以测定变化中的pAMPK水平对于中风结果的影响。必合參C减少j^MPf7A乎#^^€^^经保###为了检查AMPK激活在这种缺血模型中的功能作用，我们在用化合物C处理的小鼠上探察了中风结果的影响，化合物C是一种药理学AMPK抑制剂，被描述在/C7Z"/"veW108，第1167-1174页(2001年)中。测定了在中风发作(2-小时MCAO和22小时再灌注)时，在用化合物C(20mg/kg腹膜内传递；n-14)或媒介物(n-8)处理的动物中对中风结果的影响(图6)。与媒介物处理的动物相比，化合物C显著地减少总的梗塞体积(如用％非-缺血的半球测量的，使用TTC对水肿校正)，以及紋状体的(CP;64±5.7对21±3.9;pX).001)和皮质的(CTX;63土3.4对19.4±3.3;p〈0.001)梗塞体积(图6A)。在24小时行为缺陷的严重性的减少反映了这些差异(媒介物3.3±0.3对化合物C1.9±0.2，p<0.01)。在内缺血的时期(媒介物=9.8±0.54对化合物C=10.6±0.9;基线的百分比；p-n.s.)或在再灌注后的30分钟期间，根据激光多普勒测量的相对脑血流量(CBF)不存在差异，这提示血流量的差异不能解释缺血损伤的差异。在处理组之间没有发现生理学量度的差异(表1)，这证明这些因素对中风结果的贡献等同。另外組的媒介物或化合物C处理的小鼠(接受2小时MCAO(n=6/组)或假手术(11=4/组))在梗塞形成后4小时(图6B)或24小时(图6C)被处死，用于测定AMPK和pAMPK水平。在中风和假手术动物中，来自缺血的(右，R)或非-缺血的(左，L)半球的溶胞产物通过蛋白质印迹分析进行分析。相对于假手术动物(泳道3和4),在媒介物处理的动物(图6B，泳道1和2)中发现梗塞形成后4小时(再灌注的2小时)pAMPK的预期增加，但是在化合物C处理的动物中pAMPK的水平减少(泳道5和6);总的AMPK水平没有变化。化合物C的作用是暂时的；pAMPK水平与在媒介物-处理的小鼠中到24小时看到的水平相似(图6C，泳道l和2，与泳道5和6比较)。这些结果提示，用化合物C对AMPK的抑制是神经保护性的，并且这种神经保护效应与pAMPK水平的降低相关。K4S押新浙C75f/趟的j^4Af/^:水乎的膠瓶4井X吵^C^^经保^赠在缺血(i^9/gp)发作之前即刻，我们给予FAS抑制剂C75(腹膜内20mg/kg)或媒介物(RPMI)。这个剂量是以先前的体内数据为基础的，其证明了对喂养行为和下丘脑中C75活性的抑制的影响。在C75-处理的组中看到的总的和局部的梗塞体积显著地减少(pO.OOl)。看到行为评分的提高(媒介物3.2±0.05对C752.0±0.03，p<0.01)。当使用化合物C时，没有看到LDF或生理学变量上的差异(ii-4)。另外组的媒介物或C75处理的小鼠(接受2-小时MCAO和再灌注(n-6/组)或假手术(11=4/組))在中风后4小时(图7B)或24小时(图7C)4皮处死，用于分析AMPK和pAMPK水平。在再灌注的2小时，在C75-处理的和媒介物-处理的小鼠(图7B，泳道1和2分别地对泳道5和6)中看到pAMPK预期的增加，尽管pAMPK水平的增加被C75处理减弱。当使用化合物C时，与非-缺血的左半球(L)相比，在缺血的右半球(R)中，pAMPK水平增加的降低更显著。与媒介物-处理的小鼠相比，中风后24小时C75显著地降低了假手术和中风小鼠中的pAMPK水平(图7C，泳道l-4分别地对泳道5-8)，这表明了在降低pAMPK^水平上C75(与化合物C相比)更持久的中枢效应。如图5A所示，在C75-处理的組中发现总的和局部的梗塞体积有显著的减少(PO.001)。在内-缺血的或再灌注的血流量上没有显著的差异，血流量通过激光多普勒测量，在未能幸存的群组中MAP、pH或血气量度也没有看到存在差异(11=4，数据没有显示)。另外组的媒介物或C75处理的小鼠(接受2-小时MCAO(n-6/组)或假手术(n-4/组)，在中风后4小时(图5B)或24小时(图5C)被处死，用于分析AMPK和pAMPK水平。在媒介物和C75-处理的小鼠中，在再灌注的2小时，发现pAMPK预期的增加。在假手术和中风小鼠中，在C75处理的动物中在24小时看到pAMPK水平的降低，这证明了在减少pAMPK中C75(同化合物C相比)更持久的中枢效应。炎眉^Af尸^T^活浙5-扇差^^!"-f教麽核潜裙茅"/C!R》的在中风发作时，给予广泛使用的AMPK激活剂，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷(AICAR)，(参见,Corton等人，/5/oc/ie附，229，第558-565页(1995年))(腹膜内注射500mg/kg;n-ll/组)。AICAR被吸收到细胞中并磷酸化形成ZMP,其模拟AMP对AMPK激活的影响。在AICAR-处理的动物中，总的和皮质(CTX)的中风体积有显著的加剧(图8A)。生理学监测证明在AICAR处理的动物中平均动脉压(MAP)显著的降低，所述动物到注射后15分钟自我校正(MAP媒介物84对AICAR69mmHg，p<0.05)。在再灌注后30分钟，同对照相比，在AICAR-处理的小鼠中发现内缺血的CBF没有差异，但是CBF有减少(基线的98%对82.7%，p<0.05)。这提示除了其对AMPK的作用之外，AICAR的部分有害效应可能继发于减少的灌注压力。蛋白质印迹分析显示，在AICAR处理的动物与媒介物处理的动物中，中风(再灌注的2小时)后4小时pAMPK升高(图8B泳道5-8分别地对比泳道1-4)，到24小时时返回至基线(数据没有显示)。因为onoo(过亚硝酸盐)是中风诱导的神经元损伤的显著贡献者，并且AMPK在体外由ONOO以及缺氧激活，我们评价了神经元的NOS(nNOS)在中风后AMPK激活中的作用(图9)。nNOS敲除动物和它们的野生型相应物相比，具有显著更小的梗塞，这主要是由于ONOO产生的减少。我们证实了在MCAO模型中nNOS耗竭的神经保护作用(总的梗塞WT中为55.8±4.9%;nNOS-Z-中为31.9±4%;p<0.01)。雄性nNOS-Z-和野生型(WT)小鼠接受右侧MCAO，并在梗塞形成(再灌注的22小时)后4小时(图9A)或24小时(图9B)采集脑。在第4小时，WT小鼠同WT假手术动物相比显示在缺血的(右，R)和非-缺血的(左，L)半球中pAMPK的升高。然而，在nNOS-Z-小鼠中，中风诱导的pAMPK水平的上升被取消，并且pAMPK水平和假手术小鼠的相似。在24小时发现了相似的结果(图9B)。在梗塞形成(再灌注的22小时)后24小时，同WT相比，磷酸化Akt的水平在nNOS-/-小鼠中也减少，这提示在Akt、AMPK和NOS之间的可能联系(图9C)。由于nNOS-A小鼠中AMPK激活的减少可能只是在这种品系中看到的缺血损伤减少的反映，我们还检查了DNA修复酶聚(ADP-核糖)聚合酶-1缺乏的雄性小鼠(PARP-1敲除的小鼠)，其与111>[08-/-雄性小鼠相比具有相似的中风体积的减少(图10)。令人意外的是，尽管有更小的梗塞，同它们各自的WT相比，PARP-1缺乏的小鼠在缺血的半球中具有相似的pAMPK激活水平(图10，仅显示了缺血的半球)。这提示在nNOS缺乏的小鼠中发现的NO或ONOO产生的减少，导致了AMPK激活的选择性改善。权利要求1、一种神经保护的方法，其包括向正经受中风或经历过中风，或者其它由于其它病因学引起的脑血流的中断的患者给予一种化合物，该化合物是AMPK抑制剂。2、权利要求1的方法，其中所述化合物不是肽或其它生物物质或生物学衍生的物质。3、权利要求2的方法，其中所述化合物是C75。4、权利要求2的方法，其中所述化合物是化合物C。5、权利要求2的方法，其中所述化合物不是C75或化合物C。6、权利要求l的方法，其中所述化合物是小分子。7、用于治疗中风的药物组合物，其含有AMPK抑制剂。8、权利要求7的药物组合物，其中所述AMPK抑制剂是直接的抑制剂。9、权利要求7的药物组合物，其中所述AMPK抑制剂是间接的抑制剂。全文摘要一种神经保护的方法，包括给予患者一种AMPK抑制剂，所述患者正经受或经历过中风，该化合物是AMPK抑制剂。使用这些药剂的治疗显著地减少了梗塞的面积，因此使脑组织和神经元的损失最小。因此，可以在中风或脑缺血损伤后保持功能。相似地，可以使变性疾病中神经元的损失最少，该变性疾病通过扰乱神经元中的能量利用和有效性引起神经元的损害。文档编号C07K14/00GK101132802SQ200580012767公开日2008年2月27日申请日期2005年3月23日优先权日2004年3月24日发明者G·V·罗奈特,H·李,J·麦克法丹,L·D·麦库洛夫申请人:法斯根有限责任公司;约翰斯霍普金斯大学