专利名称：用于抑制神经递质分泌的融合多肽和递送该融合多肽的方法
技术领域：
本发明涉及通过使用由蛋白转导结构域(PTD)与能够结合到能够形成 SNARE复合体的三种蛋白质上的结构域形成的偶联物来抑制神经递质的分 泌，从而促进其递送到细胞中和局部位置的效率。
背景技术：
关于神经递质的分泌，由小突触囊泡蛋白(synaptobrevin)(囊泡相关膜 蛋白，VAMP)、 SNAP25 (兔抗人突触相关膜蛋白25)和突触融合蛋白 (syntaxin)这三种蛋白质形成SNARE复合体，并且这三种蛋白质通过Ca2+ 的剌激向细胞外分泌；所述小突触囊泡蛋白存在于携带神经递质的突触小泡 的表面，SNAP25和突触融合蛋白存在于突触前脂质膜中(参见图l)。
肉毒杆菌神经毒素经常被用作神经递质的分泌的抑制剂，它包括几种亚 型，如肉毒杆菌神经毒素A、 B、 C、 D、 E和F，每一种亚型在特定位点切 割VAMP-2、 SNAP25和突触融合蛋白，以干扰SNARE复合体的形成，从 而抑制神经递质的分泌(Schiavo et al. Nature 359, 832-835, 1992)。
由于这种肉毒杆菌神经毒素具有很高的毒性，因此，已有报道，研究集 中在使用由上述的肉毒杆菌神经毒素来切割的肽片段，以抑制神经递质的分 泌。然而，由于仅仅使用完整蛋白质的一部分，因此，与肉毒杆菌神经毒素 相比，所述肽的片段的特异性通常较低，从而具有较低的活性。此外，与肉 毒杆菌神经毒素被递送到细胞中的速度相比，如果所述肽的片段较大，则该 肽被递送到细胞中的速度降低，因此，它在细胞内传导的效率较低，因为， 肉毒杆菌神经毒素被递送到细胞中是以结合到受体的状态进行的(Antonio V.Ferror-Monitiel et al. FEBS letters, 435， 84-88, 1998)。需要一种在体内和体外都能有效地递送生物活性大分子而不损害细胞
的普通方法(L.A. Sternson，Ann. N.Y.Acad. Sci.， 57, 19-21(1987))。这种方法的 实例包括用于脂质肽的化学加成的方法(P. Hoffmann et al. Immunobiol., 177,158-170(1998))或者使用碱性聚合物(如，聚赖氨酸和聚精氨酸)的方 法(W扁C. Chen et al.， Proc. Natl. Acad. Sci.， USA， 75， 1872-1876(1978))，但是这 些方法还没有被验证。此外，据报道，用作转运蛋白的叶酸以叶酸-偶联物 的形式被转移到细胞中(C.R Leamon and Low, Proc. Natl. Acd. Sci.， USA, 88， 5572-5576 (1991))，但是叶酸被递送到细胞质中还没有没证实。此外，假单 胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)也被用作一种转运蛋白(T. I. Prior et al.， Cell, 64， 1017-1023(1991))。然而，这些方法对于待递送的生物活性物质在细 胞内的传导的效果以及它们普遍的适用性还没有被明确地证实。因此，继续 需要能够将生物活性物质以更安全和更有效的方式，递送到活细胞的细胞质 中或者细胞核中的有效方法。
作为对这种需要的研究的结果，提出了蛋白转导结构域(PTDs )。在 它们当中，作为人免疫缺陷病毒-1 (HIV-l)的转录因子的转录反式激活因子 (Tat)蛋白，得到了最彻底的研究。据发现，当转录反式激活因子蛋白由 47-57 (YGRKKRRQRRR)个氨基酸组成时(集中了正电荷氨基酸)，比全长 的86个氨基酸的蛋白质形式能更有效地穿过细胞膜(Fawell S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:664-668(1994))。 PTDs的其它实例包括由单纯疱疹 病毒1型蛋白质(HSV-l)的267th-300th氨基酸所组成的肽(Elliott G. et al.， Cell 88:223-233(1997))，和由果蝇的触角足(ANTP)蛋白的第339个至第355 个氨基酸所组成肽(Schwarze S. R. et al., Trends Pharmacol Sci. 21:45-48 (2000))。此外，还发现由正电荷氨基酸组成的人工肽也有效(Laus R. et al., Nature Biotechnol. 18:1269-1272 (2000》。
发明内容
因此，本发明的发明者尝试使用能够与可形成SNARE复合体的三种蛋 白相结合的结构域，来促进向细胞内递送的效率，以能够完全干涉所述蛋白 之间的结合，从而抑制神经递质的分泌。在本发明中，为了促进向细胞内递 送的效率，通过将一种蛋白转导结构域与能够结合到能够形成SNARE复合 体的三种蛋白的结构域相结合，而制备一种融合多肽，并且使用这种制备 的融合多肽，以抑制神经递质的分泌。
能够形成SNARE复合体的小突触囊泡蛋白(VAMP-2)、 SNAP25和突 触融合蛋白的氨基酸序列分别如下 SNAP25 (SEQIDNO: 1):
MAEDADMRNE LEEMQRRADQ LADESLESTR 画LQLVEESK DAGIRTLVML DEQGEQLERI
EEGMDQINKD MKEAEKNLTD LGKFCGLCVC PCNKLKSSDA YKKAWG丽QD GVVASQPARV
VDEREQMAIS GGFIRRVTND ARENEMDENL EQVSGIIGNL RHMALDMGNE IDTONROIDR IMEKAOANKT RIDEANORAT KMLGSG;
VAMP2 (SEQ ID NO: 2)
MSATAATAPP AAPAGEGGPP APPPNLTSVNR RLOOTOAOVD EWDIMRVNV DKVLERDOKL
SELDDRADALOAGASOFETSAAKLKRKYWW KNLKMMIILG VICAIILIII IVYFSS;禾口 突触融合蛋白(SEQIDNO:3):
MKDRTQELRT AKDSDDDDDV TVTVDRDRFM DEFFEQVEEI RGFIDKIAEN VEEVKRKHSA
ILASPNPDEK TKEELEELMS DIKKTANKVR SKLKSIEQSI EQEEGLNRSS ALDRIRKTQHSTLSRKFVEV MSEYNATQSD YRERCKGRIO RQLEITGRTT TSEELEDMLE SGNPAIFASG
画DSSISKQ ALSEIETRHS EIIKLENSIR ELHDMFMDMA
MLVESQGEMI DRIEYNVEHA
VDYVERAVSD TKKAVKYQSK ARRKK腿II CCVILGIIIA STIGGIFG
SNAP25 (SEQ ID NO: l)的第170个至第206个氨基酸残基(粗体且具 有下划线的部分)对应于能够结合到VAMP-2的结构域(SEQ ID NO: 4; SBD); VAMP-2 (SEQ ID NO: 2)的第29个至第86个氨基酸残基(粗体且具有 下划线的部分)对应于能够结合到SNAP25/突触融合蛋白的结构域(SEQ ID NO:5;VBD)。在本发明中，使用具有SBD (SEQ ID NO: 4)或VBD (SEQ ID NO: 5)的PTD的偶联物作为神经递质分泌的抑制剂。
为了实现上述目的，本发明提供了一种融合多肽，该融合多肽包括具 有高度的细胞穿透性和能够高效地向皮肤、眼睛等中进行递送的蛋白转导结 构域(PTD);和人源SNAP25的能够结合VAMP-2的结构域或者VAMP-2的 能够结合突触融合蛋白/SNAP25的结构域，即，用于抑制SNARE复合体形 成的肽，在神经细胞中，所述SNARE复合体被形成以用于神经递质的分泌。 本发明的融合多肽的特征在于该融合多肽能够抑制神经递质(例如，儿茶 酚胺和乙酰胆碱)的分泌，并且PTD的结合能够显著增加神经递质分泌的 效率并且不改变所述融合多肽的细胞毒性。
本发明的融合多肽是指由连接有衍生自人源SNAP-25的肽(本文中也 称为"SBD")或者衍生自人源VAMP-2的肽(本文中也称为"VBD")的PTD 肽所组成的融合多肽(本文中也称为"PTD-SBD或者VBD")。所述融合多 肽的结构可以由下述的式1表示[式l]
SBD或VBDPTD Gly
其中，[]PTD是自身细胞穿透性(self-cell-penetrating) PTD肽;R,为选自由以下氨基酸所组成的组中的至少一种氨基酸的侧链酪氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、甘氨酸和脯氨酸；n是5-30的整数；并且超过30%的总的氨基酸为精氨酸残基。PTD的实例包括Hph-l (YARVRRRGPRR (SEQ IDNO: 6))、 Sim-2 (AKAARQAAR (SEQ ID NO: 7))、转录反式激活因子(Tat)(YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 8》、Antp (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQID NO: 9》、VP22 (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSAS RPRRPVE (SEQID NO: 10)) 、 R7 (RRRRRRR (SEQ ID NO: 11》、MTS(AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP (SEQ ID NO: 12》、pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQIDNO: 13))等。[]ay连接自身细胞穿透性PTD肽与SBD/VBD肽，并且能够提高所述融合肽的流动性，以增加穿透的PTD-SBD或VBD与SNAPE复合体之间的结合效率。m是0-5的整数。尽管在式1中采用甘氨酸作为接头，但可以理解的是可以使用各种接头以实现本发明的目的。
SBD (SEQ ID NO: 4)和VBD (SEQ ID NO: 5)分别为来源于人SNAP-25和VAMP-2的肽，本发明的范围包括这些结构域的片段。本领域的技术人员可以理解的是可以使用其中的氨基酸被修饰(即，氨基酸被取代、插入或者删除)的如SEQIDNO:4和5所示的序列，作为本发明的融合多肽的SBD和VBD部分。根据本发明，可以通过在SBD或VBD肽与PTD肽之间插入约3个甘氨酸残基，以促进递送到并被吸收到细胞中的效率。
同时，用于制备本发明的融合多肽的方法可以通过使用本领域技术人员公知的方法进行，例如采用固相合成方法或者使用重组表达系统的合成方法。然而，用于制备本发明的融合多肽的方法并不限于上述指出的方法。
在第一种方法中，所述融合多肽的合成可以使用用于有机合成的设备来进行。该方法为Merrified的固相合成方法C/J附.C7^m. 5bc. 85, 2149-21,54(1963)))，在该方法中，使用半自动肽合成仪(Peti-Syzer Model PSS-510)通过使位于C-末端和N-末端的氨基酸发生縮合来合成所述融合多肽。
所述固相合成是从多肽的羧基末端开始的，通过将一个ct氨基被保护的氨基酸偶联到适当的树脂上。本文中，所述(x氨基被保护的氨基酸通过酯键被偶联到羟甲基树脂或者氯甲基树脂上。使用Fmoc (9-苑甲氧羰基)作为a氨基的保护基团，并且Fmoc-保护的氨基酸可以从Beadtec Company商购获得。例如，精氨酸的氨基是有活性的。使用被适当的基团(叔丁基(t-Bu)或者Pmc(2，2,5，7，8-五甲基二氢批喃-6 (pentamethylchroman-6))保护的Fmoc-氨基酸，作为甘氨酸、赖氨酸或者谷氨酰胺的活性残基。在肽的这种合成方法中，将用于连接到固体支持物树脂上的肽链的氨基末端的保护基团，随后用试剂(例如，三氯乙酸(TFA)或者酚)除去。所述肽可以用二乙醚在TFA溶液中进行萃取并被分离出来，并且可以通过高效液相色谱(HPLC)来纯化。
第二种方法是使用生物方法制备所述融合多肽的方法。该方法包括以下步骤(a)将所述融合多肽的基因克隆到能够表达特定肽的表达载体pPET中，以制备能够表达所述融合多肽的重组载体；使用所述的pPET-PTD-SBS(VBD)表达载体在大肠杆菌中表达大量的重组转运蛋白-PTD-SBS(VBD)肽，然后分离和纯化表达的肽。在这一点上，编码所述融合多肽的用于制备重组载体的碱基序列可以容易地由本领域的技术人员从本文公开的氨基酸序列中推导出来。此外，用于插入所述碱基序列的克隆载体的选择方法和一般的技术详细资料、使用克隆技术制备的重组表达载体、使用重组载体进行转化以表达靶融合多肽的宿主细胞、用重组载体对所述宿主细胞进行转化的方法、在转化的宿主细胞中表达所述靶融合多肽的方法、以及从得到的产品中收集所述靶融合多肽的方法，对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
在另一方面，本发明提供了包括融合多肽的神经递质抑制剂，所述融合
多肽含有与蛋白转导结构域(PTD)肽连接的人源SBD/VBD肽蛋白。
这种神经递质抑制剂可以被应用于各种领域，包括疼痛的减轻、皱纹的
减少、颌角的减少等。尤其是，所述神经递质抑制剂可以通过PTD被递送
到局部的位置，例如，皮肤。
本发明的融合多肽能够被高效地递送到细胞中和局部位置中，从而有效
地抑制神经递质的分泌。
图1表示神经递质分泌的机制。
图2表示按照本发明合成的多肽的HPLC分析的结果。图3表示PTD偶联物的切割位点图。图4表示PTD-SBD和PTD-VBD的琼脂凝胶照片。图5表示PTD偶联物的细胞穿透效率。
图6表示通过以频率为2 Hz反复刺激50次坐骨神经所记录的复合肌肉动作电位的平均值；复合肌肉动作电位的波幅(dY)表示肌肉收缩的量，时间表示刺激的时间点与产生复合肌肉动作电位的时间点之间的时间过程(tC)。
图7表示复合肌肉动作电位的波幅。
具体实施例方式
实施例1: PTD-SBD〖VBD)偶联物的制备
(1) PTD-SBD(VBD)偶联物的制备
MLGSG (PTD-GGG-SBD多肽)
按照固相合成的方法使用半自动合成仪(Peti-Syzer Model PSS-510)合成氨基酸序列为YARVRRRGPRRGGGNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKR的融合多肽(PTD-GGG-VBD多肽)。为了实现这一目的，将0.1 mmol的Rink Amide MBHA树脂置于一个标准的反应器中，向该反应器中加入摩尔数均为0.5 mmol的活化的Fmoc-G和Fmoc-R (Fmoc-G和Fmoc-R为待合成的多肽的第一个C末端的氨基酸)，然后开始所述多肽的合成。以从C末端氨基酸到N末端氨基酸的顺序，将0.5 mmol的每一种相应的氨基酸縮合3次。使用含有20%的哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)，对Fmoc进行三次脱保护作用，脱保护的时间为10分钟；用DMF洗涤10分钟，偶联100分钟。在偶联时，使用N-羟基苯并三唑(HOBT)和1，3-二异丙基碳二亚胺(DIC)，并用DMF洗涤10分钟。
(2) 融合多肽的分离和纯化
在合成完成后，将所述多肽置于50-mL的康宁管(comingtube)中，并冷却到0。C。然后，将含有0.75g的苯酚、0.25ml的1,2-乙二硫醇(EDT)、 0.25ml的苯甲硫醚(thianisol)、 0.5 mL的蒸馏水和8.25 ml的TFA的混合物加入到所述管中，在室温下反应4小时。在反应完成后，将30ml低于5(TC的乙醚加入到通过过滤将所述树脂从所述肽中分离后的溶液中，沉淀所述肽，然后用乙醚洗涤沉淀两次。将收集的沉淀干燥，溶解在MeOH中，并通过HPLC纯化。在纯化时，使用C18分析柱218TP54 (VyDac)和C18制备柱218TP1022(VyDac)。此外，在纯化时，使用1 mL/min和25 mL/min的条件，并使用溶 剂A (100 % H20 + 0.01 % TFA)和溶剂B (100%乙腈+ 0.01 % TFA)洗脱所述 肽。将乙腈从所述肽中除去，并将所述肽进行冷冻干燥，从而得到高度纯化 的肽(参见图2)。
实施例2:使用微生物表达系统制备和纯化融合多肽的表达载体
(1) 表达载体的制备
为了构建编码所述融合多肽的碱基序列，将N-末端的Hind III切割位点 和C-末端的BamHI切割位点设置在pUC 19 (购自Invitrogen)中，从而构 建了一个模版。为了将使所述融合多肽的高表达的和易于纯化的聚组氨酸标 签结合到编码高表达的蛋白的碱基序列上，使用限制酶HindIII和BamH I 分离所述模版，并使用Auiaquick纯化试剂盒进行纯化。使用限制酶HindIII 和BamH I处理表达载体pPET，并用Auiaquick纯化试剂盒进行纯化。然后 将纯化的表达载体克隆到上述制备的编码所述融合多肽的碱基序列模板中， 这样制备了重组表达载体。在图3中，给出了所述表达载体的示意性的基因 图谱。
(2) 大肠杆菌转化株的制备以及融合多肽的表达和纯化 通过热激转化方法并使用上述制备的表达载体，对大肠杆菌BL21 (购
自Invitrogen)进行转化，然后，将1 ml的转化的大肠杆菌株(1%)接种到100 mL的LB培养基中，并在37 'C下摇动预培养12小时。然后，将预培养物 接种到l，OOO mL的LB培养基中，在37 'C下培养4小时。将1 mM的IPTG
(异丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(isopropyl卩-D-thiogalactopy認oside ); GibcoBRL cat. #15529-019)加入到培养基中，以诱导乳糖操纵子的表达，将 培养基孵育8小时，以诱导所述融合多肽的表达。在4'C下并以5,000 rpm 将培养基离心20分钟，然后除去上清液并保留沉淀。然后，将所述沉淀溶解在含有lmg/mL的同功酶(Sigma，cat亂-7651)的缓冲液(50mMNaH2PO4， 300mMNaCl， 10 mM imidazole, pH8.0)中，然后在冰上静置30分钟。然 后，使用热系统超声波处理器XL在强度为300W下，处理所述沉淀10秒， 然后冷却10秒，重复进行所述的超声和冷却的过程，直到超声总时间达到 3分钟。在4"C下以12,000 rpm离心裂解物20分钟，除去破坏的大肠杆菌细 胞，并收集纯化的裂解物。向所述裂解物中加入2.5mL的50% N产-NTA琼 脂糖浆(Qiagen， cat#30230)，将混合物在4。C下以200 rpm搅拌1小时，以 使所述融合多肽结合到N产-NTA琼脂糖上。然后，将混合物通过0.8 x 4 cm 色谱柱(BioRad， cat #731-1550)。用4 mL的缓冲液2 (50 mM NaH2P04， 300 mMNaCl， 20 mM的咪唑，pH 8.0)洗涤得到的材料两次，然后用0.5 mL的 缓冲液3 (50mMNaH2PO4， 300mMNaCl， 250mM的咪唑，pH8.0)洗涤四 次，从而收集所述融合多肽。将收集的融合多肽进行SDS-PAGE，然后通过 考马氏蓝染色，分析的结果如图4所示。在图4中，泳道l为标准分子重量 的蛋白；泳道2为PTD-SBD;泳道3为PTD-VBD。向所述融合蛋白中加入 2mL用冰冷却的缓冲液(4MNH2OH， 0.4MK2CO3， 6MGuHCl， pH9.0) 使得到的缓冲液中含有2MNH20H， 0.2MK2CO3， 3MGuHCl， pH9.0。然 后，在45t:下以225rpm搅拌溶液5小时，以使所述融合蛋白分离成融合多 肽和转运蛋白，并通过加入12NHCl将所述溶液的pH调节到2-3，再进一 步搅拌10分钟。在反应完成后，通过加入12.5 N NaOH将反应溶液中和到 pH为6.5，然后通过填充有1^2+->^八琼脂糖的柱，以将转运蛋白从所述溶 液中分离出来。将得到的溶液进行凝胶过滤，以将盐成分从所述溶液中除去， 然后冷冻干燥，从而获得纯化的融合多肽。
实施例3:融合多肽在测试管中抑制神经递质分泌的效果。 分析在实施例1和2中制备的融合多肽抑制神经递质分泌的效果。为了比较活性，对SBD和VBD分别制备了两种片段。所述片段样品如下: 样品l:SBD(SEQIDNO:4) 样品2: VBD(SEQIDNO: 5) 样品3: Hph-l-GGG-SBD (SEQ ID NO: 14) 样品4: Hph-l-GGG-VBD (SEQ ID NO: 15) 样品5:Tat-GGG-SBD(SEQIDNO: 16) 样品6:Hph-l画GGG-SBDFl (SEQIDNO: 17) 样品7: Hph-1-GGG-SBDF2 (SEQIDNO: 18) 样品8: Hph-1-GGG-VBDF1 (SEQ ID NO: 19) 样品9: Hph-1-GGG-VBDF2 (SEQ ID NO: 20) Hph-l-GGG-SBD (SEQ ID NO: 14)
MLGSG
Hph-l-GGG-VBD (SEQ ID. NO.: 15)
LSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKR Tat-GGG陽SBD (SEQ ID NO: 16)
MLGSG
Hph-l画GGG-SBDFl (SEQIDNO: 17)
Hph-1-GGG-SBDF2 (SEQ ID NO: 18) YARVRRRGPRRGGGKTRIDEANQRAT認 Hph-l-GGG-VBDFl (SEQIDNO: 19)
Hph-1-GGG-VBDF2 (SEQ ID NO: 20)
YARVRRRGPRRGGGLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKR.在15ml的F-12K培养基(Gibco)(含有2mML-谷氨酰胺，1.5g/L碳 酸氢钠，15%马血清和2.5%胎牛血清(FBS)的T75 (Nunc)溶液)中解冻PC12 细胞(嗜铬细胞瘤，ATCC CRL-1721)，并在该培养基中培养2天，以使细 胞密度为625,000个细胞/cm2。然后，将培养基离心，除去上清，将相同体 积的F-12K培养基和每一种样品药物加入到沉淀中，将混合物孵育一天。然 后，用10pMC^+刺激混合物，通过荧光HPLC分析分泌的儿茶酚胺的量。 加入的样品药物的浓度范围为10'6-10—5M。检测的结果如下表l所示。从表 1可以看出，本发明的由式1表示的化合物具有优异的抑制神经递质分泌的 效果。
表1多肽对神经递质分泌的抑制效果
多巴胺去甲肾上腺素
阴性对照3655234
阳性对照22394463
样品 110-5M20450455
10-6M22060473
样品21(T5M21244459
10-6M22374471
样品310-5M5261284
10-6M8109307
样品410-5M5029289
IO力M7960311
样品510-5M5537291
l(TbM8370320
样品610-5M5470301
1(T6M8219322
样品710-5M5743315
10-6M9027355
样品810-5M6940337
10-6M10690381
样品91(T5M9163376
10-6M14260421
阴性对照没有刺激
阳性对照用Ca^进行刺激但不使用药物
14实施例4:偶联物对细胞内递送的影响
为了分析PTD偶联物对细胞内递送的影响，用荧光物质FITC (购自 Sigma;荧光素5-异硫氰酸盐；27072-45-3)对每一个结合有PTD的SBDF1 肽和未结合的SBDF1肽进行标记，并通过Facs (FACSCalibur， Becton Dickinson)(参见图5)进行分析。其结果为PTD的结合使细胞内的递送的 效果增加约50倍。
实施例5: PTD偶联物对肌肉瘫痪的作用的测试
由于肉毒杆菌神经毒素和本发明的多肽能够通过抑制神经递质而导致 肌肉瘫痪，分别将肉毒杆菌神经毒素和所述多肽注射到大鼠的胫骨前的肌肉 中，并在注射后的l周、2周和3周时，测量由电刺激导致的胫骨前的肌肉 的复合肌肉动作电位(CMAP)的波幅(dY)。在测量时，向8周大的SD (购自 Hyochang)大鼠的右胫骨前的肌肉中分别注射5pl的肉毒杆菌神经毒素A
(由Allergan制备，并购自Sigma)、样品1、样品3和样品6。具体地说， 将400U的肉毒杆菌神经毒素溶解在lml的生理盐水中，以制备400U/ml的 溶液，并一次向大鼠中注射5(al的溶液。此外，样品l、样品3和样品6分 别以10ng、 100ng和500ng的量给予大鼠。
在复合肌肉动作电位的测量中，向大鼠的腹腔中注射氯胺酮/甲苯噻嗪 合剂，以麻醉大鼠，然后将大鼠以卧姿置于桌上，保持温度为30'C，并将四 肢固定在该桌上。待检测的下肢的髋关节、膝关节和踝关节分别以的90°角 固定；记录电极、 一个参考电极和一个接地电极分别被连接到胫骨前的肌肉、 跟腱和足底(foot sole)。在腿弯曲部分刺入刺激电极(+)针，在耻骨部分和股 骨近端(proximal femur)的耻骨肌刺入刺激电极(-)针。使1-5 pA的电流通 过所述刺激电极，以刺激坐骨神经，导致胫骨前的肌肉的复合肌肉动作电位。 以频率为2Hz反复剌激50次，诱导复合肌肉动作电位，其强度相应于显示为最大波幅的剌激强度的150%。在休息5分钟后，以频率为20Hz反复刺激 50次，诱导复合肌肉动作电位。在生物电放大器以及信号处理系统
(CyberAmp380， Axon Instruments, Inc.)中，将这些信号放大50倍，并在 300-3000 Hz处过滤信号。然后，将过滤的信号通过信号采集系统
(Digidata1320， Axon Instruments, Inc.)输入到计算机中，所述信号以波的 形式表示。
分析储存在计算机中的信号，波幅(dY)为通过以频率为2Hz反复刺激 50次获得的CMAPs的平均电位的负峰和正峰之间的值；时间为电刺激的时 间点与负峰的时间点之间的时间过程(tC)(参见图6)。
如图7所述，复合肌肉动作电位对于肉毒杆菌神经毒素、样品l、样品 3和样品6的结果表明，注射5个单位的肉毒杆菌神经毒素能够使肌肉完全 瘫痪；当样品1、 3和6的给予量增加时，样品1表示出较弱的肌肉瘫痪效 果，约为肉毒杆菌神经毒素效果的20%，而样品3和样品6则表示出与肉毒 杆菌神经毒素相同的效果。
尽管己经描述了本发明的优选的实施方式，但它们仅用于说明的目的， 本领域的技术人员可以理解的是，在不偏离在所附权利要求中所公开的本发 明的范围和精神实质的前提下，可以进行各种改变、增加和取代。
工业实用性
如上所述，本发明的融合多肽能够有效地被递送到细胞中和局部位置， 从而有效地抑制神经递质的分泌。
权利要求
1、一种用于在体内抑制神经递质分泌的融合多肽，该融合多肽包括蛋白转导结构域与能够结合到SNAP25的结构域(SEQ ID NO4)或者能够结合到VAMP-2的结构域(SEQ ID.NO5)的偶联物；所述蛋白转导结构域由5-30个氨基酸组成，并且精氨酸的含量高于30％；所述能够结合到SNAP25的结构域和能够结合到VAMP-2的结构域均能形成SNARE复合体。
2、 根据权利要求1所述的融合多肽，其中，所述蛋白转导结构域具有选自由SEQ ID NO: 6至SEQ ID NO: 12、和SEQ ID NO: 13所组成的组中的任何一种氨基酸序列。
3、 根据权利要求1或2所述的融合多肽，其中，所述蛋白转导结构域通过接头而与所述能够结合SNAP25的结构域或者能够结合VAMP-2的结构域结合。
4、 根据权利要求3所述的融合多肽，其中，所述接头由三个甘氨酸组成。
5、 一种用于抑制神经递质分泌的组合物，该组合物含有权利要求1或者2所述的融合多肽作为活性成分。
全文摘要
本文公开了使用蛋白转导结构域(PTD)的偶联物来抑制神经递质的分泌，从而促进递送到细胞内和局部位点的效率的方法，所述蛋白转导结构域(PTD)的偶联物为所述蛋白转导结构域与能够结合到可形成SNARE复合体的三种蛋白的结构域的偶联物。
文档编号C07K19/00GK101511873SQ200780032098
公开日2009年8月19日 申请日期2007年8月24日 优先权日2006年8月31日
发明者李尚揆, 李承揆 申请人:为人技术株式会社