人源人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备方法

专利名称：人源人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程和免疫学等技术领域，涉及一种人源人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备方法。

背景技术：
血管生成(angiogenesis)是指组织利用既存血管产生新的血管的过程。1971年，Folkman最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，并把恶性肿瘤的生长分为血管前期和血管化期，但此观点在当时并未被人们接受。之后，1979年毛细血管内皮细胞培养技术的建立、1982年第一个血管生成抑制剂的发现、1984年第一个血管生成活性蛋白的纯化等工作的完成，使这一观点为越来越多的证据所支持，并成为肿瘤研究和治疗的新热点。
原发肿瘤具有诱导新生血管生成的能力，同时肿瘤的生长和转移也依赖于肿瘤内新生血管的生成。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1-2mm3。因此，肿瘤新生血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor，TAI)所具有的破坏或抑制肿瘤的新生血管生成的能力，使其具有阻止肿瘤的生长和转移的作用。TAI与传统细胞毒性药物相比，具有特异性较好、可直接发挥作用、效果具有放大作用、不易产生耐药性和毒副作用较小等优点。
目前，已知肿瘤新生血管过程受四、五十种正负调节因子的共同调控。其中，VEGF是一种研究最为深入的血管生成正调节因子，它具有增加微血管的通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建、促使内皮细胞的迁移等多种作用，是已知的最强的血管通透剂。针对VEGF的抑制剂的研究是抗肿瘤研究领域的一个热点方向。其中，VEGF的单克隆抗体是一类具有极大潜力的特异性抑制剂。
自1975年Kohler和Milstein报告用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)以来，由于单抗对相应抗原具有高度的特异性以及抗体分子的均质性，可大大降低在体内与正常组织的交叉反应，为治疗疾病，尤其是肿瘤带来了新的希望。但不幸的是鼠源单抗应用于人体时存在着免疫学和药理学两方面的问题，主要表现在以下方面①血清中半衰期短，多数鼠IgG的半衰期仅20h，很快被机体清除，最后仅1％到达靶标；②抗原表达具有异质性(不均一性)，表面靶抗原脱落或特异性不强，很多病变细胞未被抗体结合；③不是所有亚类的抗体均能引发效应功能，非特异分布的抗原会募集效应细胞产生副作用；④目前可大量供应的绝大多数优质抗体为鼠抗体，最大的应用障碍是诱发人抗鼠抗体(human antimouseantibody，HAMA)反应。鼠抗体注入人体内，在8-10天左右即出现HAMA反应，并于20-30天时达到高峰。
鼠单抗在人体内诱导的内源性抗体基本可分两类抗独特型抗体和抗种型抗体。前者通过中和抗原结合位点而消除单抗结合能力；后者除了加速单抗的清除外，还会在诊断时引起假阳性，最主要的则是会引起过敏性休克。据报道，多数鼠源性单抗药物在黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌和卵巢癌患者中HAMA发生率高达100％，HAMA对注入的单抗药物起中和作用，从而抵消其疗效，除非这些问题被解决，否则不可能大剂量及多次给病人使用单抗。解决这些问题，要从抗体质量(亲和力、特异性、免疫原性)、抗体药物理化性质、用药途径等多个环节进行改善，目前避免或减小HAMA反应的主要途径是使鼠源性单抗人源化或研制完全人源抗体。
2004年2月，美国GENENTECH公司利用基因工程技术研制的人源化抗VEGF单克隆抗体AVASTIN作为治疗转移性结直肠癌的一线治疗药物，在美国上市。但是AVASTIN并非是一种全人源的单抗，其蛋白结构中仍然保留约7％的鼠源氨基酸。最理想的单克隆抗体是100％人源的，或由人类免疫系统自然产生的。但是目前在开发这类抗体时却往往会遇到抗体亲和力下降、活性不高、稳定性差、或产量低等瓶颈问题。
因此，本领域有必要进一步研究和开发抗VEGF的抗体药物，特别是开发出全人源的单克隆抗体药物，以期将药物对人体的毒性降到最低，开发出免疫原性低且亲和力高、特异性强的单克隆抗体药物，为肿瘤的治疗提供新的途径。


发明内容
本发明的目的在于提供一种人源的人血管内皮生长因子单克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供一种用于制备所述人源的人血管内皮生长因子单克隆抗体的方法。
在本发明的第一方面，提供一种人血管内皮生长因子单克隆抗体，所述的抗体为IgM型抗体，并且其与人血管内皮生长因子的亲和力为1×10-9M-1×10-8M。更优选的，其与人血管内皮生长因子的亲和力为1×10-9M-5×10-9M。
在本发明的另一优选例中，所述的抗体由小鼠杂交瘤细胞系V2 CCTCC NOC200623，V50，V71，或V75产生。
在本发明的另一优选例中，所述的抗体特异地累积于胃、肝、或脾。
在本发明的另一优选例中，所述的抗体是全人源的单克隆抗体。
在本发明的第二方面，提供一种产生所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是小鼠杂交瘤细胞系V2 CCTCC NOC200623，V50，V71，或V75。
在本发明的第三方面，提供一种制备所述单克隆抗体的方法，所述的方法包括步骤 (1)培养杂交瘤细胞系V2 CCTCC NOC200623，V50，V71，或V75，使之分泌单克隆抗体；(2)分离(1)中获得的单克隆抗体。
在本发明的第四方面，提供一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有所述的单克隆抗体和选自下组的偶联部分药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在本发明的第五方面，提供一种药物组合物，它含有有效量(如0.00001-50wt％；更优选的0.0001-20wt％)的所述的单克隆抗体或权利要求7所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。
在本发明的第六方面，提供所述单克隆抗体的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
在本发明的另一优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
优选的，所述的肿瘤为胃癌、肝癌；更优选的，所述的肿瘤为胃癌。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。



图1显示了从肿瘤组织中提取的总RNA的琼脂糖电泳分析。其中，泳道1为DNA梯度标记(DNA ladder(1kb))，泳道2为总RNA。
图2显示了RT-PCR的结果。其中，泳道1为100bp DNA ladder；泳道2-6为样品的电泳情况；泳道7为对照。
图3显示了pPIC9K-VEGF165的限制性酶分析。其中，泳道1-4为样品1，3，8，18(PCR阳性克隆)的BglII+NotI限制性酶BglII+NotI；泳道5为1Kb DNA ladder；泳道6为pPIC9K质粒。
图4显示了转化克隆的PCR结果，其中A中泳道1为标记(Marker)、泳道2-15为样品1-14、泳道16为阳性质粒对照；B中泳道1为标记(Marker)、泳道2-17样品15-30。
图5显示了酶切鉴定阳性克隆。泳道1-4为样品1，3，8，18的电泳情况；泳道5为1Kb DNA ladder；泳道6为质粒PIC9K。
图6A显示了转化克隆表达的SDS-PAGE电泳的结果；其中，泳道1为BMMY培养基，泳道2为样品2(诱导6天)，泳道3为样品2(诱导1天)，泳道4为样品4(诱导6天)，泳道5为样品4(诱导1天)，泳道6为GS115(诱导6天)，泳道7为母质粒(parentvector)(诱导1天)，泳道8为空白对照，泳道9为低分子量蛋白标记。图6B显示了转化克隆表达的Western印迹结果；其中，泳道1为BMMY培养基，泳道2为样品2(诱导6天)，泳道3为样品2(诱导1天)，泳道4为样品4(诱导6天)，泳道5为样品4(诱导1天)，泳道6为GS115(诱导6天)，泳道7为母质粒(parent vector)(诱导1天)，泳道8为空白对照，泳道9为低分子量蛋白标记。
图7A显示了有利于表达的甲醇浓度的选择。图7B显示了有利于表达的甲醇浓度的选择，通过SDS-PAGE电泳来确定蛋白的表达，其中，泳道1为GS115，泳道2为母质粒(parent vector)，泳道3为0.25％甲醇，泳道4为0.5％甲醇，泳道5为0.75％甲醇，泳道6为1.0％甲醇，泳道7为1.50％甲醇，泳道8为2.0％甲醇，泳道9为标记。图7C显示了诱导表达的持续时间的选择。图7D显示了诱导表达的持续时间的选择，通过SDS-PAGE电泳来确定蛋白的表达，其中泳道1为未诱导，泳道2为诱导1天，泳道3为诱导2天，泳道4为诱导3天，泳道5为诱导4天，泳道6为诱导5天，泳道7为诱导6天，泳道8为诱导7天，泳道9为第分子量蛋白标记。
图8A显示了对纯化样品进行亲和层析的结果，可见一个洗脱峰。图8B显示了亲和层析的洗脱峰样品的SDS-PAGE结果，其中，泳道1为低分子量的蛋白标记，泳道2和3为洗脱峰的样品。
图9A显示了生理盐水组对鸡胚囊膜血管生成没有影响；图9B显示了VEGF组(2μg/L)对鸡胚囊膜血管生成的促进作用。
图10显示了VEGF对于HMVECnd细胞的增殖作用。
图11显示了在rhVEGF和人VEGF之间的免疫原性的比较。
图12A显示了Sephacryl S200HP柱层析的人抗VEGF单克隆抗体的洗脱曲线。图12B显示了亲和柱层析的全人抗VEGF单克隆IgM抗体的洗脱曲线。图12C显示了由IgM亲和柱层析纯化的样品的还原SDS-PAGE，其中，泳道1为在IgM亲和柱层析前的样品，泳道2为在IgM亲和柱层析前的样品，泳道3为由IgM亲和柱层析纯化的样品，泳道4为低分子量蛋白标记。图12D显示了由IgM亲和柱层析纯化的样品的非还原SDS-PAGE，其中，泳道1为低分子量蛋白标记，泳道2为由IgM亲和柱层析纯化的样品，泳道3为在IgM亲和柱层析前的样品，泳道4为由IgM亲和柱层析纯化的样品。图12E为不同的人源VEGF单克隆抗体的Western印迹分析，其中，泳道1为样品V50，泳道2为空白对照，泳道3为样品V71，泳道4为样品V2，泳道5为空白对照，泳道6为样品V75。
图13A和图13B显示了杂交瘤的染色体分析。
图14A显示了采用ELISA方法测定不同的人抗VEGF单克隆抗体的亲和力。图14B显示了用CurveExpert 1.3程序进行曲线回归分析。
图15A显示了通过竞争性ELISA测定V2的亲和参数。图15B显示了通过竞争性ELISA测定V50的亲和参数。图15C显示了通过竞争性ELISA测定V71的亲和参数。图15D显示了通过竞争性ELISA测定V75的亲和参数。
图16显示了4株单抗的加成实验图。
图17显示了人源VEGF单克隆抗体对于HMVEC增殖的影响。
图18显示了人源VEGF单克隆抗体对于HMVEC增殖的影响。
图19显示了人源VEGF单克隆抗体对于鸡胚囊膜(CAM)血管生成的影响。
图20显示了T24细胞增殖曲线。
图21显示了人源VEGF单克隆抗体对于T24细胞增殖的抑制。
图22A-图22E表示在连续5天的测定中，血清中放射性的理论值与实测值之间的关系，图22F-图22J表示在连续5天的测定中，血清中的放射性与TCA可沉淀部分放射性之间的关系。
图23A显示了rhVEGF-Ab单次静脉高剂量给药后大鼠血清中rhVEGF-Ab的血药浓度-时间曲线。图23B显示了rhVEGF-Ab单次静脉中剂量给药后大鼠血清中rhVEGF-Ab的血药浓度-时间曲线。图23C显示了rhVEGF-Ab单次静脉低剂量给药后大鼠血清中rhVEGF-Ab的血药浓度-时间曲线。图23D显示了rhVEGF-Ab单次给药后大鼠各剂量的药时曲线。
图24显示了大鼠静脉给予不同剂量rhVEGF-Ab后剂量-曲线下面积(AUC)关系。
图25显示了静脉给药后rhVEGF-Ab在小鼠组织中的分布。
图26显示了rhVEGF-Ab在大鼠胆汁中的排泄累积百分率。
图27A显示了rhVEGF-Ab在大鼠尿液中的排泄累积百分率。图27B显示了rhVEGF-Ab在大鼠粪中的排泄累积百分率。

具体实施例方式 本发明人经过长期的研究和试验，开发了一种全人源的抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体，所述的抗体为IgM型抗体。所述的抗体能够高特异性地结合VEGF抗原，其具有很高的亲和力(在1×10-9M-1×10-8M之间，更优选的，在1×10-9M-5×10-9M)和很低的免疫原性。并且，所述的抗体具有显著的抗肿瘤活性，而对于哺乳动物本身没有可见的毒副作用。基于此完成了本发明。
如本文所用，“人源抗VEGF单克隆抗体”、“人源抗VEGF单抗”、“人源抗人VEGF单克隆抗体”、“rhVEGF-Ab”可互换使用，均是指全人源的、能够高特异性结合人VEGF抗原的单克隆抗体。
如本文所用，术语“全人源”是指所述的单克隆抗体是100％人来源的。目前获得全人源的抗体的途径包括但不限于获自噬菌体显示技术制备人源性抗体、转基因动物制备人源性抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
本发明还包括具有所述的人源抗VEGF单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的人源抗VEGF单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的人源抗VEGF单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的人源抗VEGF单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。
本发明还提供了编码所述的人源抗VEGF单克隆抗体或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的人源抗VEGF单克隆抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
本发明还提供了可生产本发明人源抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞系；优选的，本发明提供了高效价的人源抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明人利用五特征IgM转基因小鼠，所述的小鼠具有以下五种特征①整合部分人源Ig重链基因；②整合人源κ链基因；③整合人源λ链基因；④鼠源Ig重链基因被敲除；⑤鼠源κ链基因被敲除，以杂交瘤技术研制抗VEGF全人源IgM型单克隆抗体，成功获取多株有抗癌活性的人源VEGF165单克隆抗体(rhVEGF-Ab)。
在获得生产本发明的人源抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤，本领域人员可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。
首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。
本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。
编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一阅读框内。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如pPIC9K。
随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中，优选哺乳动物细胞。通常用哺乳动物细胞系来作为表达真核细胞衍生多肽的宿主细胞。哺乳动物细胞在培养物中的繁殖是本领域熟知的。见《组织培养》，Academic Press，Kruse andPatterson编辑(1973)，该文纳入本文作为参考。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这些无限增殖细胞系包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如HepG2)和其它许多细胞系。它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰，包括正确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。尽管在下文实施例中，本发明仅列举了以CHO细胞作为宿主细胞的例子，但是本领域技术人员在阅读了本发明的详细描述和具体实施例可以知道，本发明也能采用上述这些细胞系。
用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染诸如CHO细胞等宿主细胞。
然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的人源抗VEGF单克隆抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的人源抗VEGF单克隆抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
此外，本发明还提供了一种检测VEGF的试剂盒，它含有所述的人源抗VEGF单克隆抗体或其活性片段。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，该组合物含有药学上有效量的本发明单抗以及药学上可接受的载体。例如，本发明的药物组合物可用来治疗胃癌、直肠癌。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的突变蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用灌注和其它治疗方式。
使用药物组合物时，是将安全有效量的人源抗VEGF单克隆抗体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常约0.1-10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1-10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围内的。
在本发明的实施例中，对该单抗进行了抗肿瘤活性研究及初步的药代学研究，发现该单抗对直肠癌细胞株LS-174-T和膀胱癌细胞株T-24具有显著的体外抑制活性。在用125I-VEGFAb研究VEGF-Ab在小鼠中的组织分布时发现，在单次静脉给药后，rhVEGF-Ab在胃中有高的累积，给药后1h，其在胃中的相对累积系数超过肝脏，而且这种现象一直持续到给药后8h。此现象表明该单抗在给药后能够迅速在胃部浓集，提示其在胃部肿瘤的靶向治疗中具有潜在的作用。
在本发明的优选实施例中，主要的操作流程如下(1)由肿瘤组织中提取总RNA，RT-PCR获取VEGF cDNA片段；(2)构建含有VEGF cDNA的酵母表达质粒；(3)将表达质粒转染到酵母中，获得含表达载体基因的酵母细胞；(4)进行大量的含表达载体基因的酵母的培养与扩增，分离并纯化，获得VEGF蛋白，并测定其生物活性；(5)利用分泌人IgM抗体的五特征小鼠通过常规杂交瘤技术制备抗人VEGF165的高亲和力、高特异性单克隆抗体；(6)进行相关单抗的抗肿瘤药效学研究，主要包括①鸡胚尿囊膜实验(CAM)研究抗体抗血管生成的体内作用；②对接种人肿瘤细胞裸鼠体内肿瘤生长的抑制作用；③对接种人肿瘤细胞裸鼠体内肿瘤转移的抑制作用；④药代学研究观察单抗在动物体内的分布及代谢情况。
本发明的抗体可抑制肿瘤部位的血管生长，由于大多数肿瘤的生长都与血管生成有密切的关系，因此本发明的抗体可用于治疗很多种类的肿瘤，所述的肿瘤比如(包括但不限于)胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤等。优选的，所述的肿瘤为胃癌、肝癌；更优选的，所述的肿瘤为胃癌。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1人血管内皮生长因子(VEGF165)的制备 一.人血管内皮生长因子(VEGF165)cDNA的克隆及鉴定 1.人肿瘤总RNA的提取 取荷瘤裸鼠一只，处死，无菌剥离肿瘤组织。冰浴中匀浆后，按100mg组织加入1ml TriZol。冰上放置约5min，待组织完全裂解。加入等体积酚∶氯仿(1∶1)，涡旋混匀1min。冰上放置5min，12000rpm，4℃离心10min。小心吸取上清，加入等体积氯仿，混匀，冰上稍稍放置，12000rpm，4℃离心5min。吸取上清，加入两倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置30min。2000rpm，4℃，离心10min。倒干上清，70％酒精洗涤，晾至无酒精味后，加入适量不含RNase的水溶解，分装，以琼脂糖电泳检验提取RNA的质量，余者迅速置-80℃冻存。
结果检测肿瘤组织用经典Trizol法提取总RNA，琼脂糖电泳出现2条带，分别为28s RNA和18s RNA。结果见图1。
2.人血管内皮生长因子(VEGF165)cDNA的克隆(RT-PCR) (1)VEGF165cDNA的扩增 以1.中获得的总RNA为模板，按Promega公司的Reverse Transcription System说明书进行VEGF cDNA第一链的反转录，用不含核酸酶的灭菌水补足至20μl，置室温10分钟(min)，42℃温育50分钟后将样品置95℃变性5分钟，0-5℃放置5分钟即为cDNA第一链样品，获得的产物置-20℃保存，备用。以上游引物(VP5)5’-TAGAAT TCG CAC CCA TGG CAG AAG GAG G-3’(SEQ ID NO1)和下游引物(VP3)5’-TAGCGG CCG CTT ACC GCC TCG GCT TGT C-3’(SEQ ID NO2)，按94℃5min，94℃1min，68℃45s，72℃1min，35个循环扩增VEGF165cDNA。所用酶为pfu polymerase(Promega)。产物用1.0％的琼脂糖电泳检查，EB染色，在长波长紫外灯下迅速切下目的条带。电泳结果见图2。
(2)PCR产物的回收及纯化 在紫外灯下切下目的条带，将切下的琼脂糖条带按100mg加400μl结合缓冲液(Binding buffer)，50℃水浴10min，待胶完全溶解后转移至QIANGENE离心柱，8000r/min 1min，弃废液后加洗涤液(Wash solution)450μl，8000r/min 1min，弃废液，重复1次，12000r/min开盖离心1min，取出离心柱置另一干净离心管中，在柱中央加20μl ddH2O，12000r/min离心2min，-20℃保存。
(3)结果 mRNA经逆转录得到cDNA第一链，以上、下游引物进行PCR扩增，得到大小为495bp左右的目的片段，结果见图2。
3.重组载体pPIC9K-(VEGF165)cDNA的构建与鉴定 (1)目的基因与载体的连接将目的基因片段分别用EcoRI和NotI酶切后定向克隆入pPIC9K质粒(购自Invitrogen)载体，将重组质粒电转入DH5α菌，后挑取30个转化菌落，提取质粒，-20℃保存备用。
(2)PCR鉴定和酶切鉴定以各质粒为模板，按VEGF165cDNA的扩增条件进行PCR扩增，1.0％琼脂糖电泳观察结果，在500bp位置出现扩增条带的质粒为阳性。用Not I和Bgl II双酶切PCR阳性质粒，1.2％琼脂糖电泳观察结果。
(3)序列测定选3株阳性菌测序，采用ABI PRISM 377DNA Sequencer。
(4)结果 a.目的片段与载体的连接及鉴定 挑取的30个转化克隆，经PCR鉴定，有500bp的阳性扩增条带。经BglII和NotI双酶切，出现6.9Kb，2.4Kb，1.7Kb三条带，而未整合有外源基因的质粒有6.9Kb，2.4Kb，1.2Kb三条带，见图3。
b.测序结果显示，3号菌质粒测得的序列与目的基因序列完全吻合，序列如下 CGTAGAATTCGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATC CAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGG GGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCA GCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTT GCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAG CTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGT(SEQ ID NO3) 二.人血管内皮生长因子(VEGF165)在Pichia pastoris酵母中的表达与纯化 1.重组人血管内皮生长因子(VEGF165)在Pichia pastoris酵母中的表达 (1)重组质粒的线性化及线性产物的回收重组质粒以Sal I酶切线性化，1.2％琼脂糖电泳，用DNA胶回收试剂盒回收9.7Kb的片段，-20℃保存。
(2)携带有线性化重组质粒的阳性酵母克隆的获得 用传统方法制备酵母菌GS115(购自美国Invitrogen公司)感受态细胞，把SalI线性化的重组质粒10μg加入制备好的100μl酵母细胞中，混匀，转入0.2cm的电打孔杯内，置于冰上10min。放入用Bio-Rad的电打孔仪，电击条件如下1500V，200Ω，25μF电打孔仪。电击后迅速放回冰上并加入1ml预冷的山梨醇，混匀，吸取200μl涂布于MD平板上，30℃培养2天，挑选阳性克隆。
将MD平板上长出的单个菌落用灭菌牙签依次接种在浓度递增的G418-YPD平板上(G418浓度为0.25，0.5，2.0，4.0mg/ml)，30℃培养2天，挑选耐G4184.0mg/ml的多拷贝的阳性克隆。
取抗性克隆培养液10μl，加入细胞溶解酶(Lyticase)(5U/μl)5μl置30℃10min，再于-80℃放置10分钟。G418抗性克隆的PCR鉴定，结果见图4。
(3)阳性克隆的诱导表达 随机挑选几个生长在4.0mg/ml G418-YPD平板上的阳性克隆，接种于5ml YPD培养液中，28-30℃振荡培养过夜，次日吸取100μl过夜培养物接种于10ml BMGY培养液中，28-30℃继续振荡培养过夜。第3天于室温下3,500g离心10min，弃上清，细胞沉淀重悬于25ml BMMY培养液中，加入甲醇至终浓度为0.5％，28-30℃振荡培养，诱导表达。连续7天在固定时间补加甲醇，第7天于室温下3,500g离心10min。收获上清，取10μl经SDS-PAGE电泳和Western印迹法鉴定。其余保存于-20℃待检测。
(4)表达条件的优化 a.甲醇诱导浓度的选择取6只50ml灭菌离心管，按上述方法接种等量的4号克隆菌液，每天按以下浓度补加甲醇0.25％，0.5％，0.75％，1.0％，1.5％，2.0％，于培养第6天收集培养液，采用SDS-PAGE及ELISA法分别测定目的蛋白含量。
b.诱导时间的选择取一500ml的摇瓶，接种4号克隆菌液，每日按1％补加甲醇溶液，分别于诱导前及诱导后1，2，3，4，5，6，7天取1ml培养液留样，集中处理，采用SDS-PAGE及ELISA法分别测定目的蛋白含量。
结果 (1)载体构建及重组质粒的筛选由图4可见样品1，3，5，6，7，8，9，11，12，13，14，15，16，18，22，23，24，26，30均有500bp的强阳性条带。挑选1，3，8号样品做酶切鉴定，采用BglII和NotI双酶切，重组质粒应有6.9Kb，2.4Kb，1.7Kb三条带，而未整合有外源基因的质粒有6.9Kb，2.4Kb，1.2Kb三条带，结果见图5。由图可见，样品1，3，8均有三条阳性条带，选取1，3号菌测序。
(2)VEGF165cDNA测序结果测序结果显示，3号菌质粒测得的序列与目的基因序列完全吻合，序列如SEQ ID NO3。选取3号菌，接种20μl菌液于200ml LB(Amp+)中，37℃培养过夜，抽提质粒。SalI酶切线性化，准备转化酵母。
(3)转化克隆的PCR检测经PCR检测发现，转化克隆均有500bp的阳性条带。
(4)转化克隆的表达由图6A、图6B结果可见，2、4号转化菌均有目的产物表达，而GS115宿主细胞及转入空载体的转化菌无目的蛋白表达，表明转化菌构建成功。
(5)表达条件的筛选由图7A和图7B可见，甲醇浓度为1.0％时的表达量最高。由图7C可见，诱导后第5天，目的蛋白的产量与第6，7天相近，因此诱导表达持续5-6天即可。由图7D可见，诱导后第5天，目的蛋白的产量与第6，7天相近，因此诱导表达持续5-6天即可，再长已无必要。
2.重组人血管内皮生长因子(VEGF165)的纯化 (1)重组蛋白的分离、纯化酵母培养液4000r/min离心15min，分离菌体，培养上清在20mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)中透析平衡过夜后，8000r/min离心20min，吸取上清，上样于Heparin-Sepharose CL6B亲和柱，进行0-1mol/L线性梯度洗脱，收集各洗脱峰的洗脱液做SDS-PAGE分析。结果见图8A、8B。
(2)重组蛋白的氨基酸测序 将亲和柱层析纯化样品进行SDS-PAGE，转PVDF膜后，测定N端15个氨基酸的序列。结果显示有两条肽链，一条是带有4个载体氨基酸(WVEF)的VEGF165全序列，另一条是缺省了N端3个氨基酸(APM)的VEGF165序列。VEGF的氨基酸序列(165aa) APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIG EMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR(SEQ ID NO4) 第一条肽链的N端15个氨基酸序列AEGGGQNHHEVVKFM(SEQ ID NO5) 第二条肽链的N端15个氨基酸序列WVEFAPMAEGGGQNH(SEQ ID NO6) 3.重组人血管内皮生长因子(VEGF165)的活性测定 (1)VEGF体外生物活性的测定一鸡胚尿囊膜实验(CAM实验) 按文献(Midgley R等，Bevacizumab2current status and future direc2tions.Ann Oncol，2005，16(7)99921004.或McMahon G.VEGF receptor signaling in tumorangiogenesis.Oncologist，2000，5(supp l 1)3210.)方法，将孵化6-7日的鸡胚放入37℃孵箱，气室向上，鸡蛋长轴与蛋托呈80度角。每天翻蛋两次。温箱底部放一装水平皿以保证孵箱内湿度。取接种孵化8-9天的鸡胚，在照蛋器下标记胎位，于血管不丰富处碘酒消毒，用小锯片将蛋壳锯一三角形，不要破坏壳膜。用尖锥在气室将蛋壳和壳膜锥一小孔。用针尖挑去三角形蛋壳，在壳膜上加1滴无菌生理盐水，用胶皮吸头从气室小孔吸气，盐水被吸下，壳膜和尿囊膜之间形成人工气室。挑破壳膜，将重组人血管内皮生长因子(VEGF)直接加载于尿囊膜上或将VEGF加于灭菌滤纸上，再将滤纸贴在尿囊膜上。用无菌胶带封口。接种第3天在开口处滴加等量甲醇和丙酮的混合液，室温固定15min，待血液凝固后剪下尿囊膜，放入水中展平。将尿囊膜铺在滤纸上，以滤纸为背景再用照相机拍照。
结果评价(a)不影响血管新生(-)，即薄片覆盖区域血管生成正常；(b)影响不明显(±)，无血管区只出现在薄片覆盖部位，也即无血管区直径不超过2mm；(c)明显抑制血管新生(+)，无血管区域超过薄片覆盖范围，直径达4mm或更多。
结果见图9A、9B以生理盐水作对照，观察重组人血管内皮生长因子(VEGF)对鸡胚尿囊膜血管生成的促进作用。结果表明，试验组重组人血管内皮生长因子2μg/L即对尿囊膜血管生长有明显的促进作用。
(2)HMVECnd细胞增殖实验复苏HMVECnd细胞(购自Cascade Biologics，Inc.)，按1×104个/孔接种至96孔培养板中，采用倍比稀释法加入不同浓度的VEGF溶液，置37℃、5％CO2培养箱培养48h，每孔加入MTT(5mg/ml)溶液20μl，5h后加入裂解液100μl，过夜，测OD570nm。以PBS溶液为阴性对照，以Sigma公司VEGF(CHO细胞表达产品)为阳性对照。结果见图10，本发明获得的VEGF与阳性VEGF活性接近。
(3)与人源VEGF165免疫原性的比较 利用检测人VEGF的ELISA检测试剂盒(购自CHEMICON公司)检测本发明获得的rhVEGF，并与Sigma公司的VEGF进行对照，比较两者的抗原性。结果见图11，可见rhVEGF与Sigma公司的VEGF有相似的抗原表位，两者的免疫原性相似。
实施例2人源抗VEGF单抗的制备、纯化及特性研究 一.人源抗VEGF单抗的制备 1.动物免疫采用皮下和腹腔两种免疫途径免疫五特征小鼠(购自英国Babraham研究所)，具体方法如下 (1)取适量实施例1制备的纯化VEGF样品，以PBS稀释至所需浓度，按1∶1与免疫佐剂混合，充分乳化备用。初次免疫采用福氏完全佐剂(CFA)，加强免疫采用福氏不完全佐剂(IFA)。
(2)皮下免疫方法于一测脚掌皮下注射0.01ml，剩余部分注射于颈部两测皮下。
(3)腹腔注射方法按所需剂量腹腔注射。
(4)剂量及间隔时间按计量大小分别设置10、30、50、70、100μg/kg等剂量组，每组3-5只动物，初次免疫后，每隔2-3周加强免疫一次，于第三次加强免疫后第7天眼眶取血测效价。如效价符合要求，于20天后尾静脉注射VEGF样品溶液，3-5天内取脾脏进行细胞融合。
2.细胞融合及阳性克隆的筛选 (1)冲击免疫末次免疫后20天，由尾静脉注射抗原溶液20-50μg/只，3-5天内进行细胞融合。
(2)取免疫小鼠，摘眼球取血，留作阳性对照。处死小鼠，置70％乙醇溶液中整体消毒5分钟，用灭菌手术器械分离脾脏，置灭菌筛网中，加入无血清培养液制成细胞悬液，细胞计数，用无血清培养液1000rpm/min离心洗涤2次，在手心轻轻敲打试管底部，使细胞团块松散后，加入骨髓瘤细胞并轻轻混匀，置37℃水浴中，在1min内慢慢加入1ml PEG1500，边加边缓慢搅拌，继续在水浴1.5min。加入37℃无血清培养液30-40ml，轻轻转动试管，使混合均匀，800rpm/min离心5min，弃上清，用适量HAT培养液充分稀释，按200μl/孔铺96孔培养板，置37℃5％CO2培养箱培养。
(3)10-14天后，观察细胞生长情况，ELISA法检测克隆培养上清，阳性孔换成HT培养液，继续培养至一定大小后，用完全培养基(DMEM-F12)稀释，进行第一次克隆，每个阳性克隆铺一块板，采用2个细胞浓度梯度，约取600个细胞/块培养板。
(4)10天后，观察克隆生长情况，ELISA法检测克隆培养上清，阳性孔换液，第二天复检，挑取1-2个阳性克隆进行第2次克隆，采用2个细胞浓度梯度，约取150个细胞/块培养板。
(5)如此连续克隆，直至每块培养板单克隆检测都为阳性，即达100％阳性时，表明细胞已成系，在体外连续培养3-6个月，考察稳定性。细胞置液氮罐冻存保种。
3.腹水的制备取＞8周龄的五特征鼠与Bab/C鼠杂交F1代鼠，腹腔注射降脂烷0.5ml/只，7天后，腹腔接种杂交瘤细胞0.5-1.0×106/只，10-14天观察、采集腹水，3500rpm/min离心10min，取中间水层，置-20℃冻存备用。
4.腹水效价的测定采用ELISA间接法测定。VEGF(2μg/ml)4℃包被过夜，2％BSA(用pH7.2的磷酸缓冲液溶解)37℃封闭1h后，加入不同浓度梯度的腹水溶液(将腹水以1％BSA溶液倍比稀释成16个浓度梯度)，37℃反应1h后，加入辣根过氧化物酶标记的抗-人μ链单抗，37℃反应1h后显色。
结果 1.细胞融合、阳性克隆的筛选结果两次融合共得到77个阳性克隆(分泌能与VEGF结合的人源μ链抗体)，经4-5次亚克隆筛选后，得到9株稳定分泌人源VEGF IgM抗体的杂交瘤细胞株，分别编号为V2(即CCTCC NOC200623)，V8，V12，V44，V50，V60，V71，V72，V75，一部分置液氮罐冻存保种，另取一部分在体外传代培养3-6个月，考察稳定性。经体外连续培养3个月后发现，V2，V50，V71，V75已成系，并稳定地分泌人源抗体，成系细胞置液氮罐冻存保种。
2.腹水效价的测定结果 经ELISA间接法测定，腹水的效价为4.1×103-3.3×104，结果见表1。
表1 二.人源抗VEGF单抗的纯化 1.凝胶层析硫酸铵沉淀取腹水，9000rpm/min离心15min，取上清，边搅拌边缓慢滴加等体积100％饱和(NH4)2SO4，使终浓度达50％，继续搅拌20min，置4℃过夜沉淀。第二天8000rpm/min离心30min，弃上清。用等体积磷酸缓冲液(PH 7.2)溶解，过0.45μm滤器后上Sephacryl S200凝胶柱，上样量为4ml/次，洗脱液为PH 7.2磷酸缓冲液，流速2ml/min。Sephacryl S200HP洗脱峰见图12A，收集I号峰样品。用MW100kD的超滤膜超滤浓缩，测定蛋白含量后分装置-20℃保存。
2.优球蛋白沉淀法取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达到0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白产生；经4000rpm/min离心20分钟后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃8-15小时(若是IgG3单抗，也可室温2小时)，其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于pH8.01mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml，分装冻存备用。
结果显示，优球蛋白沉淀法的蛋白回收率较低，未用此法大规模纯化单抗样品。
3.亲和柱层析用至少5个柱体积的结合缓冲液(20mM磷酸钠，0.8M(NH4)2SO4，pH 7.5)平衡柱子；上样1ml/次；用至少15倍柱体积结合缓冲液冲洗未结合上柱的样品，至A280nm回到基线；用洗脱液(20mM sodium phosphate)洗脱收集IgM样品；用再生缓冲液(20mM磷酸钠及30％异丙醇，pH 7.5)洗柱；重新用结合缓冲液平衡柱子，准备第二次上样。亲和柱洗脱峰见图12B。
4.单抗的纯度鉴定采用SDS-PAGE法，配制7.5％浓度的胶，选用次高分子量蛋白Marker，电泳后经考马斯亮蓝染色后，观察目的条带及其所占比例。用还原SDS-PAGE法测得亲和层析后样品纯度可＞85％。结果见图12C。
5.SDS-PAGE和Western印迹配制7.5％浓度的胶，选用次高分子量蛋白Marker，将人源单抗样品进行非还原SDS-PAGE，蛋白条带采用SEMI-DRY TRANSFER CELL系统(Bio-Rad，Cambridge，MA)电转至Immobilon-P膜上后，用10％脱脂奶粉封闭1小时，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人μ链抗体(Sigma)37℃温育1hr，洗膜后加DAB底物溶液显色。
非还原SDS-PAGE法的检测结果见图12D。人源单抗的Western印迹结果见图12E。
三.人源抗VEGF单抗特性测定 1.单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定(ELISA法) 取各成系杂交瘤细胞株培养上清，ELISA法测定各细胞株分泌抗体的重链、轻链类型，检测各抗体是否为全人源IgM抗体。
分两步①检测杂交瘤细胞培养上清是否为鼠源 VEGF 2μg/ml包板，置4℃过夜；2％BSA-PBS 37℃封闭1小时，洗涤；分V75、V50、V71-2、V60、V2和PBS阴性对照共6组，每个测定孔设3个复孔。分别加入各杂交瘤细胞培养上清100μl和PBS 100μl，37℃孵育1小时，洗涤；加入酶标羊抗鼠二抗(购自Santa Cruz)溶液100μl(辣根过氧化物酶标记)，37℃孵育1小时，洗涤；(5)加入酶底物反应溶液100μl，37℃孵育15min，酶标仪测定490nm处吸收值。
②检测是否为人源IgM VEGF 2μg/ml包板，置4℃过夜；2％BSA-PBS 37℃封闭1小时，洗涤；分V75、V50、V71-2、V60、V2和PBS阴性对照共6组，每个测定孔设4个复孔。分别加入各杂交瘤细胞培养上清100μl和PBS 100μl，37℃孵育1小时，洗涤；分别加入鼠抗人κ链、λ链单抗(各加2孔)100μl，37℃孵育1小时，洗涤；加入酶标羊抗鼠IgG二抗溶液100μl(辣根过氧化物酶标记)，37℃孵育1小时，洗涤；加入酶底物反应溶液100μl，37℃孵育15min，酶标仪测定490nm处的吸收值。
结果判断如果同一样品两个实验都为阳性，则其轻链为鼠源的；如果第一步结果为阴性，第二步结果为阳性，则说明其轻链为人源的。结果见表2。
表2抗VEGF单抗重链和轻链类型的鉴定 由表2可知，V2、V50、V71、V75、V60的轻链都为λ链，抗体类型为IgM。由于人类B淋巴细胞κ∶λ＝3∶2，分泌抗体的轻链类型两者比例应相当，而正常小鼠κ∶λ＝19∶1，κ轻链占绝对优势，多数鼠源抗体的轻链应为κ链，而本发明人得到的几株杂交瘤细胞株分泌的都是λ轻链，而非常见的κ链，与前述的五特征小鼠特性相符。
2.杂交瘤细胞的染色体分析 加秋水仙素前48-36h将杂交瘤细胞传代；在培养瓶中加入秋水仙素(100μg/ml，除菌，-20℃保存)，使最终浓度为0.02-0.05μg/ml；继续培养4-6h，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min离心10min，弃上清。加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20min；向悬液中加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3∶1混合)1ml，混匀，室温静置15min，然后1000r/min离心10min，弃上清。加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置15-20min，然后1000r/min离心10min，弃上清；重复操作一次，加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。取出离心管，1000r/min离心5min，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的10％Giemsa染液染色10-20min，然后用自来水洗去染液，自然干燥。选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。
杂交瘤细胞的染色体分析结果见图13A和图13B。
3.间接ELISA法测定单抗的相对亲和力 将纯化的各单抗样品倍比稀释后，按前述效价测定方法，采用间接ELISA法测定各单抗样品在490nm处的吸收值，达到最大吸收值一半时的样品浓度的倒数即该样品的相对亲和力。结果见图14A和图14B。
V2、V50、V71和V75的原始浓度为1.67(≈1.86μM)，1.88(≈2.09μM)，3.35(≈3.72μM)和0.87(≈0.97μM)mg/ml[IgM的分子量按90万计算]，经CurveExpert1.3程序拟合后，求得1/2Ymax所对应的稀释度分别为V2＝507.5，V50＝293.2，V71＝799.3，V75＝267.2，因此相对亲和力分别为V2＝3.67×10-9M，V50＝7.13×10-9M，V71＝4.65×10-9M，V75＝3.63×10-9M。
由计算结果可见，V2和V75的相对亲和力最大，V71其次，V50最低。
4.竞争性ELISA测定单抗亲和常数 采用竞争性ELISA测定单抗亲和常数的方法。其步骤如下取2μg/m1VEGF包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜。洗涤后，加入封闭液(0.5％BSA-PBS，PH7.2)100μl/孔，37℃1小时。取一定浓度的单抗，与系列倍比稀释的抗原混合，4℃过夜，使反应达到平衡；必须注意所用抗原浓度至少比抗体浓度高10倍以上。将平衡后的抗原抗体复合物加入酶标板孔中，100μl/孔，37℃1小时。洗涤后，加入适宜稀释度的HRP标记抗人μ链抗体，100μl/孔，37℃1小时。洗涤后加入底物(OPD)溶液100μl/孔，37℃显色15min；2mol/L H2SO4终止反应后，于495nm波长测定各孔的吸收率(A)。按下列公式计算各单抗的亲和常数(K)A0/(A0-A)＝1+k/a0[其中A0＝无抗原时A值；A＝采用不同浓度抗原时的A值；a0＝抗原总量；K＝亲和常数]。结果见表3。
表3由酶联免疫分析测定的亲和常数 分别以A0/A0-A为纵坐标，以抗原量的倒数1/a为横坐标作图，应成线性，该直线的斜率即为亲和常数，见图15A-图15D。
5.单抗的特异性检测 分别用VEGF、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子各0.5μg/ml包板，4℃过夜；加入不同瘤株来源单抗溶液100μl/孔，37℃温孵1小时，洗涤；加入适宜稀释度的辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人μ链抗体(Sigma 1∶10000)，100μl/孔，37℃温孵1小时，洗涤；加入OPD显色液100μl/孔，37℃显色10-15min；2mol/L H2SO4 50μl/孔终止反应后，于490nm波长测定各孔的吸收值(A490nm)。
结果见表4。可见，四种抗VEGF单克隆抗体与VEGF的接合特异性很强。
表4四种抗VEGF单克隆抗体的交叉反应特性的分析 注抗原-抗体反应随-、-/+、+、++、+++而递增。
6.单抗作用表位的初步分析 (1)竞争实验往包被有VEGF抗原的酶标板上先加入一种抗VEGF单克隆抗体，37℃温育2h后再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的另一种抗VEGF单克隆抗体，最终根据显色程度判断两种单抗的决定簇是否相同。结果见表5。
表54个抗VEGF单克隆抗体的抗原决定簇分析 由表5可见，V50和V2作用于VEGF不同的表位，与V71、V75的抗原表位相似。可以推断，V2、V50、V71、V75作用的抗原表位可能各不相同，但V71、V75、V50的作用表位邻近。
(2)单抗的加成实验 以VEGF 2μg/ml包板，2％牛血清白蛋白封闭后，将V2，V50，V71，V75单抗配成一定浓度，单独加样或等体积两两混合后加样，其余步骤同效价测定方法。比较混合后样品与单独加样的OD490nm值。每份样品重复测定一次，结果以平均值表示。
结果见图16。由图可见，V71与V2、V50、V75都有一定程度的协同作用，说明V71与其他三种单抗的作用表位可能都不相同。V2和V50也有明显的协同作用，说明两者的作用表位可能也不同。
实施例3人源抗VEGF单抗的活性研究 一.体外活性研究 1.ELISA法测定人源单抗对VEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用 法一用VEGFR2(购自sigma)包板后，加入1nM VEGF和不同浓度的酶标人源抗体(HRP标记)的混合溶液孵育1小时后，显色，测定490nm处的光吸收值。
法二用VEGFR2包板后，加入1nM VEGF，37℃温育1hr后，分别加入不同浓度的酶标人源抗体(HRP标记)，37℃温育1hr，显色，测定490nm处的光吸收值。
结果见表6。
表6人源单抗对VEGF与其受体VEGFR2结合的阻抗作用 注OD490nm值随“-”、“+”、“++”逐渐增大。
表6可见，V2，V50，V75对VEGF与其受体的结合均有拮抗作用。其作用机制可能为VEGF与其受体VEGFR的结合位点同时也是人源单抗的结合位点，与单抗结合后再难与VEGFR结合；另一方面，若VEGF先与VEGFR结合，则亦难与人源单抗结合。而V71与VEGF的结合位点与VEGF和其受体VEGFR的结合位点不重合，因此在上述两种情况下均能显色。
2.对HMVEC细胞增殖的影响 (1)细胞生长曲线测定选用生长良好的人微血管内皮细胞(HMVEC，购自ATCC)悬液，调整细胞浓度2.5×104个/ml，接种于96孔培养板，生长培养液为M131培养液(Cascade公司产品)，37℃5％CO2培养，分别于培养1-6天的细胞孔中加入四唑盐(MTT)溶液(5mg/ml)10μl，37℃，继续孵育4h，终止培养，弃去培养液，加入DMSO 100μl/孔，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，酶标仪上测各孔光吸收值(OD)，结果以OD490nm值表示细胞增殖水平，每组3复孔。试验重复2次。结果见表7。
表7HMVEC增殖的结果(X±SD)(n＝3) (2)MTT法测定抗体对微血管内皮细胞增殖作用的影响 选用生长良好的HMVEC细胞悬液，调整细胞浓度2.5×104个/ml，接种于96孔培养板，生长培养液为M131培养液(Cascade公司产品)，37℃5％CO2培养至融合状态，分为正常对照组、受体KDR组、V2、V50、V71、V75、5-氟尿嘧啶(5-Fu)组等7组，按不同分组给药。药物分别作用4天后，测定每孔OD490nm值，结果以OD490nm值表示细胞增殖水平，每组3复孔。试验重复2次。结果见表8和图17。
表8人源VEGF单克隆抗体对于HMVEC增殖的影响(X±SD)(n＝3) *P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01(与PBS组相比) 人源单抗对HMVEC的中和活性见表9。
表9人源单抗对HMVEC的中和活性 (-)无作用；(±)影响不明显；(+)较明显的抑制作用；(++)作用很明显 人源VEGF单克隆抗体对于HMVEC增殖的影响还体现在图18中。由图可知，5-氟尿嘧啶能显著抑制HMVEC细胞的增殖，VEGF人源单抗V2，V50，V71，V75对细胞增殖有一定的抑制作用，镜下视野中可见死细胞，作用较5-氟尿嘧啶稍弱。
3.对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的影响 鸡胚培养和处理方法同前，挑破壳膜后，将待试样品直接加于尿囊膜上或将VEGF通过滤纸贴在尿囊膜上。用无菌胶带封口。接种第3天在开口处滴加等量甲醇和丙酮的混合液，室温固定15min，待血液凝固后剪下尿囊膜，放入水中展平。将尿囊膜铺在载玻片上，晾干。以滤纸为背景，数码相机拍照。
结果评价分为(1)不影响血管新生(-)，即薄片覆盖区域血管生成正常；(2)影响不明显(±)，无血管区只出现在薄片覆盖部位，即无血管区直径不超过2mm；(3)明显抑制血管新生(+)，无血管区域超过薄片覆盖范围，直径达4mm或更多。结果见表10和图19。可见各株单抗样品对鸡胚尿囊膜血管生成有一定作用。
表10各单抗对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的影响 其中，(-)无作用；(±)影响不明显；(+)较明显的抑制作用。
4.MTT法测定各单抗对人膀胱癌细胞T24增殖的影响 (1)细胞生长曲线测定(MTT法)取生长良好的T24细胞(购自ATCC)悬液，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于48孔培养板，分别于培养1-6天的细胞孔中，每孔加入四唑盐(MTT)溶液(5mg/ml)10μl，37℃继续孵育4h，弃培养液，加入DMSO 100μl/孔，使细胞充分裂解溶解。在酶标仪上测定各孔490nm光吸收值(OD)，结果以OD490nm值表示细胞的正常生长、增殖水平，每组设3复孔。T24细胞增殖曲线见图20，由图可知，接种密度1即2.5×104/ml较合适，能持续稳定增长，密度2、3偏大。
(2)MTT法检测细胞增殖 a.MTT法检测各单抗对T24细胞增殖的影响 取生长良好的T24细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于48孔培养板，待细胞培养至融合状态，按不同分组给药。药物分别作用1、2、3天后，测定OD490nm值，结果以OD490nm值表示细胞在药物作用下的增殖水平，每组设3复孔。镜下观察药物对细胞的影响。
按2.5×104/ml的密度接种100μl/孔，第二天待细胞贴壁后加入不同的待试品各20μl(即200μg/ml)，待试品分别作用1、2、3天的结果如表11。
表11人源VEGF单克隆抗体对于T24细胞增殖的影响(X±SD)n＝3 由表11可知，作用第1天各组无明显差异，作用2、3天后，V2、V75，200μg/ml明显抑制T24细胞增殖(p＜0.01)，同时，V71、V50对T24细胞增殖也有抑制作用。
几种人源VEGF单克隆抗体对于T24细胞增殖的影响还见图21，这几种抗体均呈现对T24细胞增殖的抑制作用。
b.MTT法测定各单抗对直肠癌细胞LS-174-T细胞增殖的影响 检测方法同上，用LS-174-T细胞(购自ATCC)取代T24细胞，结果见表12。
表12人源VEGF单克隆抗体对于LS-174-T增殖的影响(X±SD)n＝3 *p＞0.05，**p＜0.05，***P＜0.01(与PBS组相比) 由表12可见，V2，V71，V75作用2天后，对LS-174-T细胞增殖有显著抑制。
(3)CCK-8法检测细胞增殖 取生长良好的T24细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于48孔培养板，待细胞培养至融合状态，按不同分组给药。药物分别作用3天后，加入CCK-8试剂(购自株式会社日本同仁化学研究所)20μl/孔，37℃继续孵育2小时，测定OD490nm值，结果以OD490nm值表示细胞在药物作用下的增殖水平，每组设3复孔。结果也证实上述人源VEGF单克隆抗体对于T24细胞增殖有抑制作用。
二.人源抗体的体内抗肿瘤活性研究 1.抗人VEGF单抗抑制小鼠S180纤维肉瘤的生长 (1)小鼠S180纤维肉瘤细胞的培养 培养液为RPMI 1640/10％FBS，37℃5％CO2培养增殖，细胞呈悬浮生长。
(2)动物模型的建立 取18-22g BALB/c小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，雌雄各半，分别于右腋皮下接种S180肉瘤细胞(购自ATCC)(悬浮于生理盐水中)，每只接种量为2×106个细胞/0.2ml，后随机分为4组，具体分组和给药方式见表13。2周后处死动物。
表13小鼠S180肉瘤动物模型实验分组 (3)观察指标 ①小鼠一般情况观察；②肿瘤生长变化当肿瘤可触及时，隔2天测瘤体积1次，瘤体积计算方法(短径2×长径)×1/2；描绘肿瘤生长曲线；③计算抑瘤率；④组织病理学检查动物处死后取肿瘤组织，常规切片，HE染色，光镜下观察。
人源VEGF单克隆抗体的抗肿瘤活性测定结果见表14，可见抗人VEGF单抗抑制小鼠S180纤维肉瘤的生长。
表14人源VEGF单克隆抗体的抗肿瘤活性(X±SD)n＝5 **p＜0.05，***p＜0.01(与生理盐水相比) 由表14可见，接种S180肿瘤细胞后，瘤周注射人源抗体样品后，对肿瘤的形成、生长有明显抑制。另外，在实验中发现，5-FU毒性较大，连续用药5天后动物体毛疏松，停药后动物有死亡，但抗体组动物一般状况良好，无明显毒性反应产生。
2.抗VEGF单抗对移植人肿瘤细胞的裸鼠成瘤的抑制活性 (1)人膀胱癌细胞系T24细胞的培养 于含20％小牛血清的DMEM/F12培养液中，37℃5％CO2培养箱中培养、增殖。
(2)动物模型的建立将细胞制成单细胞悬液，接种6-8周龄Bal b/c裸鼠前肢下或腹部，每只裸鼠接种0.2mL(约含1×106个细胞)，每周观察2次并记录成瘤情况。
具体分组设计及给药方式同前述1中。观察指标同前述1中。
抗VEGF单抗对移植人膀胱癌细胞的裸鼠肿瘤的抑制活性的测定结果见表15。
表15人源VEGF单克隆抗体的抗肿瘤活性(X±SD)n＝5 **p＜0.05，***p＜0.01(与生理盐水相比) 由表15可见，人源单抗V2，V71对接种于裸鼠皮下的T24细胞成瘤有明显的抑制作用。另在试验中发现，5-FU毒性较大，连续给药3天后，动物明显消瘦，停药后动物死亡，可能给药剂量偏高，而本发明制备的单抗药物组无明显不良反应。
实施例4人源VEGF单克隆抗体的药代动力学研究 受试药物基因重组人源化VEGF单克隆抗体(rhVEGF-Ab，即前述的单抗V2)；剂型无色透明液体(含0.8M的(NH4)2SO4及稳定剂)；规格6mg/ml。
受试动物SD大白鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；ICR小白鼠，购自南京医科大学实验动物中心。动物体重大白鼠雌雄各半，220-240g；ICR小白鼠雌雄各半，体重18-22g。
试剂、仪器三氯乙酸(购自姜堰市裕民化工有限公司)；0.9％氯化钠注射用水(购自南京小营制药厂)。SN-695B型智能放免测定仪(上海原子核研究所日环仪器一厂)。
利用125I-rhVEGF-Ab为示踪剂，通过动物实验，测出rhVEGF-Ab在动物体内的药代动力学参数及其分布、排泄数据。通过三氯乙酸沉淀法来确定rhVEGF-Ab在血清中的含量。
1.125I-rhVEGF-Ab的制备采用Iodogen法标记rhVEGF-Ab，HPLC法纯化标记物(TSK gel3000 PWXL色谱柱，洗脱液为0.05mol·L-1的磷酸缓冲液加0.15mol·L-1NaCl，PH 7.2)。比活度为6.4×104Bq·μg-1，放化纯度＞90％。
2.生物样品的测定方法取50ul血清样品γ-计数仪测定其计数后，加入2倍体积20％三氯乙酸(TCA)溶液，振荡并充分沉淀后，3000rpm离心20min，弃去上清液，2倍体积20％TCA洗涤沉淀，离心，测定沉淀物γ-放射性计数值。
3.血清中rhVEGF-Ab的测定方法的研究 A.溶液的配制 (a)血清标准曲线溶液的配制配制中浓度原始工作液2mL(rhVEGF-Ab的浓度为1.73mg/ml其中含125I-rhVEGF-Ab 3700Bq/20μL)，用大鼠血清等比稀释，依次分别配成计数约为87480、29160、9720、3240、1080、360和180dpm/50μL的标准工作液系列备用。
(b)组织匀浆的制备取一定量的的心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、脑等组织，加入0.5ml生理盐水匀浆后备用。
(c)肝匀浆干扰曲线溶液的配制配制原始工作液(22850dpm/5ul)200ul，加适量生理盐水成400ul工作液I(约11425dpm/5ul)，依次等比稀释成计数约为5714dpm/5ul工作液II、2857dpm/5ul工作液III、1428dpm/5ul工作液IV、714dpm/5ul工作液V，备用。
B.血清标准曲线分别取50ul 1.4.3A(a)工作液用γ-计数仪测定计数后加入2倍体积的20％TCA，振荡充分沉淀，3000rmp离心20min，弃上清，2倍体积20％TCA洗涤沉淀，离心，取沉淀γ-计数仪测定计数。
日内精密度取87480、3240和180dpm/50uL三个浓度的工作液个5份，γ-计数仪测定计数后加入2倍体积的20％TCA，振荡充分沉淀，3000rmp离心20min，弃上清，2倍体积20％TCA洗涤沉淀，离心，取沉淀γ-计数仪测定计数。
日间精密度每日重新配制87480、3240和180dpm/50uL三个浓度的工作液，γ-计数仪测定计数后加入2倍体积的20％TCA，振荡充分沉淀，3000rmp离心20min，弃上清，2倍体积20％TCA洗涤沉淀，离心，取沉淀γ-计数仪测定计数。连续测5天。
血清标准曲线结果见图22。其中图22A-图22E表示连续5天血清中放射性的理论值与实测值之间的关系，图22F-图22J表示连续5天的血清中的放射性与TCA可沉淀部分放射性之间的关系。
由图22可以看出，125I-rhVEGF-Ab用血清进行梯度稀释时不影响其测定结果，其TCA沉淀效率为86.63％。在125I-rhVEGF-Ab的放射性计数为3-1456Bq范围之间线性良好。标准工作曲线方程为Y(DPM)＝0.8663X-181.1 r＝0.9999 日内精密度试验结果见表16，日间精密度试验结果列于表17。
表16日内精密度(n＝5) 表17日间精密度(N＝5) 由以上结果可知，高、中、低剂量的日内精密度分别为2.48％、3.96％和4.49％；日间精密度分别为3.25％、4.81％和16.4％。符合国家对生物样品测定方法学的要求(一般RSD小于15％，在定量下限附近RSD小于20％)。
4.rhVEGF-Ab药代动力学参数的测定 SD大鼠18只，随机分为3组，雌雄各半，禁食，自由饮水。试验前12小时腹腔注射1％KI水溶液1ml，以封闭甲状腺。通过尾静脉分别给予高剂量(14mg·kg-1，使注入放射性为1.77×106Bq·kg-1)，中剂量(7mg·kg-1，使注入放射性为1.77×106Bq·kg-1)，低剂量(3.5mg·kg-1，使注入放射性为1.77×106Bq·kg-1)，分别在给药后5、15、30min、1、2、4、8、24h、2、3、5、7、9、12、15d眼眶取血0.4ml，6000rpm离心15min，吸取上清血清，参照“3”项中γ-计数仪法测定。
(1)高剂量组大鼠给予高剂量rhVEGF-Ab(14.0mg·Kg-1)后，血清中的rhVEGF-Ab含量测定结果见表18。并且，图23A显示了rhVEGF-Ab单次静脉高剂量给药后大鼠血清中rhVEGF-Ab的血药浓度-时间曲线。
表18给予高剂量rhVEGF-Ab后大鼠血清中rhVEGF-Ab含量(mg·L-1) 根据以上数据可以求出大鼠给予高剂量rhVEGF-Ab后，rhVEGF-Ab在大鼠体内的主要动力学参数，结果见表19。
表19大鼠静脉注射高剂量rhVEGF-Ab后rhVEGF-Ab的动力学参数 大鼠注射高剂量rhVEGF-Ab后的动力学参数为末端半衰期t1/2γ为(135.6±12.6)h；表观分布容积V1为(0.17±0.02)L·kg；清除速率常数CL为(0.014±0.002)L·h-1·kg-1；药时曲线下面积AUC为(908.95±116.01)mg·h·L-1。
(2)中剂量组大鼠给予中剂量rhVEGF-Ab(7.0mg·kg-1)后，血清中的rhVEGF-Ab含量测定结果见表20。并且图23B显示了rhVEGF-Ab单次静脉中剂量给药后大鼠血清中rhVEGF-Ab的血药浓度-时间曲线。
表20大鼠给予中剂量rhVEGF-Ab后血清中的rhVEGF-Ab含量(mg·L-1) 根据以上数据可以求出大鼠给予中剂量rhVEGF-Ab后，rhVEGF-Ab在大鼠体内的主要动力学参数，结果见表21。
表21大鼠静脉注射中剂量rhVEGF-Ab后rhVEGF-Ab的动力学参数 大鼠注射中剂量rhVEGF-Ab后的动力学参数为末端半衰期t1/2γ为(203.4±41.9)h；表观分布容积V1为(0.232±0.101)L·kg；清除速率常数CL为(0.011±0.001)L·h-1·kg-1；药时曲线下面积AUC为(483.74±76.60)mg·h·L-1。
(3)低剂量组大鼠给予低剂量rhVEGF-Ab(3.5mg·kg-1)后，血清中的rhVEGF-Ab含量测定结果见表22。并且，图23C显示了rhVEGF-Ab单次静脉低剂量给药后大鼠血清中rhVEGF-Ab的血药浓度-时间曲线。
表22大鼠给予低剂量rhVEGF-Ab后血清中的rhVEGF-Ab含量(mg·L-1) 根据以上数据可以求出大鼠给予低剂量rhVEGF-Ab后，rhVEGF-Ab在大鼠体内的 主要动力学参数，结果见表23。
表23大鼠静脉注射低剂量rhVEGF-Ab后rhVEGF-Ab的动力学参数 大鼠注射低剂量rhVEGF-Ab后的动力学参数为末端半衰期t1/2γ为(156.2±23.2)h；表观分布容积V1为(0.23±0.08)L·kg；清除速率常数CL为(0.01±0.002)L·h-1·kg-1；药时曲线下面积AUC为(279.25±37.95)mg·h·L-1。
(4)大鼠单次静脉注射给予rhVEGF-Ab后，不同剂量下的药时曲线见图23D，rhVEGF-Ab主要药动学参数结果见表24。
表24rhVEGF-Ab单次给药后大鼠各剂量药动学参数比较 表24比较可见①静脉给药后，rhVEGF-Ab末端消除半衰期T1/2γ在高、中、低剂量分别为135.6±12.6h、203.4±41.9h、156.2±23.2h；②高、中、低剂量的AUC分别为908.95±116.01mg·L-1·h、483.74±76.60mg·L-1·h、279.25±37.95mg·L-1·h。给药剂量与AUC成线性关系见图24，其相关系数为0.9999；③高、中、低剂量的Cmax分别为78.79±8.30mg·L-1，30.46±8.32mg·L-1，15.72±3.61mg·L-1。
5.rhVEGF-Ab在小鼠体内的组织分布试验 小白鼠40只，随机分成5组，每组8只，雌雄各半，禁食自由饮水。试验前12小时腹腔注射1％KI水溶液0.5ml，以封闭甲状腺。静脉注射(i.v.)给予10.0mg·kg-1的rhVEGF-Ab，使注入放射性为3.70×106Bq·kg-1)，分别在给药后5min，1h，4h，8h，24h处死，取全血100ul及心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脑、胃、性腺、骨、小肠等脏器，各脏器分别用清水洗净后，吸水纸吸干，称重，γ-计数仪测定计数。
静脉注射125I-rhVEGF-Ab在各组织放射性分布用相对积累程度来表示，小鼠皮下给药后，5min，1h，4h，8h，24h中各组织的相对累积系数见表25及图25。
相对累积程度表示方法如下
表25静脉给药后rhVEGF-Ab在小鼠组织总放射性的分布(相对累积系数) 由表25、图25可见，rhVEGF-Ab在各组织中放射性的相对积累程度的顺序为 5min时肝＞血液＞脾＞肾＞肺＞胃＞骨＞心＞小肠＞性腺＞肌肉＞脑； 1h时胃＞肝＞脾＞血液＞肺＞肾＞小肠＞骨＞性腺＞心脏＞肌肉＞脑； 4h时胃＞肝＞脾＞血液＞肺＞肾＞小肠＞性腺＞骨＞心脏＞肌肉＞脑； 8h时胃＞肝＞脾＞血液＞肾＞肺＞小肠＞骨＞性腺＞心脏＞肌肉＞脑； 24h时肝＞脾＞血液＞肺＞胃＞肾＞骨＞性腺＞小肠＞心脏＞肌肉＞脑。
由上可见，rhVEGF-Ab在胃中积累程度最高。
胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，本实施例的试验发现，本发明的rhVEGF-Ab能够在小鼠的胃中积累，因此可见rhVEGF-Ab特别适合于胃癌的治疗。
6.rhVEGF-Ab的排泄试验 A)rhVEGF-Ab在大白鼠中的胆汁排泄取SD大鼠5只，雌雄各半，禁食，自由饮水。试验前12小时腹腔注射1％KI水溶液1ml，以封闭甲状腺。腹腔注射2％戊巴比妥钠0.3ml麻醉，做总胆管插管，尾静脉给予中剂量rhVEGF-Ab(7.0mg·kg-1，使注入放射性为7.91×105Bq·kg-1)，在0-2、2-4h、4-8h、8-16h、16-22h、22-30h、30-41h、41-49h、49-66h和66-90h收集胆汁。记录体积，取100ul γ-计数仪测定计数，计算胆汁中总放射性计数。
rhVEGF-Ab在大鼠中的胆汁排泄用125I-rhVEGF-Ab静脉给药后从胆汁排泄出的放射性总量占总放射性的百分比来表示，见表26及图26。
表26rhVEGF-Ab在大鼠胆汁中的排泄累积百分率 由表26及图26可知125I-rhVEGF-Ab在大鼠胆汁中90h的累积排泄率为(13.71±4.70)％。
B)rhVEGF-Ab在大白鼠中的尿粪排泄取大白鼠6只，雌雄各半，试验前12小时腹腔注射1％KI水溶液1ml，以封闭甲状腺。尾静脉给予中剂量rhVEGF-Ab(7.0mg·kg-1，使注入放射性为7.81×105Bq·kg-1)，注射后放入大鼠代谢笼中，自由饮水，进食。收集时间段0-2h、2-4h、4h-6h、6h-11h、11h-18h、18h-24h、24h-32h、32h-43h、43-51h、51-68h、68-93h、93-120h和120-144h之间的尿和粪。分别取一定量γ-计数仪测定计数，计算尿、粪中的总放射计数。
rhVEGF-Ab在大鼠的尿粪中的排泄用125I-rhVEGF-Ab静脉给药后从胆汁排泄出的放射性总量占总放射性的百分比来表示，结果见表27、表28及图27A(大鼠尿液)和图27B(大鼠粪)。
表27rhVEGF-Ab在大鼠尿液中的排泄累积百分率 表28rhVEGF-Ab在大鼠粪中的排泄累积百分率 试验结果表明，大鼠静脉注射125I-rhVEGF-Ab后，144h中由尿、粪排出的累积总放射性百分率分别为(84.94±4.39)％、(4.58±3.06)％。
7.数据处理本次试验采用Drug And Statistics for Windows(DAS ver2.0)统计软件，根据AIC最小原则对数据结果进行分析处理。
结论 (1)大白鼠i.v.给予不同剂量rhVEGF-Ab后的药代动力学特征符合三房室模型。
(2)rhVEGF-Ab在大鼠中主要动力学参数如下 高剂量(14.0mg·kg-1)T1/2γ为(135.6±12.6)h；表观分布容积V1为(0.17±0.02)L·kg；清除速率常数CL为(0.014±0.002)L·h-1·kg-1；药时曲线下面积AUC为(908.95±116.01)mg·h·L-1； 中剂量(7.0mg·kg-1)t1/2γ为(203.4±41.9)h；表观分布容积V1为(0.232±0.101)L·kg；清除速率常数CL为(0.011±0.001)L·h-1·kg-1；药时曲线下面积AUC为(483.74±76.60)mg·h·L-1； 低剂量(3.5mg·kg-1)t1/2γ为(156.2±23.2)h；表观分布容积V1为(0.23±0.08)L·kg；清除速率常数CL为(0.01±0.002)L·h-1·kg-1；药时曲线下面积AUC为(279.25±37.95)mg·h·L-1。AUC与给药剂量成正相关，相关系数为0.9999。
(3)rhVEGF-Ab主要通过尿进行排泄，144h时大鼠体内的总放射性的84.94±4.39％通过尿液排出，其次是胆汁排泄，90h时有13.71±4.70％的放射性通过胆汁排出，通过粪便排泄的最少，144h内仅有4.58±3.06％的放射性通过该途径排出体外。
(4)rhVEGF-Ab在小鼠各组织中的分布特点为在血液、心脏、肝、脾、肺和骨中，静脉给药后，其放射性迅速达到最大值，然后随着时间的延长放射性逐步降低；而在胃、肌肉、性腺和小肠中，其放射性在给药后1h达到最大，然后在随着时间的延长而降低；脑中的放射性始终很低，表明rhVEGF-Ab无法通过血脑屏障。
尤其值得注意的是，rhVEGF-Ab在胃中有高的累积，静脉给药后1h，其在胃中的相对累积系数超过肝脏，而且这种现象一直持续到给药后8h。
菌种保藏 小鼠杂交瘤细胞系V2保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏号为CCTCC N0C200623，保藏日为2006年5月26日，其分类命名为“杂交瘤细胞VEGF”。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海杰隆生物工程股份有限公司
<120>人源人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备方法
<130>063181
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
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<221>misc feature
<223>引物
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tagaattcgc acccatggca gaaggagg28
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<400>2
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<210>3
<211>490
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
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catggatgtc tatcagcgca gctactgcca tccaatcgag accctggtgg acatcttcca120
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ttcctgcaaa aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag cttgagttaa acgaacgtac480
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<212>PRT
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<400>4
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1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Trp Val Glu Phe Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His
1 5 10 1权利要求
1.一种人血管内皮生长因子单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体为IgM型抗体，并且其与人血管内皮生长因子的亲和力为1×10-9M-1×10-8M。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体由小鼠杂交瘤细胞系V2CCTCC NOC200623，V50，V71，或V75产生。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体特异地累积于胃、肝、或脾。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体是全人源的单克隆抗体。
5.一种产生权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞系V2 CCTCC NOC200623，V50，V71，或V75。
6.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤
(1)培养杂交瘤细胞系V2 CCTCC NOC200623，V50，V71，或V75，使之分泌单克隆抗体；
(2)分离(1)中获得的单克隆抗体。
7.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有
(a)权利要求1所述的单克隆抗体；和
(b)选自下组的偶联部分药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
8.一种药物组合物，其特征在于，它含有
(i)有效量的权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求7所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
9.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
全文摘要
本发明公开了一种新的人源的人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体。本发明还公开了制备所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明还公开了制备所述的单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合VEGF抗原，其具有很高的亲和力及很低的免疫原性，并且具有显著的抗肿瘤活性。
文档编号C07K16/18GK101148474SQ200610116318
公开日2008年3月26日 申请日期2006年9月21日 优先权日2006年9月21日
发明者成国祥, 煜 刘, 张爱民, 刘思国, 陈建泉 申请人:上海杰隆生物工程股份有限公司