家猪增殖诱导配体cDNA序列及其克隆方法和重组应用的制作方法

专利名称：家猪增殖诱导配体cDNA序列及其克隆方法和重组应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及家猪增殖诱导配体cDNA及其克隆、表达技术。
背景技术：
人增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand, APRIL)为1998年首先发现 并成功克隆的与人体免疫调控密切相关的肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员，主要表达 于树突状细胞、巨噬细胞和T、 B淋巴细胞表面。APRIL可通过特异性受体促进部分恶性 胶质瘤细胞的增殖，体外可促进T、 B细胞的增殖和T细胞的活化，体内影响胸腺非依赖 性B细胞的免疫反应。APRIL转基因小鼠的T细胞在体外活化后能明显增强其增殖能力。 APRIL诱导的增殖效应还可经TACI调节，TACI在活化T细胞表面表达增加，用TACI-Ig 能有效抑制APRIL促活化T细胞的增殖作用，但对未活化的T细胞无此效应。APRIL缺陷 小鼠存在选择性IgA缺失，降低血清IgA抗体对TD抗原相关性黏膜免疫的应答反应，APRIL 对T细胞非依赖性II型抗原反应有明显的增强作用。由于APRIL在免疫系统中的重要调节 作用，其与免疫系统疾病关系密切，在临床方面能通过对APRIL的检测而达到早期诊断， 这对肿瘤的早期治疗具有重要意义，通过可溶性受体竞争性抑制配体与膜受体结合来抑制 某些肿瘤细胞的增殖，为肿瘤治疗提供新的靶点。因此，通过APRIL抑制剂的筛选可为与 APRIL高表达相关的多种疾病的治疗提供新的候选药物。可见对APRIL功能及机理的进一 步研究将为疾病的诊断、预防和治疗提出新的思路和方案。根据GenBank、 EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前只有 人、鼠和兔的APRIL cDNA已被克隆，并分别己在GenBank数据库中申请了序列号，序列 号分别是AF046888、 NM023517和EF494239。家猪增殖诱导配体(pAPRIL) cDNA还未被克 隆出来，关于pAPRIL基因的研究及应用在整个国内外还处于完全空白状态。家猪是国内 外十分重要的肉源畜类，由于增殖诱导配体具有很强的免疫调节能力，基因工程家猪 APRIL蛋白有可能开发成一种能增强家猪免疫能力的生物制剂(如免疫佐剂等)，用于体 质弱、免疫功能低下的病家猪，增加家猪的抗病毒能力，尤其是在由于家猪新型免疫抑制 性疾病如家猪蓝耳病、伪狂犬，圆环病毒病(仔家猪断奶多系统消耗性综合症)，导致传 统兽医疫苗免疫效力不足或失效，因而给畜牧业生产造成了极大损失的今天。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量家猪的细胞因子得以克隆及 重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市。细胞因子用于细菌病毒类疾病的治疗能够 克服传统药物副作用大、疗效不佳的缺点，而且运用基因工程方法生产的细胞因子，可以 大大降低生产成本，获得良好的市场信价比，因此，重组家猪APRIL蛋白具有潜在的巨大 市场应用价值。 发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种从家猪提取的增殖诱导配体(APRIL) cDNA，并提供增殖诱导配体cDNA的克隆方法、重组表达及活性检测技术。本发明从家猪中克隆到增殖诱导配体cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所示的序列。家猪增殖诱导配体，它具有SEQ ID N0.2所示的序列。本发明的家猪增殖诱导配体cDNA的克隆方法如下(1) 根据己知物种的增殖诱导配体cDNA保守序列设计引物正义寡核苷酸兼并引物zl: 5， — CAGAG跳NGATGNCCTGGAAGCCTG -3， (N=A、 T、 G、 C)反义寡核苷酸兼并引物z2: 5， _ TCACAAACCCCAGGAANGTTCCATG-3， (N=A、 T、 G、 C)(2) 从家猪脾脏提取总RNA，(3) 通过RT-PCR方法，以上述引物zl及z2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列， 命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定，(4) 应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，根据已获得的P1核苷酸序列设计正义引物 GSP2(5， -GTCTCCTGCCTTCCCTGGCCCTCCCGAG-3，)及反义引物GSP1 (5， -CAAGCGTGGGAGAGG TCTGGAGGCCCAAG-3，)分别用以扩增出APRIL cDNA 3，-及5，-全长末端区域，扩增片段 分别命名为P2及P3，然后分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定，(5) 根据Pl、P2、P3的重叠区域拼接出cDNA的全长序歹iJ，并设计首尾引物FL1(5' -GCTTCCTAGAGAAACTGACACTAAATTCTC-3，)及FL2 (5， -CTGTCAAACCTGGGGTTCCAGTCAAAC- 3，)一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定及验证。 上述家猪增殖诱导配体cDNA的克隆方法具体操作如下(1) 根据已知物种的增殖诱导配体全长cDNA两段高保守区域设计同源克隆的正义寡 核苷酸兼并引物zl (5， - CAGAGNNCNGATGNCCTGGAAGCCTG -3， (N=A、 T、 G、 C))与反义 寡核苷酸兼并引物z2 (5， - TCACAAACCCCAGGAANGTTCCATG -3，(N=A、 T、 G、 C))，(2) 应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen公司)，按照操作手册，提取出家猪脾 脏细胞的总RNA。(3) 应用RT-PCR方法，以上述zl及z2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，全 长为490bp，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反 应条件为以总RNA为模板，在50ul反应体系中，加入5XRT-PCR反应缓冲液10u 1、 25mM MgS042 u 1、 lOmM dNTP混合物1 u 1、 20 y M的上下游引物各2. 5 u 1、 AMV逆转录酶(Takara公司)1 y 1、 Tf 1 DNA聚合酶1 u 1及RNA模板2 P 1，补水至50 u 1。 RT-PCR 循环参数为48。C逆转录45min， 94。C变性2min，再进行40个PCR循环(94。C变性30s， 57。C退火lmin， 68。C延伸2 min)，最后于68'C延伸7 min。 RT-PCR产物用1. 5%的琼月旨 糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约bp的DNA条带，置4'C保存。(4) 应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，采用SMART RACE Kit (Clontech公司) 根据已获得的Pl碱基序列设计正义引物GSP2 (5' - GTCTCCTGCCTTCCCTGGCCCTCCCGAG -3')及反义引物GSP1 (5， - CAAGCGTGGGAGAGGTCTGGAGGCCCAAG -3，)分别用以扩增出 APRILcDNA3，-及5，-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2 (575bp)及P3 (820bp)， 分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定。(5) 根据Pl、 P2、 P3的重叠区域拼接出全长序列，并设计首尾引物FL1 (5'-GCTTCCTAGAGAAACTGACACTAAATTCTC-3，)及FL2 (5， -CTGTCAAACCTGGGGTTCCAGTCAAAC-3，) 一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取8个阳性克隆进行碱基序列 测定，以验证其真实性。将所得序列与GenBank数据库序列进行BLAST程序相似性搜索，发现与已知的人、鼠 和兔APRIL序列相似率最高，分别是96， 93和97%、，从而可以确定该序列是家猪增殖诱 导配体(pAPRIL)的全长cDNA，其开放阅读框如SEQ ID NO. 1所示。对该基因的进一步研究表明pAPRIL基因是一个组成表达性基因；表达该基因功能 区后的重组蛋白(soluble pAPRIL)具有很强的生物学活性；该基因功能区编码的蛋白对 家猪B淋巴细胞具有明显的促增殖效应;充分表明本发明克隆得到的基因就是'家猪增殖诱 导配体(pAPRIL)的cDNA。上述家猪增殖诱导配体(pAPRIL)cDNA的重组应用就是通过现有基因工程方法，生产 重组pAPRIL，作为家猪免疫增强剂，转入家猪体内，增加其免疫力，在饲养中应用。


图1是pig APRIL (pAPRIL)全长cDNA的克隆过程示意图；其中Pl代表同源克隆 片段；P2代表3， -RACE产物；P3代表5， -RACE产物；全长cDNA共1258 bp。 图2是pig APRIL cDNA序列及推测编码氨基酸序列。图3是pig APRIL与人、鼠及兔APRIL全长氨基酸序列同源性比较图。其中*代表 一致氨基酸；()及(.)分别代表保守和半保守的氨基酸，箭头所指代表弗林蛋白酶识 别位点，双线所示为硫酸类肝素蛋白聚糖(HSPG)结合为点，切割后的C端为APRIL的胞 外可溶性功能区(soluble pAPRIL)，灰色阴影为胞外保守的半胱氨酸。图4是pig APRIL mRNA在各组织中的real time-PCR表达分析图。 图5是pig APRIL的可溶性功能区(soluble pAPRIL)在大肠杆菌BL21 (DE3)中的诱 导表达，Ni+柱纯化后重组蛋白的SDS-PAGE鉴定及鼠抗His6-tag的western-blotting鉴 定结果，图中条带l是未经IPTG诱导的全菌蛋白，2是经IPTG诱导5小时后的全菌蛋 白，3是经Ni+柱纯化后目的蛋白，4和5是鼠抗His6-tag的western-blotting鉴定结果， 可见在目的蛋白位置出现了特异性条带。图6是本发明克隆的pAPRIL的可溶性功能区(soluble pAPRIL)对家猪B淋巴细胞 的共刺激促增殖作用(金黄色葡萄球菌Ccwan 1 (SAC)作为共刺激因子)结果示意图。 说明不同浓度的soluble pAPRIL (psAPRIL)相对于PBS对照组、全菌蛋白对照组、B 淋巴细胞刺激因子(psBAFF)及金黄色葡萄球菌Cowan 1 (SAC)对照组在作用家猪B淋 巴细胞72小时后，对家猪B淋巴细胞显著的促增殖作用，且呈剂量依赖效应。(说明SAC 是B淋巴细胞特异丝裂原，在此作为soluble pAPRIL的共刺激因子)具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理解 的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例l:家猪(Sus scrofa)，人工饲养。(1) 引物设计应用ClustalX软件对己克隆出的人、鼠、兔增殖诱导配体全长cDNA 序列进行同源性比对分析，精心选取出两段高保守区域用来设计同源克隆的正义寡核苷酸 兼并引物zl (5， -CAGAGNNCNGATGNCCTGGAAGCCTG-3， (N=A、 T、 G、 C))与反义寡核苷 酸兼并引物z2 (5， — TCACAAACCCCAGGAANGTTCCATG -3，(N=A、 T、 G、 C))，(2) 提取总RNA:应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen公司)按照其操作手册提取出约O. 5克家猪脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。(3) 应用RT-PCR方法，以上述zl及z2为特异性引物，扩增出pigAPRIL (pAPRIL) cDNA 的一段序列，全长为490bp，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。 RT-PCR的反应条件为以总RNA为模板，在50iU反应体系中，加入5XRT-PCR反应缓冲液 10 yl、 25mM MgS042 u 1、 10mM dNTP混合物l u 1、 20 u M的上下游引物各2. 5 y 1、 AMV逆转 录酶(Takara公司)lu 1、 Tfl DNA聚合酶1 y 1及RNA模板2ul，补水至50ul。 RT-PCR 循环参数为48。C逆转录45min， 94。C变性2min，再进行40个PCR循环(94。C变性30s， 57°C 退火l min， 68'C延伸2 min)，最后于68。C延伸7 min。 RT-PCR产物用l. 5%的琼脂糖凝胶 电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约408bp的DNA条带，置4。C保存。(4) 应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，采用SMART RACE Kit (Clontech公司)根 据已获得的Pl碱基序列设计正义引物GSP2及反义引物GSPl分别用以扩增出pAPRIL cDNA 3，-及5'-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2 (575bp)及P3 (820bp)，分别克隆入 pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定。操作完全按照试剂盒操作手册要求进行。(5) 如图1所示，根据P1、 P2、 P3的重叠区域拼接出pig APRIL cDNA的全长序列，并 设计首尾引物FLl及FL2—步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，经含A卿抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑取出8个阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱 基序列测定，得到如图2所示的pig APRIL全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。(6) 同源检索将所得序列向http:〃w丽.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/提交克隆得到 的cDNA序列，在GenBank、 EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库进行相似性搜索及同 源性分析，如图3所示，发现与已知的人(GenBank登录号AF046888)、鼠(GenBank登录号 NM023517)及兔(GenBank登录号EF494239) APRIL氨基酸序列相似性最高(但不包括数据 库中其他种属的预测氨基酸序列)，分别是96, 93和97%，可以确定该序列是就家猪增殖诱 导配体(pAPRIL)的全长cDNA。并且其开放阅读框具有SEQ ID NO. l序列，碥码的蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。实施例2:Pig APRIL基因在各组织的表达分析采用实施例1中的提取RNA的方法，分别提取了家猪肝(liver)、外周血淋巴细胞 (PBLs)、 肾(kidney)、胸腺(thymus)、小肠(intestine)、脾(spleen)、心(heart) 及肺(lung)的总RNA，运用Real time-PCR法对pig APRIL基因在各组织的表达进行了研究，对各组织的RNA进行逆转录反应，体系为RNA 3 u 1， polyA引物1 u 1，补水至18. 5 iU， 70°C 预变性5 min,冰浴2 min,在体系中加入5XRT-PCR反应缓冲液5 u 1、 lOmM dNTP混合物 1.5ul、 MLV逆转录酶(Takara公司)lul、 inhibitor lu 1至25y 1。 42。C水浴反应l h。 根据APRIL cDNA序列设计两条特异性引物分别为PA1 (5， -GCAGGTGTGTTCCATTTACA CCAAG-3，)和PA2(5， - TCACAGTTTCACAACTCCCAGGAAG-3 ，)，反应条件为SYBR Green Realtime PCRMix 25ul，上下游引物各2ul、 cDNA模板2ul、补水至50ul。各样品作 3个复孔。Real time-PCR循环参数为94。C预变性5min，再进行40个PCR循环(94'C变性 15s， 60。C退火15s， 72。C延伸45s)。结果如图4所示，pig APRIL基因是一个组成表达性 基因，它在各个组织中均有表达。试验中家猪GAPDH mRNA扩增作为内参，采用的引物为 PG1 (5'-GACTTCGAGCAGGAGATGG-3，)和PG2 ( 5'隱GCACGGTGTTGGTGTTGGCGT AGAGG-3')。pig soluble APRIL重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达以实施例l得到的pig APRIL全长cDNA为模板，设计引物psl (5' - TCAGGACATATGGCC GTGCT CACCCGTAAACAG-3， (〃Gfe I ))及ps2 (5， - ACTGAGGGATCCTCACAGTTTCACAACTCCCA G-3' (fe/ H I))扩增出pig APRIL cDNA胞外可溶区段(soluble pAPRIL)，引物分别引 入酶切位点AWeI及fe州I ，亚克隆入pET28a载体，构建成重组载体pET28a-psAPRIL。将 此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)，经特异性条件(诱导温度24°C; IPTG 诱导浓度0. lmM/L)诱导，胞浆内高可溶性表达出了目的蛋白soluble pAPRIL，此融合 蛋白经共刺激促增殖试验(图6)证实具有soluble pAPRIL的高活性生物学功能。 重组目的蛋白的的Ni+亲和纯化IPTG诱导含有重组载体pET28-psAPRIL的大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3) 5小时后， 4。C收菌，冰上超声破碎(工作10s，暂停10s，共99次)表达菌体，4°C， 13， 000Xg， 20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱。简要过程是3体积Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，6体积Wash Buffer (60mM 咪唑，0. 5M NaCl， 20mM Tris-HC1 pH7. 9)洗去未结合上Ni+-NTA柱的杂蛋白，最后6体 积Elute Buffer(lM咪唑，0. 5M NaCl， 20mM Tris-HC1 pH7. 9)洗脱目的蛋白，PBS透析 除盐，以SDS-PAGE及毛细管电泳分析纯度并以紫外分光光度计检测蛋白浓度，如图5(条 带3)所示，表达得到的目的蛋白经附+柱亲和纯化得到纯度达93%的活性目的蛋白，其产 量是103 mg/L。 Western-blotting分析8Western-blot中所用一抗为羊抗His6-tag， 二抗为辣根过氧化酶标记的鼠抗羊IgG。 其简要步骤是将诱导的产物先行SDS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维 素膜(NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭 lh，与抗Hise单抗孵育lh，与HRP标记的鼠抗羊IgG孵育lh，每步完成后均严格洗膜， 最后加TMB避光显色。结果如图5 (条带4和5)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。 Pig APRIL对家猪B淋巴细胞促增殖作用实验采用免疫磁珠法即抗CD19分子的抗体磁珠(Miltenyi Biotec公司)严格按照说明书 无菌分离家猪脾外周血B淋巴细胞(经流式细胞术检测分离后的B淋巴细胞纯度为98%)， 用RPMI1640调节细胞密度至IX 10s个/mL.将B细胞悬液加入96孔培养板，每孔100 u 1。 向每孔内加入不同浓度的soluble pAPRIL, 37°C， 5%032培养72h后每孔加入lOul 5mg/mL MTT， 37°C, 5%0)2继续培养5h，加入100u 1 SDS-HC1溶解沉淀物，37。C过夜，测 定各孔0Ds7。值.实验设三复孔，取其平均值,并计算标准误差。在体外通过MTT细胞毒试验 检测pig APRIL对家猪及人B淋巴细胞的促增殖作用，如图6所示，结果表明本发明克隆 得到的soluble pAPRIL对家猪B淋巴细胞具有明显的促增殖效应，与兔、人、鼠APRIL 的体外生物学功能相同(参考已发表的文献)，且呈现剂量依赖效应，即当soluble pAPRIL 为2化/ml时促增殖作用最强，同时也证实了 APRIL在生物体内促B细胞增殖的生物学功 能的保守性。实施例3:将实施例l获得的家猪增殖诱导配体cDNA通过现有基因工程方法，生产重组soluble pig APRIL,作为家猪类免疫增强剂。实施例4:将实施例1获得的家猪增殖诱导配体cDNA通过现有基因工程方法，转入家猪体内， 增加其免疫力，在饲养中应用。按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰家猪增殖诱导配体基因并用于所 述研究和生产。〈110〉南京师范大学〈120〉家猪增殖诱导配体cDNA序列及其克隆方法和重组应用〈160〉2〈210>1〈211〉702<212〉cDNA〈213>家猪(Sus scrofa)<400〉1atgccagcctcatctccttccttgccagcccctaaagggcccctggg卿catggccccc60atccgagagccggctcgctccgttgccctctggttgagttggggggcggctctgggggct120gtggcttgtgccatggttctgctgacccaaca^cagagctgcaaaccct鄉g卿gag180gtg獄cggctgc卿ggaccggagggccctccg卿agg鹏卿gggatccatggcag240aacctctggggagccctgacggcgcgg卿cctgggagaaCgggg3g聊300tcccggagaagg卿gccgtgctcacccgtagaagcgctcagttctgcat360ctcgttcccact犯catcacctcca已ggaggactcggatgtgacagaactC3tgtggC3已420ccagctctcaagcgtgggagaggtctggaggcccaaggatactttgttcgagtctgggat480gctggagtttatctgctgtacagccaggtcctgtttcacgatgtgactttcaccatgggt540caggtggtatctcgggagggccaggg已aggcaggagactctattccgatgtgLttcgaetgt600atgccctcca已ccccgactgggcctacaatagctgctacagtgcaggtgtgttccattta660cac隱ggggacattctgagtgttgtgatcccccgggccagggcgaaactcagtctctct720ccacatggaaccttcctgggagttgtga犯ctgtga756<210>2〈211〉233 〈212〉PRT〈213〉家猪(Sus scrofa) 〈400>2Met Pro Ala 1Gly Asp MetTrp Leu SerVal Leu LeuSer Ser Pro Ser Leu 5Ala Pro lie Arg Glu 20Trp Gly Ala Ala Leu 35Thr Gin Gin Thr Glu10Pro Ala Pro Lys Gly Pro Leu 10 15Pro Ala Arg Ser Val Ala Leu 25 30Gly Ala Val Ala Cys Ala Met 40 45Leu Gin Thr Leu Arg Arg GluVal Thr Arg LeuGly Asp Pro TrpGly Ala Glu AlaAla Val Leu ThrLeu Val Pro ThrGlu Leu Met TrpAla Gin Gly TyrLeu Tyr Ser GinGin Val Val SerSer Cys Tyr SerLeu Ser Val ValPro His Gly Thr50 Gin 65 Gin 80 Trp 95 Arg 110 Asn 125 Gin 140 Phe 155 Val 170 Arg 185 Ser 200 Ala 215 lie 230 Phe 245Arg Thr Gly Gly Pro Ser Glu LysAsn Leu Trp Glu Gin Glu Gin SerGlu Asn Gly Glu Arg Ser Arg ArgLys Gin L>ys Lyslie Thr Ser LysPro Ala Leu Lys Arg Gly Arg GlyVal Arg Val Trp Asp Ala Gly ValLeu Phe His Asp Val Thr Phe ThrGlu Gly Gin GlyArg Cys lie Arg Ser Met Pro Ser AsnGly Val Phe His Leu His Gin GlyPro Arg Ala ArgLeu Gly Val Val55 Pro 70 Gin 85 Arg 100 Lys 115 Glu 130 Arg 145 Asp 160 Val 175 Arg 190 Pro 205 Leu 220 Ala 235 LysArg Ser ValAsp Ser AspGin Glu ThrAsp Trp AlaLys Leu SerLeu 25160Gly Glu 75Pro Asp 90Arg Arg105 Leu His120 Val Thr135 Leu Glu150 Tyr Leu165 Met Gly180 Leu Phe195 Tyr Asn210 Asp lie225 Leu Ser240
权利要求
1、家猪增殖诱导配体cDNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2、 一种权利要求1所述的家猪增殖诱导配体cDNA的克隆方法如下(1) 根据已知的增殖诱导配体cDNA保守序列设计引物正义寡核苷酸兼并引物zl: 5， -CAGAGNNCNGATGNCCTGGAAGCCTG-3，，反义寡核苷酸兼并引物z2: 5， — TCACAAACCCCAGGAANGTTCCATG-3，，其中N为A、 T、 G或C;(2) 从家猪脾脏提取总RNA，(3) 通过RT-PCR方法，以上述引物zl及z2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列， 命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定，(4) 应用cDNA末端快速扩增方法，根据已获得的Pl核苷酸序列设计正义引物GSP25'-GTCTCCTGCCTTCCCTGGCCCTCCCGAG-3，及反义引物GSP1 5， -CAAGCGTGGGAGAGGTCTGGAGGCC CAAG-3，分别用以扩增出APRIL cDNA 3，-及5，-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2 及P3，然后分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定，(5) 根据P1、P2、P3的重叠区域拼接出cDNA的全长序列，并设计首尾引物FL15， -GCT TCCTAGAGAAACTGACACTAAATTCTC-3，及FL2 5' -CTGTCAAACCTGGGGTTCCAGTCAAAC-3' —步 扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定及验证。
3、 一种权利要求1所述的家猪增殖诱导配体cDNA的重组应用，是通过现有基因工程 方法，生产重组家猪增殖诱导配体，作为家猪免疫增强剂。
4、 家猪增殖诱导配体，其特征在于，具有SEQ ID N0.2所示的序列。
全文摘要
本发明涉及家猪增殖诱导配体cDNA及其克隆、表达技术。家猪增殖诱导配体的基因，具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。其克隆方法如下根据家猪增殖诱导配体的保守序列设计引物；提取总RNA；通过RT-PCR方法，扩增出一段cDNA，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，测序；再根据P1的序列设计正义引物及反义引物分别用以扩增出上述cDNA 3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2及P3，分别克隆入pMD18-T载体，并测序；将P1、P2、P3拼接出cDNA全长序列，并设计首尾引物一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行测序。
文档编号C07K14/435GK101250528SQ20081002450
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月25日 优先权日2008年3月25日
发明者张双全, 燕 水 申请人:南京师范大学