专利名称：Boc和Fmoc固相肽合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽的方法， 所述肽具有N-端氨基酸、邻近该N-端氨基酸的倒数第二个氨基酸和 C-端氨基酸。
背景技术：
为了克服与溶液肽合成有关的许多中间体提纯问题，于1963年引 入固相肽合成。Stewart等人，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)(百克化学公司(Pierce Chemical Co.),第2版，1984)。在固相
合成期间，氨基酸被组装(即，偶联)成任何想得到的序列的肽，而链的 一端(即，C-端)被锚定到不能溶解的载体上。 一旦在载体上将想得到的 序列连接到一起，那么肽就被从载体中解封闭(deblock)(即，裂开 (cleave))。偶联氨基酸的a-氨基官能团的这两个标准保护基团为通过利 用强酸处理而除去的Boc，以及利用碱除去的Fmoc。本发明涉及一种 利用这些a-氨基保护基团两者的组合，以单一合成，在便宜的氯甲基 化的聚苯乙烯树脂上制备肽的便利方法。
在通过利用任一种上面提及的a-氨基保护方案的固相方法合成肽 的设计中，重要的是在整个链组装期间保护构成氨基酸的任何反应性 "侧基"不发生不希望的化学反应。还希望选择来保护各种侧基的化 学基团可耐受被用来除去a-氨基保护基团的试剂除去。第三，重要的 是在链组装期间生长中的肽链与树脂颗粒的连接对于用来除去任一类 型a-氨基保护基团的试剂稳定。在Fmoca-氨基保护方案的情况下，侧 基保护官能团应当可耐受用来除去Fmoc的碱性试剂。实际上，在肽链 组装之后，这些侧链保护基团一般由温和酸性试剂除去。当利用Boca-氨基保护方案时，侧链保护基团必须在每一个循环中都可耐受被用来脱保护Boc基团的温和酸试剂除去。实际上，在肽链组装之后，Boca-氨基保护方案的这些侧链保护基团一般由无水HF除去。因此，实际上， 就Fmoc a-氨基保护而言常用的侧链保护基团在用于Boc a-氨基脱保护 的条件下不稳定，并且这两个类型的a-氨基保护方案未在通过固相肽 合成的肽链的组装中混合。另外，尽管就Boc保护的氨基酸而言广泛 地使用了用于肽合成的最不昂贵的聚合树脂，氯甲基化的苯乙烯或 "Merrifield树脂"，但是文献暗示就在a-氨基上的Fmoc保护而言由 于其在碱性条件下的不稳定性而不适于使用。(参见Stewart等人，固相 肽合成(百克化学公司，第2版，1984)。本发明涉及在某些肽的固相合 成期间在"Merrifield树脂"上混合使用Boc和Fmoc氨基酸两者的方 法。
Lanreotide②(兰瑞肽)为生长抑素的类似物并且已知抑制生长激素 释放以及抑制胰岛素、胰高血糖素和胰腺外分泌。
美国专利号4853371公开并要求保护Lanreotide⑧、其制备方法及 抑制生长激素、胰岛素、胰高血糖素的分泌和胰腺外分泌的方法。
美国专利号5147856公开了 Lanreotide⑧治疗再狭窄的用途。 美国专利号5411943公开了 Lanreotide⑧用于治疗肝细胞瘤的用途。
美国专利号5073541公开了 Lanreotide⑧用于治疗肺癌的用途。
于1993年7月9日提交的美国申请号08/089410公开了 Lanreotide 用于治疗黑色素瘤的用途。
美国专利号5504069公开了 Lanreotide⑧用于抑制实体瘤加速生长
的用途。于1997年5月13日提交的美国申请号08/854941公开了 Lanreotide⑧用于降低体重的用途。
于1997年5月13日提交的美国申请号08/854943公开了 Lanreotide⑧用于治疗胰岛素抵抗和综合征X的用途。
美国专利号5688418公开了 Lanreotide⑧用于延长胰腺细胞生存的 用途。
PCT申请号PCT/US97/14154公开了 Lanreotide⑧用于治疗纤维化 的用途。
于1997年5月13日提交的美国申请号08/855311公开了 Lanreotide 用于治疗高脂血症的用途。
于1995年5月12日提交的美国申请号08/440061公开了 Lanreotide 用于治疗血淀粉酶过多(hyperamylinemia)的用途。
于1997年5月7日提交的美国申请号08/852221公开了 Lanreotide⑧用于治疗高催乳素血症和催乳素瘤的用途。
前面的专利和专利申请的内容并入本文中作为参考。
发明内容
本发明特征在于一种用于制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽 的方法，该肽具有N-端氨基酸、邻近该N-端氨基酸的倒数第二个氨基 酸和C-端氨基酸，其中所述方法包括如下步骤
(a)通过酯键把第一氨基酸连到固体载体树脂上以形成第一级偶 联产物，其包括(i)使碳酸铯的水溶液与第一氨基酸的醇溶液反应，以形成第一氨基酸的铯盐，(ii)获得第一氨基酸的无溶剂铯盐，(iii)在干 的极性非质子溶剂中使固体载体树脂与第一氨基酸的铯盐反应，以形 成第一级偶联产物；
其中第一氨基酸与肽的C-端氨基酸对应，第一氨基酸的非侧链氨 基被Boc封闭并且第一氨基酸没有需要保护的侧链官能团，以及固体 载体树脂为氯甲基化的聚苯乙烯树脂；
(b) 利用酸从第一级偶联产物中解封闭Boc，以形成第一级解封闭 的偶联产物；
(c) 任选地把下一个氨基酸偶联到第一级解封闭的偶联产物上，其 包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与第一级解封闭 的偶联产物反应，以形成下一级封闭的偶联产物，其中下一个氨基酸 具有被Boc封闭的非侧链氨基，并且如果下一个氨基酸具有一个或更 多个侧链官能团，那么侧链官能团不需要保护，或者侧链官能团具有 对于分别用来解封闭Boc和Fmoc的酸试剂和碱试剂稳定的保护基团；
(d) 从下一级封闭的偶联产物中解封闭Boc，其包括使下一级封闭 的偶联产物与酸反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；
(e) 任选地重复步骤(c)和(d)，每个循环形成(X+1)级的下一级解封 闭的偶联产物，其中X为所需的循环重复次数；
(f) 把下一个氨基酸偶联到得自(b)的第一级解封闭的偶联产物上， 或者任选地偶联到得自(e)的(X+l)级的下一级解封闭的偶联产物上，其 包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与所述第一级解 封闭的偶联产物或所述(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物反应，以形 成下一级封闭的偶联产物，其中下一个氨基酸具有被Fmoc封闭的非侧 链氨基，条件是如果下一个氨基酸具有一个或更多个侧链官能团，那 么侧链官能团不需要保护，或者侧链官能团具有对于用来解封闭Fmoc 的碱试剂稳定的保护基团；
(g) 从下一级封闭的偶联产物中解封闭Fmoc，其包括使下一级封 闭的偶联产物与伯胺或仲胺反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；
(h) 任选地重复步骤(f)和(g)，每个循环形成(X+1)级的下一级解封 闭的偶联产物，其中X为所需的循环重复次数，直到肽的倒数第二个氨基酸被偶联和解封闭；
(i)把N-端氨基酸偶联到(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物上， 其包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使N-端氨基酸与(X+1)级的下 一级解封闭的偶联产物反应，以形成完成的封闭的偶联产物，其中N-端氨基酸具有被Boc或Fmoc封闭的非侧链氨基；
(j)从完成的封闭的偶联产物中解封闭Boc或Fmoc基团，其包括 在Boc的情况下使完成的封闭的偶联产物与酸反应，或者在Fmoc的情 况下与碱反应，以形成完成的肽-树脂产物；
(k)如果侧链官能团存在于完成的肽-树脂产物上，那么任选地脱 保护(deprotecting)完成的肽-树脂产物的侧链官能团，其包括使完成的 肽-树脂产物与适当的脱保护试剂反应，以形成脱保护的完成的肽-树脂 产物；及
(1)使肽与完成的肽-树脂产物或脱保护的完成的肽-树脂产物的固 体载体树脂断裂，以得到肽，其包括使完成的肽-树脂产物或脱保护的 完成的肽-树脂产物与氨、伯胺或仲胺反应，直到肽与树脂的断裂基本 上完成；
条件是在肽的合成中，步骤(f)和(g)必须进行至少一次。
本发明的优选方法是其中步骤(l)的氨、伯胺或仲胺在包含醇并且 任选包含非质子极性溶剂的溶剂中。
本发明的优选方法是其中步骤(l)进一步包括下列步骤 从溶剂中沉淀出断裂的肽； 过滤固体载体树脂和沉淀出来的肽；及 在酸溶液中提取肽，以离析肽。
本发明的优选方法是其中第一氨基酸为Boc-L-Thr。
本发明的优选方法是其中第一氨基酸为得到Boc-L-Thr-树脂作为 第一级偶联产物的Boc-L-Thr-铯盐，并且H-L-Thr-树脂为第一级解封闭的偶联产物。
本发明的优选方法是其中步骤(j)中用来解封闭Boc基团的酸为
TFA。
紧接着前述方法的优选方法是其中有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或 二甲基甲酰胺，并且肽偶联试剂为二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二 亚胺或N-乙基-N'-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺。
紧接着前述方法的优选方法包括在式H-L-Thr-树脂的第一级解封 闭的偶联产物形成之后，进行步骤(f)和(g)六次，其中按照这样的顺序 偶联下列氨基酸Fmoc-L-Cys(Acm)、 Fmoc-L-Val、 Fmoc-L-Lys(Boc)、 Fmoc-D-Trp 、 Fmoc-L-Tyr(O-t國Bu)和 Fmoc-L-Cys(Acm)， 以形成 H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-树脂。
紧接着前述方法的优选方法包括根据步骤(c)把Boc-D-(3-Nal偶联 至U H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Ti"p-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-树月旨 上，以形成 Boc國D-p-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D陽Trp-Lys(Boe)隱 Val-Cys(Acm)-Thr-树脂。
紧接着前述方法的优选方法包括根据步骤Ci)同时解封闭 Boc-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr(0-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr -树脂的封闭D-P-Nal的Boc基团、保护Tyr的O-t-Bu基团和保护Lys 的Boc基团，以得到式H-D-卩-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cy s( Acm)-Thr-树脂的完成的肽-树脂产物。
紧接着前述方法的优选方法包括通过使 H-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr誦D隱Trp-Lys隱Val-Cys(Acm)-Thr-树脂与氨在包
含醇并且任选包含非质子极性溶剂的溶剂中反应直到断裂基本上完 成，使肽，H-D-卩-Nal-Cys(Acm)-Tyr陽D-Trp-Lys-Val國Cys(Acm)-Thr与固体树脂断裂，以得至lj H-D-卩-Nal-Cys(Acm)墨Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2。
紧接着前述方法的优选方法是其中醇为甲醇并且极性非质子溶剂 为二甲基甲酰胺。
紧接着前述方法的优选方法包括通过使 H-D-p-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2与碘在醇 中的溶液反应直到脱保护和环化基本上完成，同时脱保护保护Cys的 Acm基团和环化所得至U的式H-D-J3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2的完成的肽产物的脱保护的Cys残基，以得 到H-D-p-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2。
本发明的优选方法是其中肽为H-D-P-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2。
紧接着前述方法的优选方法是其中肽为生长抑素类似物。
用于本发明的说明书中的术语的定义如下 "第一氨基酸"包括具有其被BOC保护的非侧链氨基的任何氨 基酸，其可商购或能够根据对于本领域的普通技术人员来说已知的方
法合成，例如，Boc-L-Thr;
"第一级偶联产物"描述了由第一个氨基酸向固体载体树脂上
偶联得到的连到固体载体树脂上的产物，例如Boc-L-Thr-树脂；
"第一级解封闭的偶联产物"描述了由BOC基团从第一级偶联产
物中除去或解封闭得到的产物，例如H-L-Thr-树脂，其中"H"代表得自 解封闭步骤的非侧链氨基的可利用的氢 ，
"下一个氨基酸"描述了具有其被Boc或Fmoc保护的非侧链氨 基的任何氨基酸，其可商购或能够根据对于本领域的普通技术人员来 说已知的方法合成。因为步骤(c)和步骤(f)能够处于其中步骤进行超过一次的重复循环中，所以每当进行步骤(C)或步骤(f)时，下一个氨基酸
能够独立地选自已知的和可合成的具有其分别被Boc或Fmoc保护的非 侧链氨基的氨基酸；
"(X+1)级的下一级封闭的偶联产物"描述了由下一个氨基酸与下 一级解封闭的偶联产物偶联得到的连到固体载体树脂上的产物。因为 步骤(C)和(d)及步骤(f)和(g)能够处于其中另外下一个氨基酸能够被偶 联的重复循环中，所以术语(X+1)级的下一级封闭的偶联产物意味着代 表得自前一个偶联循环的各产物；
"(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物"描述了由从(X+1)级的下一 级封闭的偶联产物中解封闭Fmoc基团得到的产物；
"完成的肽-树脂产物"描述了在把N-端氨基酸连到肽链上之后且 在除去或解封闭N-端氨基酸的非侧链氨基之后连到固体载体树脂上的 肽产物，但其仍然具有未通过用以解封闭N-端氨基酸的非侧链封闭基 团的反应所除去的任何侧链官能团保护基团；及
"脱保护的完成的肽-树脂产物"描述了连到固体载体树脂上的肽 产物，其中除去或脱保护氨基酸的侧链官能团的任何保护基团。
能够用来解封闭Boc的酸的实例为三氟乙酸(TFA)、甲磺酸和包含 HC1的有机溶液。
能够用来解封闭Fmoc的伯胺和仲胺的实例为4-(氨基甲基)哌啶、 哌啶、二乙胺、DBU和三(2-氨基乙基)胺。
能够用于中和游离的氨基的TFA盐(RNH3+CF3COCT,在下一级氨 基酸的偶联之前或期间必须将这些盐转化成"游离的"胺(NH2)，否则偶 联将不会起作用)的非亲质子性碱的实例为二异丙基乙胺(DIEA)和三乙 胺(TEA)。
能够用于氨基酸偶联反应的有机溶剂的实例为二氯甲烷、氯仿、 二氯乙垸、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、乙酸乙烯酯、l-甲基-2-吡咯垸酮、乙腈或者上面溶剂的组合。
肽偶联试剂的实例包括取代的碳二亚胺如二异丙基碳二亚胺、二
环己基碳二亚胺和N-乙基-N'-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺。
参与肽酰胺键形成的羧基和氨基分别称为"非侧链"羧基或氨基。 另一方面，未包括在肽酰胺键形成中的任何氨基酸官能团称为"侧链" 官能团。
术语"碱稳定的基团"是指用来保护氨基酸的官能团的保护基团，
该保护基团(l)为碱稳定的，例如不能够被碱如4-氨基乙基-哌啶、哌啶、 或者三-(2-氨基乙基)胺除去，这些碱为典型地用来除去保护基团Fmoc 的碱，并且(2)能够被酸如三氟乙酸，或者通过其它手段如催化氢化来 除去。
此处和所附的权利要求书中分别使用符号"Fmoc"和"Boc"来表示 9-芴基甲氧羰基和叔丁氧羰基。
上述方法能够用来制备肽、优选生长抑素类似物，如八肽 Lanreotide ， 其具有下式 H-D-(3-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 。 当要合成H-D國p國Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2时，用来封闭侧链官能团Cys、 Lys和Tyr的碱稳定的保护基 团能够分别为乙酰氨甲基(Acm)、 Boc和叔丁基。对于Cys来说，Acm 是优选的。
"生长抑素"类似物所表示的为展示出与生长抑素相似(即，激动剂 (agonist))或相对(即，拮抗剂(antagonist))的生物活性的肽。
在式H-D-p-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2中，常规的
三字母氨基酸符号(例如，Lys)的各自代表氨基酸的结构残基。例如，上式中的符号Lys代表-NH-CH((CH2)4NH2)-CO-。符号D-p-Nal代表氨 基酸残基D-2-萘丙氨基。括号代表连接肽的两个Cys残基的游离硫醇 的二硫键，表示括号内的肽的氨基酸为环状。
基于此处的描述，本领域的技术人员能够将本发明用至最充分的 程度。
除非另外限定，本文中所采用的所有技术和科技术语均具有与本 发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。此外，本文中 提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都并入作为参考。
根据本发明的方法，按照下列步骤，能够制备肽。
将0.5摩尔当量的碳酸铯在水中的溶液缓慢添加到1摩尔当量的 Boc-AA^Bachem California, Torrance, CA)溶于醇、优选甲醇中的溶 液中，其中AA'与C-端氨基酸对应。在室温下将所得到的混合物搅拌 约1小时，然后在降低的压力下除去所有醇和水，得到Boc-AA'的铯 盐干粉末。用氯化的溶剂、优选二氯甲垸(DCM)，醇、优选甲醇，及极 性非质子溶剂、优选二甲基甲酰胺(DMF)漂洗Merrifidd树脂，1.0当 量(氯甲基化的聚苯乙烯；200~400目，引入为1.3毫当量m叫/克， Advanced ChemTech， Louisville, Kentucky or Polymer Laboratories, Church Stretton， England)。将Boc-AA1铯盐粉末溶于干的极性非质子 溶剂、优选DMF中，并且将溶液与上面洗涤过的树脂结合。在惰性气 氛如氮气中，在约45X: 65T:、优选5(TC 6(TC下，使浆料小心地混合 约48 106小时、优选85 90小时。将树脂过滤，并用极性非质子溶剂 优选DMF、水及最后是醇如MeOH对其充分漂洗。在降低的压力下， 干燥Boc-AA、树脂。
将Boc-AA、树脂添加到具有粗糙烧结的玻璃过滤底板的玻璃反应 器中。树脂用氯化的溶剂如DCM漂洗，用有机酸、优选25。/。TFA/DCM解封闭，用氯化的溶剂如DCM和醇如MeOH简单漂洗，用有机碱、 优选三乙胺在DCM中进行中和，以及再次用DCM和极性非质子溶剂 如DMF漂洗，以得到解封闭的AA^树脂。
然后，将解封闭的AAL树脂任选地与任何所需数量的氨基酸偶联。 如果随后的氨基酸在a-氨基上被Fmoc保护(Fmoc-AAX)，那么侧链基 团必须或者不需要保护(如Fmoc-Gly、 Fmoc-Ala、 Fmoc-Phe或Fmoc-苏氨酸)，或者侧链必须由耐碱除去的基团保护。利用在DCM/DMF混 合物中的肽偶联试剂(如二异丙基碳二亚胺(DIC))，将摩尔过量的 Fmoc-AAX(其中x为肽中氨基酸的序号，从C-端计数)与解封闭的AA1-树脂偶联约60分钟。偶联的树脂用DMF、醇和DCM漂洗，以得到 Fmoc-AAX-AAL树脂。能够通过Kaiser茚三酮方法检査偶联。 Fmoc-AAX-AA^树脂然后用DMF漂洗一次，接着用碱在有机溶剂中(如 哌啶在DMF中)的溶液解封闭，以得到AAX-AA、树脂。AAX-AA、树脂 然后用DMF漂洗，接着用醇(如MeOH)和DCM两者漂洗几次。 AAX-AA!-树脂用DMF漂洗一次约3分钟，用异丙醇(IPA)漂洗三次优 选每次约2分钟，以及用DCM漂洗三次优选每次约2分钟。然后使树 脂准备好与如上所述的Fmoc保护的氨基酸或如下所述的Boc氨基酸进 一步偶联。
同样地，如果，选定了在a-氨基(Boc-AAX)上有Boc保护的待偶联 到脱保护的AA^树脂上的任何随后的氨基酸，那么侧链基团也必须或 者不需要保护(如Boc-Gly、 Boc-Ala、 Boc-Phe或Boc-苏氨酸)，或者侧 链必须由耐被酸和碱两者除去的基团如Boc-Cys(S-Acm)保护。如果选 择，那么Boc-AAX利用与上文所述的Fmoc氨基酸相同的试剂和溶剂 进行偶联并且能够通过Kaiser茚三酮方法检查偶联的完成。 Boc-AAX-AA^树脂然后用酸在有机溶剂中如TFA在DCM中的溶液解 封闭，以得到CF3CCT H+AAX-AA^树脂。该树脂然后用氯化的溶剂如 DCM和醇如MeOH漂洗几次，并用在DCM中的非亲质子性碱如三乙 胺中和，接着用氯化的溶剂如DCM再漂洗几次，以得到AAX-AA^树脂。然后使树脂准备好与如上所述的Boc或Fmoc保护的氨基酸进一步 偶联。
依据想得到的肽序列和所使用的a-氨基封闭的氨基酸类型，不管 Fmoc保护或Boc保护，执行前述偶联步骤的适当组合直到在序列中需 要侧链具有保护基团的氨基酸，该保护基团能够或者被用来解封闭在 a-氨基上的Fmoc的碱或者被用来解封闭在a-氨基上的Boc的酸除去。 这种受保护的氨基酸可以为N-a-Boc-N'-s-Fmoc-赖氨酸或 N-a-Fmoc-N'-s-Boc-赖氨酸。 一旦这种情况出现，选取的所有随后的氨 基酸的a-氨基封闭基团必须与直到N-端氨基酸的那个位置所选取的侧 基保护适合。即，侧链保护基团必须对于用来解封闭随后的a-氨基封 闭基团的解封闭试剂稳定。对于N-端氨基酸来说，或者Boc或者Fmoc 能够用作a-氨基封闭基团，因为N-端氨基酸的解封闭能够同时脱保护 某些受保护的侧链，而对于肽的合成策略没有不利影响，因为将不会 添加其它氨基酸。
然后，必须将仍然连在树脂上的完成的肽链脱保护和解封闭。为 了除去N-端氨基酸的任何碱稳定的保护基团和a-氨基封闭基团，如果 适用的话，用在有机溶剂中的酸如TFA在DCM中处理肽-树脂。为了 除去N-端氨基酸的任何酸稳定的保护基团和a-氨基封闭基团，如果适 用的话，肽-树脂用有机碱如哌啶在DMF中处理。或者能够将酸稳定 的基团留住，以在随后肽的断裂中被氨或胺碱除去。脱保护的肽-树脂 然后用氯化的溶剂如DCM和醇如MeOH漂洗，并且在降低的压力下 干燥至恒定重量。
使肽与树脂断裂，并且通过在3:1 MeOH/DMF中悬浮肽-树脂而将 C-端转化成酰胺。在氮气中，把悬浮液冷却至约^(TC，并将无水氨气 添加到溶剂表面下方直到溶液饱和，同时把温度保持在低于约10°C。 使浆料小心地混合约24小时，同时使温度升至约2(TC。在取决于肽的 适当的条件下，通过用HPLC监视甲基酯中间体的消失，来检查反应，并且根据需要添加更多无水氨，直到在HPLC上 甲基酯的面积低于所需产物峰的面积的10%。把浆料冷却至约低于10 °C，并且继续混合过夜，以使肽沉淀出来。将沉淀物和树脂过滤并用
冷MeOH漂洗。在降低的压力下干燥沉淀物和树脂，并且用乙酸水溶 液从树脂中提取产物。
如果肽在其序列内包含受保护的Cys残基，则Cys的硫醇基团能 够根据下列步骤脱保护和环化。在氮气氛中，将具有Acm-保护的Cys 基团的肽溶于乙酸水溶液中。快速搅拌溶液，并且以一个部分添加碘 在醇中的溶液。搅拌混合物并通过HPLC检测脱保护的完成，接着通 过用2%硫代硫酸钠溶液滴定至无色终点而结束。将粗混合物在C8填 料上用0.1乙酸铵/乙腈梯度缓冲液通过制备色谱提纯，在C8填料上 用0.25N乙酸/乙腈梯度脱盐，以及冻干，而得到所需的肽。
具体实施例方式
提供下列实施例来举例说明本发明的方法并且不应当将其解释为 限制本发明的范围。
实施例1
H2-D-(3-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 A) Boc-L-Thr-树脂
将2.58克碳酸铯在2.5 ml水中的溶液缓慢添加到溶于7 ml甲醇的 3.48克Boc-L-苏氨酸(Bachem California, Torrance, CA)的、溶液中。在 室温下搅拌所得到的混合物约1小时，然后在降低的压力下除去所有 甲醇和水，得到Boc-L-苏氨酸的铯盐干粉末。用二氯甲垸(DCM)、甲 醇(MeOH)和二甲基甲酰胺(DMF)(均为2X70 ml)漂洗10克Merrifield 树脂(氯甲基化聚苯乙烯；200~400目，氯化物引入为1.3毫当量/克， Advanced ChemTech， Louisville, Kentucky)。将Boc-L-苏氨酸铯盐粉 末溶于60ml干DMF中，并且将溶液与上面洗涤过的树脂结合。在氮 气氛中，在约5(TC 6(TC下，使浆料轻轻地混合约85 90小时。将树脂过滤并用DMF、去离子水以及最后是MeOH充分漂洗。在降低的压力 下，在约4(TC下，干燥Boc-苏氨酸树月旨(苏氨酸引入,.85士0.15毫当量
/克干树脂)。
B) H-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-树脂 将得自步骤A的2.0克Boc-苏氨酸树脂添加到具有粗糙烧结的玻 璃过滤底板的50 ml玻璃反应器中(批次规模=1.74毫摩尔)。树脂用 DCM(20 ml)漂洗两次每次约5分钟，用25% TFA/DCM(30 ml)解封闭 一次约2分钟且一次约25分钟，用DCM(20 ml)、异丙醇(IPA)(20 ml) 禾口DCM(20 ml)漂洗三次约2分钟，用10Q/。三乙胺/DCM(20 ml)中和两 次约5分钟，用DCM漂洗三次约2分钟，以及用DMF(20 ml)漂洗一 次约5分钟。
将解封闭的树脂与在14 ml 2:1 DCM/DMF中的1.8克(4.35毫摩 尔，2.5当量)Fmoc-L-半胱氨酸(Acm)(Bachem， CA)和683 ^1(4.35毫摩
尔，2.5当量)二异丙基碳二亚胺(DIC)偶联约1小时。偶联的树脂用 DMF(20 ml)漂洗一次约3分钟，用异丙醇(IPA)漂洗三次约2分钟，以 及用DCM(20 ml)漂洗三次约2分钟。通过Kaiser茚三酮方法检査偶联。
偶联的树脂然后用DMF漂洗一次，接着用哌啶在DMF中的溶液 解封闭。然后用DMF漂洗解封闭的偶联的树脂，以及用MeOH和DCM 两者漂洗几次。偶联的树脂用DMF(20ml)漂洗一次约3分钟，用异丙 醇(IPA)(20 ml)漂洗三次约2分钟，以及用DCM(20 ml)漂洗三次每次约 2分钟。通过Kaiser茚三酮方法检查偶联。
如上所述按照下列顺序，利用在DMF/DCM中的DIC，使下列受 保护的氨基酸的每一种与漂洗过的树脂偶联并解封闭Fmoc-L-缬氨 酸、Fmoc-L-赖氨酸(Boc)， Fmoc-D-色氨酸、Fmoc-L-酪氨酸(O-t-Bu)和 Fmoc-L-半胱氨酸(Acm)(所有均得自Bachem California)、 Boc-D-2-萘丙 氨酸(Synthetech， Albany, OR)。完成的肽链用75:20:5 DCM/TFA/苯甲醚(30 ml)解封闭和脱保护两 次约2分钟和约25分钟，用DCM(20 ml)、 IPA(IO ml)和DCM(20 ml) 漂洗三次每次约2分钟，用10Q/。三乙胺/DCM(20 ml)中和两次约5分钟， 以及用DCM(20 ml)和MeOH(20 ml)漂洗三次约2分钟。在降低的压力 下干燥树脂。干重=3.91克(理论值的103%)。
C) H-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 将得自步骤B的2.93克负载肽的树脂(1.3毫摩尔当量)悬浮在50
ml3:l MeOH/DMF中。在氮气中，把悬浮液冷却至约〈10'C ，以及使无 水氨气鼓泡直至饱和，同时把温度保持在低于约IO'C。使浆料轻轻地 混合约24小时，同时使温度升至约20°C。通过用HPLC(在VYDAC 上，对于甲基酯来说室温(Rt.) 14分钟对(vs.)对于酰胺产物来说室温 ~9.3分钟，5|Li 100 A，利用26% CH3CN/0.1% TFA无梯度(Isocratic)的 C18， lml/分钟，220nm)监视甲基酯中间体的消失，来检查反应完成。 将反应冷却，并且添加更多无水氨，直到在HPLC上甲基酯的面积低 于产物峰的10%面积。把浆料冷却至约低于10°C，并且继续混合过夜， 以使肽沉淀出来。将沉淀物和树脂过滤并用15 ml冷MeOH漂洗。在 降低的压力下干燥沉淀物和树脂，并且用50。/。乙酸水溶液(3X30 ml， 分成多个部分)从树脂中提取产物。HPLC分析显示在混合物中存在870 mg(0.70毫摩尔)标题产物(96%纯度，在无梯度HPLC系统上)。
D) H-D-p-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2
在氮气氛中，将得自步骤C的500 mg(0.40毫摩尔)肽溶于300 ml 4%乙酸中并加热至约55'C。快速搅拌溶液，并且以一个部分添加碘在 7.7 ml MeOH(0.60毫摩尔)中的2% w/v溶液。搅拌混合物约15分钟， 接着通过用2。/o硫代硫酸钠溶液滴定至无色终点( 2ml)而结束。将混合 物冷却至室温并过滤。将粗混合物在C8填料(YMC， Inc.， Wilmington， NC)上用0.1乙酸铵/乙腈梯度缓冲液通过制备色谱提纯，在YMC C8 填料上用0.25N乙酸/乙腈梯度脱盐，以及冻干，以得到350 mg99。/。纯度的所需的肽。
从上面描述，本领域的技术人员能够容易地确定本发明的必要特 征，并且在不偏离其精神和范围的条件下，能够完成本发明的各种改 变和修改以使它适应各种用途和条件。因而，其它实施方案也落在权 利要求内。
权利要求
1.一种用于制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽的方法，该肽具有N-端氨基酸、邻近该N-端氨基酸的倒数第二个氨基酸和C-端氨基酸，其中所述方法包括如下步骤(a)通过酯键把第一氨基酸连到固体载体树脂上，以形成第一级偶联产物，其包括(i)使碳酸铯的水溶液与第一氨基酸的醇溶液反应，以形成第一氨基酸的铯盐，(ii)获得第一氨基酸的无溶剂铯盐，(iii)在干的极性非质子溶剂中使固体载体树脂与第一氨基酸的铯盐反应，以形成第一级偶联产物；其中第一氨基酸与肽的C-端氨基酸对应，第一氨基酸的非侧链氨基被Boc封闭并且第一氨基酸没有需要保护的侧链官能团，以及固体载体树脂为氯甲基化的聚苯乙烯树脂；(b)利用酸从第一级偶联产物中解封闭Boc，以形成第一级解封闭的偶联产物；(c)任选地把下一个氨基酸偶联到第一级解封闭的偶联产物上，其包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与第一级解封闭的偶联产物反应，以形成下一级封闭的偶联产物，其中下一个氨基酸具有被Boc封闭的非侧链氨基，并且如果下一个氨基酸具有一个或更多个侧链官能团，那么侧链官能团不需要保护，或者侧链官能团具有对于分别用来解封闭Boc和Fmoc的酸试剂和碱试剂稳定的保护基团；(d)从下一级封闭的偶联产物中解封闭Boc，其包括使下一级封闭的偶联产物与酸反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；(e)任选地重复步骤(c)和(d)，每个循环形成(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物，其中X为所需的循环重复次数；(f)把下一个氨基酸偶联到得自(b)的第一级解封闭的偶联产物上，或者任选地偶联到得自(e)的(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物上，其包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与所述第一级解封闭的偶联产物或所述(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物反应，以形成下一级封闭的偶联产物，其中下一个氨基酸具有被Fmoc封闭的非侧链氨基，条件是如果下一个氨基酸具有一个或更多个侧链官能团，那么侧链官能团不需要保护，或者侧链官能团具有对于用来解封闭Fmoc的碱试剂稳定的保护基团；(g)从下一级封闭的偶联产物中解封闭Fmoc，其包括使下一级封闭的偶联产物与伯胺或仲胺反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；(h)任选地重复步骤(f)和(g)，每个循环形成(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物，其中X为所需的循环重复次数，直到肽的倒数第二个氨基酸被偶联和解封闭；(i)把N-端氨基酸偶联到(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物上，其包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使N-端氨基酸与(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物反应，以形成完成的封闭的偶联产物，其中N-端氨基酸具有被Boc或Fmoc封闭的非侧链氨基；(j)从完成的封闭的偶联产物中解封闭Boc或Fmoc基团，其包括在Boc的情况下使完成的封闭的偶联产物与酸反应，或者在Fmoc的情况下与碱反应，以形成完成的肽-树脂产物；(k)如果侧链官能团存在于完成的肽-树脂产物上，那么任选地脱保护完成的肽-树脂产物的侧链官能团，其包括使完成的肽-树脂产物与适当的脱保护试剂反应，以形成脱保护的完成的肽-树脂产物；及(l)使肽与完成的肽-树脂产物或脱保护的完成的肽-树脂产物的固体载体树脂断裂，以得到肽，其包括使完成的肽-树脂产物或脱保护的完成的肽-树脂产物与氨、伯胺或仲胺反应，直到肽与树脂的断裂基本上完成，条件是在肽的合成中，步骤(f)和(g)必须进行至少一次。
2. 根据权利要求1的方法，其中步骤(l)的氨、伯胺或仲胺在包含 醇并且任选包含非质子极性溶剂的溶剂中。
3. 根据权利要求l的方法，其中步骤(l)进一步包括下列步骤 (i)从溶剂中沉淀出断裂的肽；Cii)过滤固体载体树脂和沉淀出来的肽；及 (iii)在酸溶液中提取肽，以离析肽。
4. 根据权利要求1的方法，其中第一氨基酸为Boc-L-Thr。
5. 根据权利要求4的方法，其中第一氨基酸为得到Boc-L-Thr-树 脂作为第一级偶联产物的Boc-L-Thr-铯盐，并且H-L-Thr-树脂为第一级解封闭的偶联产物。
6. 根据权利要求5的方法，其中步骤(j)中用来解封闭Boc基团的 酸为TFA。
7. 根据权利要求6的方法，其中有机溶剂为二氯甲垸、氯仿或二 甲基甲酰胺，并且肽偶联试剂为二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚 胺或N-乙基-N'-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺。
8. 根据权利要求7的方法，其包括在式H-L-Thr-树脂的第一级解 封闭的偶联产物形成之后，进行步骤(f)和(g)六次，其中按照这样的顺 序偶联下列氨基酸Fmoc-L-Cys(Acm)、 Fmoc-L-Val、 Fmoc-L-Lys(Boc)、 Fmoc-D-Trp 、 Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu)禾卩Fmoc-L-Cys(Acm)， 以形成 H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-树脂。
9. 根据权利要求8的方法，其包括根据步骤(i)把Boc-D-卩-Nal偶 联到H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-树脂 上，以形成Boc-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr(0-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys (Acm)-Thr-树脂。
10. 根据权利要求9的方法，其包括根据步骤(j)同时解封闭 Boc-D-卩隱Nal-Cys(Acm)-Tyr(O曙t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)國Val-Cys(Acm)-Thr -树脂的封闭D-(3-Nal的Boc基团、保护Tyr的O-t-Bu基团和保护Lys的Boc基团，以得到式H-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm)-Thr-树脂的完成的肽-树脂产物。
11. 根据权利要求10的方法，其包括通过使 H-D-P-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-树脂与氨在包 含醇并且任选包含非质子极性溶剂的溶剂中反应直到断裂基本上完 成，使肽，H-D-p-Nal陽Cys(Acm)-Tyr-D-T卬-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr与固 体树脂断裂，以得至lj H-D-|3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2。
12. 根据权利要求ll的方法，其中醇为甲醇并且极性非质子溶剂 为二甲基甲酰胺。
13. 根据权利要求12的方法，其包括通过使H-D-P-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2与碘在醇中的溶液反应直到脱保 护和环化基本上完成，同时脱保护保护Cys的Acm基团并环化所得到 的式H-D-p-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2的完 成的肽-树脂产物的脱保护的Cys残基，以得到 H-D-(3-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2。
14. 根据权利要求1的方法，其中肽为H-D-p-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2。
15. 根据权利要求l的方法，其中肽为生长抑素类似物。
16. 根据权利要求1的用于制备包含三个或更多个氨基酸残基的 肽的方法，该肽具有N-端氨基酸、邻近该N-端氨基酸的倒数第二个氨 基酸和C-端氨基酸，该方法基本上如以上所描述和例示。
全文摘要
本发明公开了一种利用Boc和Fmoc保护的氨基酸两者及氯甲基化的聚苯乙烯树脂合成包含三个或更多个氨基酸残基的肽的固相方法。
文档编号C07K1/00GK101541824SQ200780043049
公开日2009年9月23日 申请日期2007年8月31日 优先权日2006年11月21日
发明者凯瑟琳·菲奥纳·多尔顿, 加里·亚历山大·西夫吕克, 史蒂文·艾伦·杰克逊, 约翰·斯图尔特·艾农 申请人:爱尔兰伊普森制造有限公司