一种具有抗菌功能的融合蛋白及其应用的制作方法

专利名称：一种具有抗菌功能的融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白及其应用，尤其涉及一种用基因工程技术建立的动物抗菌 肽基因载体和通过酵母表达系统获得的抗菌肽融合蛋白，及其在制备抗菌药物或具有病 害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料产品中的应用。
背景技术：
抗菌肽是生物体自身产生的，抵抗外界微生物、病毒等病原体侵染，用于肌体非特 异性防御的免疫物质。其广泛存在于动物和植物中，具有杀菌活力高、作用迅速、不产 生耐药性等特点，是多细胞生物免疫防御的有效手段，在生物的生存与进化过程中发挥 着重要作用。抗菌肽不仅能直接杀灭病原微生物，而且能激活生物体的免疫系统，增加 抵抗外界病原体入侵的能力。迄今为止，已经有包括自较为低等的动物至高等哺乳动物 和人类来源的多种抗菌肽被分离、纯化。例如家蚕中的cecropin、 cecatotoxin，鲨、 贝类、被囊动物中的防御素(defensin)，七鳗鱼、比目鱼中的pleurocidin，两栖动 物的鹏gainin和dermas印in,鸟类中的防御素，哺乳动物中的a -def ensin 、 P -defensin,植物中的thionin、植物防御素等。已经发现的抗菌肽数目超过800余种。
海洋生物抗菌肽是机体天然免疫系统的重要组成部分，由于大部分海洋动物的免疫 系统为先天性免疫系统，因而较哺乳动物而言，作为先天性免疫系统成员的抗菌肽对海 洋动物的作用就显得更为重要。对海洋生物抗菌肽的研究主要集中在一些甲壳类动物， 如鲎、蟹等方面，近年来也有关于虾、贝类抗菌肽或抗菌肽类似物质的研究报道，表明 海洋生物抗菌肽及其在水产养殖业的应用前景正在受到越来越广泛的关注。但是对鱼类 抗菌肽的研究起步较晚，分离得到的抗菌肽种类有限。
defensin是一类重要的抗菌肽家族，其中h印cidin是e-defensin蛋白家族中的 一员(Verga F， et al' Gene. 2005， 364: 37-44 )。 h印cidin最初是从人的血浆抽滤 液或尿液中分离得到的，经检测证实它是一种富含半胱氨酸的抗菌蛋白，其抗菌活性已 得到多方的证实(Krause A， et al, FEBS Lett, 2000， 480: 147 — 150; Park C H， et al， J Biol Chem, 2001， 276: 7806 - 7810)。在对其进行抗菌活性研究的同时又发现 H印cidin在铁代谢中也发挥着作用(Nicolas G， et al， Proc Natl Acad, 2001， 98: 8780 - 8785)。随后克隆得到了多种h印cidin的同源异构体基因。Shike等从杂交石斑 鲈鱼中得到了 h印cidin基因，是首次从鱼类中得到的h印cidin基因(Shike H, et al， Eur J Biochem, 2002， 269: 2232 - 2237)。 magainin最初是从蟾蜍的皮肤中分离得到 的，这类抗菌肽具有a螺旋结构，通常是由L型两性氨基酸组成，对革兰阴性菌、阳性 菌、都有杀伤作用(Zasloff M, Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:5449-5453; Barrell PJ，et al， Protein Expr Purif， 2004， 33:153-159)。
尽管抗菌肽抗菌功效显著，应用前景广阔，但天然抗菌肽的含量很低，无法从生物 体内大量获取；而化学合成肽价格昂贵，限制了其广泛应用。目前由于环境污染的严重 致使水产养殖病害频繁发生，常造成比较大的经济损失。水产养殖业广泛和大量使用氯 霉素等抗生素，造成抗生素在水产品中超标累积，给消费者的健康带来巨大危害。目前 欧盟己经禁止我国抗菌素超标的水产品出口欧盟国家。因此，利用基因工程技术生产基 因工程重组的具有高效杀菌效果的抗菌肽并应用于水产养殖业，以及用于各种畜禽动物 的饲养中，以替代日益受到禁用的抗菌素已经成为我国水产养殖业和畜牧业的必然选 择。
应用酵母表达系统表达真核生物基因在DNA重组技术中正在得到越来越广泛的应 用。最先使用的是酿酒酵母系统，迄后具有优良特性的巴斯德毕赤酵母表达系统越来 越受到科学一工业界的重视，并逐渐取代酿酒酵母系统。酵母表达系统具有独特的生 物学特性，具有严格调控外源真核细胞蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高， 营养要求低等优点。由于抗菌肽直接作用于原核生物细胞膜，抑制其生长以至杀灭菌 体，因此采用真核生物酵母的表达系统几乎成为生产基因工程重组抗菌肽的唯一选择。 另外，毕赤酵母表达系统能利用甲醇作为唯一碳源大量合成蛋白质，曾用于工业规模的 单细胞蛋白的生产。以酵母工程菌表达基因工程抗菌肽，能够大量生产水生生物和动 物饲养所急需的、可以替代抗菌素的动物自身基因表达的抗菌肽，为市场提供无毒无 害、健康的绿色产品。并且对抗菌肽的进一步开发和利用将产生很高的经济价值和巨 大的社会效益。

发明内容
本发明的目的是提供一种用基因工程技术建立的动物抗菌肽基因载体和通过酵母 表达系统获得的抗菌肽融合蛋白，及其在制备抗菌药物或具有病害防治功能的水生生物 或养殖畜禽词料产品中的应用。
本发明的技术构思是将鱼类的抗菌肽和两栖动物的抗菌肽组成新型的融合蛋白，使 用基因工程的手段构建含融合蛋白cDNA序列的表达载体并整合至酵母基因组进行表达。 其表达产物可以应用于水生生物或畜禽动物养殖中；也可以通过纯化或浓縮的方法，得 到高纯度的融合蛋白，直接作为抗生素的替代品用于生物的病害防治，细菌性甚至病毒 性疾病的治疗。
本发明的具有抗菌功能的融合蛋白由经过修饰的鱼类抗菌肽h印cidin和两栖动物 抗菌肽magainin组成，其特征在于所述融合蛋白是含有SEQ ID N0: 1所示氨基酸序 列的短肽。
上述融合蛋白的基因由编码鱼类h印cidinl precursor成熟肽的cDNA序列、编码 两栖动物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列、限制性内切酶EcroR I位点的cDNA序列 以及符合真核生物表达偏好性的基因序列组成，其特征在于所述融合蛋白基因的核苷 酸序列是SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
本发明所述的融合蛋白在制备在制备抗菌药物中的应用。
本发明所述的融合蛋白在制备具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料中的 应用。
其中所述融合蛋白直接作为免疫添加剂添加到水生生物或畜禽词料中，或经纯化 后作为病害防治药物直接使用或作为饲料添加剂使用。
本发明所述融合蛋白的酵母表达系统，其特征在于，含有外源融合蛋白cDNA的酵 母细胞内表达载体PA0815或其它类型的酵母表达载体，以及利用载体使融合蛋白基因 在毕赤酵母、酿酒酵母、假丝酵母或其它可食性酵母中进行细胞内或细胞外表达。它的
步骤为
表达载体的构建人工合成的抗菌融合蛋白CDNA序列上设计有限制性内切酶的酶 切位点，融合蛋白cDNA序列和Invitrogen公司的酵母细胞内表达质粒pA0815酶切后 链接在一起，通过PCR反应检测融合蛋白基因插入的方向，筛选出含有正向插入的融合 蛋白基因的克隆。
酵母表达系统的构建使用限制性内切酶酶切酵母表达质粒，使其线性化，通过电 击转化的方法，将融合蛋白cDNA序列整合到酵母的基因组中。将转化后的菌体悬液涂 布于MD平板上，30。C培养，诱导筛选直至单个菌落出现。挑取单菌落，将其作为模板， 通过PCR反应确认阳性克隆。
融合蛋白的细胞内或细胞外诱导表达及活性检测。
表达产物抗菌活性的检测方法如下
挑选阳性克隆菌落，于3(TC培养，收集菌体，用含有甲醇的培养基重悬菌体，使外 源基因能够被诱导表达。如使用细胞内表达载体，收集菌体，破碎细胞后取得蛋白粗提 液。如使用细胞外表达载体，收集细胞培养液后通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶 层析纯化，通过聚丙烯酰铵凝胶电泳分离得到电泳纯的融合蛋白。
通过在培养皿上涂布融合蛋白粗提液并同时接种大肠杆菌、鳗弧菌、溶藻弧菌等种 类致病菌，进行抑菌圈实验，或是通过在上述致病菌培养液中添加融合蛋白粗提液，检 测A600吸光值来检测其抗菌活性。
本发明的融合蛋白经检测具有明显的抗菌活性，可以用于水生生物、养殖动物对抗 生素有耐药性的细菌性疾病的防治，或者将纯化的融合蛋白直接作为药品，用于对细菌 甚至病毒所引起的疾病的治疗。
本发明的有益效果是
(1) 应用基因工程技术可以大量生产新型的水生生物和养殖动物的抗菌肽。
(2) 解决靜她长其鹏的病害危害,J^品及禽驴口口oiM^辯鹏示的问题。
(3) 用高技术带动养殖业以及养殖饵料工业的行业技术进步。
(4) 向社会衛繊泰白WfeK^品和禽熟口口。


图1. 鱼类h印cidinl precursor基因的克隆。图2.表达融合蛋白cDNA的载体pA0815 — antibac质粒。
图3. pA0815-antibac阳性克隆的检测。
图4.毕赤酵母表达系统表达的抗菌融合蛋白对大肠杆菌的抑菌效果。 图5.毕赤酵母表达系统表达的抗菌融合蛋白对鳗弧菌的抑菌效果。 图6.毕赤酵母表达系统表达的抗菌融合蛋白对溶藻弧菌的抑菌效果。
其中图4 6中1X、2X、3X为不同浓度的抗菌融合蛋白表达系统蛋白粗体液，
0为对照(表达f3-Gal的酵母表达系统蛋白粗体液)。
具体实施例方式
下面以实施例并结合附图对本发明内容做进一步说明
1.鱼类肝脏cDNA的制备大鲮鲆注射鳗弧菌感染24h后，取出肝脏，迅速放于液 氮中，将硬的组织块置于一80。C冷冻保藏。参照TRIZOLS试剂操作说明，取冷冻保藏的
组织约100mg，加入到lml TRIZ0L试剂中，置室温下匀化5分钟之后，加入200W氯仿 剧烈振荡15秒，室温下温育3min。 4'C条件下以12， 600rpm转速离心15 min。获取界 面上层液体加入25014以0.腦乙酸钠和1. 2M氯化钠组成的高浓度盐溶液，混匀后再加 入250rt异丙醇混匀，于室温下沉淀10min，再在4'C以12, 600rpm转速离心10 min。 移去上清后用lml 70%乙醇漂洗沉淀，以11，000rpm转速4。C离心5 min。以20WDEPC 处理过的双蒸水(无RNase) 55。C溶解RNA沉淀10 min后，取2. Oug总RNA，加入 50pM的随机引物，以DEPC水稀释至17. U4。 70°C 5 min破坏RNA 二级结构后置冰上骤 冷。依次加入5^1 M-MLV 5X转录缓冲液，1. IO固dNTP， 24U rRNA酶抑制剂和200U M-MLV逆转录酶。于42。C反应lh后在94。C维持5 min终止反应，于4。C保藏。
2. 鱼类抗菌肽h印cidinl precursor基因的克隆和序列分析以大菱鲆肝脏cDNA 为模板，使用引物 W朋sp ( 5—-CAAACCCTCCTAAGATGAAG-3' )， WBHap
(5—-AATCCTCAGAACCTACAGCA-3')进行PCR反应。反应退火温度为52°C, 30个循环得 到大约300bp的PCR条带(见图l)。得到的PCR产物使用凝胶电泳试剂盒回收，经测 序证实，该序列全长293bp，包括完整的编码区，其中开放阅读框长273bp，编码90个 氨基酸，详见GenBank序列号AM113708。。通过NCBI的Blastn服务器对核酸序列进 行同源相似性比对。同源相似性较高的序列多为H印cidin家族的基因序列，其中与牙鲆 的同源相似性为90%[ /^e〃t/oscj'ae朋 crocea(DQ307050)]，与白鲈的同源相似性为84 % [yfforw e c力/ysoA (AF394246)]，与黑鲷的同源相似性为83% [/)ca/ t力o/)艰r〃s sc/^e^^h'(AY669380)]。确定该序列为大菱鲆h印cidinl precursor基因。使用signalP 月艮务器予页测hepcidinl precursor蛋白序列的iW号月太区土或，hepcidinl precursor蛋白 序列中C端24个氨基酸为信号肽。使用软件0miga2. 0预测h印cidinl precursor蛋白 序列的二级结构，h印cidinl precursor的蛋白序列中N端21个氨基酸为{3 -折叠结构， 而这部分序列包含八个半胱氨酸。H印cidin蛋白家族成熟肽的最显著的特征就是由这八 个半胱氨酸形成的P-折叠结构，这符合h印cidin蛋白家族的特征。比较鲈鱼、斑马鱼 H印cidin成熟肽，从而得出大菱鉀h印cidinl precursor的成熟肽具有21个氨基酸。
3. 融合蛋白cDNA的的设计与制备融合蛋白cDNA序列由编码鱼类h印cidinl precursor成熟肽的基因序列、编码两栖动物抗菌肽Magainin成熟肽的基因序列、限制 性内切酶EcroR I位点的序列以及符合真核生物表达偏好性，同时符合Kozak规则的基 因序列组成。进行基因工程修饰的位点描述如下(l)第4位的偏好碱基为G; (2)ATG 的5'端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T; (3)在-3， -6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3， -6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。所以融合蛋白基因序列编码 的蛋白序列是由h印cidinl precursor和Magainin的两段成熟肽序列经基因工程方法 优化设计修饰组成。使用固相亚磷酸酰胺法人工合成这段基因序列，序列长151bp (见 SEQIDN0: 2所示的核苷酸序列)，编码39个氨基酸，后续构建的酵母表达系统所表达 的蛋白就是这个含有39个氨基酸的短肽(见SEQ ID NO: l所示氨基酸序列)。
4. 酵母表达系统pA0815-antibac载体的构建人工合成的抗菌融合蛋白基因序列 上设计有限制性内切酶EcroR I的酶切位点，酵母细胞内表达质粒载体pA0815同样具有 EcroRl的单酶切位点，融合蛋白基因和pA0815质粒酶切后具有同样的粘性末端。使用 EcroR I分别酶切融合蛋白基因和pA0815质粒，使用凝胶电泳回收试剂盒分别回收酶切 后的产物。使用DNA Ligation Kit试剂盒进行连接，取融合蛋白基因加入pA0815载体2W连接缓冲液2. 5W、连接酶4.5W， 16匸连接过夜。使其链接在一起，并导入 到大肠杆菌DH5a中。使用引物HMsp (5—-GGACAGCCACATCTCCCTTT-3')和HMap (5、-GTGCGAATTCTCAGAACTTC-3—)，以转化后大肠杆菌DH5 a菌悬液为模板，进行PCR反应， 退火温度53'C，进行30个循环。连接产物检测融合蛋白基因插入的方向。如果融合蛋 白基因正向插入到质粒pA0815中则会出现大约130bp的PCR条带，如果融合蛋白基因 反向插入则不会出现PCR条带。筛选出含有正向插入的融合蛋白基因的克隆。将得到的 表达载体命名为pA0815-antibac质粒(图2)。将该质粒导入到大肠杆菌中，使其形成 多克隆。制备pA0815-antibac质粒，使用限制性内切酶Sal I酶切质粒，使其线性化。 将约20Pg的线性化pA0815-antibac质粒溶液与80Ml的GS115感受态细胞混匀，转至 0.2ml冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min后使用电转化仪进行转化。条件为 电压1. 5kV，电击10msec，使外源基因整合到酵母GS115的基因组中。转化后将菌体加 入lml冰预冷的lmol山梨醇溶液混匀，转至1. 5ml的EP管中。转化后的菌体悬液随后 均匀涂布于MD平板上于3(TC培养，直至单个菌落出现。挑取单菌落，将其作为模板， 使 用 引 物 5—A0X (5、-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3—) 和 3—AOX (5、-GCAAATGGCCATTCTGACATCC-3')，通过PCR反应筛选具有pA0815-antibac的阳性克 隆。整合融合蛋白cDNA序列的阳性克隆出现600bp左右的PCR条带(图3)。挑选含 pA0815-antibac的菌落，置于装有25ml刚GY培养基的摇瓶中，于3(TC培养至菌液的 0D6。。 = 2. 0。收集菌体，用歷MY重悬菌体，使0D6 。 =1. 0左右。所得的菌液置于1L的 摇瓶中，放置于3(TC培养，每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为0. 5%培养至0D6 。 =3.0。收集菌体，破碎细胞后取得蛋白粗提液，其中富含融合蛋白。
也可以将蛋白粗提液用梯度硫酸铵沉淀，然后将沉淀收集溶于磷酸缓冲液后，分别 经离子交换层析和凝胶层析处理，得到电泳纯的融合蛋白。
同时，以同样条件下培养的，可以表达P-Gal的酵母表达系统蛋白粗体液作为对照。
5. 抑菌试验在涂布有大肠杆菌、鳗弧菌或溶藻弧菌的平板培养皿上滴加不同浓度 的酵母蛋白粗提液或经过纯化的融合蛋白。将培养皿至于37'C过夜培养，次日观察并记 录抑菌效果。
上述富含融合蛋白的粗提液和经过纯化的融合蛋白，均表现有抗菌活性(结果见图 4 6)。
6. 融合蛋白在制备抗菌药物中的应用将含融合蛋白分泌型表达载体的酵母，经 常规培养后收集培养液，再经常规沉淀、离心、脱盐、层析等步骤得到兽药级的融合蛋 白；或在融合蛋白序列两端添加组氨酸cDM序列等标签，使用亲和层析获得更高纯度
的融合蛋白。
获得的融合蛋白可直接作为抗菌药物，以常规用药量应用于水生生物或其它养殖禽 畜疾病的防治。
7. 融合蛋白在制备具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料中的应用由于
酵母含有丰富的蛋白质、维生素及其它营养物质，因此含胞内表达型载体的酵母可以作 为饲料添加剂。按照设定比例将含胞内表达型载体的酵母添加到水生生物或养殖畜禽饲 料中，在为水生生物或养殖畜禽提供营养物质的同时，提高其病害防御能力。
如应用上述方法，使用100L发酵罐，于3(TC下扩大培养基因组中包含有SEQ ID N0:
2所示核苷酸序列的毕赤酵母GS115，通过发酵液中添加0. 5%甲醇诱导抗菌融合蛋白基 因的表达，经3_5天培养，经过滤后，得到大量具有表达抗菌活性融合蛋白的GS115 酵母，所述酵母菌数不少于5X104cfu/g，含水量《10%。
以常规方式选择玉米粉、糠、麸皮、豆饼、鱼粉、骨粉为水生生物或养殖畜禽的基 础饲料，将上述获得的酵母菌作为饲料添加剂，直接添加于上述水生生物或养殖畜禽的 基础饲料中混合，所述饲料添加剂添加比例量为基础词料重量的20% (可相应减少鱼粉 或其它蛋白质饲料的用量)，使混有添加剂的基础饲料的最终营养成分中粗蛋白>35%、 粗脂肪》3%、粗纤维》3%、粗灰分》15%、钙》2%、磷》1%、赖氨酸》1.8%，制得 具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料。
或者，以基础伺料重量5% 25%的添加比例量直接将上述所得发酵全液用于畜禽和 水产养殖生物的喂养。
进一步的，以上述方法将含融合蛋白分泌型表达载体的酵母，经常规培养后收集培 养液，再经常规沉淀、离心、脱盐、层析等步骤得到兽药级的含有SEQ ID NO: 1所示 氨基酸序列的融合蛋白。
以常规方式选择玉米粉、糠、麸皮、豆饼、鱼粉、骨粉为水生生物或养殖畜禽的基 础饲料，将上述获得的融合蛋白作为饲料添加剂，直接添加于上述水生生物或养殖畜禽 的基础饲料中混合，所述词料添加剂添加比例量为基础饲料重量的10%，使混有添加剂 的基础饲料的最终营养成分中粗蛋白>35%、粗脂肪》3%、粗纤维》3%、粗灰分》15 %、钙》2%、磷》1%、赖氨酸》1.8%，制得具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽 饲料。
序列表
〈110〉国家海洋局第一海洋研究所
<120>—种具有抗菌功能的融合蛋白及其应用
〈141〉2007-9-11
<160〉2
<210〉1
<211>39
〈212>PRT
<213〉人工序列
<400>1
Met Asp Ser His lie Ser Leu Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys 5 10 15
Lys Ala Tyr Lys Gly Cys Gly Phe Cys Cys Arg Phe Gly lie Gly 20 25 30
Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe 35
<210〉2
〈211>151
<212〉cDNA
<213〉鱼类h印cidinl precursor成熟肽的cDNA序列&编码两栖动物抗菌肽magainin成
熟肽的cDNA序列
<400〉2
ccctcgaatt cgccgccacc atggacagcc acatctccct ttgccgctgg tgctgcaact 60 gctgcaaggc ctacaagggc tgtggcttct gctgtaggtt cggcattggc aagttcctgc 120 actctgccaa gaagttctga gaattcgcac c 15权利要求
1.一种具有抗菌功能的融合蛋白，由经过修饰的鱼类抗菌肽hepcidin和两栖动物抗菌肽magainin组成，其特征在于所述融合蛋白是含有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的短肽。
2. 权利要求1所述融合蛋白的基因，由编码鱼类h叩cidinl precursor成熟肽的cDNA 序列、编码两栖动物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列、限制性内切酶EcroR I位点 的cDNA序列以及符合真核生物表达偏好性的基因序列组成，其特征在于所述融合蛋 白基因的核苷酸序列是SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
3. 权利要求1所述融合蛋白在制备抗菌药物中的应用。
4. 权利要求1所述融合蛋白在制备具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料中 的应用。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述融合蛋白直接作为免疫添加剂添加 到水生生物或畜禽饲料中，或经纯化后作为抗菌药物直接使用或作为饲料添加剂使用。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗菌功能的融合蛋白及其应用。所述融合蛋白基因序列组成为克隆得到的hepcidinl precursor抗菌肽基因和人工合成的magainin抗菌肽基因，通过基因工程手段将二者组成为新型的融合蛋白cDNA并整合在酵母的基因组上，通过诱导使融合蛋白cDNA在酵母表达，进而通过酵母发酵培养获得大量的融合蛋白。本发明的融合蛋白经检测具有明显的抗菌活性，可以用于水生生物、养殖动物的细菌性疾病的防治，或者将纯化的融合蛋白直接作为药品，替代抗生素用于对细菌甚至病毒所引起的疾病的治疗。
文档编号C07K19/00GK101182360SQ20071011386
公开日2008年5月21日 申请日期2007年10月8日 优先权日2007年10月8日
发明者丛柏林, 刘晨临, 刘胜浩, 林学政, 黄晓航 申请人:国家海洋局第一海洋研究所