专利名称：异源同种乳清蛋白的分离纯化方法
技术领域：
本发明属于蛋白的分离纯化方法，特别是涉及一种异源同种乳清蛋白的分离 纯化方法。
背景技术：
哺乳动物乳液中的许多乳清蛋白含有较高的营养价值和药用价值，如为机体 提供各种必需氨基酸、抑菌和诱导肿瘤细胞凋亡。哺乳动物乳液如牛乳中的乳清 蛋白存在过敏原，能够导致部分婴幼儿及成年人发生IgE或非IgE介导的过敏反 应。利用转基因技术在哺乳动物乳腺反应器中表达转基因人源乳清蛋白，可以改 善乳液的营养价值，转基因乳液作为原料纯化的人源乳清蛋白可以作为高营养价 值、高经济附加值的食品添加剂。
转基因哺乳动物乳液中除转基因表达的人源乳清蛋白外，还有哺乳动物自身 表达的乳清蛋白，异源同种乳清蛋白结构相似，理化性质接近，难以分离，王建 武(重组人a-乳清白蛋白转基因牛鉴定与分析，中国农业大学博士论文，2007) 报道用阴离子交换等度洗脱的方法分离牛源和人源a-乳清白蛋白，但是难以进行 有效的放大。
发明内容
本发明的目的是提供一种异源同种乳清蛋白的分离纯化方法。
本发明采用的技术方案步骤如下
1) 选取至少含有一种异源同种乳清蛋白的转基因哺乳动物乳液为原料，离 心去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清；
2) 将所得乳清经预处理去除免疫球蛋白、剩余的酪蛋白等大分子杂质；
3) 将乳清或预处理后的乳清经过疏水作用层析和凝胶过滤层析联用的组合 层析工艺或经过单步疏水作用层析工艺，分离得到异源同种乳清蛋白。
本发明所述的转基因哺乳动物乳液优选为牛乳，所述的异源同种乳清蛋白优
选为转基因人源a-乳清白蛋白、乳转铁蛋白、溶菌酶和牛自身表达的牛源a-乳
清白蛋白、乳转铁蛋白、溶菌酶等；以下仅以一种蛋白的分离来加以说明，但本
发明的保护不局限与此；牛乳中总蛋白浓度为30-38g/L异源同种乳清蛋白总浓 度1.0-4.0g/L，优选蛋白总浓度为1.5-3.5g/L。
本发明所述的乳清预处理步骤可采用硫酸铵沉淀或超滤的方法。在采用硫酸 铵沉淀时，需在室温下将乳清调节pH到5.0-10.0，优选的pH值为6.0-8.0，并通 过加入硫酸铵粉末使得乳清中硫酸铵饱和度为20%-60%，以摩尔数计为 0.86-2.95M,优选的硫酸铵饱和度为30%-60%，以摩尔数计为1.33-2.37M，振荡 2小吋，离心收集上清液。在采用超滤时，需将乳清调节pH值到5.0-10.0，优选 的pH值为6.0-8.0,优选采用截留分子量30-200KD的超滤膜超滤，收集滤出液。
本发明所述的疏水作用层析中，疏水作用层析介质采用琼脂糖材料为基质， 所述的配基可为丁基、苯基、辛基，优选为丁基。
本发明所述的疏水作用层析中，可采用的疏水盐为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠 等，优选采用硫酸铵；
本发明所述的疏水作用层析中，缓冲液体系可采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基 氨基甲垸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液；低盐 缓冲液优选为20-100mM， pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，缓冲液无疏水盐或疏水盐 浓度在0.5M以下；高盐缓冲液优选为20-100mM， pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液， 疏水盐浓度为0.5-2.0M，优选浓度为0.6-1.2M。
本发明所述的疏水作用层析中，将预处理得到的乳清溶液调节pH到 5.0-10.0，优选的pH值为6.0-8.0;并将乳清溶液调节疏水盐浓度为0.5-2.0M，优 选浓度为0.6-1.5M,疏水盐浓度可采用低盐缓冲液或者疏水盐粉末调节。
本发明所述的疏水作用层析中，本领域技术人员可根据异源同种乳清蛋白的 类型选择合适的疏水层析介质、层析柱和进样速度将经预处理后的乳清溶液进样 到用高盐缓冲液平衡好的疏水层析柱中，层析过程使用280nm紫外吸收波长进 行蛋白检测，进样的乳清溶液体积为0.5-5.0倍层析柱体积，优选为1.0-3.0倍层 析柱体积；乳清中异源同种乳清蛋白中的一种在适宜的高盐浓度下变构同疏水介 质的配基相结合保留在柱中，而低疏水性的另一种异源同种乳清蛋白和其它杂质 蛋白则无法保留，全部样品进样完毕后，用高盐缓冲液冲洗去疏水作用层析柱中 未保留的蛋白，直到紫外吸收波长回到基线；再用低盐缓冲液洗脱，洗脱方式可 为一歩洗脱、阶段洗脱、线形洗脱，收集洗脱液以得到异源同种乳清蛋白的一种， 本领域技术人员可调节工艺参数以得到不同的异源同种乳清蛋白的初步纯化产 品或纯品；由于异源同种乳清蛋白的疏水性强弱不同，通过本步骤已将异源同种 乳清蛋白分开。
本发明所述的凝胶过滤层析中，将不同的异源同种乳清蛋白的初步纯化产品 再经凝胶过滤层析除去剩余杂质以得到纯品，凝胶过滤层析介质为琼脂糖介质， 优选为Superdex 75。
本发明相对于现有技术，由于采用了疏水层析技术，可根据异源同种乳清蛋 白之间构象和疏水性质的差异分离，可调节具体疏水层析的工艺条件，得到不同 的异源同种乳清蛋白初步纯化产品或纯品；采用了凝胶过滤层析对初步纯化产品 进行了进一步的精制纯化，得到了高纯度的异源同种乳清蛋白纯品；采用了直接 的方法，简化了去除酪蛋白的步骤，提高了牛乳预处理过程中的乳清蛋白的回收 率；采用以疏水层析为核心的复合工艺方法，生产工艺稳定，适于进行转基因异 源同种乳清蛋白的规模化生产，产品纯度高，工艺回收率高。
图1为分离纯化工艺流程图
A为乳清经处理后进行疏水层析的工艺流程图
B为乳清直接进行组合层析的工艺流程图
图2为Butyl Sepharose 4FF疏水层析分离纯化人源a-LA。
图3为Superdex 75凝胶过滤分离纯化人源a-LA。
图4为SDS-PAGE鉴定人源a-LA图谱。
l为经过预处理的乳清，2为疏水层析穿透峰p0， 3为疏水层析洗脱峰即人 源a-乳清白蛋白纯品，4为凝胶过滤峰p3即牛源a-乳清白蛋白纯品
图5为反相鉴定人源a-LA液相图谱，色谱柱为C4 protein,检测波长280nm。 图6为质谱鉴定人源a-LA图谱。
实施例l
取100mL转基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为1.0 g/L，使用Sigma 3k30 离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上 清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9.5g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.7g/L， 牛源a-乳清白蛋白浓度为1.2g/L。使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH
到8.0,缓慢加入硫酸铵粉末到乳清硫酸铵饱和度为45%，以摩尔记数为2.09M, 在室温下振荡2小时后，将沉淀样品使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离 心力为10000g离心30分钟并收集上清液70mL，上清液总蛋白浓度4.5g/L,人 源a-乳清白蛋白浓度为1.8g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为1.2g/L。
使用20mM， pH7.0磷酸盐缓冲液调节乳清预处理样品硫酸铵浓度达到 0.8M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到7.0，进样到用 20mM， pH7.0含0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液预平衡好的Butyl S印harose 4FF 疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度IO厘米，层析设备GEAKTAExplorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM， pH7.0 含0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集 上样的穿透峰150mL，总蛋白浓度为1.4g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为0.01 g/L， 牛源a-乳清白蛋白浓度为0,5g/L;再用20mM， pH7.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱 并收集洗脱峰105mL，总蛋白浓度为1.0g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为0.95g/L， 纯度95%，工艺回收率71%，牛源a-乳清白蛋白浓度为0.02g/L。
取穿透峰30mL进样到用20mM， pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预 平衡好的Superdex75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米， 层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mUmin， 上样完毕后继续用20mM， pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集330 mL处的蛋白峰共80mL，总蛋白浓度为0.18g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为 0.005g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为0.175g/L，纯度97%，工艺回收率70%。 实施例2
取lOOmL转基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为1.0 g/L，使用Sigma 3k30 离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上 清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9.5g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.7 g/L， 牛源a-乳清白蛋白浓度为1.2 g/L。使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH 到7.0，缓慢加入硫酸铵粉末到乳清硫酸铵饱和度为40%，以摩尔记数为1.84M， 在室温下振荡2小时后，将沉淀样品使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离 心力为10000g离心30分钟并收集上清液70mL，上清液总蛋白浓度5.4g/L，人
源a-乳清白蛋白浓度为1.85 g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为1.3 g/L。
使用20mM， pH6.0磷酸盐缓冲液调节乳清预处理样品硫酸铵浓度达到 0.7M,使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到6.0，进样到用 20mM， pH6.0含0.7M硫酸铵的磷酸盐缓冲液预平衡好的Octyl Sepharose 4FF疏 水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100， 紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min,上样完毕后用20mM， pH6.0含0.7M 硫酸铵的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集上样的 穿透峰160mL，总蛋白浓度为1.2g/L,人源a-乳清白蛋白浓度为0.01 g/L，牛源 a-乳清白蛋白浓度为0.5g/L;再用20mM， pH6.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收 集洗脱峰108mL，总蛋白浓度为1.7g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.0g/L，纯度 58%，工艺回收率77%，牛源a-乳清白蛋白浓度为0.1g/L。 实施例3
取lOOmL转基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为1.0 g/L,使用Sigma 3k30 离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上 清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9.5g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.7 g/L， 牛源a-乳清白蛋白浓度为1.2 g/L。使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH 到7.0，使用上海之信仪器有限公司DDB-300型恒流蠕动泵和Millipore公司 IOOKD中空纤维膜柱进行超滤，循环5次，循环缓冲液使用20mM， pH7.0的磷 酸盐缓冲液，最终收集透出液体80mL，上清液总蛋白浓度3.8g/L，人源a-乳清 白蛋白浓度为1.2g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为0.8g/L。
使用20mM， pH6.0磷酸盐缓冲液调节乳清预处理样品硫酸铵浓度达到 1.2M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到6.0，进样到用 20mM， pH6.0含1.2M硫酸铵的磷酸盐缓冲液预平衡好的Phenyl S印harose 6FF 疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度IO厘米，层析设备GEAKTAExplorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速1()ml/min，上样完毕后用20mM， pH6.0 含1.2M硫酸铵的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集 上样的穿透峰155mL，总蛋白浓度为1.0g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为0.3 g/L， 牛源a-乳清白蛋白浓度为03g/L;再用20mM， pH6.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱
并收集洗脱峰105mL，总蛋白浓度为1.0g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为0.5g/L，
纯度50%，工艺回收率37.5%，牛源a-乳清白蛋白浓度为0.2g/L。
实施例4
取100mL转基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为1.0 g/L，使用Sigma 3k30 离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上 清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9.5g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.7 g/L, 牛源a-乳清白蛋白浓度为1.2 g/L。使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH 到9.0，使用上海之信仪器有限公司DDB-300型恒流蠕动泵和Millipore公司 150KD中空纤维膜柱进行超滤，循环5次，循环缓冲液使用20mM， pH9.0的磷 酸盐缓冲液，最终收集透出液体85mL，上清液总蛋白浓度4.6g/L，人源a-乳清 白蛋白浓度为1.3g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为0.9g/L。
使用20mM， pH7.0磷酸盐缓冲液调节乳清预处理样品硫酸铵浓度达到 l.OM,使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到7.0，进样到用 20mM， pH7.0含l.OM硫酸铵的磷酸盐缓冲液预平衡好的Octyl Sepharose 4FF疏 水层折柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100， 紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM， pH7.0含l.OM 硫酸铵的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集上样的 穿透峰165mL，总蛋白浓度为1.4g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为0.01 g/L，牛源 a-乳清白蛋白浓度为0.3 g/L;再用20mM， pH7.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收 集洗脱峰120mL，总蛋白浓度为1.2g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为0.9g/L，纯度 75%，工艺回收率77%，牛源a-乳清白蛋白浓度为0.2g/L。 实施例5
取lOOmL转基因人源a-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.4 g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度为1.0 g/L，使用Sigma 3k30 离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上 清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9.5g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.7 g/L， 牛源a-乳清白蛋白浓度为1.2 g/L。
使用硫酸铵粉末调节乳清样品硫酸铵浓度达到0.8M,使用1M盐酸或氢氧 化钠溶液调节乳清预处理样品pH到8.0，进样到用20mM， pH8.0含0.8M硫酸 铵的磷酸盐缓冲液预平衡好的Octyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，柱内径3.5 厘米，柱床高度10厘米，层析设备GEAKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸 收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM， pH8.0含0.8M硫酸铵的磷酸盐 缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集上样的穿透峰150mL, 总蛋白浓度为3.8g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为0.2 g/L，牛源a-乳清白蛋白浓 度为0.5 g/L;再用20mM， pH8.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收集洗脱峰112mL， 总蛋白浓度为1.5g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为0.9g/L，牛源a-乳清白蛋白浓度 为0.2 g/L
取洗脱峰30mL进样到用20mM， pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预 平衡好的Superdex75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米， 层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min， 上样完毕后继续用20mM, pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集330 mL处的蛋白峰共80mL，总蛋白浓度为0.35g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为0.3g/L， 纯度86%，工艺回收率17%。 实施例6
取100mL转基因人源乳转铁蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为34g/L，人源乳转 铁蛋白浓度为1.7g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0.1g/L，使用Sigma 3k30离心机4 摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得 乳清80mL，总蛋白浓度为98g/L，人源乳转铁蛋白浓度为2.0 g/L，牛源乳转铁 蛋白浓度为O.l g/L。使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到9.0，缓慢 加入硫酸铵粉末到乳清硫酸铵饱和度为50%，以摩尔记数为2.37M，在室温下振 荡2小时后，将沉淀样品使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为10000g 离心30分钟并收集上清液75mL，上清液总蛋白浓度3.6g/L，人源乳转铁蛋白浓 度为1. 5 g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0.1 g/L。
使用20mM， pH6.0磷酸盐缓冲液调节乳清预处理样品硫酸铵浓度达到 l.OM，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到6.0，进样到用 20mM， pH6.0含l.OM硫酸铵的磷酸盐缓冲液预平衡好的Butyl Sepharose 4FF 疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度IO厘米，层析设备GEAKTA Explorer
100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM， pH6.0 含l.OM硫酸铵的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集 上样的穿透峰148mL，总蛋白浓度为1.6g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.2 g/L, 牛源乳转铁蛋白浓度为0.05 g/L;再用20mM， pH6.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱 并收集洗脱峰103mL，总蛋白浓度为0.9g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.8g/L,纯 度89%，工艺回收率48%，牛源乳转铁蛋白浓度为0.001 g/L。 实施例7
取100mL转基因人源乳转铁蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为34g/L，人源乳转 铁蛋白浓度为1.7 g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0.1 g/L，使用Sigma 3k30离心机 4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获 得乳清80mL，总蛋白浓度为9.8g/L，人源乳转铁蛋白浓度为2.0 g/L，牛源乳转 铁蛋白浓度为0.1g/L。使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到8.0，使用 上海之信仪器有限公司DDB-300型恒流蠕动泵和Millipore公司10KD中空纤维 膜柱进行超滤，循环5次，循环缓冲液使用20mM， pH8.0的磷酸盐缓冲液，最 终收集透出液体77mL，上清液总蛋白浓度4.2g/L，人源乳转铁蛋白浓度为1.4 g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0.1g/L。
使用20mM， pH7.0磷酸盐缓冲液调节乳清预处理样品硫酸铵浓度达到 0.6M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到6.0，进样到用 20mM， pH7.0含0.6M硫酸铵的磷酸盐缓冲液预平衡好的Octyl Sepharose 4FF 疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GEAKTAExplorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM， pH6.0 含0.6M硫酸铵的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集 上样的穿透峰152mL，总蛋白浓度为1.4g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.3 g/L， 牛源乳转铁蛋白浓度为0.04 g/U再用20mM， pH7.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱 并收集洗脱峰106mL，总蛋白浓度为1.0g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.5g/L，纯 度50%,工艺回收率31%，牛源乳转铁蛋白浓度为0.02g/L。 实施例8
取100mL转基因人源溶菌酶牛乳，牛乳总蛋白浓度为32g/L，人源溶菌酶浓 度为1.5 g/L，牛源溶菌酶浓度为0.01 g/L，使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，
调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清80mL, 总蛋白浓度为9.3g/L，人源溶菌酶浓度为1.7g/L，牛源溶菌酶浓度为0.01 g/L。 使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到8.0，使用上海之信仪器有限公司 DDB-300型恒流蠕动泵和Millipore公司150KD中空纤维膜柱进行超滤，循环5 次，循环缓冲液使用20mM， pH8.0的磷酸盐缓冲液，最终收集透出液体85mL， 上清液总蛋白浓度3.4g/L，人源a-乳清白蛋白浓度为1.4g/L，牛源a-乳清白蛋白 浓度为0.008g/L。
使用20mM， pH8.0磷酸盐缓冲液调节乳清预处理样品硫酸铵浓度达到 0.9M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到8.0，进样到用 20mM， pH8.0含0.9M硫酸铵的磷酸盐缓冲液预平衡好的Octyl Sepharose 4FF 疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度IO厘米，层析设备GEAKTAExplorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM， pH8.0 含0.9M硫酸铵的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集 上样的穿透峰150mL，总蛋白浓度为1.1g/L，人源溶菌酶浓度为0.35 g/L，牛源 溶菌酶浓度为0.004 g/L;再用20mM， pH8.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收集洗 脱峰112mL，总蛋白浓度为0.8g/L，人源溶菌酶浓度为0.5g/L,纯度62.5%，工 艺回收率37%，牛源溶菌酶浓度为0.0001 g/L。
权利要求
1.异源同种乳清蛋白的分离纯化方法，其步骤包括1)选取至少含有一种异源同种乳清蛋白的转基因哺乳动物乳液为原料，离心去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清；2)将所得乳清经预处理去除免疫球蛋白、剩余的酪蛋白等大分子杂质；3)将乳清或预处理后的乳清经过疏水作用层析和凝胶过滤层析联用的组合层析或单步疏水作用层析，分离得到异源同种乳清蛋白。
2. 如权利要求l所述的方法，其中的哺乳动物乳液为牛乳。
3. 如权利要求l所述的方法，其中所述的异源同种乳清蛋白为人源和牛源a-乳 清白蛋白。
4. 如权利要求l所述的方法，预处理步骤为硫酸铵沉淀法或超滤处理法。
5. 如权利要求l所述的方法，疏水层析介质为琼脂糖基质，其配基为丁基。
6. 如权利要求l所述的方法，疏水层析所用的盐为硫酸铵，其浓度为0,5-2M硫 酸铵，优选为0.6-L5M硫酸铵。
7. 如权利要求l所述的方法，疏水层析所用的缓冲体系为磷酸盐缓冲液。
8. 如权利要求l所述的方法，疏水层析单次处理量为2倍柱体积的牛乳原料。
9. 如权利要求l所述的方法，凝胶过滤层析介质为Superdex75。
全文摘要
本发明一种异源同种乳清蛋白的分离纯化方法，其步骤为选取含有一种异源同种乳清蛋白的转基因哺乳动物乳液为原料，离心去除脂类和酪蛋白后获得乳清，将所得乳清经预处理去除免疫球蛋白等大分子杂质。将乳清或预处理后的乳清进行疏水作用层析分离操作，乳清中的异源同种乳清蛋白同疏水层析介质相互作用，由于异源同种乳清蛋白之间空间构象和疏水性的不同，两者可以在疏水层析中分离开，进一步通过凝胶过滤层析得到高纯度的异源同种乳清蛋白纯品，工艺回收率高，生产工艺稳定，适于规模化生产。
文档编号C07K1/00GK101367864SQ20081011896
公开日2009年2月18日 申请日期2008年8月27日 优先权日2008年8月27日
发明者强 卫, 焱 张, 坚 罗, 苏志国, 闭静秀, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所