专利名称：一种载脂蛋白－j的制备方法
专利说明一种载脂蛋白-J的制备方法 本发明涉及生物医药工程技术领域，有关采用基因重组的制备方法，具体地说是一种载脂蛋白-J的制备方法。载脂蛋白-J(apolipoprotein-J)是一种硫基化的糖蛋白异二聚体，含有两条40KD的链，通过一种独特的5个二硫键相连，其多肽序列如
图1所示。编码载脂蛋白-J的mRNA，从小鼠第14号染色体的单拷贝基因转录而来。有几个功能区域组成，如两亲螺旋，肝磷脂结合功能区，脂肪结合功能区等。这个蛋白最早是从公羊的睾丸网液体中分离，因为能够促进Sertoli细胞的凝集，支持精子的成熟和发展，所以命名为凝集因子(NCBI/Genbank，_NM.Sub.-203339，001831)。此后，不同物种的这一蛋白质被不同的研究机构分离和克隆。产生了很多的名字包括睾酮抑制前列腺信使2(TRPM-2)，硫化糖蛋白2(SGP-2)，载脂蛋白-J，SP-40，补体细胞溶解抑制剂(CTI)，二聚酸性糖蛋白(DAG)，gp80，NA1/NA2，糖蛋白III等等。很多的细胞和组织可以持续的表达低水平载脂蛋白-J。因此载脂蛋白-J存在于几乎所有的体液中，尤其是在组织间隙或上皮细胞的表面。在血液中载脂蛋白-J是高密度脂蛋白的一个蛋白成份，与载脂蛋白AI和对氧磷酶(paraoxonase，PON1，NM-000446)的功能相关。后者是一种重要的抗氧化的酶。载脂蛋白-J是一种高度诱导型蛋白，多种应激刺激因子或疾病可诱导载脂蛋白-J表达。例如在动脉硬化病人的病灶中的浓度很高。通常载脂蛋白-J含有一个长度为21个氨基酸的疏水或亲脂多肽基因。据报道，载脂蛋白-J的功能可能包括调控细胞凋亡，补体防御，脂肪再生，膜保护，维持细胞与细胞，细胞与基层组织之间的接触。可以有效地与脂质包括胆固醇、氧化固醇结合，促进胆固醇和氧化固醇从泡沫样细胞流出。这个蛋白还可以抑制补体介导的细胞死亡，促进细胞凝聚和黏附。最近，还发现载脂蛋白-J还是一种抗凋亡蛋白。据报道，在由于热休克和氧化疲劳引起的细胞中能诱导载脂蛋白-J的表达，抵抗细胞凋亡。在凋亡的组织中出现高水平的载脂蛋白-J。但是，经过对产生载脂蛋白-J的细胞的仔细分析，发现载脂蛋白-J的表达仅限于死细胞附近的活细胞，提示这个蛋白可能起到生存因子的作用，保护邻近的细胞。近来的一些研究也显示载脂蛋白-J是一种抗凋亡蛋白。然而，我们在利用载脂蛋白-J的生物活性功能时，必须寻找更好的方法提高它表达的合成存活率。
载脂蛋白-J指的是最早从公羊睾丸中分离的载脂蛋白J(NM-203339，NM-001831)，从其他哺乳动物中也分离到的该蛋白，有不同的命名。来自于不同动物的载脂蛋白-J的序列有不同的NCBI号码(NM013492，NM-053021，NM-012679)。产生的载脂蛋白-J可以诱导或引起编码乙醛脱氢酶、载脂蛋白-AI或对氧磷酶的基因的表达，这些是具有解毒能力的蛋白或酶。天然的或重组的全长或载脂蛋白-J片段在一种或多种细胞内发生，尤其是心肌细胞或血管细胞。由于载脂蛋白-J诱导产生的乙醛脱氢酶具有解毒的作用，可以清除氧化脂蛋白和氧化固醇引起的毒性，从而具有抗动脉硬化的作用。乙醛脱氢酶是由一些哺乳动物细胞如心肌细胞、血管细胞、未分化的干细胞中的核酸编码的。乙醛脱氢酶是一种异构体，重组的载脂蛋白-J表达发生在一种或多种哺乳动物组织中，(即心脏、血管、肝脏、肾脏、脑)，在一定程度上可以保护细胞免受氧化疲劳、缺血的损伤。本发明的目的在于提供一种产生或合成全长或部分载脂蛋白-J的方法。
为实现上述目的发明一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于以下工艺步骤a、采用脱氧核糖核酸DNA重组技术制备重组人或哺乳动物的载脂蛋白-J全长或部分片段并用亲和层析法纯化；b、采用逆转录-多聚脱氧核糖核酸合成酶链反应RT-PCR技术从RNA克隆并扩增出载脂蛋白-J的全长或部分片段的互补脱氧核糖核酸cDNA；c、利用DNA重组技术将载脂蛋白-J cDNA全长或部分片段插入到一个质粒构成原核(如pET系列)或真核细胞(如pKS系列)表达载体，载脂蛋白-J cDNA连接或不连接于一个标签多肽基因；d、将此载脂蛋白-J表达质粒载体转染大肠杆菌，在抗菌素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增载脂蛋白-J表达质粒，根据质粒所含抗菌素阻抗基因，抗菌素可选为氨苄青霉素或/和氯霉素，在培养基中诱导重组载脂蛋白-J的合成；e、收集转染的菌体，离心沉淀，裂解释放载脂蛋白-J，用制备层析方法分离载脂蛋白-J；f、用Ni-NTA树脂从细菌中抽提含有连续6个组氨酸尾6Histag的具有天然结构的可溶性重组载脂蛋白-J；g、用亲和层析方法纯化，鉴定重组载脂蛋白-J；对纯化载脂蛋白-J生物活性鉴定及检测。
所述的利用DNA重组技术将载脂蛋白-J cDNA全长或部分片段插入到一个质粒的工艺步骤为a.先将载脂蛋白-J cDNA构建载体；b.将该载体转染哺乳动物细胞或人胚肾293细胞；c.在载脂蛋白-J基因前插入巨细胞病毒CMV启动子，具有四环素敏感元件，被转染的细胞只有在四环素存在的情况下才表达载脂蛋白-J。这个载体转染干细胞，因为载体是新霉素抗性的，被转染的细胞用G418进行筛选；d.转染的人胚肾293细胞在DMEM培养基中培养，生成分泌大量载脂蛋白-J，此培养基含有四环素和血清。
免疫亲和层析方法纯化重组和天然载脂蛋白-J，由以下工艺步骤组成a、人工合成载脂蛋白-J多肽片段或全长并以此片段作为原去免疫家兔以制备抗载脂蛋白-J抗体；b、用层析法从免疫血清中提取载脂蛋白-J抗体；c、将上述载脂蛋白-J的特异性抗体共价结合到层析柱中的亲和凝胶上；d、用此亲和层析凝胶柱从人类或哺乳动物血浆/清或其他体液如羊水或载脂蛋白-J cDNA转染细胞的条件培养基提取载脂蛋白-J；e、用醋酸缓冲液洗出结合的载脂蛋白-J；f、用聚丙烯胺凝胶电泳和免疫印迹法检测鉴定载脂蛋白-J，10％含SDS的聚丙烯胺凝胶上，并用银试剂染色，随后，蛋白电泳带转印迹于PDVF纤维膜上，然后用抗载脂蛋白-J抗体免疫染色鉴定重组或天然载脂蛋白-J。
所述的抗载脂蛋白-J抗体亲和凝胶过滤法制备过程a.抗载脂蛋白-J抗体共价连接于葡聚糖其他多聚凝胶；b.凝胶装层析柱；c.含载脂蛋白-J血清或其他液体过柱；d.用磷酸盐水洗去未结合蛋白；e.从柱上洗脱载脂蛋白-J，然后在碳酸氢铵缓冲液中透析，并用Amicom滤膜超滤法将载脂蛋白-J蛋白液浓缩；f.超滤浓缩制备载脂蛋白-J溶液；g.制备冷冻干燥载脂蛋白-J粉剂。
制备载脂蛋白-J表达菌体，包括在Luria Broth培养基下的表达菌体培养，离心收集菌体细胞，接着将收集的细胞重新混悬溶解于含有1％Triton X-100三硝基甲苯，500mM氯化钠，及10mM Tris-HCl，pH6.0，盐酸缓冲液中。
表达菌体进行处理时细胞被超声裂解，于Sarcosgl缓冲液10mMTris-Hcl，pH8.0，150mM Nacl，1mM MgCl2，20mM依咪达唑imidagole，5mMβ-巯基乙醇，以及多种蛋白质抑制剂，在13000g离心后，5ml体积的上清液装置与Ni-NTA柱上，此柱用洗涤缓冲液10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM Nacl，0.1％Triton X-100 20mM依咪达唑，1mM MgCl2，5mM β-巯基乙醇平衡。
从载脂蛋白-J基因表达菌体或哺乳细胞抽提纯化载脂蛋白-J，用制备型SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳，用考马斯兰染色后可见到一个75kDa道尔顿的带与此融合蛋白相一致。
通过基因重组将载脂蛋白-J连接一个标签多肽.这样的多肽可以由连续6组氨酸构成。
鉴定及检测载脂蛋白-J生物活性和应用所述的载脂蛋白-J全长或部分片段于抑制哺乳动物细胞凋亡、促进组织细胞的功能恢复，抑制炎症反应及治疗或预防哺乳动物动脉硬化或其并发症包括但不局限于心衰。
a.所述制备含有纯化重组或天然载脂蛋白-J水溶液，经由肌肉，静脉或其他的路径应用于健康或不健康哺乳动物体内；抑制哺乳动物细胞凋亡、促进组织细胞的功能恢复，抑制炎症反应；b.所述制备含有纯化重组或天然载脂蛋白-J水溶液，经皮表面或皮下应用于抑制哺乳动物细胞凋亡、促进组织细胞的功能恢复，抑制炎症反应；c.所述制备含有纯化重组或天然载脂蛋白-J的哺乳动物干细胞悬液，经由肌肉，静脉或其他的路径应用于健康或不健康哺乳动物体内，促进组织修复和再生；d.所述制备抗载脂蛋白-J抗体应用于分析测试体内或体外重组或天然载脂蛋白-J。图1为载脂蛋白-J的分子结构示意图。
图2为真核细胞表达载体。
图3为原核细胞表达载体。
图4为Ni-NTA柱的载脂蛋白-J聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
图5为重组人类载脂蛋白-J的质谱分光光度纯化分析。例一本实施例表达了一种天然状态的载脂蛋白-J(NM 0134921)，用载脂蛋白-J抗体亲和柱从血浆中分离。同时用人或小鼠的载脂蛋白-JcDNA，连接标签多肽基因Histag，插入到CMV的启动子。图2是带Histag的载脂蛋白-J的cDNA的pKS56示意图。将CMV启动子-载脂蛋白-JcDNA-HisTag插入到pGlow-TOPO质粒就构建了载脂蛋白-J表达质粒pKS。启动子含有抗四环素的功能区。同时含有抗zeocin的基因，使用zeocin可以进行稳定的转染。被转染的人胚肾293细胞产生的载脂蛋白-J用Histag亲和柱提纯，(HisTag removing kit)。重组的载脂蛋白-J的纯度用SDS-PAGE鉴定(图3)。
例二本实施例表达了一种重组载脂蛋白-J的制备。
一、处理干细胞培养基。首先使用了一种体外鉴定载脂蛋白-J保护干细胞的功能的方法。在干细胞培养基中加入炎性细胞因子或T细胞致敏的有丝分裂原，再加入不同浓度的载脂蛋白-J。培养2-4天后，用流式细胞、荧光显微镜、同位素标记的多种方法观察。用牛血清白蛋白做对照。
二、凋亡细胞的检测。确定是否凋亡需要形态学和生物化学的结合。凋亡用以下六种方法鉴定1、光学显微镜2、荧光共聚焦3、3`端原位标记(TUNEL技术)4、电镜5、DNA凝胶电泳6、流式细胞仪以上各种方法详细介绍1、光学显微镜作为常规的方法观察血管细胞的形态学变化。2、荧光共聚焦扫描或非共聚焦显微镜观察经过免疫荧光标记后细胞的骨架以及核酸的变化。紫外线激发DAPI或Hoechst染料可以观察核酸的形态变化3、TUNEL技术，原位末端标记法。细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick endlabeling，TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。4、电子显微镜，观察细胞凋亡过程中细胞超微结构的变化。5、DNA凝胶电泳，可以确定细胞的死亡是否有凋亡引起，核小体间DNA断裂从生化学上正式凋亡的发生。DNA用常规的酚/氯仿抽提，用2％的凝胶进行电泳。6、流式细胞检测用Beckman-Coulter的仪器。在本研究中，细胞的增殖和凋亡用流式细胞仪分析。细胞用抗caspase抗体或抗-anexin V抗体包被，并用propidium iodide进行核酸复染色。
三、载脂蛋白-J cDNA转染。先将载脂蛋白-J cDNA跨膜区切除，构建载体。将该载体转染人胚肾293细胞，293细胞可以在细胞内生成大量载脂蛋白-J，但不是分泌的形式。在载脂蛋白-J基因前插入巨细胞病毒(CMV)启动子，具有四环素敏感元件，被转染的细胞只有在四环素存在的情况下才表达载脂蛋白-J。这个载体转染干细胞，因为载体是新霉素抗性的，被转染的细胞用G418进行筛选。
四、流式细胞仪检测和免疫印迹。为了进一步确定载脂蛋白-J的表达，干细胞在用四环素处理后，用流式细胞仪测定凋亡的同时对载脂蛋白-J进行定量。干细胞用FITC或PE标记的抗载脂蛋白-J抗体标记后用流式细胞仪测定。在一些实验中，同时将细胞用抗caspase，Fas(CD95)抗体标记。免疫印迹的方法抽提细胞的总蛋白，SDS-PAGE电泳，每泳道30μg蛋白，电泳后将蛋白电转移到PVDF膜，与抗载脂蛋白-J抗体反应，用化学发光试剂盒获得反应结果。
五、CD95，CD95配体的表达和活化。转染了载脂蛋白-J的细胞是否有CD95或Fas的升高表达采用了流式细胞仪和免疫印迹的方法。载脂蛋白-J过度表达的干细胞的凋亡也用以上各种方法进行了鉴定，包括原位DNA标记，DNA凝胶电泳，形态学测量。而且caspase的活化和线粒体功能也用以下的方法进行了测定。
六、线粒体跨膜电位的降低。线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体崩溃，则细胞凋亡不可逆转。
线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
方法将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM)，JC-1(1mM)，TMRM(100nM)，37℃平衡30min，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。
七、细胞色素-C的释放。细胞色素-C从线粒体释放是很多细胞发生凋亡的一个重要步骤。通过一种受体蛋白，细胞色素-C可以活化caspase-9和一种DNA酶，导致细胞的凋亡。细胞用氧化固醇刺激后，收集细胞裂解液进行免疫印迹试验。洋地黄皂苷可以穿过细胞膜，但可以保持线粒体膜的完整，当洋地黄皂苷穿过细胞后，进行离心，收集上清，用抗-细胞色素-C抗体进行免疫组化试验。
八、在mRNA和蛋白水平检测载脂蛋白-J的表达。两种方法测定mRNA水平，包括实时逆转录PCR，荧光定量PCR及RNA酶保护试验。用Promega试剂盒从培养的细胞或组织中抽提总RNA。用western-blot的方法测定载脂蛋白-J的水平。
例三为了使本发明具体化，这里描述一种抑制哺乳动物细胞凋亡的方法。所谓“抑制”除了常规的意义外还具有阻止和预防的意思。这个方法包括用一定量的载脂蛋白-J，与细胞和细胞的微环境接触(微环境在体外实验中指的是细胞培养基，在体内指的是邻近细胞)，可有效的抑制凋亡或程序性死亡。细胞分泌的载脂蛋白-J在一定范围内的组织中可以有效地阻止细胞凋亡。具体实施的时候，编码载脂蛋白-J全长或活性片段的核酸表达的方法包括将基因修饰过的干细胞移植到相应的组织中，这里的基因修饰就是指将编码载脂蛋白-J全长或活性片段的核酸整合到干细胞的基因组中，这段基因可以与干细胞的启动子连接，在细胞表达并产生足够的载脂蛋白-J达到抑制该组织中该细胞的凋亡。生物学活性部分指的是全长的载脂蛋白-J分子或者该分子的一部分片段，在一定程度上具有与全长分子一样的抑制凋亡的功能。在一些实施的方法中使用一些载体如质粒、噬菌体、病毒(腺病毒或腺病毒相关病毒)将DNA转染至更多的细胞。
首先在体外运用重组DNA技术，体外合成载脂蛋白-J，然后将干细胞用编码载脂蛋白-J的基因进行生物改造，确定干细胞中载脂蛋白-J的表达。载脂蛋白-J相关蛋白或调控蛋白也进行测定。最后将改造好的干细胞和/或载脂蛋白-J产物送到已有理化损伤或有损伤危险的组织中。在一些情况中，心血管组织已经受到了动脉硬化和心衰的影响。另一些情况中，心血管组织还没有受到动脉硬化和心衰的影响。有些情况中，细胞为一种或多种干细胞，血管干细胞，心肌细胞和/或血管细胞。有些情况中，干细胞是自身的或同种移植的干细胞(骨髓来源的)。较佳的方案是干细胞在移植前未接受特征性指令，并能够分化成心肌或血管细胞(指较幼稚的祖细胞)。
在上述抑制哺乳动物细胞凋亡的方法的实施中，引起编码载脂蛋白-J的核酸有一定量表达的步骤包括在组织中移植基因修饰的哺乳动物干细胞。基因修饰是指将编码载脂蛋白-J全长或活性片段的核酸整合到干细胞的基因组中，这段基因可以与干细胞的启动子连接并在细胞中表达，产生足够的载脂蛋白-J达到抑制该组织中该细胞的凋亡。
在这一实施中，提供了载脂蛋白-J介导引起载脂蛋白-J相关蛋白或载脂蛋白-J调控蛋白或酶升高和活化，不单单是乙醛脱氢酶。有一些情况中，凋亡是由氧化固醇或脂蛋白，细胞因子，Fas配基中的至少一个因素引起的。
实施例四提出了一种治疗和预防哺乳动物动脉硬化或并发症的方法。在这里“预防”动脉硬化还有阻止或降低动脉硬化危险性的意思，包含动脉硬化损伤的心肌或血管组织，或者是具有发生动脉硬化的高度危险性的心血管组织。在这些组织中载脂蛋白-J与细胞的接触可以有效的预防动脉硬化形成，降低动脉硬化形成的危险性。在一些措施中，细胞与载脂蛋白-J的接触可以有效的阻止和预防细胞的凋亡，从而阻止或降低动脉硬化的形成及硬化斑块破裂的危险性。在一些措施中，将基因修饰过的干细胞移植到相应的组织中，这里的基因修饰就是指将编码载脂蛋白-J全长或活性片段的核酸整合到干细胞的基因组中，从而导致载脂蛋白-J的表达。在一些措施中，被转染的细胞可以是心肌细胞、血管细胞、或是移植的干细胞。另一些措施中，干细胞指的是骨髓来源的干细胞或者是血管干细胞。
动脉硬化损伤包括血管内的动脉瘤。动脉硬化损伤包括由于高脂血症引起的不稳定的粥样硬化斑块，一定量的载脂蛋白-J的接触有助于稳定硬化斑块(即降低斑块破裂，血栓形成或其他并发症的风险)在上述描述的方法中，载脂蛋白-J能够有效的阻止和预防凋亡的发生，或保护细胞由于氧化固醇或脂蛋白、Fas配基、细胞因子引起的炎症对细胞的损伤。
是移植经过基因修饰的能高表达载脂蛋白-J的心肌细胞或干细胞，治疗哺乳动物心衰。表达的载脂蛋白-J可以提高心功能，保护基因修饰的心肌细胞或干细胞以及邻近部位的细胞免受炎性损伤。
权利要求
1.一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于以下工艺步骤a、采用脱氧核糖核酸DNA重组技术制备重组人或哺乳动物的载脂蛋白-J全长或部分片段并用亲和层析法纯化；b、采用逆转录-多聚脱氧核糖核酸合成酶链反应RT-PCR技术从RNA克隆并扩增出载脂蛋白-J的全长或部分片段的互补脱氧核糖核酸cDNA；c、利用DNA重组技术将载脂蛋白-J cDNA全长或部分片段插入到一个质粒构成原核或真核细胞表达载体，载脂蛋白-J cDNA连接或不连接于一个标签多肽基因；d、将此载脂蛋白-J表达质粒载体转染大肠杆菌，在抗菌素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增载脂蛋白-J表达质粒，根据质粒所含抗菌素阻抗基因，抗菌素可选为氨苄青霉素或/和氯霉素，在培养基中诱导重组载脂蛋白-J的合成；e、收集转染的菌体，离心沉淀，裂解释放载脂蛋白-J，用制备层析方法分离载脂蛋白-J；f、用Ni-NTA树脂从细菌中抽提含有连续6个组氨酸尾6HisTag的具有天然结构的可溶性重组载脂蛋白-J；g、用亲和层析方法纯化，鉴定重组载脂蛋白-J；对纯化载脂蛋白-J生物活性鉴定及检测。
2.如权利要求1所述的一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于所述的利用DNA重组技术将载脂蛋白-J cDNA全长或部分片段插入到一个质粒的工艺步骤为a.先将载脂蛋白-J cDNA构建载体；b.将该载体转染哺乳动物细胞或人胚肾293细胞；c.在载脂蛋白-J基因前插入巨细胞病毒CMV启动子，具有四环素敏感元件，被转染的细胞只有在四环素存在的情况下才表达载脂蛋白-J；这个载体转染干细胞，因为载体是新霉素抗性的，被转染的细胞用G418进行筛选；d.转染的293细胞在DMEM培养基中培养，生成分泌大量载脂蛋白-J，此培养基含有四环素和血清。
3.如权利要求1所述的一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于免疫亲和层析方法纯化重组和天然载脂蛋白-J，由以下工艺步骤组成a、人工合成载脂蛋白-J多肽片段或全长并以此片段作为原去免疫家兔以制备抗载脂蛋白-J抗体；b、用层析法从免疫血清中提取载脂蛋白-J抗体；c、将上述载脂蛋白-J的特异性抗体共价结合到层析柱中的亲和凝胶上；d、用此亲和层析凝胶柱从人类或哺乳动物血浆/清或其他体液如羊水或载脂蛋白-J cDNA转染细胞的条件培养基提取载脂蛋白-J；e、用醋酸缓冲液洗出结合的载脂蛋白-J；f、用聚丙烯胺凝胶电泳和免疫印迹法检测鉴定载脂蛋白-J，10％含SDS的聚丙烯胺凝胶上，并用银试剂染色，随后，蛋白电泳带转印迹于PDVF纤维膜上，然后用抗载脂蛋白-J抗体免疫染色鉴定重组或天然载脂蛋白-J。
4.如权利要求3所述的一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于所述的抗载脂蛋白-J抗体亲和凝胶过滤法制备过程a.抗载脂蛋白-J抗体共价连接于葡聚糖其他多聚凝胶；b.凝胶装层析柱；c.含载脂蛋白-J血清或其他液体过柱；d.用磷酸盐水洗去未结合蛋白；e.从柱上洗脱载脂蛋白-J，然后在碳酸氢铵缓冲液中透析，并用Amicom滤膜超滤法将载脂蛋白-J蛋白液浓缩；f.超滤浓缩制备载脂蛋白-J溶液；g.制备冷冻干燥载脂蛋白-J粉剂。
5.如权利要求1所述的一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于制备载脂蛋白-J表达菌体，包括在Luria Broth培养基下的表达菌体培养，离心收集菌体细胞，接着将收集的细胞重新混悬溶解于含有1％Triton X-100三硝基甲苯，500mM氯化钠，及10mM Tris-HCl，pH6.0，盐酸缓冲液中。
6.如权利要求1所述的一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于表达菌体进行处理时细胞被超声裂解，于Sarcosgl缓冲液10mMTris-Hcl，pH8.0，150mM Nacl，1mM MgCl2，20mM依咪达唑imidagole，5mM β-巯基乙醇，以及多种蛋白质抑制剂，在13000g离心后，5ml体积的上清液装置与Ni-NTA柱上，此柱用洗涤缓冲液10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM Nacl，0.1％Triton X-100 20mM依咪达唑，1mM MgCl2，5mM β-巯基乙醇平衡。
7.如权利要求1所述的一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于从载脂蛋白-J基因表达菌体或哺乳细胞抽提纯化载脂蛋白-J，用制备型SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳，用考马斯兰染色后可见到一个75kDa道尔顿的带与此融合蛋白相一致。
8.如权利要求1所述的一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于通过基因重组将载脂蛋白-J连接一个标签多肽，这样的多肽可以由连续6组氨酸构成。
9.如权利要求1或2所述的一种载脂蛋白-J的方法，其特征在于鉴定及检测载脂蛋白-J生物活性和应用所述的载脂蛋白-J全长或部分片段于抑制哺乳动物细胞凋亡、促进组织细胞的功能恢复，抑制炎症反应及治疗或预防哺乳动物动脉硬化或其并发症包括但不局限于心衰。a.所述制备含有纯化重组或天然载脂蛋白-J水溶液，经由肌肉，静脉或其他的路径应用于健康或不健康哺乳动物体内；抑制哺乳动物细胞凋亡、促进组织细胞的功能恢复，抑制炎症反应；b.所述制备含有纯化重组或天然载脂蛋白-J水溶液，经皮表面或皮下应用于抑制哺乳动物细胞凋亡、促进组织细胞的功能恢复，抑制炎症反应；c.所述制备含有纯化重组或天然载脂蛋白-J的哺乳动物干细胞悬液，经由肌肉，静脉或其他的路径应用于健康或不健康哺乳动物体内，促进组织修复和再生；d.所述制备抗载脂蛋白-J抗体应用于分析测试体内或体外重组或天然载脂蛋白-J。
全文摘要
本发明涉及一种载脂蛋白—J的制备方法，其特征在于a.采用RT－PCR技术从RNA克隆并扩增出载脂蛋白－J的全长或部分片段的互补脱氧核糖核酸cDNA；b.利用DNA重组技术将载脂蛋白－J cDNA全长或部分片段插入到一个质粒构成原核或真核细胞表达载体并连接6个组氨酸尾6HisTa；c.将此载脂蛋白－J原核表达质粒载体转染大肠杆菌，在抗菌素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增载脂蛋白－J表达质粒；d.收集转染的菌体，离心沉淀，裂解释放载脂蛋白－J；e.将此载脂蛋白－J真核表达质粒载体转染哺乳动物细胞；f.用Ni－NTA树脂从细菌中抽提或细胞培养基上清含有连续6个组氨酸尾6HisTag的具有天然结构的可溶性重组载脂蛋白－J；g.用亲和层析方法纯化；h.对纯化载脂蛋白－J生物活性鉴定及检测。
文档编号C07K14/435GK101082045SQ20071000735
公开日2007年12月5日 申请日期2007年1月22日 优先权日2007年1月22日
发明者耿永健 申请人:耿永健