专利名称：酰乙基苯丙氨酸型镍亲合层析介质在纯化融合蛋白中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酰乙基苯丙氨酸型镍亲合层析介质在纯化融合蛋白中的应用，属于蛋 白纯化技术。
背景技术：
酶催化法合成手性药物由于具有耗资少、污染小等一系列优点，市场前景广阔。随着 基因工程的发展，大量的酶可以通过克隆表达获得，而融合蛋白的纯化是酶催化法合成手 性药物的前提。金属螯合亲合层析作为一种常用的蛋白纯化手段，在融合蛋白的纯化中被 广泛应用。该方法利用蛋白质链末端的一些氨基酸，例如组氨酸、色氨酸、赖氨酸等能与 金属离子发生特殊的相互作用的原理对蛋白质加以分离、纯化。常规的金属螯合亲合层析介质多以葡聚糖或琼脂糖等软基质作为载体，但这些介质价 格昂贵、配基的制备困难、偶联条件激烈，且在制备时常使用溴化氰等剧毒试剂，须采取 特殊防护措施。而聚苯乙烯(Polystyrene， PS)作为载体，具有原料来源广泛、价廉且易功能 化等优点。已有研究者采用PS作为载体，通过氯甲基功能化制得氯甲基聚苯乙烯 (PS-CH2-C1)介质，再胺化后引入氨基酸及氯乙酸或氯乙酰氯及亚胺二乙酸(IDA)等配体， 最后与金属离子形成三齿的五元螯合环，制备获得金属螯合亲合层析介质。该方法除具有 在合成氯甲基化亲和层析介质中通常要用到有强致癌性的氯甲醚或二氯甲醚等原料，及苯 环氯甲基化反应常伴有氯甲基的多取代和二次交联，会影响亲和层析介质的性能外，其合 成制备金属螯合环的步骤过于复杂。发明内容本发明的目的是采用一种酰乙基苯丙氨酸型镍亲合层析介质(PS-Phe-N产)来有效的 纯化融合蛋白的方法。由该PS-Phe-N产亲合层析介质纯化融合蛋白的技术方案包括以下步骤(1) 将融合蛋白溶液加入PS-Phe-N产亲合层析介质中进行亲合吸附；(2) 用不同咪唑浓度的缓冲液对上述亲合层析介质进行梯度洗脱，收集每个浓度的洗 脱液，测定酶活并取微量经丙酮沉淀过夜，进行SDS-PAGE电泳观察目的蛋白的洗脱位置 及杂蛋白的洗脱情况。本发明的优点以氯乙酰化聚苯乙烯(PS-Acyl-Cl)为载体，固载苯丙氨酸(Phe)和螯合 镍离子(N产)，只需两步反应即可制备这种亲合层析介质(PS-Phe-N产)，而上述PS-CH2-C1 亲和层析介质的制备方法至少需要4步。本发明方法所用亲合介质制备方法简单，成本低廉， 并克服了氯甲基化亲和层析介质制备过程中使用致癌物氯甲醚的弊端。将其应用于纯化融合 蛋白，结果表明该亲和层析介质对蛋白的纯化效果良好，且粗酶液不经过硫酸铵沉淀、透析 等预处理，直接可用于亲合纯化，简化了纯化工艺。具体实施方案实施例l称量0.15gPS-Phe-N产亲合层析介质，用具塞锥形瓶盛放，加入20% (V/V，下同)的 乙醇水溶液10mL溶胀该介质12h。然后用磷酸缓冲液多次置换20%的乙醇溶液，去除介 质中的乙醇。用50mM pH 7.4的磷酸缓冲液将介质全部转移到10mL的离心管中，转移完毕之后将 管中的磷酸缓冲液吸净，再加入5mL浓度为11.52 mg/mL的醛糖还原酶，用封口膜封口。 将离心管固定在摇床上。将摇床置于4'C层析柜中，开启电源，使管内介质在蛋白溶液中适 度晃动12h。吸附结束，测定醛糖还原酶浓度为7.23mg/mL。将介质转移至吸附柱中，分别用10、 20、 50、 100、 200、 300、 400 mM咪唑浓度的磷酸缓冲液洗涤介质2-3次，收集每个浓度 的洗脱液，测定酶活并取微量洗脱液经丙酮沉淀过夜，进行SDS-PAGE电泳观察目的蛋白 的洗脱位置及杂蛋白的洗脱情况。亲和层析介质对醛糖还原酶的吸附量为143.00 mg/g，酶 活回收率达到80%，纯化后的融合蛋白纯度达到98%，纯化倍数达到30倍。实施例2称量0.15gPS-Phe-Ni"亲和层析介质，用具塞锥形瓶盛放，加入20X的乙醇溶液10mL 溶胀该介质lh。然后用50mMpH7.4的磷酸缓冲液多次置换20X的乙醇，去净介质中的乙 醇。用50mM pH 7.4的磷酸缓冲液将介质全部转移到10mL的离心管中，转移完毕之后将 管中的磷酸缓冲液吸净，再加入5mL浓度为8.60mg/mL的醛糖还原酶，用封口膜封口。将 离心管固定在摇床上。将摇床置于4'C层析柜中，开启电源，使管内介质在蛋白溶液中适度 晃动12h。吸附结束，测定醛糖还原酶浓度为5.37mg/mL。将亲和层析介质转移至吸附柱中，分 别用10、 20、 50、 100、 200、 300、 400 mM咪唑浓度的磷酸缓冲液洗涤介质2-3次，收集 每个浓度的洗脱液，测定酶活并取微量经丙酮沉淀过夜，进行SDS-PAGE电泳观察目的蛋 白的洗脱位置及杂蛋白的洗脱情况。亲和层析介质对醛糖还原酶的吸附量为107.70mg/g， 酶活回收率达到65%，纯化后的融合蛋白纯度达到70%，纯化倍数达到21倍。实施例3称量0,20gPS-Phe-N产亲和层析介质，用具塞锥形瓶盛放，加入20%的乙醇溶液10mL 溶胀该介质8h。然后用50mMpH7.4的磷酸缓冲液多次置换20X的乙醇，去净介质中的乙 醇。用50mMpH7.4的磷酸缓冲液将介质全部转移到10ml的离心管中，转移完毕之后将管 中的磷酸缓冲液吸净，再加入5mL浓度为10.05 mg/mL的六聚组氨酸融合蛋白CD155D， 用封口膜封口。将离心管固定在摇床上。将摇床置于4X:层析柜中，开启电源，使管内介质 在蛋白溶液中适度晃动12h。吸附结束，测定六聚组氨酸融合蛋白CD155D浓度为6.12mg/mL。将介质转移至吸附 柱中，分别用50、 100、 200、 300、 400 mM咪唑浓度的磷酸缓冲液洗漆介质2-3次，收集 每个浓度的洗脱液，测定酶活并取微量经丙酮沉淀过夜，进行SDS-PAGE电泳观察目的蛋 白的洗脱位置及杂蛋白的洗脱情况。亲和层析介质对醛糖还原酶的吸附量为98.25mg/g，纯 化后的融合蛋白纯度达到80%，酶活回收率达到75%，纯化倍数达到56倍。
权利要求
1. 本发明涉及一种酰乙基苯丙氨酸型镍(PS-Phe-Ni2+)亲合层析介质在纯化融合蛋白中的应用。此方法包括以下两步(1)融合蛋白溶液加入PS-Phe-Ni2+亲合层析介质中进行亲合吸附；(2)用不同咪唑浓度的缓冲液对介质进行梯度洗脱，收集每个浓度的洗脱液。
2. 根据权利要求l所述，其特征在于PS-Phe-N产由氯乙酰化聚苯乙烯树脂(PS-Acyl-Cl)固 载苯丙氨酸(Phe)和金属镍离子(Ni2+)制得。
3. 根据权利要求l所述，融合蛋白溶液可以不经硫酸铵沉淀、透析等预处理，直接用于亲合 纯化。
4. 根据权利要求l所述，缓冲液为50mMpH7.4的磷酸缓冲液。
5. 根据权利要求1所述，咪唑浓度为10-400mM。
6. 根据权利要求l所述，洗脱液测定酶活，并取微量经丙酮沉淀过夜，进行SDS-PAGE电泳 观察目的蛋白的洗脱位置及杂蛋白的洗脱情况。
全文摘要
本发明涉及一种酰乙基苯丙氨酸型镍亲合层析介质(PS-Phe-Ni<sup>2+</sup>)在纯化融合蛋白中的应用。该介质对蛋白的纯化效果较好，且粗酶液不经过硫酸铵沉淀、透析等预处理，可直接用于亲合纯化，简化了纯化工艺。其主要步骤为将融合蛋白溶液加入PS-Phe-Ni<sup>2+</sup>亲合层析介质中进行亲合吸附；用10-400mM咪唑浓度的磷酸缓冲液对介质进行梯度洗脱，收集每个浓度的洗脱液，经酶活测定并取微量用丙酮沉淀过夜后，进行SDS-PAGE电泳观察目的蛋白的洗脱位置及杂蛋白的洗脱情况。
文档编号C07K1/22GK101270149SQ20081002462
公开日2008年9月24日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者刘晓宁, 张晓晓, 魏荣卿 申请人:南京工业大学