专利名称：：口服干扰素的广谱免疫和抗病毒基因调节作用的制作方法口服干扰素的广谱免疫和抗病毒基因调节作用与相关申请案交互参考本申请要求美国2006年3月8日申请的临时专利申请序列号60/780,079的优先权。本发明涉及使用由天然a-干扰素的混合物和任选其他可激活免疫应答的组分组成的a-干扰素对抗病毒感染例如禽流感(AVI)的作用。人类细胞的病毒感染会引起由1型干扰素特别是a-千扰素介导的固有免疫应答(第一道防线)。这通常会引起免疫"级联"的激活，如干扰素-a(作为该免疫"交响乐"的一类指挥)，将时间和组成该免如果免疫交响乐的指挥尤其是a-干扰素失活，交响乐团的成员则会不规律地、不按顺序地演奏等等，其累积作用对人体并非有益而是有害的。致命急性人类病毒通常可灭活a-干扰素以在人体内占得一席之地。具有这种行为方式的原型病毒为禽流感病毒、SARS病毒、类天花病毒和其他可在数小时或数日内杀死人类宿主的病毒(在动物中可观察到类似作用)。近期对于肺病理学的研究(尸检)表明伴随着对免疫交响乐的指挥即a-干扰素的破坏/失活，某些介质/"演奏者"过度反应，导致对肺的免疫介导性损害，可导致死亡。基于动物的研究和人类数据(在本文中作为题述发明(subjectinvention)报导)表明短暂地施药于口腔/颊粘膜的小剂量a-干扰素可在严重感染发生之前或其前期阶段适当地重新调节免疫失常和可能引起死亡的免疫失调。对禽流感肺病理学的研究不仅显示出组织损伤害也显示出氧化损伤、肺水肺和出血。干扰素-a[本文中使用的AlferonN,是由人类干扰素家族的8种不同分子种类约20种a-干扰素组成的"鸡尾酒"]可在短暂的口腔接触中通过诱导抗病毒/免疫调节基因逆转这些变化。本文记录了385种该类相关基因，其可被AlferonN暂时诱导以完成对致命病毒的协作攻击。Geiss等(ProcNatlAcad-Sci，2002年8月6日，99巻，16期)报导了大流行禽流感中的肺上皮病变是由"阻断干扰素-调节基因的表达"引起的。其他研究者指向"炎性反应的彻底激活"，这主要是由TNF(肿瘤坏死因子)的不当表达引起的，其为一种在实施本发明中被有效下调的免疫调节淋巴因子。很明显，题述发明重新激活相关干扰素免疫调节途径而不会显著上调炎性细胞因子-TNF就是研究最充分的原型实例。本文描述的治疗步骤中的a-干扰素组分优选基于AlferonN注射剂@,美国市售的唯一被批准的天然、多种类a-干扰素。它是第一个天然来源的多种类干扰素，是至少7种a-干扰素组成的稳定混合物。相反，其他市售a-干扰素为使用DNA重组技术在细菌中获得的a-干扰素单分子种类。这些a-干扰素的单分子种类也缺少重要的结构性碳水化合物组分，这是因为在细菌中没有糖基化步骤。与重组技术生产的a-干扰素种类不同，AlferonN注射剂@是由可将多种a-干扰素种类糖基化的人白细胞生产的。反相HPLC研究显示AlferonN注射剂⑧是由至少7种a-干扰素种类(a2、a4、a7、a8、a10、a16、a17)组成的稳定混合物。这一天然来源的干扰素具有独特的抗病毒性质，使其有别于基因工程干扰素。AlferonN注射剂@具有高纯度和7种干扰素种类组成的天然混合物的优点，其中一些例如种类8b比其他种类例如种类2b具有更强的抗病毒活性，后者为IntronA的唯一组分。已报导AlferonN注射剂②与其他市售重组干扰素例如IntronA和RoferonA相比在例如慢性丙型肝炎(HCV)的治疗中具有更好的抗病毒活性和耐受性。AlferonN注射剂为含有5,000,000国际单位(IU)/ml的注射液。对于a-干扰素的体内给药可配制成例如传统的口服、鼻腔或含服给药形式。口服给药制剂包括含水溶液、糖浆、酏剂、粉末、颗粒、片剂和胶嚢，它们通常包含传统的辅料例如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、混悬剂、乳化剂、防腐剂、緩冲盐、芳香剂、着色剂和/或甜味剂。优选适当的途径给予a-干扰素用于治疗，包括口服、鼻腔和局部(包括透皮、含服和舌下)给药。应理解优选的途径可随着接受者的疾病和年龄、感染的性质和所选择的活性成份而变化。该组分的建议剂量取决于患者的临床状况和临床医师在治疗相似感染中的经验。作为总体指导原则，用于全身感染的AlferonN注射剂@的剂量为5百万至1千万单位(59)，每周三次。到目前为止的经验为高于3IU/磅患者体重的剂量。以液体溶液形式在500-2000IU/曰的范围内给予口服a-干扰素(AlferonLDO)并以体重为150磅的患者为P出进行计算，这是3.3-13.3IU/lb/日。我们的经验表明超过450IU的a-干扰素剂量水平可得到有利结果，这大于3IU/;t体重。这些用量与Cummins在美国专利5,190,304中使用的以口服或作为锭剂或片剂给予咽粘膜的a-干扰素的量形成反差并且更大。已报道低剂量的a-干扰素与口腔粘膜接触后可在动物和人体中引起生物学作用。但是达到全身抗病毒作用的低剂量口服a-干扰素的最优剂量和/给药方案需由临床医师确定。天然来源的a-干扰素(AlferonNInjection)已^皮批准用于治疗尖锐湿疣。它的活性剂量显著低于重组a-干扰素。实施例1本研究用于测定Alferon在短尾猕猴中对流感病毒H5N1感染的预防作用。用流感病毒H5N1感染短尾猕猴(食蟹猴)，结果显示短尾猴的临床表现与被禽流感H5N1病毒感染的人类的临床表现相似，因此可以使用被流感病毒H5N1感染的短尾猕猴作为人类感染的冲莫型(Rimmelzwaan等，AvianDis.2003;47(3增刊1):931-3，Kuiken等，VetPatho1,2003年3月；40(3):304—10，Rimmelzwaan等，J.Vriol.2001年7月；75(14):6687-91)。将上述猕猴H5N1感染模型用于测定给短尾猕猴口腔粘膜给药(在用流感病毒A/Vietnam1194〃04(H5N1)进行气管内刺激5天前)Alferon并之后以各种剂量连续十天单次给药后Alferon在短尾猕猴中的预防作用。为安全和实际操作(口腔粘膜给药AWeron，用流感病毒H5Nl感染)考虑在每一步骤前将动物麻醉。该实验包含四组动物，每组三只。A组接受10mg/kgAlferon的治疗，B组25mg/kgAlferon,C组62.5mg/kgAlferon,D组使用安慰剂。未观察到不良反应。在感染后第5天进行安乐死时，显微肺损伤表明用62.5mg/kgAlferon治疗的C组动物肺部显示出分离的黑红区域或弥散的黑色区域，与其他組动物相反。这与也表明该组动物左颅和尾部肺叶存在低级原发性非典型肺炎的显《效观察结果一致。口腔粘膜给予Alferon预防性治疗猕猴显示出在被治疗动物中外观和組织病变减少的有利剂量依赖作用。实施例2研究A:持续10天每日口服给予500IU或1000IUAlferon(由稀释Alferon注射剂制备的含水緩冲液中)治疗无症状HIV感染受试者，其CD4水平〉400。应用Paxgene技术分离RNA，从治疗前、中、后收集的血液中分离外周血白细胞的RNA。应用cDNA微阵列分析来鉴定由于口服Alferor^而被调节的基因。研究B:以相似方式研究正常健康志愿者。研究A的初始结果表明在口服给药500IU或1000IU多种类天然白细胞a-干扰素后诱导了外周血白细胞中a-干扰素相关基因的活性。该研究中使用的Alferoi^为液体溶液，包装在密封的用聚丙烯衬里的箔片袋中。每一箔片袋包含1.OmlAlferon(500IU或1000IU)或安慰剂。每日口服该溶液并持续10天。给药前或给药后30分钟内不得进食或饮水。给药和血液取样见表l。剂量效应见表2-4。表l研究天数和事件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>'天数0-基线阶段，其间取两个分离的样品(B1和B2)。目的将T1-T5样品的基因表达与两个合并基线样品(即B1+B2)比较用cDNA微阵列分析血液样品阵列构建。该研究中应用的阵列包含由ResearchGenetics公司提供的经过序列验证的cDNA克隆亚组。40000个克隆组代表了950个富含腺苷目^/尿苷酸元件的基因和18个可能参与了AU-定向mRNA衰退的基因，855ISGs代表了前述克隆组的扩增，该克隆组含有在各种细胞类型中被IFN激活的已确认和候选基因，288个对病毒类似物多聚(I).多聚(C)具有反应性的基因和85个管家基因。目标RNA的制备。由基于T7聚合酶的线性扩增反应产生目标RNA。将总体积5.5|il的2吗总RNA和5pmo1T7-(dT)24引物(5'GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(dT)24-3，)于70。C温育10分钟然后置于冰上冷冻。对于第一链cDNA的合成，将已退火RNA模板在10^1的反应液内于42°C温育1小时，该反应液包含第一链緩冲液(Invitrogen)、1OmMDTT、lU/pl的抗核糖核酸酶(Ambkm)、500joMdNTPs和2U/pl的SuperscriptII(Invitrogen)。第二链的合成于16。C进行2小时，总反应体积为50|il，其包含第一链反应产物、第二链緩沖液(Invitrogen)、250(iMdNTPs、0.06U/|al的DNA连接酶(Ambion)、0.26U/|al的DNA聚合酶I、(NEB)和0.012U/pl的核糖核酸酶H(Ambion)，然后加入3.3UT4DNA聚合酶(3U/jal;新英格兰Biolabs)并进一步于16°C温育15分钟。根据厂商使用说明在Paselock微量离心管(Eppendorf)中用苯酚氯仿异戊醇提取第二链反应物并用乙醇沉淀。根据经修改的实验方案在T7megascript试剂盒中进4亍体外转录，该方案中将已纯化的cDNA与ljil各IOXATP、GTP、CTP和UTP以及lplT7酶混合于lOjil的反应体积中并于37。C温育9小时。用RneasyRNA纯化试剂盒(Ambion)纯化已扩增的RNA。RNA标记。通过间接掺入制备Cy3或Cy5标记的cDNA。将2吗已扩增RNA、l|ildT12-18引物(lpg/Vl,Invitrogen)、2.6(il随机六核苦酸(3吗4d,Invitrogen)和liil抗核糖核酸酶(Ambion)混合于15.5pl的反应体积中并于70。C温育IO分钟。逆转录在30jal的反应液中于42。C进行2小时，其含有已退火RNA模版、第一链緩冲液、各500mM的dATP、dCTP、dGTP、300pMdTTP、200jaM氨基烯丙基-dUTP(Sigma)、10mMDTT和12.7U/|il的SuperscriptII。在模板水解中，向逆转录反应液中加入10plO.lMNaOH并将混合物于70°C温育IO分钟，然后在室温下冷却5分钟并加入10pl0.1MHCl中和。在加入1^1线性丙烯酰胺(Ambion)、4pil3MNaAC(pH5.2)和lOOpd无水乙醇后于-20。C沉淀cDNA30分钟，然后重悬于5[il0.1MNaHC03中。在染料偶联中将1管含有Cy3或Cy5染料(AmershanBiosciences)的NHS酯内容物溶解于45^1DMSO中。将5ptl染料溶液和cDNA混合并于室温下黑暗处温育1小时。才艮据厂商^f吏用说明用QiaquickPCR纯化柱(Qiagen)纯化已标记cDNA。将净皮洗脱的cDNA真空干燥并重悬于30^1的SlidehybII杂交緩冲液(Ambion)中。于95。C变性2分钟后，将杂交混合物点样于盖玻片下的^f鼓阵列片。在55。C水浴的密封湿润反应室中杂交过夜。杂交之后，先后用2XSSC0.1%SDS和2XSSC于55。C各洗涤玻片5分钟，然后用0.2XSSC于室温下洗涤最后5分钟。数据采集和归一化。使用GenePix4000B激光扫描仪和GenePixPro5.0软件软件采集数据。将原始数据输入GeneSpring6.0软件(SiliconGenetics)并在进一步分析之前用局部加权线性回归(LOESS)基于所有数值的分布将原始数据归一化。研究中的起始数据表明口服500和1000IU/日剂量水平的Alferon⑧耐受性好。cDNA微阵列分析鉴定出385个在两名或更多患者样品中表达量大于基线水平2倍的基因。如表2、3和4所示，与500IU/日(p<0.0001)相比在1000IU/日剂量水平观察到基因表达约增长了4倍。尽管表5(不是详尽的列表)显示了25个在^33%的患者样本中表达量大于两倍基线水平的基因。PDZ和LIN结构域5和2，-5，寡腺苷酸合成酶类似物是前五名被上调的基因。2，-5，寡腺苷酸合成酶是干扰素胞内抗病毒途径的重要组分。如图6所示，重要的是与炎性反应激活相关的基因例如肿瘤坏死因子(TNF)相关基因被下调。最近的证据表明流感A(包括禽类(H5N1)分离物)的毒力与非结构性NS1病毒蛋白与人PDZ结构域的结合能力相关并因此阻断了宿主细胞中包括干扰素途径在内的抗病毒基因的表达(Sciencexpress，2006年1月26日)。因此，口服Alferon②可上调PDZ结构域的表达这一发现增大了Alferon⑧在阻断流感病毒包括禽类(H5N1)逃避人类宿主防御机制的能力中可以具有重要作用的可能性。口服Alferon耐受性好，未有严重不良事件的报导。仅报导过数例轻微的不良事件，例如口中的金属味或胃气胀/胃胀。实验室参数没有临床显著变化并且Karnofsky氏体能表现状态(KPS)没有变化。至目前为止的实验表明口服天然人干扰素种类的生物鸡尾酒具有基于上调外周血白细胞中a-干扰素相关基因的全身生物活性。由于a-干扰素为广谱抗病毒/免疫调节分子，其具有应用于多种a-干扰素敏感疾病的潜质，包括应用于呼吸感染例如禽流感。表2剂量效应在两个或更多患者样品中表达增加^倍基线水平的基因数量剂量500IU1000IU平均值增加倍数患者编号123平均值46平均值第2天1013916.78577108卯5.4第5天1442313.7547235543.9第11天1844.344540306.9第12天15一9.0194428303.4第16天—14一1435948372.6平均值7.08.42212.5335952483.9t-检验，p-值〈0.0001(n=385)表3剂量效应在两个或更多患者样品中表达增加^2倍基线水平的基因数量剂量5歸U1000IU平均值患者编号12平均值46平均值增加倍数第2天31197.636414239.75.2第5天2263.316171616.34.9第11天1111.0333.03.0第12天12—1.57887.75.1第16天一0—02222.0>5平均值1,81.28.73.912.814.214.213.73.5t-检验，p-值〈0扁l(n=252)表4剂量效应在两个或更多的患者样品中表达增加^2倍基线水平的基因数量<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5在S3%的患者样品中表达^2倍基线水平的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1.一种在包括人在内的动物中诱导抗病毒/免疫调节应答的方法，其包括口服给予被感染的动物或人α干扰素。2.—种系统性激活固有免疫应答的方法，其包括口服给予动物或人a干扰素。3.权利要求1或2的方法，其中所述干扰素可口服或鼻腔给药，用量至少为3IU/磅动物体重。4.一种减轻易感性病毒感染的作用或对其产生抗性的方法，其包括在接触病毒之前，或在接触病毒后不久但在出现症状之前口服给予动物或人a-干扰素。5.权利要求4的方法，其中通过口服或鼻腔给予所述干扰素，用量至少为3IU/磅动物体重。6.权利要求4的方法，其中所述病毒感染为禽流感。全文摘要将人α-干扰素口服给予包括人在内的被感染动物，以在动物中诱导抗病毒/免疫调节应答。本文描述了对病毒(包括禽流感)产生抗性或减轻该病毒接触作用的方法。文档编号C07K14/56GK101437534SQ200780016132公开日2009年5月20日申请日期2007年3月6日优先权日2006年3月8日发明者D·斯特拉耶,W·A·卡特申请人:半球生物制药公司