表面核仁素的多价合成配体在治疗癌症或发炎中的用途的制作方法

专利名称：表面核仁素的多价合成配体在治疗癌症或发炎中的用途的制作方法
表面核仁素的多价合成配体在治疗癌症或发炎中的用途
本发明涉及一种多价合成化合物在制备用于治疗涉及细胞增殖和/或血管生成 下调的疾病以及优选地作为表面核仁素配体的药物中的用途，该化合物包含或者 由一个载体(support)组成，在所述载体上至少三个假肽单元被接枝，该化合物通式
(I)为 Met/Cys标记的全核仁素和N-和l C-术端部分(分别含有氨基酸1-707， 1-308和 309-707)。然后以生物素化的HB19来温育标记的粗产物，复合体在亲和素-琼脂糖 柱上纯化。如所期望的，全核仁素与HB19相互作用。另一方面，富含酸性残基的 核仁素的N-末端部分根本不与该化合物相互作用，而核仁素的C-末端含有HB19 的靶位(14)。鉴定了含有HB19靶位的核仁素的C-末端后，制造了这个区域的各种 构建体(N。l-9)。第一个构建体对应于编码人核仁素(包括4个RBD和RGG结构域) 的C-末端部分的cDNA，与GST蛋白(谷胱甘肽S-转移酶)融合以进行用抗-GST抗 体的检测。其它的构建体，也是与GST融合，对应于同样的部分但一个或多个较 短结构域。所有这些蛋白以五.co/Z产生。HB19与每个构建体相互作用的能力这样 测定将表达不同的核仁素构建体的细菌粗提物与生物素化的HB19温育，然后固 定于亲和素-琼脂糖以进行纯化。然后以聚丙烯酰胺凝胶和GST分析这些样品，使 用抗-GST抗体以免疫检测(Westem Blot)显示。结果表明RGG结构域的存在对于 HB19与核仁素的C-末端部分相互作用是必需的。而且，RGG结构域自身对这种 相互作用已足够。
图2.A.化合物HB19的结构。B.三价化合物Nucant01的结构，所述Nucant 01具有环形六肽作为载体，所述环形六肽由交替的D构型的丙氨酸残基(A)禾口 L 构型的赖氨酸残基(K)组成。3个假肽单元KvPR(v^CH2-N)共价连接至每个赖氨酸 残基(K)的s氨基基团；C.五价化合物Nucant 2(SEQ ID NO: 10)的结构，所述Nucant 2具有直链肽作为载体，所述直链肽具有SEQIDNO: 8序列的螺旋面结构，其中 5个假肽单元Kv]/PR(fCH2-N)共价逢接至5个赖氨酸残基中的每个的s氨基基团，Ac代表CH3-CO-基团；D.五价化合物Nucant 3(SEQ ID NO: ll)的结构，所述 Nucant 3具有直链肽作为载体，所述直链肽具有SEQ ID NO: 9序列的螺旋面结构， 其中5个假肽单元KyPRO-CH2-N)共价连接至5个赖氨酸残基(K)中的每个的e氨 基基团，Ac代表CH3-CO-基团。E.六价化合物Nucant 6(SEQ ID NO: 16)的结构， 所述Nucant 6具有直链肽作为载体，所述直链肽具有SEQ ID NO: 15序列的螺旋 面结构，其中5个假肽单元KvPR(vi/《H2-N)共价连接至6个赖氨酸残基(K)中的每 个的s氨基基团，Ac代表CH3-CO-基团。F.六价化合物Nucant 7(SEQ ID NO: 17)的结构，所述Nucant 7具有直链肽作为载体，所述直链肽具有SEQ ID NO: 13 序列的螺旋面结构，其中6个假肽单元KvPR(x^CH2-N)共价连接至6个赖氨酸残 基(K)中的每个的s氨基基团，Ac代表CH3-CO-基团。
图3. A.抗-核仁素(抗Nu)， B.同位型IgG， C.肽F3和D. HB-19在经HARP 刺激的NIH-3T3细胞增殖中的效应。在所示浓度的HB19存在或不存在的情况下， 不剌激或以4 nM HARP刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测定氚 化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果以相对于经HARP刺激的对照(100%)的百分 率给出。MSD(起点)，(**p<0.01， ***p<0.001)。
图4.以HB19预处理NIH-3T3细胞1个小时在HARP诱导的增殖中的效应。 NIH-3T3细胞以HB19处理1个小时，然后洗涤，不刺激或以3.6 nM HARP刺激。 温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果以相对于经HARP 刺激的对照(100%)的百分率给出。MSD(起点)，(**p<0.01， ***p<0.001)。
图5. HB-19在经0.2 nM FGF-2(A)刺激或5。/。胎牛血清(B)刺激的NIH-3T3细胞 增殖中的效应。在所示浓度的HB19存在或不存在的情况下，以FGF-2或5%血清 刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞 增殖。结果以相对于经HARP刺激对照(100。/。)的百分率给出。MSD(起点)， (**p<0.01， ***p<0.001)。
图6.抗-核仁素(抗Nu)(A)， IgG同位型(B)和HB-19(C)对MDA-MB231在湿 琼脂上生长的效应。MDA-MB231细胞在培养基上培养，所述培养基在0.6%琼脂 基质上含有0.35%琼脂。培养10天后，直径大于50 的克隆被计数。每孔5个 区域，每个点三次重复("pO.Ol)。
图7.抗-核仁素(抗Nu)(A)和HB19(B)对B16-BL6在湿琼脂上生长的效应。 B16-BL6细胞在培养基上培养，所述培养基在0.6%琼脂基质上含有0.35%琼脂。 培养10天后，直径大于50 的克隆被计数。每孔5个区域，每个点三次重复 (*p<0.05， **p<0.01)。
图8. HB-19在血管生成中的效应。A. HB-19在HUVEC细胞体外增殖中的效 应。20000个HUVEC细胞在孔中培养，每天加入不同浓度的化合物HB19。处理 6天后对细胞计数。B.也测定了 HB19(1 pM)在HUVEC细胞分化中的效应，所述 HUVEC细胞在HARP血管生成因子(l nM); VEGF(l nM)和FGF-2(3 nM)存在下以
22三维胶原凝胶培养。结果以任意单位表现。C.体内血管生成模型(matrigel插入检 领ij)(matrigel plug assay)中，HB-19在HARP或FGF-2引发的血管生成中的效应。 将含有所示浓度的分子的matrigel(300 pl)经皮下注射入小鼠。l周后杀死小鼠，除 去matrigd。进行8 ^m厚的切片。染色后，通过图像分析估计内皮细胞的数目。 对于每个matrigel，每个实验点分析5个切片和4只小鼠。
图9. MDA-MB231异种移植模型中，HB-19在肿瘤生长中的效应。人乳腺癌 MDA-MB231细胞经皮下注射入无胸腺小鼠(裸)。当肿瘤达到200 mm3的体积时， 以图A中所示的皮下途径处理小鼠。B.在第40天杀死的小鼠中肿瘤的观测和测 量。C.在第40天杀死的小鼠的肿瘤重量。


图10.MDA-MB231异种移植模型中，HB-19在肿瘤生长中的效应。肿瘤生长 的变化。腹腔内(IP)或皮下(SC)注射。
图11.MDA-MB231异种移植模型中，HB-19在转移的肿瘤细胞中的效应。使 用抗HLA-DR抗体，以流式细胞仪(FACS)研究经HB-19处理或未处理的异种移植 小鼠血液中的MDA-MB231细胞。HLA-DR+被环绕，标明了 HLA-DR+细胞在血细 胞中的百分率。A.没有MDA-MB231异种移植的小鼠的血液，未处理，HLA-DR+ 细胞在外周血细胞中的百分率0.36%。 B.没有MDA-MB231异种移植的小鼠的 血液，未处理，HLA-DR+细胞在外周血细胞中的百分率22.2%。 C.具有 MDA-MB231异种移植的小鼠的血液，以HB19经皮下途径处理，HLA-DR+细胞 在外周血细胞中的百分率0.1%。 D.具有MDA-MB231异种移植的小鼠的血液， 以HB19经皮下途径处理，HLA-DR+细胞在外周血细胞中的百分率0.31%。
图12. HB-19和Nucant 01在经HARP刺激的NIH-3T3细胞生长中的效应。在 所示浓度的HB19或Nucant 01存在的情况下，不刺激或以4 nM HARP刺激静止 的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结 果(3个点的平均值)以相对于对照的细胞增殖百分率给出，所述对照在无HB19和 Nucant 01存在下经HARP刺激(100%细胞增殖)。
图13. HB19、 Nucant 2和Nucant 3在经HARP刺激的NIH-3T3细胞生长中的 效应。在所示浓度(O.l ， 0.25和0.5^M)的HB19、 Nucant 2或Nucant 3存在的情况 下，不刺激或以4 nM HARP刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测 定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果(3个点的平均值)以相对于经HARP刺激 的对照的百分率(100%细胞增殖)给出。同时给出了 IC50浓度(相对于经HARP刺 激的对照，导致细胞增殖抑制50%的浓度)。
图14. NUCANT 3， 6和7在经5% FCS刺激的NIH-3T3细胞增殖中的效应。 在浓度范围为0.125至2 的NUCANT 3， 6和7存在或不存在的情况下，以5% FCS刺激MH-3T3细胞。所述NIH-3T3细胞经血清剥夺而成为静止的。温育24 小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果以相对于经5%FCS刺激 的对照细胞的百分率给出。IDso以点线表示。
23图15. Nucant 6和Nucant 7比HB19表现出更好的抗表面核仁素活性。ID50: 抑制表面核仁素50%的浓度，以pM表示；ID95:抑制表面核仁素95%的浓度，以 )iM表示。
图16.HB-19、 Nucant 3、 Nucant 6和Nucant 7对MDA-MB231细胞表达核仁 素的抑制效应。MDA-MB231细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中在75cm2培养。 培养2天后，以10 的HB-19(线1)、Nucant 3(线2)、Nucant 6(线3)或Nucant 7(线 4)处理分汇合(subconfluent;)细胞(每瓶约3 x 106个细胞)24或48个小时。线C代表 未经处理的细胞。处理24或48小时后，以PBS洗涤细胞，以10 ml含有1%胎牛 血清和生物素化的HB-19(5 pM)的DMEM在室温下温育45分钟。以含有1 mM EDTA的PBS(PBS-EDTA)彻底洗涤后，用含有20 mM Tris HC1， pH 7.6， 150 mM NaCl， 5 mM MgCl2， 0.2 mM苯甲基磺酰氟化物，5 mM (3-巯基乙醇，抑肽酶(1000 U/nil)和0.5% TritonX-100的裂解缓冲液制备胞质提取物。使用PBS-EDTA中的亲 禾口素-琼月旨茅唐(lOO)al; ImmunoPure Immobilized Avidin, Pierce Chemical Company, USA)从纯化提取物分离表面核仁素和生物素化的HB-19之间形成的复合体。在 4"温育2小时后，亲和素-琼脂糖样品以PBS-EDTA彻底洗涤。这些含有纯化的 表面核仁素的样品(A;対'应于2 x 106个细胞的材料)和细胞粗提物(3和C;对应于 4x 105个细胞的材料)在含有SDS的电泳缓冲液中变性，通过SDS-PAGE分析。表 面核仁素的存在使用D3单克隆抗体(A和B)以免疫杂交显示。C中显示了考马斯 蓝染色后的电泳分析。线M对应于分子重量标记物。
图17.体外CAM模型中血管生成的抑制。含有或不含有(对照)HB-19(10 pM; 0.6吗)或Nucant 7(10 iaM; 0.8吗)的20 |il水沉淀至CAM表面。温育48小时后进 行血管的观测。
图18. HB-19对经各种LPS制备物刺激的人初级外周单核细胞(PBMC)产生 TNF-a的抑制。使用人全血EDTA-钾通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC并重悬 于含有1%人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640。在HB-19不存在(O)或存在(l和5 ^M)的情况下，以100ng/ml的来自大肠杆菌(&t'/;er/c/2/a co/Z)型0111: B4和055: B5的LPS以及来自肠道沙门氏菌(5b/附o恥〃a e"fen'ca)血清型Re 595的LPS刺激浓 度为1(^个细胞/0.5ml的细胞。同样的PBMC以20 ng/ml: 1 pM的PMA:伊屋诺 霉素(Ionomycin)(佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯伊屋诺霉素)刺激。在37。C下5% C02的温育箱中温育PBMC培养物。温育20小时后收集培养物上清，以ELISA 测定TNF-a的水平。
图19. HB-19对经各种LPS制备物刺激的鼠腹膜初级巨噬细胞产生TNF-a和 IL-6的抑制。在4iiMHB-19不存在(-)或存在(+)的情况下，不刺激(B4 0)或以浓度 为100 ng/ml(B4 IOO)和1000 ng/ml(B4 IOOO)的來自大肠杆菌(Eyc/2en'c/^ co")型 0111: B4的LPS刺激鼠腹膜巨噬细胞。在37"下5%(302的温育箱中温育细胞培 养物20小时。以ELISA测定TNF-a(A)和IL-6(B)的水平。图20. Nucant 7对经各种LPS刺激的鼠腹膜初级巨噬细胞产生TNF-a和IL-6 的抑制。在10pMNucant7不存在(-)或存在(+)的情况下，不刺激(-)或以浓度为10 ng/ml， 100 ng/ml和1000 ng/ml的来自大肠杆菌(&cfen'c/u'a co/f)型0111: B4的LPS 刺激(+)鼠腹膜巨噬细胞。在37'C下5% C02的温育箱中温育细胞培养物20小时。 以ELISA测定TNF-a(A)和IL-6(B)的水平。
图21. HB-19对经LPS刺激的人脐带血管内皮细胞(HUVEC)产生IL-8和表达 ICAM-l的抑制。HUVEC细胞以10000个细胞/cn^在96孔板中以含有2%胎牛血 清的EBM-2培养液进行培养。在5 |iM HB-19不存在或存在的情况下，以100 ng/ml 的大肠杆菌(&c/ en'c/z/a co/Z)血清型055: B5刺激细胞。在37。C下5% C02的温育 箱中温育细胞培养物20小时。以ELISA测定IL-8和ICAM-1蛋白水平。在5 HB-19存在或不存在的情况下，HUVEC细胞用作对照，作为基础水平。
图22. HB-19对经热灭活的金黄色酿脓葡萄球菌(Stop/zj^cocc^ m^^)(HKSA，热杀死的金黄色酿脓葡萄球菌)刺激的人初级外周单核细胞(PBMC) 产生TNF-ot和IL-6的抑制。使用人全血EDTA-钾通过Ficoll密度梯度离心分离 PBMC并重悬于含有1%人血清AB(Invi加gen)的RPMI 1640。在HB-19、 Nucant 3、 Nucant 6或Nucant 7(10 iiM)或地塞米松(Dexamethasone)(Dex. 1 |ig/ml)不存在(对 照)或存在的情况下，以108个HKSA/ml的颗粒(InvivoGen, San Diego, USA)刺激浓 度为106个细胞/0.5ml的细胞。在37。C下5% C02的温育箱中温育PBMC培养物。 温育20小时后收集培养物上清，以ELISA测定TNF-a(A)和IL-6(B)的水平。
实施例
1.1五价化合物HB19对体外肿瘤生长的效应
l丄l表面核仁素在锚定依赖性细胞增殖中的作用和HB-19对这种增殖的抑 制效应
在一系列实验中研究了核仁素在HARP分子的生物活性中的作用在特异性 识别核仁素的单克隆抗体存在或不存在的情况下评估HARP的有丝分裂活性，所 述有丝分裂活性通过测定NIH 3T3细胞的氖化胸苷的引入而进行测试。结果表明， 这个抗体通过剂量依赖性方式在NIH 3T3细胞中抑制HARP的有丝分裂活性(图 3A)。
加入50 nM的抗-核仁素抗体完全抑制了来自4 nM HARP的有丝分裂活性， 而针对相同同位型的核仁素的非特异性抗体对HARP诱导的增殖没有效应。无论 所用的免疫球蛋白浓度如何，总是这样，因此证明了所观测到的抑制的特异性(图 3B)。
肽F3和化合物HB19是核仁素的两个配体。肽F3结合至核仁素的N-末端部 分(包含酸性氨基酸区域(9))，相反，化合物19结合至位于核仁素的C-末端部分的RGG结构域(见图1)。也表明了化合物HB19特异性结合至细胞表面不受肽F3存 在的影响(本发明人以FACS进行的实验)。
' 本发明人研究了肽F3和五价化合物HB19是否能够抑制生长因子HARP引发 的NIH-3T3细胞的细胞增殖。因此在相同系列实验中，测定了化合物HB19和肽 F3的效应(特异性结合至表面核仁素)。
肽F3的结果在图3C中给出，毫不含糊地表明像IgG抗体一样，肽F3不引 起对HARP引发的NIH 3T3增殖的抑制。
HB19的结果在图3D中给出，表明HB-19引起对HARP引发的NIH3T3增 殖的剂量依赖性抑制。加入0.5 的HB-19引起对4 nM的HARP引发的效应的 81 %的抑制。这清楚地表明 一个能够内化而带来增殖抑制的核仁素配体是不够的；
暗示了为了有效，'核仁素配体必须是多价的并可结合至一个或多个核仁素分子
的C-末端结构域的一个或多个RGG单元。
此外，有趣的是，注意到当细胞以各种浓度的HB-19预处理1小时、洗涤然 后以HARP剌激时，可观测到水平相当的抑制(图4)。这个结果表明HB-19结合至 NIH 3T3上存在的表面核仁素，因此在一个小时后抑制由HARP引发的细胞增殖。
为了研究HB-19对抑制细胞增殖的效应是不是对给定的生长因子例如HARP 是特异性的，进行了两个系列实验，其在于研究HB-19对NIH 3T3细胞的效应， 所述NIH 3T3细胞由以下刺激
-FGF-2,另一个生长因子，或
-含有各种生长因子的混合物的5%胎牛血清。
这些实验的结果表示在图5中，其表明HB-19在浓度为0.5 pM时能够抑制 FGF-2(A)或胎牛血清(B)引发的细胞增殖。
因此，结果表明，总的来说，HB-19能够体外抑制肿瘤细胞的增殖。不管所 用来引发细胞增殖的试剂是什么，情况都是这样。
l丄2核仁素在锚定依赖性细胞增殖中的作用和HB-19对这种增殖的抑制效 应
与细胞增殖的研究相平行，使用人类乳腺癌细胞系MDA-MB231和鼠黑素瘤 细胞系B16-BL6在湿琼脂上以一个生长模型测定了核仁素在锚定非依赖性细胞生 长中的作用，和转化细胞的表型特征。
在这些实验中，在各种浓度的对照抗-核仁素抗体、对照免疫球蛋白或化合物 HB-19存在或不存在的情况下，在琼脂凝胶上培养细胞。在37。C下温育IO天后， 对每个培养板上存在的克隆数目计数。如图6所示，以O.l ^M抗-核仁素(A)处理 的培养物的克隆数目下降60%，而以相同的同位型免疫球蛋白处理的培养物中未 发现有效应(B)。
更特别的，相对于对照，也发现了以HB-19处理的培养物中克隆数目的抑制， 其为剂量依赖性方式。在以1 nM HB-19处理的培养物中观测到克隆数目减少59%(图6C)。
使用鼠黑素瘤例如B16-BL6作为靶细胞得到了类似的结果。结果显示于图7。 对结果的分析表明抗-核仁素抗体(A)和HB-19分子(B)都以剂量依赖性方式抑制 湿琼脂上B16-BL6的生长。在l ^M的HB-19存在下，观测到超过50%的克隆数 目的抑制。
这套结果证明化合物HB-19对锚定非依赖性细胞生长具有抑制效应。这对
两个细胞模型，人乳腺癌和鼠黑素瘤都是正确的。
1.2五价化合物HB19对血管生成因子引发的血管生成的效应 鉴于表面核仁素存在于激活的内皮细胞表面(9)，测定了 HB-19对内皮细胞分
化的效应。
首先，在内皮细胞的体外增殖中测试了这种效应(HUVEC:人脐带血管内皮细 胞)。培养每孔20000个HUVEC细胞并在每天加入不同浓度的化合物HB19。处理 6天后对细胞计数。结果在图8A中给出，其表明与Huang等人的文章(16)中所 用的抗-核仁素多克隆抗体制备物相反，HB19引起内皮细胞增殖的抑制。
也测定了 HB19(1 ^M)的存在对HUVEC细胞分化的效应，所述HUVEC细胞 在HARP血管新生因子(angiogens)(l nM)、 VEGF(l nM)和FGF-2(3 nM)存在下在三 维胶原凝胶培养。4天后，对管网结构计数。结果以任意单位表示于图8B，其表 明，HB19也抑制血管生成因子存在下在三维胶原凝胶培养的HUVEC细胞的分 化。
最后，在体内血管生成模型中测定了 HB-19对内皮细胞分化的效应。这个测 试模拟弓1起血管形成的过程的第 一个时期。
这个血管生成实验模型在于，以含有待分析其血管生成刺激或抑制特性物质 的matrigel经皮下注射小鼠。1周后除去matrigel，进行组织切片，在免疫组化后 以图像分析对内皮细胞(CD31+，因子VIII+)的数目进行定量。如图8中所示，HB-19 自身对matrigel中内皮细胞的补充无效应。另一方面，它抑制HARP或FGF-2引 发的血管生成。
对结果的分析表明HB-19能够抑制促血管生成因子例如FGF-2或HARP引 发的血管生成。这显示了 HB-19(特异性靶向血管生成中相关的内皮细胞)的一般的
血管生成效应。
因此，化合物HB19彻底地抑制HARP、 VEGF和FGF-2引发的HUVEC细胞
的增殖和分化。因此它具有比黄等人的文章(16)所用的抗-核仁素单克隆抗体更加 显著的效应。
使用内皮细胞作为抗癌靶细胞具有几个优点。与肿瘤细胞所呈现的遗传不稳 定相反，内皮细胞在遗传上是极其稳定的，因此限制了抗性机制。而且，由于分 子靶标是表面核仁素，HB-19主要靶向激活的内皮细胞从而靶向那些己进入新血 管生成期的。应该注意，肿瘤内皮细胞比正常内皮细胞分裂快70倍，这就是为何
27肿瘤内皮细胞是主要的靶点，从而限制了潜在的副作用。 1.3五价化合物HB19的体内抗肿瘤效应
在无胸腺小鼠的肿瘤生长模型中测试了五价化合物HB-19在体内对肿瘤生长 的效应。在本实验中，靶细胞起源自人乳腺癌MDA-MB231。
以2 x 106个细胞在腰窝处注射每组4只无胸腺(裸/裸)小鼠。当肿瘤体体积达 到至少200 mm3时，每两天以100 pl的PBS溶液(对照组)或HB-19溶液(5 mg/kg) 或一种广泛使用的临床试剂它莫西芬(tamoxifen，也称为紫杉醇，10 mg/kg)注射肿 瘤(癌周的或皮下途径)来处理小鼠，或者不处理小鼠。在第7、 14、 21、 28、 34 和40天以卡钳测量肿瘤体积。
结果在图8中显示，其表明相对于未处理的对照小鼠(具有7倍大的肿瘤体 积)，以5 mg/kg的剂量使用肽HB-19引起肿瘤生长的抑制。
此外，尽管经它莫西芬处理的小鼠其肿瘤体积从处理丌始没有显著性变化， 但是以HB-19处理的小鼠的肿瘤在处理21天后已检测不到(图9A)。虽然它莫西芬 在10 mg/kg只是引起肿瘤体积的稳定或部分退化，五价化合物HB-19在5 mg/kg 实际上引起明显的总肿瘤退化。
为了对照这些结果，在处理40天后杀死小鼠，除去肿瘤并称重。未处理的小 鼠的平均肿瘤重量为0.22 g(分布于0.083-0.34 g)，经10 mg/kg它莫西芬处理的为 0.06 g(分布于0.006-0.22 g)，以HB-19处理的小鼠中未发现肿瘤(图9B和C)，因 此确定了经体外测量大小来估计的肿瘤体积。
在另一个实验中，经腹腔内(IP)途径和癌周(SC)途径使用HB19(5 mg/kg)(图 10)。结果表明，通过腹腔内(IP)途径和癌周(SC)途径，HB-19的抗癌作用是同样有 效的，不仅证明了五价化合物HB-19的未预料到的功效，而且证明了其在体内肿 瘤位置的生物可利用率，包括全身使用的情况。
也应该注意，在HB-19处理的过程中，在经处理的小鼠中没有观测到不JH常 的生理或行为迹象。而且，在实验末尾对器官的解剖学检验没有揭示任何的组织 毒性的可见迹象，或者任何的血管和血小板计数上的变化。
此外，在经HB-19处理的异种移植小鼠的外周血细胞中，不可能检测HLA-DR+ 人类细胞(从而检测MDA-MB231肿瘤细胞)(图11)。事实上，与未处理小鼠(PBS)(其 中MDA-MB231细胞(HLA-DR+)的比例代表外周血细胞的22.2%)相反，在经皮下 或腹腔内以HB-19处理的小鼠的情况下，这个比例只有0.1%至0.31%。这些结果 暗示，HB-19也能够在血液中防止肿瘤细胞循环，从而防止转移现象。
1.4继
实施例2中呈现的结果表明，因为其在肿瘤生长和血管生成上的双效应，五 价化合物HB-19是细胞增殖有利的抑制剂。这些观测在体内模型(其表明，在无胸 腺小鼠的PC3细胞异种移植模型中，癌周注射HB-19的处理能够诱导肿瘤的抑制 甚至是退化)中经过了确认，并且没有组织毒性。' 与在癌症治疗中常规使用的处理例如紫杉醇相比，实验模型中所用的HB-19 似乎更有效。与它莫西芬相比HB-19这种更强的功效可能来源于HB-19对肿瘤生 长和肿瘤增殖所需的血管形成都具有抑制效应。不管是肿瘤细胞还是激活的内皮 细胞的情况，HB-19靶向并阻断这两种类型细胞的增殖。
存在很多具有抑制肿瘤细胞增殖特性的细胞。这些分子通常具有效应，而没 有细胞靶点。实际上，对于很多化疗试剂，肿瘤细胞中存在的分子靶点也在正常 细胞中发现，这就解释了这种治疗的很多副作用。经靶向的生物试剂具有较少的 副作用，因为它们阻断的目标不存在于正常细胞中或只是很少地存在于正常细胞 中。激活细胞表面存在的核仁素响应这种特性，因此成为癌症治疗中理想的治疗 靶点。应着重注意，我们不仅靶向癌细胞而且靶向激活的内皮细胞。而且，表面 核仁素似乎不限于一种特定类型的癌症。
双靶向(肿瘤细胞本身和激活的内皮细胞)的功效应该与Genentech所进行的一 项研究(其表明，在一个随机试验中，抗增殖试剂(5-氟尿嘧啶)与抗血管生成试剂(阿 瓦斯丁(Avastin))结合对人结肠直肠癌的情况有很高的功效)的结果相比较。在III 期临床试验中，在以前未经处理的转移的结肠直肠癌个体中，阿瓦斯丁处理作为 化疗(依列替康(irinotecan)/5-氟尿嘧啶/亚叶酸(leucovorin))的补充，将生存率显著延 长了平均5个月(20.3个月，与15.6个月相比)。在这些病人中发现，与只接受化疗 的病人相比，肿瘤不生长的时间长度，从6.2个月增长到10.6个月(29)。
这种对肿瘤细胞和内皮细胞的双效应使HB-19成为癌症治疗中可选择的一种 分子。
实盧辨2.三份众合激7V"cfl/" 0/游拔#/#活丝 2.1三价化合物Nucant 01的合成
三价化合物Nucant 01的化学结构在图2B中给出。这个化合物具有环形六肽 作为载体，所述环形六肽由交替的D构型的丙氨酸残基(A)和L构型的赖氨酸残基 (K)组成。3个KVPR单元(v^CH2-NH)共价连接至3个赖氨酸残基(K)中的每个的s
氨基基团。
化合物Nucant 01的合成包括将KVPR单元共价连接至三元对称碳环核心分 子。核心分子的合成如S. Foumd等人(30)所描述。在氯三苯甲基型树脂上使用根 据Fmoc化学的标准固相合成技术组装经保护的Ki)/PR单元，然后在弱酸性条件下 从树脂上切割下来。然后，以1.1 KVPRyi个环形分子的化学计量学标准将经保护 的Kv)/PR单元连接至核心分子的每个赖氨酸残基(K)的s NH2基团。根据BOP/HoBt 激活程序进行连接，持续48小时。在反应末尾，在三氟乙酸中切割保护Ki]/PR单 元的基团，在醚中沉淀最终的化合物。通过HPLC纯化程序末尾所获得的Nucaiit 01 分子，并以质谱进行完全的描述。
2.2 Nucant 01在体外对肿瘤细胞增殖的抑制活性
将Nucant 01对经HARP刺激的NIH-3T3细胞增殖的效应与五价化合物HB-19进行了比较。在所示浓度(O.l， 0.2， 0.4， 1， 2和4^M)的HB19或Nucant01存在 的情况下，不刺激或以4 nM HARP刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后， 通过测定氚化胸苷的引入来确定NIH-3T3细胞的增殖，如前所述。
与HB19和Nucant 01不存在的情况下经HARP刺激的对照(100%细胞增殖) 相比较发现，化合物Nucant Ol(对于KPR单元只是三价的)在2 的浓度下也引 起对经HARP刺激的NIH-3T3细胞增殖的50%的抑制。因此这个结果证明，具有 至少3个接枝到环肽上的通式(I)的假肽单元的合成多价化合物可能和五价化合物 HB-19(其载体是直链肽)以同样的方式来抑制由HARP引发的肿瘤细胞的增殖。
所需要的浓度比达到同样水平的抑制所需的HB-19的浓度(0.2 高10倍， 但是化合物Nucant 01只具有3个通式(I)的假肽单元而化合物HB-19具有5个。
因此，增加接枝到环肽上的通式(I)的假肽单元的数目(如Nucant 01中所用)至 4或5可能进一步增加该化合物的功效，可能至100倍。
2.3结论
这些结果清晰地表明了通式(I)的假肽单元的多价态形式对本发明中所用化合 物的活性的重要性，可使用众多的载体，可使用直链肽或环肽而不影响该化合物 的功效。
因此可同样使用其它可接受的载体，只要它们允许至少3个，优选3至8个， 优选4至6个，优选5或6个通式(I)的假肽单元接枝到它们上面。 ^^"萍丄五份众会激7V"cfl/" 2 ,TV"oh" J游拔/^^舒丝 3.1五价化合物Nucant 2和Nucant 3的合成
通过固相合成来组装两个已知的采用螺旋面结构的肽载体(其上锚定了 KVPR 单元)。这些载体由重复的序列单元组成，连接起来5次对于NUCANT 2为 Aib-Lys-Aib-Gly，对于NUCANT 3为Lys-Aib-Gly。以Boc化学的方式进行组装。 然后通过DMF中的哌啶处理(3次，5分钟)切割来除去侧链上的赖氨酸残基的保护 性Fmoc基团。赖氨酸的5个s NH2基团作为KyPR单元(i^CH2-N)的支撑点。以 氢氟酸进行最后的切割。经过在醚中沉淀肽、在水性条件下分解和冷冻-干燥之后， 通过HPLC纯化NUCANT 2和NUCANT 3类似物并以质谱分析，然后冻干。
3.2 Nucant 2和Nucant 3在体外对肿瘤细胞增殖的抑制活性
将Nucant 2和Nucant 3对HARP引发的NIH-3T3细胞增殖的效应与五价化合 物HB-19进行了比较。在所示浓度(0.1 ， 0.25和0.5 [aM)的HB19、Nucant 2或Nucant 3存在的情况下，不刺激或以4 nM HARP刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小 时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定NIH-3T3细胞的增殖，如前所述。
在本实验中，HB19抑制的IC50为0.1 pM。 Nucant 2和Nucant 3以剂量依赖 性方式抑制细胞增殖，其IC50为1.5 nM。
因此五价化合物Nucant 2和Nucant 3能够以剂量依赖性方式抑制细胞增殖， 其IC50(引起细胞增殖抑制50%的浓度)与化合物HB19非常类似。也将Nucant 3对5% FCS处理的NIH-3T3细胞增殖的效应与五价化合物HB-19 进行了比较。在不同浓度(介于0.125至2pM)的NUCANT3， 6或7存在或不存在 的情况下，以5。/。FCS刺激静止的NIH-3T3细胞(通过血清剥夺来使其静止)。温育 24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞的增殖，如前所述。
结果表示于图14中，以相对于经5。/。FCS剌激的对照细胞的百分率表示。结 果表明NUCANT 3对细胞增殖具有抑制效应。对图表的分析表明NUCANT 3具有 和HB-19分子相似但比其稍低的IDso值(抑制50%的剂量)，因此其效应比HB-19 稍低。没有观察到NUCANT 3对未经刺激的细胞的效应，表明这些分子无任何毒 性。
3.3结论
这些结果亦表明通式(I)的假肽单元的多价态形式对本发明中所用化合物活性 的重要性，所用载体完全可以是含有或不含有结构元件((3折叠，卩片层)的直链肽， 具有螺旋面结构的直链肽甚至是环形化合物，而不影响该结构的功效。
因此可互换地使用各种可接受的载体，只要它们允许至少3个，优选3至8 个，优选4至6个，优选5或6个通式(I)的假肽单元接枝到它们上面。
,^"錄4 7V份众合激7V"o/W 6 ,7V"omZ 7游拔,^T活丝
4.1六价化合物Nucant 6和Nucant 7的合成
使用和五价化合物Nucant 2和Nucant 3相同的合成过程获得这些六价化合物。 4.2 Nucaiit 6和Nucant 7在体外对肿瘤细胞增殖的抑制活性 将Nucant 6和Nucant 7对5% FCS处理的NIH-3T3细胞增殖的效应与五价化 合物HB-19进行了比较。在不同浓度(介于0.125至2 pM)的NUCANT 3， 6或7 存在的情况下，以5% FCS刺激静止的NIH-3T3细胞(通过血清剥夺来使其静止)。 温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞的增殖，如前所述。
结果表示于图14中，以相对于经5。/。FCS刺激的对照细胞的百分率表示。结 果表明NUCANT 6和7对细胞增殖具有抑制效应。NUCANT 6和7具有和HB-19 分子相似但比其稍低的ID5o值(抑制50%的剂量)，因此其效应比HB-19稍低。没 有观察到NUCANT 6或7对未经刺激的细胞的效应，表明这些分子无任何毒性。 4.3结论
这些结果进一歩证明通式(I)的假肽单元的多价态形式对本发明中所用化合物 的活性的重要性，所用载体完全可以是含有或不含有结构元件(P折叠，P片层)的 直链肽，具有螺旋面结构的直链肽甚至是环形化合物，而不影响该结构的功效。
特别地，具有6个假肽单元的形式似乎在获得所需要的抗增殖和抗血管生成 方面更加有效。
TV"函,6颠"謹f 7更微表, 鄉鄉 5.1 Nucant 6和Nucant 7是比HB-19更强的抑制剂并且抑制表面核仁素的活 性使用我们以前描述的技术(13)在HelaP4细胞中测定了表面核仁素的活性。 结果表示于图15中，其表明Nucant 3对表面核仁素活性的抑制与HB-19相 当。另一方面，Nucant 6和Nucant 7具有比HB-19更大的抗表面核仁素活性。HB-19 和Nucant 3的IDso值(抑制50%的剂量)为介于0.1-0.2 ^M，而Nucant 6和Nucant 7 的IDso值低于0.1 pM。此外，Nucant 6和Nucant 7在0.8|iM下引起对表面核仁素 活性超过95%的抑制。
5.2 HB-19, Nucant 3， 6和7引起人乳癌细胞MDA-MB231中表面核仁素的
抑制
表面核仁素在增殖和肿瘤血管生成中扮演重要角色。HB-19以及相关的分子 Nucant 3， Nucant 6和Nucant 7特异性结合至表面核仁素，因此阻断肿瘤生长和血 管生成。在这些假肽结合至表面核仁素之后，复合体[假肽-核仁素]通过主动过程 被迅速内在化。这些结果显示于图16A中，其表明，与未经处理的细胞相比，以 HB-19(线1)、 Nucant 3(线2)、 Nucant 6(线3)或Nucant 7(线4)处理细胞导致表面核 仁素存在的减少。在处理24小时后而且在处理48小时后观察到这个减少，在处 理48小时后核仁素已检测不到。
有趣的是，和以HB-19及Nucant 3(线1和2)处理的细胞相比，以假肽Nucant 6及Nucant 7(线3和4)处理24小时的细胞中表面核仁素的减少要大得多。在处理 48小时后有同样的观测结果。应该着重注意，表面核仁素的减少不是表面核仁素 细胞内数量减少的结果。事实上，在未经处理和经HB-19或各种类型的Nucant处 理的细胞的提取物中发现了同样数量的核仁素(图16B)。类似地，发现从未经处 理和经HB-19或各种类型的Nucant处理的细胞中提取的蛋白，其电泳图谱没有差 异。这个结果表明蛋白合成不受HB-19或不同类型Nucant研究的影响。此外， 有趣的是，HB-19和所研究的各种类型的Nucant没有细胞毒性效应(其可能解释所 观测到的表面核仁素的减少)。
5.3结论
这一套结果表明
a) 核仁素在肿瘤细胞表面大量表达，例如在人乳癌细胞(MDA-MB231)中。
b) 以HB-19 、 Nucant 3 、 Nucant 6和Nucant 7处理引发细胞表面存在的核仁素 "库"显著的减少。
c) 假肽Nucant 6和Nucant 7对于产生细胞表面存在的核仁素"库"的减少以 及抑制表面核仁素活性方面更加有效。
//7iV顏"7,i散成游资座
方法
在体外血管生成模型(鸡胚绒毛尿囊膜，CAM)中测试了 HB-19和Nucant 7对
血管生成的效应。
将含有或不含有(对照)HB-19(10 0.6吗)或Nucant 7(10 ^M; 0.8 pg)的20 )il
32水沉淀至CAM表面。温育48小时后进行血管的观测。 结果
结果显示于图17中，其表明温育48小时后HB-19和Nucant 7清晰地引起 血管生成的抑制。图像分析研究(不仅考虑毛细血管长度，而且考虑分支的数目) 显示了在区域中相对于对照来说50%的抑制。
,嚴萍7.船激朋"颠腦"/ 7舰炎i^舒丝
7.1 HB-19对经LPS刺激的人初级PBMC产生TNF-a的抑制 方法
使用人全血EDTA-钾通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC并重悬于含有1% 人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640。在HB-19不存在(O)或存在(l和5 nM)的情况 下，以100ng/ml的来自大肠杆菌(&c/2en'c/7/aco/Z)型0111: B4和055: B5的LPS 以及来自肠道沙门氏菌(Sa/,"o脱〃a e^en'ca)血清型Re 595的LPS刺激浓度为106 个细胞/0.5ml的细胞。同样的PBMC以20 ng/ml: 1 的PMA:伊屋诺霉素 (1onomycin)(佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酉旨伊屋诺霉素)刺激。在37。C下5% C02 的温育箱中温育PBMC培养物。温育20小时后收集培养物上清，以ELISA测定 TNF-a的水平。
结果
结果(见图18)表明，新鲜分离的PBMC产生TNF-a，这种TNF-a的组成型产 生不受HB-19的影响。另一方面，HB-19以剂量依赖性方式抑制PBMC针对各种 来自大肠杆菌或肠道沙门氏菌LPS制备物刺激而产生TNF-a。这种效应是特异性 的，因为HB-19对于PBMC针对PMA-伊屋诺霉素刺激而产生TNF-a没有效应。
在5 pM的HB-19存在下，人PBMC针对各种LPS制备物刺激而产生TNF-a 被抑制达到与未经LPS刺激而观察到的基本水平类似的程度。
7.2 HB-19和Nucant 7对经LPS刺激的鼠腹膜初级巨噬细胞产生TNF-a和 IL-6的抑制
方法
为了获得经刺激的巨噬细胞，在实验前4天，以1.5ml巯基乙酸盐溶液(3。/。盐 溶液)通过腹腔内注射balb/c小鼠(7-8周龄)。以5 ml含有1%胎牛血清的RPMI培 养液洗涤腹膜腔来收集巨噬细胞，然后将细胞以RPMI 1640培养液中106个细胞 /0.5 ml的浓度置于培养板，在37"下5% C02的温育箱中温育，2小时后除去非吸 附的细胞。
在4 HB-19或10 |iM Nucant 7不存在(-)或存在(+)的情况下，不刺激或以 浓度为10 ng/ml， 100 ng/ml和1000 ng/ml的来自大肠杆菌(&c/zm'c/^ co/Z)血清型 0111: B4的LPS刺激巨噬细胞。在37。C下5% C02的温育箱中温育细胞培养物 20小时。以ELISA测定TNF-a和IL-6蛋白的水平。
结果对于HB-19所获得的结果显示于图19。在4 的HB-19存在下，鼠腹膜巨 噬细胞针对LPS刺激而产生的TNF-a和IL-6被显著性抑制。如果考虑到未经LPS 刺激所观测到的基本水平，对TNF-a的净抑制程度为72-75%,对IL-6为68-71%。
对于Nucant 7所获得的结果显示于图20。在10 的Nucant 7存在下，鼠腹 膜巨噬细胞针对LPS刺激而产生的TNF-a和IL-6几乎被完全抑制，因为在经 Nucant 7处理的培养物观测到的针对LPS刺激所产生的细胞因子水平与没有LPS 中所观测到的相类似。
如果考虑到未经LPS刺激所观测到的基本水平，10 的Nucant 7对经10， 100和1000 ng/ml LPS剌激的培养物的抑制程度超过95%。 LPS浓度为100倍大的 情况下抑制程度没有变化，这一事实意味着Nucant 7的抑制机理主要是由于结合 至表面核仁素。实际上，如果Nucant 7抑制的机理是与LPS相互作用，则100 ng/ml LPS的情况会比10 ng/ml LPS的情况抑制效应低。
7.3 HB-19对经LPS刺激的HUVEC细胞产生IL-8和表达ICAM-1的抑制 方法
HUVEC细胞以10000个细胞/cn^在96孔板中以含有2%胎牛血清的EBM-2 培养液进行培养。在5 nM HB-19不存在或存在的情况下，以100 ng/ml的来自大 肠杆菌(五sc/2er/cfea co/Z)血清型055: B5的LPS刺激细胞。在37。C下5% C02的温 育箱中温育细胞培养物20小时。以ELISA测定IL-8和ICAM-1的水平。在5 HB-19不存在或存在的情况下HUVEC细胞用作对照作为基础水平。
结果
如果考虑到未经LPS刺激所观测到的基本水平，5 HB-19对IL-8和ICAM-1 产生的抑制程度为大约50%。因此这些结果证明了 HB-19和相关的Nucant类型的 化合物作为IL-8和ICAM-1产生抑制剂的潜在的功效(见图21)。
7.4 HB19对经灭活的金黄色酿脓葡萄球菌(5fa/^t;fococc7^ a^g附)刺激的人 初级PBMC产生TNF-ct的抑制
金黄色酿脓葡萄球菌感染被证明是引起心内膜炎的主要因素之一(24， 25)。 因此本发明人测定了在10 的化合物HB-19、 Nucant 3、 Nucant6或Nucant 7不存在(对照)或存在的情况下，人初级PBMC培养物针对热灭活的金黄色酿脓 葡萄球菌(HKSA，热杀死的金黄色酿脓葡萄球菌)而产生的TNF-a和IL-6的水平。 作为阳性对照(Dex.)，也使用地塞米松(Dexamethasone，已知的具有抗炎和免疫抑 制活性的糖皮质激素)处理PBMC。 方法
使用人全血EDTA-钾通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC并重悬于含有1% 人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640培养液。在HB-19 ， Nucant 3 ， Nucant 6或Nucant 7(10 iiM)或地塞米松(Dexamethasone)(l吗/ml)不存在(对照)或存在的情况下，以 1()8个HKSA/ml的颗粒(InvivoGen, San Diego, USA)刺激浓度为1()6个细胞/0.5ml
34的细胞。在37"下5% C02的温育箱中温育PBMC培养物。温育20小时后收集培 养物上清，以ELISA测定TNF-a和IL-6蛋白的水平。 结果
结果显示于图22，其表明所有测试的假肽(HB-19、 Nucant 3、 Nucant 6和 Nucant 7)都可能获得对经热杀死的金黄色酿脓葡萄球菌刺激而产生TNF-ot和IL-6 的显著性抑制。假肽与标准抗炎治疗例如地塞米松同样有效。
因此通式(I)的假肽例如HB-19、 Nucant 3、 Nucant 6和Nucant 7也可用于治疗 心脏发炎，特别是用于治疗由感染起源的心内膜炎。
7.5继
因此本发明人获得的结果表明，化合物HB-19和Nucant 7能够抑制各种类型 的细胞针对LPS刺激而产生促炎性细胞因子例如TNF-a和IL-6，以及同时抑制各 种类型的细胞针对LPS刺激而产生趋化因子IL-8和黏附分子ICAM-1 。
此外，这些化合物也弓I起针对金黄色酿脓葡萄球菌(引起由感染起源的各种形 式的心内膜炎的一种试剂)剌激而产生促炎性细胞因子例如TNF-a和IL-6的显著性 抑制。
因此，本发明所描述的这些化合物以及相关的通式(I)的化合物能够抑制促炎 性细胞因子和发炎位置白细胞补充所涉及分子的产生。因此这些化合物可用于抗 炎症用途，特别是用于治疗一般描述中提及的各种疾病。
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权利要求
1、一种多价合成化合物在制备用于治疗涉及细胞增殖和/或血管生成下调的疾病的药物中的用途，该化合物包含或者由一个载体组成，在所述载体上至少三个假肽单元被接枝，该化合物通式(I)为其中每个X独立代表任何氨基酸；Y1和Y2独立选自具有碱性侧链的氨基酸；Z选自-脯氨酸，可能在γ、β或δ被羟基、胺、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10炔基、C5-C12芳基、C5-C14芳烷基、C5-C12杂芳基基团取代，这些基团本身可能被1至6个选自卤素原子、NO2、OH、C1-C4烷基、NH2、CN、三卤甲基、C1-C4烷氧基、C1-C4二烷基氨基、胍基基团、硫醇基团的取代基取代；-天然的或非天然的N-烷基氨基酸；-二烷基氨基酸；-环二烷基氨基酸；或-哌可酸或其衍生物；n和i独立地为0或1；m是0至3的整数；k是大于或等于3的整数；和ψ代表经修饰的肽键，其相对于标准肽键来说，对至少一种蛋白酶具有更显著抗性。
2、 根据权利要求1所述的用途，其特征为所述载体选自直链肽或环肽、直链 拟肽或环形拟肽、折叠体、直链多聚物或球形树状聚体、糖或纳米颗粒。
3、 根据权利要求2所述的用途，其特征为所述载体选自直链肽或环肽。
4、 根据权利要求3所述的用途，其特征为所述载体选自由交替的D构型的丙 氨酸残基(A)和L构型的赖氨酸残基(K)组成的环形六肽，或者具有SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO:19序列的直链肽。
5、 根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征为所述假肽单元直接接枝到所述载体上。
6、 根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征为所述假肽单元通过间隔物 的方式接枝到所述载体上。
7、 根据权利要求l-6任一项所述的用途，其特征为k介于3和8之间。
8、 根据权利要求7所述的用途，其特征为k介于5和6之间。
9、 根据权利要求l-8任一项所述的用途，其特征为i等于l， Z是脯氨酸(P)。
10、 根据权利要求l-9任一项所述的用途，其特征为Yi和Y2独立地选自精氨 酸(R)和赖氨酸(K)。
11、 根据权利要求10所述的用途，其特征为Y,是赖氨酸(K)， Y2是精氨酸(R)。
12、 根据权利要求l-ll任一项所述的用途，其特征为n和m等于0。
13、 根据权利要求1-10任一项所述的用途，其特征为V代表还原的键 (-CH2NH-)、逆反键(-NHCO-)、亚甲氧基键(-CH2-0-)、硫亚甲基(-CH2-S-)、碳 键(-CH2-CH2-)、酮亚甲基键(-C0-CH2-)、羟乙烯基键(-CHOH-CH2-)、 (-N-N-) 键、E-烯烃键或(-CH《H-)键。
14、 根据权利要求1所述的用途，其特征为该化合物选自具有如图2A(SEQID NO: 5)、图2B、图2C(SEQIDNO: 20)、图2D(SEQIDNO: 21)、图2E(SEQ ID NO: 16)或图2F(SEQIDNO: 17)所示的结构的化合物。
15、 根据权利要求1-14任一项所述的用途，其特征为所述涉及细胞增殖和/ 或血管生成下调的疾病是癌症。
16、 同时抑制细胞增殖和血管生成的分子筛选方法，包括(C)将表达表面核仁素的细胞投置于测试分子；和(d)确定所述测试分子与核仁素的RGG结构域的结合能力。
17、 如权利要求1至14所定义的化合物，但不包括下述载体为非环肽的化合 物该非环肽包括选自KPG， KGP， KGC或KX!KX4KXA的氨基酸序列，其中， Xi是可选的，选自赖氨酸(K)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)，X4是可选的，选自缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)。
18、 根据权利要求17所述的化合物，其特征为所述载体选自直链肽、环肽、 直链或环形拟肽、折叠体、直链多聚物或球形树状聚体、糖或纳米颗粒，所述直 链肽包含选自Aib-K-Aib-G(SEQ ID NO: 6)或K-Aib-G(SEQ ID NO: 7)的氨基酸序列。
19、 根据权利要求18所述的化合物，其特征为所述载体为直链肽，所述直链 肽由选自SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 19的氨基酸序列组成。
20、 根据权利要求19所述的化合物，其特征为该化合物具有如图2B、图 2C(SEQIDNO: 20)、图2D(SEQIDNO: 21)或图2E(SEQ ID NO: 16)所示的结构。
21、 如权利要求1至14所定义的化合物，其结构如图2F (SEQ ID NO:17)所述。
22、 作为药物用途的如权利要求17至21任一项所述的化合物。
23、 包含权利要求17至21任一项所述的化合物的药物组合物。
24、 权利要求1至14任一项所述的化合物在制备用于治疗炎性疾病药物中的用途。
25、 根据权利要求24所述的用途，其特征为所述炎性疾病选自自身免疫病、 败血病、感染性休克、心脏发炎疾病、移植排斥反应、外伤、关节的炎性疾病、 胃肠系统炎性疾病、皮肤的炎性疾病、呼吸系统的炎性疾病或过敏症。
26、 根据权利要求25所述的用途，其特征为所述炎性疾病是自身免疫病。
27、 根据权利要求26所述的用途，其特征为所述自身免疫病是狼疮或类风湿 性多关节炎。
28、 根据权利要求25所述的用途，其特征为所述炎性疾病是感染性休克。
29、 根据权利要求25所述的用途，其特征为所述炎性疾病是心内膜炎。
全文摘要
本发明涉及一种多价合成化合物在制备用于治疗涉及细胞增殖和/或血管生成下调的疾病，优选作为表面核仁素配体，或者治疗炎性疾病的药物中的用途，该化合物包含一个载体，在所述载体上至少三个假肽单元被接枝，该化合物符合通式(I)，其中每个X独立代表任何氨基酸；Y₁和Y₂独立选自具有碱性侧链的氨基酸；Z选自脯氨酸，可选地在≠、-或..被取代；天然的或非天然的N-烷基氨基酸；二烷基氨基酸；环二烷基氨基酸；哌可酸或其衍生物；n和i独立地为0或1；m是0至3的整数；k是大于或等于3的整数；ψ代表经修饰的肽键，其相对于标准肽键来说，对至少一种蛋白酶具有更显著抗性。
文档编号C07K14/16GK101454341SQ200780019270
公开日2009年6月10日 申请日期2007年4月22日 优先权日2006年4月27日
发明者A·荷瓦耐森, G·吉夏尔, J·P·白里安, J·库尔蒂, Y·哈马 申请人:国家科学研究中心