专利名称：：重组胶原样蛋白质的生产的制作方法重组胶原样蛋白质的生产本发明涉及用于生产重组胶原样蛋白质的酵母细胞。本发明还涉及用于产生该蛋白质的试剂盒(kitofpart)或共表达系统，以及生产该重组蛋白及由该重组蛋白所制备的线的方法。此外，本发明涉及通过这些方法得到的蛋白质或线以及它们在技术和医学的各个领域中的用途。海生贝类存在于潮间带的端流场所中并且在这里，海生贝类已经十分成功地定居在暴露于风和浪的岩石上。这种成功部分归因于独特的锚定作用，其中海生贝类通过这种锚定作用将自身固定在岩石的固体表面上。这种锚定作用的一部分是称作"足丝"或又称作"贝丝"的纤维结构。足丝为贝类提供必需的韧度以通过与岩石或硬质表面连接而在波浪不断冲击下存活。贝类足丝完全由形成与细微腱类似的短线束的胞外基质构成[2]。足丝线显示不寻常的机械特性，因为它们在一端类似于软橡胶而在另一端类似于硬尼龙并且这些特性以无缝及渐进过渡的方式存在[4]。足丝线还是弹性的它们能够承受剧烈变形而不破裂，并且在应力撤除时可以恢复至原始状态[5]。在远端，足丝线通过教性斑固定在岩石上。在近端，足丝线合并成锚定在贝足基部的所谓足丝茎(见图3)。海生贝类的足丝线是具有巨大的吸收和散逸能量能力的弹性纤维。多达70%的总吸收能量可以在足丝中散逸。在贻贝(M少"/船)物种(贝台贝(Me^fc)和紫贻贝(Mga/qpraw'"c/afo))中，每条新线具有长度为数厘米以及直径小于O.lcm的尺度，并且通过与反应注射成型相似的过程在足的腹面沟中在大约5分钟内形成[3]。在形态学上，足丝分成4个部分(由近及远)根、茎、线和斑或腕趾。此外，根据外观将线进一步分成近端部分和远端部分，即远端部分光滑坚硬并且近端部分柔软纤弱，足丝线是弹性材料。杨氏模量低(在10-500MPa的范围内)，延伸率可以高达200。/。并且存在复原性恢复(restorativerecall)。与其它蛋白质弹性体如弹性蛋白、节肢弹性蛋白和展肌蛋白(abductine)相同，足丝线相当坚韧。韧度和能量散逸对于吸附器官均是重要性质。将进行循环应力-应变分析的纤维中的能量散逸相对于总吸收能量进行归一化并报告为滞后或滞后百分数。已经将一条线的应力-应变循环分割成用于线的远端部分和近端部分的单独的机械作用。如上所述的，在这些部分中，远端部分更粗壮、更坚硬并且在緩冲作用方面性能优越，而近端部分更柔软及纤弱，具有较低但仍明显的滞后。足丝线的机械特性因时间及应变依赖行为而进一步复杂化。已经证实，当受拉伸超出其屈服点时，远端部分表现示意性应力软化(schematicstresssoftening),即第二循环的初始模量减少至第一循环中模量(500-80MPa)的约20%。第一循环模量的完全恢复是緩慢的，例如超过24小时，但是明显恢复可以在1小时内出现(初始值的30%)。近端部分也显示随循环载荷而改变劲度的倾向。在此情况下，存在从35MPa的初始模量至在50MPa的渐近水平的应变-变硬作用，增长约40%。MASCOLO和WAITE(1986)首先鉴定了Mytilus足丝中的化学梯度。在用胃蛋白酶处理足丝线后，鉴定了被称为ColP和ColD的两种抗胃蛋白酶的胶原片段，其分别具有50kDa和60kDa的分子量。ColP可以主要在近端区域中找到并且几乎不会在远端区域中找到。相反，ColD的量在远端部分增加至大约100%(LUCAS等，2002;QIN和WAITE,1995)。在足丝线中以及在贝足中，存在参与构建足丝线结构的另一种胶原样蛋白质。这种另外的蛋白质被称为ColNG(NG=无梯度)，与ColD和ColP相反，它均匀分布在整条足丝线中。它的生理学功能大概是作为其它两种线胶原的连接物(QIN和WAITE，1998).胃蛋白酶切割的片段ColD和ColP源自所谓的前月交原P和D。来自贻贝的前胶原(即D和P)都以共同的基础结构为特征两侧有不同侧翼区的中央胶原螺旋，其中所述的侧翼区分别由富含组氨酸和DOPA的末端端接(见图1)。充分认识到胶原经交联发生稳定化；然而这种化学过程仍然未充分理解。存在两种明显不同的交联可能性胶原单元间的金属络合及共价键形成[8,9]。金属络合作用由足丝中存在高水平的铁、铜、镍和锌以及在足丝蛋白质两个末端中存在结合金属的组氨酸丰富序列所提示。另外，DOPA出现在所有前胶原的两个末端。肽基-DOPA提供优异的金属结合位点并且肽基-DOPA-Fe(III)螯合物已经在海洋生物l占斑(marineadhesiveplaque)mefp-l中报道[IO]。此外，已经证实通过EDTA从足丝纤维中除去金属离子降低了纤维的屈服强度。也已经观察到了共价交联。它们通常由酪氨酸、DOPA与半胱氨酸间的氧化偶联而形成。在研究受高流量和高通气条件应激的足丝中，发现氧化的初级产物是5,5'-二DOPA[ll]。没有发现其它可能的偶联产物如将赖氨酸Michael型加成至氧化的DOPA[7]。如同"正常"胶原，每种贝类胶原具有确保将a-链运输至内质网中的20个氨基酸的信号序列。在内质网中，三条相同的ct-链装配成同三聚体。ColDa-链(指胃蛋白酶切割的前胶原D)具有由SDS-PAGE确定的60kDa分子量和由MALDI-TOF质i普确定的47kD分子量(QIN等，1997)。ColPa-链(指胃蛋白酶切割的前胶原P)分别具有55kDa分子量(SDS-PAGE)和40kD分子量(MALDI-TOF)(COYNE等，1997)。a-链的前体叫做前胶原D和前胶原P,分别具有由SDS-PAGE分析所确定的95和97kDa的分子量和通过用MALDI-TOF质谱分析所确定的75和80kD分子量(COYNE等，1997;QIN等，1997)。两种胶原均具有对I-III型胶原典型的特征。两者均具有含量大于34%的甘氨酸并在胶原结构域中显示出合计20%的脯氨酸及羟脯氨酸含量。侧翼区完全对应于其它结构蛋白，即弹性蛋白(前胶原P)和丝纤蛋白(前胶原D)。这种结构性构造解释了贝类足丝的机械行为。由于此原因，为了利用这些异乎寻常的天然材料作为新技术学应用中的结构单元，重组地生产基础性贝类足丝胶原将是极有意义的。开发具有所定义特征的材料、尤其是在应力或过载后能够自行恢复的材料在材料科学中长时间以来具有高度的重要性。复合结构在技术学中引起了兴趣，尤其对于电子元件和器件、换能器和其它材料。通过组合具有不同机械性质的材料，将会形成引起新的技术问题的结构界面。因此，对于众多应用而言，极其需要提供渐变性结构，从而降低材料的整体负荷。此外，贝类胶原在医学中的用途和应用引起极大的兴趣，原因在于高度的潜在生物相容性。基于这一点，可以产生具有高度免疫相容性的医用移植物和组织。重组贝类胶原的生产是在可以构想贝类胶原的技术应用之前必须解决的一个有趣而重要的技术问题。因此，本发明首要目的是提供这样的重组贝类足丝蛋白，其具有提高的特性，如尤其是提高的以高产量表达的能力和优异强度及挠性。本发明的另一目足丝蛋白，其中它们基于所述的特定排列以提供渐变性结构。此外，本发明的目的是提供编码重组贝类足丝蛋白的表达载体，其可以方便地在已知真核表达系统中表达。另外，本发明的目的是提供改良的纸张、织物和皮革产品。其它目的是提供于重组贝类足丝蛋白的新蛋白质和其它材料如球、纳米纤维、水凝胶、线、泡沫、薄膜用于生物技术、医学、药物和食物应用、化妆品中、在电子器件中及用于其它商业目。本发明的另一个目的是提供能够以高产量及高品质表达胶原样蛋白质、特别是贝类足丝蛋白的宿主细胞。这些目的由独立权利要求的主题解决。优选的实施方式在从属权利要求中描述。迄今为止，重组贝类足丝蛋白的表达从未得到证实。这可能至少部分地归因于表达这些蛋白质和从这些蛋白质制备线的复杂过程。生物合成胶原的复杂性造成对任何尝试表达重组胶原的结果的降低的可预测性，因此，这些尝试大概可能导致错误折叠的蛋白质、低产量或在最坏情况下根本没有表达胶原。在本发明中，提供产生高产量的正确折叠的胶原样蛋白质、尤其贝类足丝蛋白的宿主细胞系统。本发明特别是涉及以下方面和实施方式根据第一方面，本发明提供用于生产重组胶原样蛋白质、特别是贝类足丝蛋白的酵母细胞，该酵母细胞已经用以下元件转化a)编码所述重组胶原样蛋白质的第一表达载体；和b)包含编码脯氨酰-4-羟化酶(P4H)的核酸的第二表达载体.由于胶原生物合成的复杂性，对于重组合成胶原样蛋白质而言，本发明人发现必需考虑某些因素，其中最重要的一个因素是在内质网(ER)中通过脯氨酰-4羟化酶将脯氨酸翻译后修饰为羟脯氨酸，其中脯氨酰-4羟化酶是一种由两个亚基即a-PH(=P4HA)和PDI(=P4HB)构成的四聚体酶(BULLEID等，2000)。因为这个原因，原核表达系统例如细菌表达系统将不能用于本发明。酵母在一方面提供对于合成胶原所需要的细胞区室化，然而在另一方面酵母缺少胶元合成所需要的酶即脯氨酰-羟化酶(P4H)。除此之外，酵母将是用于重组胶原的理想的表达系统，因为它们的培养尤其在大规模表达系统中相对容易实现并且来自酵母培养的重组蛋白的产量超过其它表达系统。因此，在酵母中的表达可能导致高效(且成本可行)地生产重组胶原样蛋白质，尤其贝类足丝蛋白。然而由于酵母细胞的上述缺点，这些蛋白质在酵母中的表达迄今并未实现。本发明人可以证实对于不拥有P4H的酵母细胞而言，人P4H亚基可以重组地产生并且可以正确地折叠。除此之外，对这些酵母抹而言，可以证实通过共表达两个人P4H亚单位，合成贝类足丝胶原是可能的，并且形成了折叠的稳定胶原。有趣的是，共表达两个P4H亚基的基因足以在酵母中形成稳定的三股螺旋而无需其它的酶或折叠促进剂或对胶原专用的伴侣蛋白例如Hsp47,或换而言之，酵母天生的伴侣蛋白是足够"活性的"。与天然胶原相比，酵母中重组产生的人胶原具有相同含量的羟脯氨酸，并且此外在众多其它特征上相同。通过在酵母ER中的高效运输，共表达的P4H亚基的信号序列发挥重要作用。可以通过以下方法来实现最大充分的定位在优选实施方案用酵母信号序列，例如来自酿酒酵母CS.cwev&"e)的信息素交配因子al(MFa)，替换人信号序列而实现。被MFa信号序列修饰的P4H亚基被有效地运输至ER的网眼中。更优选地，信号序列是#>据8￡()101^0:10的酿酒酵母交配因子al(MFa)。作为酵母细胞，可以优选地使用酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(ScWzoracc/^rawycaspo/w&)、巴斯德毕赤酵母(尸/c/z/aposton's)、白假丝酵母(Caw&/aa/6/cam)，或多形汉逊酵母(/f(3m^咖/apo/ymo/77/2a)。第一表达载体优选地还包含一种或多种调节元件。该表达载体必须适宜用于在酵母细胞中表达。优选地，调节元件含有选自组成型或诱导型启动子、更具体地选自GPD、GAL4、CUP1、MET25、GAL1或GAL1-10的启动子。在另一个实施方式中，表达载体是质粒。优选地，重组胶原样蛋白质是重组贝类足丝蛋白，其包含两侧有弹性蛋白或丝纤蛋白的胶原结构域的一个或多个片段，或者由两侧有弹性蛋白或丝纤蛋白的胶原结构域的一个或多个片段构成。这种重组贝类足丝蛋白由向形成的蛋白质提供不同特征的一种或多种类型的结构单元构成如上所述，弹性蛋白和丝纤蛋白具有某些机械特征，这可以解释贝类足丝的机械特性并因此也用于设计重组产生的贝类足丝蛋白。因此，这些片段可以仅作为一种单一类型的片段加以使用，或作为备选，重组蛋白可以包含两种或多种不同的片段。例如若需要大的弹性，蛋白质可以仅包含或主要包含两侧有弹性蛋白的胶原的片段。若需要大的硬度和强度，蛋白质可以包含两侧有丝纤蛋白的胶原的片段。作为另一个且优选的替代方案，蛋白质可以包含两种类型片段的混合物，例如形成从一个区域至另一个区域的梯度。因此，可以形成这样的蛋白质/线，其具有特别适应的构象，即部分具有较高的弹性而部分具有较高的硬度等。术语"两侧有，，意指弹性蛋白(或丝纤蛋白)存在于胶原结构域的两侧。上述片段可以是天然衍生的，例如片段可以来源于贻贝属的种(M声z7w取)，优选地来自贻贝、紫贻贝、加利福尼亚贻贝或半皱壳菜蛤(G^fenVde附/M")。根据优选的实施方式，本发明的重组贝类足丝蛋白包含前胶原P和/或前胶原D或它们的变体的一个或多个片段，或由前胶原P和/或前胶原D或它们的变体的一个或多个片段构成。这些片段描述如上。两种前胶原(即D和P)均来源于贻贝并且以共同的基础结构为特征两侧有不同侧翼区的中央胶原螺旋，其中所述的侧翼区分别由富含组氨酸和DOPA的末端端接。侧翼区完全对应于已知的结构蛋白，即弹性蛋白(前胶原P)和丝纤蛋白(前胶原D)。将前胶原P和前胶原D的序列从各自的核酸中翻译。因此，每当氨基酸在本文以下中提及时，它们指的是前胶原P和前胶原D,并且这些序列将在本文以上所提及各种技术应用中使用。本文所提及的核酸序列首先涉及编码前胶原P和前胶原D的序列。根据另一个实施方式，本发明的重组蛋白包含由SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4或它们的变体的一个或多个片段，或由SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4或它们的变体的一个或多个片段构成。SeqIDNo对应于前胶原P和前胶原D的序列。如上提及，本发明也包含这些氨基酸序列的变体。例如，当与上文提及的氨基酸序列比较时，所述的变体可以含有一个或多个置换、插入和/或缺失。特别地，将引起所谓"沉默"变化的蛋白质的变体，例如序列的缺失、插入和/或替代，视为本发明的一部分。优选这样的氨基酸替代，替代的结果是用具有相似结构特征和/或化学特征的相似氨基酸替代氨基酸，即保守氨基酸替代。氨基酸替代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性(两亲)性质方面的相似性进行。疏水性氨基酸的实例是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性且中性的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。"插入"或"缺失"通常是在1-5个氨基酸范围内。可以通过在多肽分子中有序使用的氨基酸插入、缺失或替代，利用重组DNA方法实验确定允许变异的程度。可以对所得的变体测试其性质、尤其机械性质。应当指出，本文中所用的术语"变体，，也包含前胶原P和前胶原D的上述氨基酸序列，其中构成原贝类信号序列的头19个氨基酸被其它信号序列替代。优选的实例是贝类信号序列被信号序列aMF(SEQIDNO:IO:"MRFPSIFTAVLFAASSALA")替换。该信号序列特别适合于核酸在酵母中的表达。本发明也提供编码如上文所定义的重组蛋白的分离核酸。本文所用的关于核酸的术语"分离的，，是指不与两个序列紧密连接的天然存在的核酸，在该核酸所来源的生物的天然存在基因组中该核酸与这两个序列紧密连接(一个序列在5，端而另一个序列在3，端)。例如，分离的核酸可以是但不限于任意长度的重组DNA分子，只要在天然存在基因组中通常所发现的紧密位于该重组DNA分子两侧的核酸序列中的一个被去除或不存在。因此，分离的核酸包括但不限于独立于其它序列、作为独立分子存在的重组DNA(例如通过PCR或限制性核酸内切酶处理所产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及被并入到载体、自主复制性质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱渗病毒)中或被并入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。另夕卜，分离的核酸可以包括是杂交体核酸序列或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。术语"分离的"也包括任何非天然存在的核酸，因为在自然界中没有发现非天然存在的核酸序列，并且不具有在天然存在的基因组中的紧密连接的序列。例如，将非天然存在的核酸(如设计的核酸)视为分离的核酸。可以使用常见的分子克隆技术或化学核酸合成技术来制备设计的核酸。分离的非天然存在的核酸可以独立于其它序列存在，或者将其并入到载体、自主复制性质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱渗病毒)或原核生物或真核生物的基因组DNA中。另夕卜，非天然存在的核酸可以包括是杂交体核^列或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。对本领域技术员显而易见的是，在例如cDNA或基因组文库或含有基因组>见为分离的核酸。编码以上氨基酸的核酸可以是编码重组贝类足丝蛋白的成熟或不成熟氨基酸序列的核酸序列。在优选实施方案中，分离的核酸包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2或它们的变体的核酸，或由SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2或它们的变体的核酸构成。当与SEQIDNO:1或2的序列比较时，这些变体每一个都定义为具有一个或多个替代、插入和/或缺失，只要所述的变体在中等严格或严格条件下与包含SEQIDNO:l或2的序列的核酸杂交，或者只要所述的变体包含归因于遗传密码简并性的核酸变化，其中所述的核酸变化编码如SEQIDNO:1或2的核酸序列那样的相同或功能等同的氨基酸。如上提及，本发明还包含所述核酸的变体，其中编码前19个氨基酸(信号序列)的核酸被替换，优选地被酵母信号序列MFa(SEQIDNO:IO)替换。本文中所用的严格杂交是指这样的条件，其中多核苷酸双链体在所述条件下是稳定的。如本领域技术员已知的，双链体的稳定性是钠离子浓度和温度的函数(见,例如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual第二版(ColdSpringHarborLaboratory，(1989))。用于杂交的严才各性水平可以便利地由本领域技术员改变。严格洗涂条件指在65°C下的0.2xSSC(0.03MNaCl，0.003M柠檬酸钠，pH7)/0.1%SDS。对于较短的片段，例如最多30个核苷酸的寡核苷酸，杂交温度低于65。C，例如在50。C,优选高于50。C，但低于65°C。严格杂交温度取决于相应核酸的大小或长度和它们的核酸组成，并且将由熟练技术员经验地确定。中等严格杂交温度例如是42°C,并且具有在42。C的0.2xSSC/0.1%SDS洗涤条件。本发明中所用的P4H优选地是人或贝类的P4H。在第二方面，提供了一种包含以下组分的试剂盒或共表达系统a)如本文中所定义的第一表达载体；和b)如上文定义的第二表达载体。该试剂盒或共表达系统可以高效地用于在酵母细胞中表达重组贝类足丝蛋白。在另一个方面，公开了一种生产重组胶原样蛋白质、尤其是生产贝类足丝蛋白的方法，该方法包括步骤a)提供如上文中所定义的酵母细胞；b)用上文描述的表达载体或共表达系统转化该酵母细胞；c)在合适条件下从所述宿主细胞中表达重组蛋白；以及d)回收该蛋白质。此外，提供了一种用于从重组贝类足丝蛋白中生产线的方法，该方法包括以下步骤a)提供根据以上方法生产的重组蛋白，和b)通过合适的方法使所述的蛋白质纺丝或模塑为线。纺丝可以优选地通过电纺丝法进行。电纺丝法是使用静电力来生产连续的纳米直径纤维的纤维成型技术。已经将类型广泛的天然高分子和人工高分子从溶液中和熔融相中电纺丝成型，并且对于需要高表面积材料(滤膜和生物医学器件)的各种应用领域有意义。本发明的另外方面是通过以上方法之一可得到的蛋白质或线。本发明的蛋白质/线优选在生物技术和/或医药领域中具有用途。例如，它们可以用于制造伤口闭合或覆盖系统或缝合材料。此外，该蛋白质/线可以优选地用于制造替代材料，优选是人工软骨或肌腱材料。另外，本发明的线/蛋白质可以用于制造医疗器械如医用粘合带、皮肤移植物、替代韧带和外科用网片；以及用于范围广泛的工业产品和商品如服装面料、防弹背心内衬、容器面料、手提袋或女用包皮带、缆、绳子、黏性结合材料、非黏性结合材料、捆扎材料、汽车覆盖件和零件、飞机结构材料、耐候性材料、柔性分隔材料、体育器材；以及实际上，用于高抗拉强度和弹性是所需特征的纤维或面料的几乎任何用途。本发明也构思了处于其它形式下的稳定纤维产物(如干喷涂料、珠样粒)的适应性和用途以及在混合物中与其它组合物的用途。应当明确指出的是，本发明的贝类足丝胶原的优选应用是制造和加工服装面料(织物)及皮革、汽车覆盖件及零件、飞机结构材料，以及制造和加工纸张。可以将本发明的重组贝类足丝蛋白添加至纤维素产品和角蛋白及胶原产品中，因此，本发明也涉及纸张或护肤产品和护发产品，其包含纤维素和/或角蛋白和/或胶原和本发明蛋白质。其中加入本发明蛋白质的纸张和护肤产品和护发产品显示改良的特性，特别是改良的抗拉或撕裂强度。此外，可以将本发明的重组贝类足丝蛋白用作织物和皮革产品的涂料，从而赋予涂层产物稳定性和耐久性。特别地，所述蛋白质显示对涂层皮革产品的可用性，因为在这种情况下，可以避免或至少降低鞣革及其对环境的不利作用。本发明也涉及含有所述贝类足丝蛋白的产物，例如伤口闭合或覆盖系统、缝合材料、替代材料优选是人工软骨或肌腱材料、化妆品、药物送递载体、面料、织物、纸产品、皮革产品、汽车零件或飞_机零件。通常，本发明也涉及基于重组贝类足丝蛋白的材料，如球、纳米纤维、水凝胶、泡沫、薄膜。除非另外定义，本文中所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员惯常所理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其它参考文献完整地引用作为参考。在发生冲突的情况下，本说明书，包括定义，将优先。另外，实施例仅是说明性的并且不应理解为是限制性的。14现在，通过实施例和显示如下的附图进一步说明本发明图l显示了贝类足丝胶原的一般结构；图2描绘了足丝线从远端至近端方向上的一系列SEM图像-标出的部分分别在以下放大。a)远端；b)中部；c)近端；图3显示了贝类足丝的结构；图4显示了通过足丝线与固体结合的贝类；图5:(A)前胶原在线中的分布。(B)具有侧翼结构域的胶原亚基的示意图。由菱形所示的末端区域富含His。DOPA由Y指示。(C)轴向前胶原与水平前胶原之间交联相互作用的模型；图6:P4H构建体的设计；图7:对产生a-MF信号序列的寡核苷酸的设计，其中a-MF信号序列可随时克隆至相应的表达质粒中；图8:a-PH的克隆策略；图9:载体图。实施例贝类足丝的胶原蛋白质在母酵中的表达胶原合成通常反映复杂的生物化学过程。该过程例如需要通过脯氨酰-4羟化酶在内质网中将相应胶原的某些脯氨酸翻译后修饰为4-羟脯氨酸。脯氨酰-4羟化酶在脊推动物中是012/32四聚体，在胶原合成中发挥重要作用。由P4H产生的4-羟脯氨酸残基对于将新合成的胶原多肽链折叠成三螺旋胶原分子是必需的[13]。乂l减應-4-,^錄《迷种建傳P4H的构建体需要将信号序列克隆至酵母载体中邻近于P4H的两个亚基a-PH和PDI的基因处。这两个基因均处于在半乳糖(Gall/10)存在时受诱导的双向启动子控制下(见图6)。该信号序列是将P4H亚基转运至ER所需要的，在ER中P4H亚基可以装配成天然四聚体。在人信号序列被酵母自身的交配因子a-MF信号序列替代时已经实现了定位的最大效率[12]。见本文中的图6。从来自HepG2肝细胞的c-DNA文库(由德国慕尼黑研究中心(GSFMunich)Adamski教授提供)中通过PCR扩增a-PH的基因(无信号序列)，从大肠杆菌(五.//.)克隆载体(由英国曼彻斯特大学(1)11^^5^ofManchester,UK)NeilBulleid教授提供)中扩增(3-亚基(PDI)的c-DNA(无信号序列)。对于每个基因，相应的aMF信号序列将基于两个单链寡核苦酸进行设计。寡核苷酸A和B以这样的方式(见图7)进行设计在退火之后可以将双链DNA直接克隆至相应的载体中。用于a-PH的克隆策略显示如实施例(图8)。对PDIcDNA的克隆将以相同方式进行。将使用两种不同酵母载体pRS315(CEN，代表单拷贝数质粒)和pRS425(2|n，代表多拷贝质粒)，两者均含有双向Gall/10启动子，允许从一个质粒中同时表达两个亚基。#魔,"^微j,^魏賴贝类足丝的两种主要的蛋白质组分即前胶原D和前胶原P的重组合成是本发明的实施例。已经从Waite教授(UCSB,USA)处得到了大肠杆菌克隆载体中的前胶原P和前胶原D的c-DNA。通过PCR扩增该cDNA，然后将其克隆至不同酵母表达载体。载体区别于单位细胞的拷贝数上以及激活物(组成型启动子GPD或诱导型启动子GAL4)的选择上。为了最大的定位效率，原初信号序列将被酵母a-MF的信号序列所替代。^^^#逾#乂凑/《^Co/P斧Cb/D用于高效重组合成贝类胶原的试验需要获得抗贝类胶原的多克隆抗体。用抗人I-III型胶原多克隆抗体的预备试验显示针对化学变性的来自贝类足丝的胶原的极微弱交叉反应性。这种交叉反应性不足以检测在重组合成过程中存在的胶原水平。因此，需要产生抗贝类胶原的抗体。为了能够产生抗体，需要纯化的天然贝类胶原。将足丝从新鲜贝类中提取出来，并且使用几种色谱方法进行纯化(其中有反相色谱)。使用含有前胶原D和前胶原P的纯化蛋白质样品来免疫家兔并产生抗体。对重组胶原的生物物理学研究各种物理学方法可以被被用来表征每种蛋白质即前胶原P/前胶原D并评估在自装配方面纤维形成的效率。这些方法包括远紫外和近紫外圆二色谱(CD)法、近态和动态光散射法、傅里叶变换红外光谱(FTIR)法、电子显微镜法(EM)、原子力显微镜法(AFM)和场流分级法(FFF)。j^^个^^^p;^^^^Z)好4在将使用CD和FTIR来确定前胶原P和前胶原D的二级结构和三级结构。也将在各种条件下测试它们的化学稳定性和热稳定性。关于胶原形成中涉及的蛋白质形状方面的数据由光散射法、AFM和TEM提供。舉多4'^遽卓;^放,^^^"通过CD和FTIR分析贝类足丝胶原的二级结构和三级结构。AFM和EM将提供关于已装配的聚集物和纤维的四级结构及形态学方面的信息。FFF(—种由于FFF是无基质的色谱技术，它可以分离不能被其它经典色谱技术所分离的不同的溶解大分子，尤其是纤维。装配过程的动力学也将用CD和FTIR研究，这可以作为时间的函数通过监测在纤维形成过程中二级及三级结构的变化而进行。此外，静态光散射法、动态光散射法和时滞AFM(time-lapseAFM)允许实时监测蛋白质装配。荧光染料也可以用来研究与蛋白质装配相关的结构变化。某些染料(如3-氯-6-曱氧基-9氨基吖啶和氨基萘磺酸的N-千基衍生物)的荧光特性随蛋白质环境的极性而改变。因此，用这些染料对胶原的标记用来研究胶原的装配过程。对金属在胶原装配和交联中作用的研究GG//4DO/M一夥肩邀Jt农拃在前胶原P和前胶原D的羧基端上均已经观察到氨基酸序列GGH。在乙酸镍[Ni(OAc)2]和氧化剂单过氧邻苯二甲酸镁(MMPP)[18,19]存在的条件下，三肽NH2-Gly-Gly-His-COOH(GGH)介导溶液中结合蛋白的交联。此外，该肽为镍中心提供有利的配位环境，并且认为推测性Ni(III)中间体从邻近的酪氨酸的芳环中吸取一个电子，产生失去质子后的酪氨酰自由基(见图5)。高度活化的自由基中间体与邻近酪氨酸偶联，产生交联的加合物。酪氨酸交联的机理在贝类胶原羧基端上的GGH的可能作用可能是结合Ni(II)以便形成活性催化剂Ni-GGH。该复合物可以緩慢地催化空气氧化酪氨酸和DOPA以形成交联。该催化剂对酪氨酸和/或DOPA的接近将显著增加氧化速率。为检验这个假设，可以使GGH序列遗传性地缺失或修饰，使得它将不会结合镍。交联和装配的速率可以通过上述方法进4亍监测。^夢處必潜减^"^魔^一承4x^在钌(II)三(联吡啶)二离子[Ru(bpy)^+]和电子受体如过硫酸铵(APS)[18,20，21]存在的条件下，可见光辐射诱导接触的蛋白质之间非常高效的交联。这个过程效率极高并且推测其机理与Ni/GGH/MMPP的机理相似。在APS存在的情况下，用[Ru(bpy)^+]对从前胶原P和/或前胶原D的自装配中所形成的纤维进行辐射。这应当导致足丝胶原中酪氨酸/DOPA的交联增加并且产生具有改变的机械性质的纤维，这将基于如上所述的物理化学表征进行评估。其它实施例和序列贝类胶原即前胶原P和前胶原D的DNA序列提供如下。将两种前胶原蛋白(P和D)的cDNA整合到pGEM-T克隆载体中。为了验证起始材料，对两个cDNA完全测序，分别使用T7和SP6作为标准引物，以及使用前胶原(P或D)-T7/1和SP6/1作为内部引物。得到的DNA序列显示与两种前胶原的已经公开版本的差异并且因此进行比较。preColP(SEQIDNO:l)atggttcggttctccctagcatcggtactattactggcagtcaccagcacagctttcgctggaccagttagtgattatggtggtggtggaatcaaagtagtaccctaccacggaggcggsggtggaagcggcggcggtggcggtggaggaggaggatcatcac3tgcacatgcccactgaccaggtggatcttcacatgcatcagctgacggtttaggaggtggcagtgctcatgcacgtggattcggtggattcggcggtattggtgtcggaggcggtsttggcccaggaggaagtgttggcggcggtggtggsccaggcggtaatggaggattcggaccaggttcatctgctsgtgcaggaggttcaagcgcaagcgcaaacgcaggattcggtggaccaggtaccccaggaaactgsgcaccaggccaaccsggscgtccsggssgaccaccaggtcaaccaggtaacccaggacccggccasccagg3ggtcc3ggacgtccagasccaggscagccsggcggcccaggscsscgacgaaacggaaatccaggaaaccccggtacaggatcacgaggaatgccaggaaccccagccgtcggaggacgaggaccaagaggaccaggaaatccagg3gagccaggaaatccsggtgaaggaccacaagg3cc3gccggaggsccagcaccaggtacaccaggaggaactggaccaagagcaccaggggacca3ggaccacaaggagcaggacctaaaggactacaaggatcasatgccgcaggaccac33ggcccacaaggaaagsgagctaggggaccaga3gg3saagccggacaaggaccasc3gg3gcac3aggsccagccgcaggaggggasagsggaggccagggaccacgaccaagaggaccagcaggatcacaaggaccaggtaaaaaaggaccsaatggagaccgagaaaacggagcacgaggaaatagaggatcasgccatggcggaagcggtattggtggtatcgcttcagcatctgcccatgtgcaccattttggttcatcatcccatgcatccgcatcccataatagcagttccagcgccaacgctcattccggtattggcggtattggcccaggaggaagtgtcggaggcggcattggcggtsttggcggtagcggtatcggattcggaccaggattcggaggatccggaagtggcagcgcattcggtggtcctgcacgtgcaaatgcaaatggtggtggagcsggaccaccsggccaacccggactaccaggtaccccaccsggtcgsccaggssaccccggtccaggctcttcaggaagaccaggaggatgaacccccggcaaaccaggaaaccgaggaccaggtcacccaggagcaggaggacaaccagaaccaggaacaccaggtcacccaggaacaggaaccccaggacaaccaggaattccaggcactggaatcatcggattaattggaccasaagcaccaggaggcccaggatctscaggaccacgagcatcaggcggaccaggagacaaaggcggaggaccaatcgga_ccaitcaggscceitcsggtagaggaacaccaggactcgcaggcssacgagaagttggsccccaaggsccatctggacacggtgtcaaaggagcagcaggagatcaagcagctggaccacsaggagaaacaggsccaagtccagccggaccatcaggagsacaaggacaaggagctga3ggaccaagtggaccsgcagcaagtggtgaacgcggagaaccaggagcacgaaaccaaggatcaccaggagcaccaggcagaggaagcaacggatcacccggcagstcaggaggatcaccttgttatcgatcggaggagcgttccgctgggaggaggaccc3gg3ggcccgagtsgg3ggcaggaggattctggagcatcatgtaggaccC3C3tgcacscstctagctccatcacatgtaagccgaggatgaccagsgattcagctaacagcaggttcaattcggaggaaggaggagtatggaccaggatggaccaggaatcatcaggacggaggtsgacgcttttggt3C3CtC3tttttcaagcggaggaccscgtg3caggsccaggcsgcaagtttcatcaggaggcaggaggtgggsggsggagggagtaggagggsgcsggsgtcsgc3tctgatcggtggtgggtctcggagggcggacscgggtcacggaggagsccsagg3sgttgc3g3catgc333tgcctaacgcaaagtcccggagcttggaggtgggtggaccagggatttggtggC3tcta3cgggaagcgcatcggggaagtgct3ttCC3C3ggtcatggagg3c3tgg3ccsagcaccaggtattcccaggaatttgctggtcgcaggtggaagcaggaggc3CC3ggagg3aggagcaggaatttggaggatggaccattcagcatctgcactcagctggttgtgacccataggtccatacgttattcgtatttggtggatggscccggtgttcccattcgccsggaggaggtaggaggtgccsggsggsgggatctagcgggagtactcagcstctsgagagtcattcctC3tggsggtcaaacctggatattaa由于遗传密码的简并性，并非每个石咸基交换都导致氨基酸交换。因此，将DNA序列翻译成氨基酸序列并进行比较。这里，显示了公开的序列(COYNE等，1997)[gi:2386675](变体P38,(COYNE和WAITE，2000))与通过测序得到的前胶原P序列的比对。数据库序列对应于SEQIDNO:9,测序的前胶原P序列是SEQIDNO:3。数据库1MVRFSIASVLI^AVTSTAFAGPVSDYGGGGIKVVPYHGGGGGGGGGGGGG50测序1MVRFSIASVLLLAVTSTAFAGPVSDYGGGGIKVVPYHGGGGGSGGGGGGG50数据库51HGGSFRNGRHGGIGGIGGGSSHAHAHSSASAHVHHF"GPGGSSHASAGSSS100测序51HGGS-------GIGGIGGGSSHAHAHSSASMVHHFGPGGSSHASAGSSS93数据库101HASASHNGLGGGSAHAHSSSSANAHSGGFGGFGGIGGIGGIGPGGSVGGG150测序94HASASHNGLGGGSAHAHSSSSANAHSGGreGFGGIGG工GGIGPGGSVGGG143数据库151IGPGGSVGGGIGGIGGIGGGGGPGGNGGIGFGPGFGGGFGPGSSASGSGS200测序144IGPGGSVGGGIGGIGGIGGGGGPGGNGGIGFGPGFGGGFGPGSSASGSGS193数据库2。1GSAF"GGPGGSSASANAAARANANGGGGFGGPGTPGNSGPPGQPGLPGAPG250测序194GSAFGGPGGSSASANAAARANANGGGGFGGPGTPGNSGPPGQPGLPGAPG243数据库251QPGRPGSTPPGR]LGNPGPPGQPGNPGRPGSSGRPGGSGQPGGPGRPGTPG300测序244QPGRPGSTPPGRPGNPGPPGQPGNPGRPGSSGRPGGSGQPGGPGRPGTPG293数据库301KPGNRGQPGQPGGPGQPGHPGAGGQPGRNGNPGNPGKPGTPGHPGTAGSR350湖[l序294KPGNRGQPGQPGGPGQPGHPGAGGQPGRNGNPGNPGKPGTPGHPGTAGSR343数据库351GMPGTPGTPGQPGIPGTVGGRGPRGPAGIIGLIGPKGNPGEPGNPGAPGG400测序344GMPGTPGTPGQPGIPGTVGGRGPRGPAGIIGLIGPKGNPGEPGNPGAPGG393数据库401PGSTGPQGPQGPAGGPGASGGPGDKGAPGTPGGTGPRGPIGPSGPSGAPG450测序394PGSTGPQGPQGPAGGPGASGGPGDKGAPGTPGGTGPRGPIGPSGPSGAPG443数据库451DQGPQGGRGTPGLAGKPGPKGLQGSNGEVGPQGPSGPAGPQGPQGKNGVK500数据库501GAAGDQGARGPEGKAGPAGPQGETGPKGPTGAQGPAGPAGPSGEQGPGGE550领!l序494GAAGDQGARGPEGKAGPAGPQGETGPKGPTGAQGPAGPAGPSGEQGPGGE543数据库551RGGQGPQGAEGPSGPAGPRGPAGSQGPSGERGEPGAPGKKGPNGDRGNQG600湖!l序544RGGQGPQGAEGPSGPAGPRGPAGSQGPSGERGEPGAPGKKGPNGDRGNQG593数据库601SPGAPGKNGARGNRGSRGSNGSPGRSGSPGSRGKPGPQGPHGPRGLRGSP650测序594SPGAPGKNGARGNRGSRGSNGSPGRSGSPGSRGKPGPQGPHGPRGARGSP643数据库651GQKGPRGDQGAPGV工RIV工DDQRTGPEVAEFPGFGGFGGASM1AASSANA700顶!l序644GQKGPRGDQGAPGVIRIVIDDQRTGPEVAEFPGFGGFGGASANAASSANA693数据库701FAGGPGGSAGAGSSSGANANAGGF-----PFGGAGGGPGAAGGPGGAGGP745测序694FAGGPGGSAGAGSSSGANANAGGFPFGGGPFGGAGGGPGAAGGPGGAGGP743数据库746GGVGGGVGGGPGGVGGGVGGGPGGVGGGPGGAGPGGAGGFGPGGAGGFGG795测序744GGVGGGVGGGPGGVGGGVGGGPGGVGGGPGGAGPGGAGGFGPGGAGGFGG793数据库796FGGGSSAGASSSGSASASNGGPFGVLNVGPGGRIGGGSASASAASRAHM845湖lj序794FGGGSSAGASSSGSASASNGGPFGVLNVGPGGRIGGGSASASAASRAHAH843数据库846AFGGLGGGSASAGSHSSSSSHSFGGHVFHSVTHHGGPSHVSSGGHGGHGG895测序844AFGGLGGGSASAGSHSSSSSHSFGGHVFHSVTHHGGPSHVSSGGHGGHGG893数据库896GPYKPGY902湖lj序894GPYKPGY900COYNE和WAITE已经i正实不同前月交原P变体(P22、P33和P38)存在于其cDNA序列的某些部分区域中(COYNE和WAITE,2000)。如果将变体P22的这些短的已知序列区域与本发明的前胶原P的DNA序列进行比较，获得100%匹配。前胶原D(SEQIDNO:2)atggtctacaaactcctgaccgtgtgtcttgtagcatctcttctagagatttgcttagtaggaggcgggtgccggagcgtggtggcgcc3cgagc3gcatgcsgcsgctcggsggsctccgcsggsgcgagtaccagggaggagatgsaaccaggagagacaagtaggg3ggtg33gccagtaggagggtgaacgaggagggatcagtgaccaagaggtgggtagscgcagacggtaattgasgscctgaaccggtggcaggaccagggaccaggagggcggtgg3ctgaggaggtttc3gg3gc3ggC3gccgcagccagcaagagcccgccgcsgcg3tcscacgcgtgactatcataatggtggttgcscatggaagcacgagca3gcsgc33gscggaggagttcaaacaaggaaggaccagttcaaaggacctagaccaaggc3gg333ggccacaaggaccaaccacaaggacggagsccas3cc3gg3gagagatagaggaaggaasccgtcc33gg3caacagaacagcc3CC3gC3CC3aictcggsggscggaigg3ttssggtggtgga3gg3sacggt3cg3gcsgca3gc3gcstcaagcsgccaacacscgctgcccgg333cgstcagtatggcggcaggagccggcaagagcaccacccaggattcagcaggaggcaggsgcagggcggtccaggcaggacgtcccsgtaggagggsccsaagggatggagaaaaaaccaggagggcgaacaaggcaggaccagccaacagg3tggagcacaagagaggacaacgcaaagggaaggatcccaagcgtggagsacggagtaggaggcaggaggaactaggaggacggaggagcagctcggaggttggagcaggaggcsgc3tc3ggcagccgctagcagccgcacgccgcagctcgccggctatcgcagatacggtagcccatgcatgcacgdgctcccagttggg3tt3ggtgggatttggtgggtcaaccaggcaggaccatggacaaggaccgcg33cc3ggccggaccacacaaagggagagacc3gg3ggccggscc3ctcagsaggaccgagaccaaggaaggagcagcttca-aggaagg3gc3gt3ggaaggsgcaccgccccgtagacagcagcaacacgcagccgcttggtgcaggg3ggttt3ggtaggaggtggcaiggsggeigccagcagcagcgagcaaccgtscgcsgccgccaacagataccc3tgcccstcttggcccsttggtsgcgcaattcggatcaattcggtggaacatgccggttgg3g3tsgssggaccagctaaccggagatcstcc33ggscggaccacaaagttggagcaagcaactggc3gg3ccsgtcccgaggacgaacc3cg3gg33ggsgtt3tcaacctttgac3gc3gg3gc3aggagcaggatggactcggatggtggactcagcaggaggattcsggscttagcaggacat33gtsgcgt3atattaaggaaacggttgcccatgccagcacatgccg3gcgc3gccggcagcagccatt3ggsggstggggcaccagcgaggaccacgctgatggtaggsccaaaggcaaggagcacccasagggacggaccaatggccaggaccaagctgatggcaggccg3ccsgccaggtggtagaaactggccacccttgtcagcaggagcagtttgc3gg3gccaggagtagggtgg3ctcgggaggattaggcsggaggcgggtggaggatggtggsgcagggagcatggagggaagtggaaggacasggagatccatggtg在下文中，显示了发表的序列(QIN等，1997)[gi:2772914]与通过对前胶原D测序所得到的完整序列的比对。将DNA序列翻译成蛋白质序列。应当指出数据库序列是SEQIDNO:8而通过测序所得到的序列是SEQIDNO:4。数据库1MVYKLLTVCLVASI^EICLADYNGNKQYGGRYGNRYGNGLGGGNGGAGAV50测序1MVYKLiljTVCIjVASIjLEICIiADYISIGNKQYGGRYGNRYGNIGLGGGNGGAGAV50数据库51AHAHAHAHASAGANGRARAHARALAHAHAGGGAAHGHPGETVGGSASAAA100湖!l序51AHAHAHAHASAGANGRARAHARALAHAHAGGGAAHGHPGFPVGGSASAAA100数据库101RAAARASAGGLGGFGSAAANAAAAARAGAGFGGFGGLGGFGGLGGVGGPG150测序101RAAARASAGGLGGFGSAAANAAAAARAGAGFGGFGGLGGFGGLGGVGGPG150数据库151QPGGPGGPGGPGGPGGPGMPGGPGGPSGPGTGGPGQPGGPGGPGGPGGPG200测序151G-------------------------------------------------151数据库201GPSMPGGPGGPGGPGMPGGPGGPGGPGGAGGIPGMTGPAGPPGPAGPQGP250测序151--------------------------------------------------151数据库251EGEQGPRGRTPAGTPGPPGNPGEPGQGGAPGAPGAPGHAGKHGTAGAAGK300测序152-----------------------------------PGHAGKHGTAGAAGK166数据库301AGRPGPXGQAGASGSSGQHGASGAPGRPGNPGSTGRPGATGDPGRPGATG350测序167AGRP----------------------------------------------170数据库351TTGRPGPSGAPGNPGAPGMiGAPGPRGSPGFVGLPGPRGSPGEPGNQGPI400测序1"70--------------------------------------------------170数据库401GGPGYPGPRGPQGPDGAMGPQGPCGDRGAPGVPGKQGPVGGQGPAGPRGP450测序171---------------------GPCGDRGAPGVPGKQGPVGGQGPAGPRGP199数据库451RGDEGPVGPKGEPGARGADGKPGDKGPDGETGPQGPAGPKGQVGDQGKPG500须!)序200RGDEGPVGPKGEPGARGADGKPGDKGPDGETGPQGPAGPKGQVGDQGKPG249数据库501AKGETGDQGARGEAGKAGEQGPGG工QGPKGPVGGQGPAGPAGPLGPQGPM550狈ll序250AKGETGDQGARGEAGKAGEQGPGGIQGPKGPVGGQGPAGPAGPLGPQGPM299数据库551GERGPQGPTGSEGPVGAPGPKGSVGDQGAQGDQGATGADGKKGEPGERGQ600须!l序300GERGPQGPTGSEGPVGAPGPKGSVGDQGAQGDQGATGADGKKGEPGERGQ349数据库601QGAAGPVGRPGPRGDRGAKGIQGSRGRPGGMGRRGNRGSQGAVGPRGETG650湖!]序350QGAAGPVGRPGPRGDRGAKGIQGSRGRPGGMGRRGNRGSQGAVGPRGETG399数据库651PDGNQGQRGEQGAPGVITLVIEDLRTAGVESPVETFDAGAGTGGPAPGVG700测序400PDGNQGQRGEQGAPGVITLVIEDLRTAGVESPVETFDAGAGTGGPAPGVG449数据库701AAATAGAFAGAGPGGANAGGNAAAGAGPGVGPGGLGGLGGLGAGGLGGGL750测序450AAATAGAFAGAGPGGANAGGNAAAGAGPGVGPGG!LGGliGGIjGAGGIjGGGlj499数据库751GGGIiGGLiGGAGGLGGGLGGLGGGLGGGLGGIjG——GGAGGAGAGGNGGAG797测序500GGG:LGGLGGAGGLGGGLGGD3GGLGGGIjGGLGGGAGGAGGAGAGGNGGAG549数据库798AGGAGGNGGGSAAARAAAQAAAAAGGNGGAAQAAAQAAASAAANSGLGAG847观J序550AGGAGGNGGGSAAARAAAQAAAAAGGNGGAAQAAAQAAASAAANSGLGAG599数据库848AARAAASAAARATVTGHGSGTAAAAANAAAQAHAATRGQGGSHAHAAAAA897测序600AARAAASAAARATVAGHGSGTAAAAANAAAQAHAATRGQGGSHAHAAAAA649数据库898HAAASSVIHGGDYHGNDAGYHKPGY922测序650HAAASSVIHGGDYHGNDAGYHKPGY674在两个序列中存在显著差异所用的前胶原D序列比已发表的序列短250个氨基酸。胶原结构域中的大部分氨基酸丢失。因此，这里公开的前胶原D基因是前胶原D基因迄今未发表及未知的形式。应当指出截短胶原结构域增加了丝纤蛋白结构域在整个蛋白质中的量，因此，整个蛋白质分子的行为将是不同的。P4H表达构建体在下文中，将在P4H表达质粒后在5Wc//至Xpa/区域中的DNA序列显示为双链。MFa/P4H融合构建体的开头和结尾均印刷出来。所用的限制性位点以下划线标出。SEQIDNO:71ccgcggtcattacagttcatctttcacagctttctgatcatcgtcttcctccatgtctgg1ggcgccagtaatgtcaagtagaaagtgtcgaaagactagtagcagaaggaggtacagacc61ctcctctgcttcttccsggtcctcgagatcgtc3tcstcccctgccccstcctggccacc61agaaggtccagg3gctct3gcsgt3gt3ggggacggggtaggaccggtgg121cgagaggtccttaaagaattttggtaggtcgcacgcaaggggcaacattagttactggca121gctctcc3gg33tttCtt33a3CC3tccsgcgtgcgttccccgttgt33tcaatgaccgt181cctgtcggcactggcaggaaag33cttg3gtgtggggssgctgtgcsctttgacggcctc181ggscagccgtgsccgtcctttcttgaactc3C3CCCCttCgacacgtgaaactgccggag241cscctcgttggcagtcgagtccatcttggcgatgacgatgttctcstggtccttgtacgt241gtggagcaaccgtcsgctcaggtagaaccgctactgctacaagagtaccaggaacatgca301ctctcccsgttt3tCCC333tgggagccaactgtttgc3gtg3CC3C3CCatggggcata301gagagggtcaaatagggtttaccctcggttactggtgtggtaccccgtat361g33CtCC3C3sagacgttttttttCtC3tCaasagccacg七CttC333gttCttCCC33C361cttgaggtgtttctgcasasaaaagagtagttttcggtgcagaagtttcaagaagggttg421asgcaccttgacsggctgcttgtcccagtcctccggcagctcctggctcatcaggtgggg421ttcgtggaactgtccgacgaacagggtcaggaggccgtcgagtccacccc481cttgattttgccctccaggaagcggtggcagasctctgtg3tcctctctgccgtcagctc481gggsggtccttcgccsccgtcttgsgac3ctaggagagacggcagtcgag541ctccgattcgggcttgtacttggtcatctcctcctccagggtgatgaggcgcacggccgg541gaggctaagcccgaacatgaaccagtagaggaggaggtcccactactccgcgtgccggcc601gcactcttccttcttcaggccaaagaactcgaggatgcgctggttgtcggtgtggtcgct601cgtgagaaggaagaagtccggtttcttgagctcctacgcgaccaacagccacsccagcga661gtcgatgaagatgaacaggatcttgcccttgaagctctcggctgctgttttgaagttgct661cagctacttctacttgtcctagaacgggaacttcgagagccgacgacaaaacttcaacga721cagtttgccgtcatagtcagacacactcttgggcaagaacagcaggatgtgagtcttgat721gtcaaacggcagtatcagtctgtgtgagaacccgttcttgtcgtcctacactcagaacta781ttcacctccaaaaatcttcggggctgtctgctcggtgaac781aagtggaggtttttagaagccccgacagacgagccacttg841gttgtgtttgataaagtccagcaggttctccttggtgacc841caacacaaactatttcaggtcgtccaagaggaaccactggtcgatgacaaggggcagctgagctactgttccccgtcgactccccttcaaagttgttccgaggggsagtttcaacaaggc901gccttcatcaaacttcttaaagaggacaaccccatctttgtcgagctggtatttggagaa901cggaagtagtttgaagsatttctcctgttggggtagaaacagctcgaccataaacctctt961cacgtcactgttggaagtgatcccaaatggtatgtcatcgatggcctctgctgcctgcaa961gtgcagtgacaaccttcactagggtttaccatacagtagctaccggagacgacggacgtt1021aaactgcttggcagagtccgactccacgtccttgaagaagccgatgacagccacctcgct1021tttgacgaaccgtctcaggctgaggtgcaggaacttcttcggctactgtcggtggagcga1081ggactccscc1081cctgaggtgg1141gcgcttcttc1141cgcgaagaagaaggactctgttcctgagacagccagttcatcggtcaagtcagctgcgccgtcgacgcggApalcgatgtcatcgctacagtaggtcaggcagggtggtggcsgccgggcccgtcagtccgtcccaecaccgtcggcccgggca3gcctctctgccsgctgtst3ttccttgggteggagagaeggtcgacatataaggaaccc1201ggaagccgtgtctccattcctgaagaacttgatggtgggatagccgcgcacgccgtactg1201ccttcggcacagaggtaaggacttcttgaactaccaccctateggegegtgeggcatgae1261ctgggccaggtcagactcctccgtggcgtccaccttggccaacctgatctcggaaccttc1261gacccggtccagtctgaggaggcaccgcaggtggaaccggttggactagagccttggaag1321tgccttcagcttcccagcggctttggcatactcaggggccagagecttgeagtggccaca1321aeggaagtegaagggtcgeegaaacegtatgagtccccggteteggaacgtcaccggtgt1381ggttccccgtatcttgaggtggtegtccatgaacacccggeggtcgeggaggcgcttcaa1381ccaaggggcatagaactccaccagcaggtacttgtgggccgccagcgcctccgcgaagtt1441gcttttccgcagcaccaggacgtggtcctcctcctccggagegtcagctaatgcggagga1441egaaaaggegtcgtggtcctgcaccaggaggaggaggectcgcagtcgattacgcctcctBspEI1501tgctgcgaataaaactgcagtaaaaattgaaggaaatctcatggatccggggttttttct1501acgacgcttattttgacgtcatttttaacttcctttagagtacctaggccccaaaaaagaStartBamHI1561ecttgaegttaaagtatagaggtatattaacaattttttgttgatacttttattacattt1561ggaactgcaatttcatatctccatataattgttaaaaaacaactatgaaaataatgtaaa1621gastaagaagtaatacaaaccgaaaatgttgaaagtattsgttaaagtggttstgcagtt1621cttattcttcattatgtttggcttttacaactttcataatcaatttcaccaatacgtcaa1681tttgcatttatatatctgttaatagatcaa1681sascgtaaatatatagacsattatctagtt1741gaaataaggctaaaaaactaatcgcattat1741ctttattccgattttttgattagcgtaata1801tttgaaggtttgtggggccaggttactgcc1801aaacttccaaacaccccggtccaatgacgg1861gtattgtagaatctttattgttcggagcag1861c3七33C3tctt3g333t33C3sgcctcgtc19213cgcgaccggtgaagacgaggacgcacgga1921tgcgctggccacttctgctcctgcgtgcct1981gctcggcggcttctaatccgtacttcaata1981cgagccgccgaagattaggcatgaagttat2041agttccaaagagaaggtttttttaggctaa2041tcaaggtttctcttccaaaaasatccgatt2101tataagtsagattagatatggatatgtata2101StattC3ttct33tctat3CCt3t3C3t3t2161atatgattattaaacttctttgcgtccatc2161tatactaataatttgaagaaacgcaggtag2221saggaattcgatatcaagcttatcgatacc2221ttccttaagctatagttcgaatagctatggEcoR工SailStartasatcstcgcttcgctgstt3attscccc3tttagtagcgaagcgactaattaatggggtcatcctatggttgttaatttgattcgttcagtaggataccaacaattaaactaagcaagt33tttttCCtCttC3t￡l3CC3t3333gct3ttaaaaaggagaagtattggtattttcgattgcggcgcgsggcscstctgcgtttc3gg3acgccgcgctccgtgtagacgcaaagtcctggagagtcttccttcggagggctgtcaccccctctcsgsaggaagcctcccgacagtgggtagcaatgagcagttaagcgtattactgaaatcgttactcgtcaattcgcataatgacttgataatggggctctttacatttccacaacactattaccccgagaaatgtaaaggtgttgttggatatgtatatggtggtaatgccatgtaacctatacatataccaccattacggtacatgt33gwtttttgsswttcgtttttttttcsttctt33aascttttasggtcgacatgagatttccttcaatttttactcagctgtactctaaaggaagttaaaaatga2281gcagttttattcgcagcatcctccgcgctagctcatccaggcttttttacttcaattggt2281cgtcaaaataagcgtcgtsggaggcgcgstcgagtaggtccgaaaasatgaagttaaccaNhel2341cagatgactgatttgatccatactgagaaa2341gtctactgactaaactaggtatgactcttt2401aaggcagaagaggscaagttagascaaats2401ttccgtcttctcctgttcaatcttgtttat2461actagtacagcgacaaaagatccagaagga2461tgatcatgtcgctgttttctaggtcttcct2521ttaatgaaacgtctgaatactgagtggagt2521aattactttgcagacttatgactcacctca2581tC3g3tggCttt3tCtct33CCt33CC3tt2581agtctaccgaaatagagattggattggtaagatctggtgacttctctgaaagattatattctagaccactgaagagsctttctaatataaaaaaaatgggcagaga3gttagatcggctattttttacccgtctcttcaatctagccgattttgttgggcatccagtaaatgcattcaaaaaacaacccgtaggtcatttacgtaagtttgagttggagaatctggtccttaaggatatgCtC33CCtCt七3g3CC3gg33ttCCt3t3Ccagsgaccagtactttctaatgatgaagatgtctctggtcatg33ag3ttactacttct32641caggttggggcagccaaagctctgttacgt2641gtccasccccgtcggtttcgagacaatgca2701accatctcaaagggtaatcttccaggagtg2701tggtagagtttcccattagaaggtcctcac2761tgctttgagttgggcaaagtggcctataca27613cgaaactcascccgtttcaccggatatgtctcc3gg3t3cct3C33tttggst3C3g3tgaggtcctatggatgttaaacctatgtctasaacacaaatcttttctaacggctgaggactttgtgtttagaaaagattgccgactcctggaagcagattattaccatacggaactgtggcttcgtctaataatggtatgccttgacacc<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>MRFPSIFTAVLFAASSALAHPGFFTSIGQMWAEKLDRLTSTATKDPEGFVGHPVNAFKLMPVLSNDEDGVGAAKAL^RL^DTYNLDTDTIDYYHTELWMEQ虹RQLDEGEIST工DKVSVLQRANGNLKYFEYIMAKEKDVNKSASDDQSDKMTPRRGKKLFCRYHDGNRNPKFILAPAKGRLSRATVHDPETGKLTTAQYRVSKSAWLSGNYGVGGQYEPHFDFARKDEPDAFKELGTGNKGTAVFWYNLFASGEGDYSTRHAACPVLVGMFa-P4HB(SEQIDNO:6)MRFPSIFTAVLFAASSALADAPEEEDHVLVLAPEYAKAAGKLKAEGSEIRLAKVDATEESGREADDIV丽LKKRTGPAATTLPDGAAAESIDDIPFGITSNSDVFSKYQLDKDGVVLFKKEFTEQTAPKIFGGEIKTHILLFLPKSVSDYQRILEFFGLKKEECPAVRLITLEEEMTKYKELPEDWDK(2PVKVLVGKNFEDVAFDEKKNVNIVIAKMDSTANEVEAVKVHSFPTLKFFPAGDDDDLEDLEEAEEPDMEEDDDQKAVKDELMFa的序列(SEQIDNO:10)MRFPSIFTAVLFAASSALATDLIHTEKDLVTSLKDYIKAEEDKLEG工KKKRLNTEWSELE肌VLKDMSDGFISNIjTIQRSKGNLPGVKHKSFLTAEDCFELGKVAYTEADYLSYAVYQQGDLDKALLLTKKLLELDPEHQKTTPKKKGVAVDYLPERQKYEMLCRGEGIEDEWDKPRIIRFHDIISDAEIEIVKDLAKPYENPVVSRINMRIQDLTGLDVSTAEELQVARIATWLFYMSDVSAGGATVFPEVGASVWPKNKWVSNKWMERGQEFRRPCTLSELELRKSNFAEALAAHKYLLVEFYAPWCGHCKADLAQQYGVRGYPTIKETRNGDTASPKEYTALVESSEVAVTGETKDVESDSA叨FLGAAEAFDEGR,FEGEVTKENliDFIKH即LPLVIDGKLSNFKTAAESFKGKILFIFIDSDHTDNPESEELTAERITEFCHRFLEGKIKPHLMSQFVEFYAPWCGHCKGLAPIWDKLGETYKDHESADRTV工DYNGERTLDGFKKFLESGGQDGA1.Yonge，M.(1962).Onthesignificanceofthebyssusinthebivalviaanditseffectsinevolution(关于足丝在双壳纲(bivalvia)的意义及其在演化中的作用).J.Mar.Biol.Ass.U.K.化113-125.2.Qin,X,X.,Coyne,K丄和Waite,J,H.(1997).Toughtendons.MusselbyssusJournalofBiologicalChemistryOT，32623-32627.3.Waite,J.H.(1992).ResultsProbl.CellDiffer./9,27.4.Qin，X.画X.和Waite,J.H.(1995).ExoticCollagenGradientsintheByssusofhteMusselM"z7us(贝类贻贝(M;^71^j^w/^)足丝中的奇异胶原梯度).TheJournalofExperimentalBiology795,633-644.5.Vaccaro，E.和Waite，J.H.(2001).YieldandPost-YieldBehaviorofMusselByssalThread:ASelf-HealingBiomolecularMaterial(贝类足丝线的屈月良4亍为和屈月良后4亍为自愈性生物分子材料).Biomacromolecules2,906-911.6.Coyne，K丄,Qin,X.-X.和Waite,J.H.(1997).Extensiblecollageninmusselbyssus:anaturalblockcopolymer(贝类足丝中的延展性胶原一种天然嵌段共聚物).Science(Washington，D.C.)277,1830-1832.7.Waite,J.H.,Qin,X.-X.和Coyne,K丄(1998).Thepeculiarcollagensofmusselbyssus(贝类足丝的特殊胶原).Biology〃,93-106.8.Coombs,T.L.和Keller,P.J.(1981).聊"/附byssalthreadsasanenvironmentalmarkerformetalions(贻贝(^"7w力足丝线作为金属离子的环境标记).AquatToxicol.79S/，291-300.9.Swann，C.P.,Adewole，T.和Waite,J.H.(1998).Preferentialmanganeseaccumulationindreissenidbyssalthreads(饰贝足丝线中的偏嗜性镁积累).ComparativeBiochemistryandPhysiology,PartB:Biochemistry&MolecularBiology755-759.10.Taylor,S.W.，Chase，D.B.,Emptage,M.H.，Nelson,M丄和Waite,J.H.(1996).FerricIonComplexesofaDOPA-ContainingAdhesiveProteinfromMytilusedulis(来自贻贝(Mytilusedulis)的含DOPA的黏蛋白的铁离子络合物).InorganicChemistry35，7572-7577.11.Sun,C.，Vaccaro，E.和Waite，J.H.(2001).Oxidativestressandthemechanicalpropertiesofnaturallyoccurringchimericcollagen-containingfibers(氧化应激与含有天然存在性嵌合胶原的纤维的机械特性).BiophysicalJournal3590-3595.12.Myllyharju，J.,Nokelainen，M.,Vuorela,A.和Kivirikko,K丄(2000).ExpressionofrecombinanthumanI-I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利要求中的一项或多项所述的酵母细胞，其中，在所述重组蛋白中相应氨基酸序列的信号序列被酵母特异性信号序列、优选酿酒酵母交配因子al(MFa)所替代。14.根据前述权利要求中的一项或多项所述的酵母细胞，其中P4H是人或贝类的P4H。15.—种试剂盒或共表达系统，所述试剂盒或共表达系统用于生产重组胶原蛋白质，其包含下列组分a)如在权利要求1-14中的一项或多项所定义的第一表达载体；和b)如在权利要求1-14中的一项或多项所定义的第二表达载体。16.—种产生重组胶原样蛋白质、优选贝类足丝蛋白的方法，其包括以下步骤a)提供酵母细胞；b)用如在权利要求1-14中的一项或多项所定义的第一和第二表达载体或用权利要求15的共表达系统转化所述酵母细胞；c)从所述的酵母细胞中在适宜的条件下表达重组胶原样蛋白质，优选表达重组贝类足丝蛋白；以及d)回收所述的重组蛋白。17.—种用于从重组贝类足丝蛋白中生产线的方法，其包括以下步骤a)提供如在权利要求16中所生产的重组蛋白，和b)通过合适的方法将所述蛋白质(电)纺丝或^t塑成为线。18.通过权利要求16的方法可得到的蛋白质或通过权利要求17的方法可得到的线。19.权利要求18所述的蛋白质/线在生物技术和/或医药领域中的用途。20.权利要求18所述的蛋白质/线用于制造伤口闭合或覆盖系统的用途。21.根据权利要求20所述的用途，其中所述的用途用于制造缝合材料。22.根据权利要求21所述的用途，其中所述缝合材料用于神经外科或眼外科。23.权利要求18所述的蛋白质/线用于制造替代材料，优选是人工软骨或肌腱材料的用途。24.可使用权利要求18的蛋白质/线得到的伤口闭合或覆盖系统、缝合材料、替代材料，优选人工软骨或肌腱材料。25.含有权利要求18的蛋白质/线的化妆品、药物输送载体、面料、织物、纸产品、皮革制品、汽车零件或飞机零件。全文摘要本发明涉及用于生产重组胶原样蛋白质的酵母细胞。本发明还涉及用于生产该蛋白质的试剂盒或共表达系统，以及生产该重组蛋白及由其所制备的线的方法。此外，本发明涉及通过这些方法可得到的蛋白质或线以及它们在技术和医学的各个领域中的用途。文档编号C07K14/435GK101316862SQ200680042838公开日2008年12月3日申请日期2006年11月17日优先权日2005年11月17日发明者托马斯·沙伊贝尔申请人:慕尼黑工业大学