专利名称：：紫色杆菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及紫色杆菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用。
背景技术：
：<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>紫色杆菌素(violacein)、脱氧紫色杆菌素是微生物的代谢产物，它属于吲哚衍生物，由两个色氨酸分子氧化縮合而成。自从19世纪末紫色杆菌素被发现以来，人们对其生物功能进行了大量的探索，发现它具有很强生物功能，越来越受人们关注。紫色杆菌素具有广谱抗菌性、抗原生动物活性、抗病毒性、抗肿瘤细胞及其它功能。紫色杆菌素对革兰氏阳性细菌如金黄色葡萄球菌(&邵"^OCOCCOMsureiAs)、链球菌(S^rejC^occ"cc〃51sp)、芽孢杆菌(5acj72"5"sp)、分枝杆菌(妙coZacte".咖)、奈瑟球菌(jVe_z'5\se".3)及假单胞菌(尸sewcto/HO朋s0有显著的抑制作用(deSouza，1999;Lichstein，1945;Nakamura"a丄，2002;Nelsonefa7.，2001;Yoshitoshi,2003)，而对革兰氏阴性细菌如黄杆菌(尸.6a7iAs"'^/历)、黏质沙雷菌(5".历arcesce/s)和大肠杆菌coh')等(Nakamura"a丄，2002)有较小的抑制性(DeMoss，1967;Lichstein，1945)。紫色杆菌素还具有杀锥虫活性(Caldas，1978;Dur6n"a丄,1994;Haunefa丄，1992)、抗利什曼原虫(Leishmania)的活性(Leon"a丄，2001)。紫色杆菌素混合物(含有10%脱氧紫色杆菌素)对侵染Hela细胞的单纯性疱疹病毒(HerpesSimplexVirus,HSV)、脊髓灰质炎病毒(Polioviruses)有抵抗活性(Andrighetti-Frohner"a丄，2003;Duran"a丄，2001;MayG.，1991)。紫色杆菌素对白血病细胞(leukemiacells)、淋巴瘤(lymphoma)、肺、结肠(Dur6n，;Meloefa丄，2000)以及由艾滋病毒(AIDS)引起的淋巴瘤(Dur6n，1996)都有很好的细胞毒性作用(Meloeta丄，2000)。紫色杆菌素可以抵抗可见光辐射(AntonioWa丄，2004)。此外，紫色杆菌素可代替人工色素作为染料，对天然原料(如丝绸、棉、毛)及合成原料(如尼龙)都有很好的着色效果(Shirata，2000)。目前，已发现可以合成紫色杆菌素的微生物有C力r咖oZ^cfen'鹏w'o7ace鹏、C/7i/kj'afi7e(Moss1978)、/朋由73o/acteri咖7j.wV鹏(Sneath1956)、/^ero脂"as7wfeow'o7scea(McCarthySA1985)、尸sei/(y。a7teixvzo朋51加icata(Egan，Jamesetal.2002)。在已发现的产紫色杆菌素的菌株中，对Cw'Wace鹏的研究最为广泛。2003年，Cw》7ace咖全基因组测序完成，为紫色杆菌素合成途径解析及应用提供了保证。目前，紫色杆菌素的生物合成途径基本清楚。紫色杆菌素的生物合成受一个基因簇的控制，长约7.3kb，包括5个基因如图1所示，分别是VioA、VioB、VioC、VioD和VioE。目前Genebank已公布4个合成紫色杆菌素的基因序列，主要是来自C^z'oJace〃/z禾口/s/t/j'"o&3Cte_ri'mz7Jiv7'(/〃/ff菌株的。
发明内容本发明的目的是提供一种紫色杆菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用。本发明所提供的紫色杆菌素合成相关蛋白质系统，来源于杜擀氏菌属(Z^g朋eLa)B2CGMCC2056，是由如下1)至5)中五种蛋白质组成的1)其氨基酸序列为序列表中的序列2或在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与紫色杆菌素合成相关的由序列2限定的蛋白质衍生的蛋白质；2)其氨基酸序列为序列表中的序列3或在序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与紫色杆菌素合成相关的由序列3限定的蛋白质衍生的蛋白质；3)其氨基酸序列为序列表中的序列4或在序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与紫色杆菌素合成相关的由序列4限定的蛋白质衍生的蛋白质；4)其氨基酸序列为序列表中的序列5或在序列表中序列5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与紫色杆菌素合成相关的由序列5限定的蛋白质衍生的蛋白质；5)其氨基酸序列为序列表中的序列6或在序列表中序列6所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与紫色杆菌素合成相关的由序列6限定的蛋白质衍生的蛋白质。其中，序列表中序列2由435个氨基酸残基组成。序列表中序列3由1005个氨基酸残基组成。序列表中序列4由429个氨基酸残基组成。序列表中序列5由372个氨基酸残基组成。序列表中序列6由191个氨基酸残基组成。为了便于所述五种蛋白的纯化，可在由序列表中序列2、3、4、5或6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>带有表1所示的标签的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。如带有表1所示的标签的序列2限定蛋白的编码基因可通过将序列表中序列l自5'末端第1-1308所示的DNA序列5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白系统的基因簇也属于本发明的保护范围。所述基因簇具体可为如下的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中序列l;2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码紫色杆菌素合成相关蛋白系统的DNA分子；3)与l)的基因具有90%以上的同源性，且编码紫色杆菌素合成相关蛋白系统的DNA分子。所述步骤3)中的基因簇，与l)的基因簇最好有95%以上的同源性。上述严格条件可为在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在68。C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。序列表中的序列1由7315个核苷酸组成，序列表中的序列1自5'末端第1-1308位编码序列表中序列2所示的蛋白；序列l自5'末端第1305-4322位编码序列表中序列3所示的蛋白；序列1自5'末端第4323-5612位编码序列表中序列4所示的蛋白；序列l自5'末端第5612-6730位编码序列表中序列5所示的蛋白；序列1自5'末端第6740-7315位编码序列表中序列6所示的蛋白。扩增上述基因簇全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述基因簇的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种生产紫色杆菌素的方法。本发明所提供的生产紫色杆菌素的方法，是将所述的基因簇转入大肠杆菌中获得重组大肠杆菌，培养所述重组大肠杆菌生产紫色杆菌素。其中，所述大肠杆菌可为BL21-CodonPlus(DE3)-RIL。杜擀氏菌属("收朋el/a印.)B2CGMCC2056采集于新疆天山冰川，其合成紫色杆菌素能力较强。本发明从产紫色杆菌素的杜擀氏菌属(Z^^a/7^7s)B2CGMCC2056中分离了紫色杆菌素合成相关基因簇，该基因簇是一个新的基因资源，将其转入大肠杆菌中可以获得产紫色杆菌素的大肠杆菌。本发明的紫色杆菌素合成相关基因簇为构建高效基因工程菌生产紫色杆菌素奠定了基础。图1为紫色杆菌素基因簇结构示意图。图2为紫色杆菌素基因簇的PCR克隆示意图及结果。图3为两段式PCR扩增紫色杆菌素基因簇的结果。图4为高效液相色谱结果图。具体实施例方式实施例1、杜擀氏菌属(A/卵/7e7"印.)B2CGMCC2056紫色杆菌素合成相关基因簇的制备一、杜擀氏菌属(A^a"e77a)B2CGMCC2056紫色杆菌素合成相关基因簇的克隆将杜擀氏菌属(Z^卵/2e7"w.)B2CGMCC2056转接入液体培养基(淀粉15g/L、硫酸亚铁0.03g/L、硝酸钾lg/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁0.5g/L、色氨酸0.5g/L，调节pH为7.0)，25°C，200rpm培养36小时，按上海生工基因组DNA提取试剂盒说明书提取杜擀氏菌B2CGMCC2056基因组DNA。根据紫色杆菌素合成相关基因簇序列(AF172851、AF367409)，采用Oligo7.10软件以vioB中较为保守的部分设计引物FB和RB，FB和RB序列见表l，以DuganellaspB2CGMCC2056基因组DNA为模板，扩增得到长度为0.8kb的vioB基因内部片段，扩增产物的电泳结果如图2A所示，扩增产物测序后与已知vioB基因序列进行分析，然后再以测序结果作为设计引物的模板，根据保守的序列设计引物，引物序列如表1所示。表1.PCR引物表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>分别以VioA14-for和vioB780-rev、vio-22-for和vioA158-rev、vioB484-for和vioC953-rev、vioC163-for和vioD-518-rev、vioD200-for禾口Vio+1100-rev为引物对，以DuganellaspB2CGMCC2056基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，将序列拼接得到紫色杆菌素合成相关基因簇。图2B为紫色杆菌素合成相关基因簇拼接示意图，其中A为引物vio-22-for和vioA158-rev的PCR产物，大小为0.5kb;B为引物VioA14-for和vioB780-rev的PCR产物，大小为2.8kb;C为引物vioB484-for和vioC953-rev的PCR产物，大小为2.8kb;D为引物vioC163-for和vioD-518-rev的PCR产物，大小为1.6kb;E为引物vioD200-for和Vio+1100-rev的PCR产物，大小为2.6kb;F为引物F-B和R-B的PCR产物，大小为0.9kb。拼接后的片段为8.7Kb，其部分序列为序列表中的序列1，序列表中的序列l为紫色杆菌素合成相关蛋白质系统的编码基因簇，包含5个0RF，整个片段的平均GC含量为62.7%(32.4%G+30.3%C)，与DuganellaspB2CGMCC2056基因组GC含量(63.6%)相近。序列表中的序列l自5'末端第1-1308位编码序列表中序列2所示的蛋白，命名为序列l自5'末端第1305-4322位编码序列表中序列3所示的蛋白，命名为Kz必序列l自5'末端第4323-5612位编码序列表中序列4所示的蛋白，命名为Kz》G序列l自5'末端第5612-6730位编码序列表中序列5所示的蛋白，命名为Kz'oA序列l自5'末端第6740-7315位编码序列表中序列6所示的蛋白，命名为W0A。序列表中的序列l即为紫色杆菌素合成相关基因簇，由5个基因构成Kz》AK/M、WoC、K/o"和K/c必这5个基因编码的蛋白(VioA、VioB、VioC、VioD和VioEJ组成了紫色杆菌素合成相关蛋白系统。将Kz'a4、K&5、Kz'o。Kz》"和Fiof分别与Genebank数据库中序列比较，比较结果如表2所示。表2.Kz'W、WoS、WoC、KioZ和Kz'of与Genebank数据库中序列比较别基因大小(bp)与/.Jj'ia7咖相似性(％)与Cw'o7ace咖相似性(％)基因\B2(DQ074977)(AE016825)核苷酸氨基酸核苷酸氨基酸13081308125781.1977.9360.549.8930183021299783.9683.4269.762.5912901290129086.1285.3175.8972.7311191119112284.9984.1473.4467.8357658257681.4478.7665.4658.33表2的分析结果表明，本发明的杜擀氏菌株B2CGMCC2056的K/oAK/oAWo"和WoA基因和其他物种的同源基因具有一定的同源性，但氨基酸最高为相似性85.31%。根据序列表中的序列1设计引物vioA-for和vio3054-rev、vio3046-for和vioE—rev，vioA—for禾口vio3054—rev、vio3046—for禾口vioE—rev的序列如表1所示。以"w^a/7eZ/as;B2CGMCC2056基因组DNA为模板，利用高保真PyrobestDNA聚合酶进行PCR扩增，扩增产物的电泳结果如图3。以vioA-for和vio3054-rev为引物PCR扩增片段A，对片段A进行测序，测序结果表明，片段A包括完整的和部分w'oA基因，以vio3046-for和vioE-rev为引物PCR扩增片段B，对片段B进行测序，测序结果表明，片段B包括完整的w'oC、w'o"、Wof和部分WoS基因，片段A和片段B经PCR纯化试剂盒回收，AseI和船d双酶切片段A、#ofI和双酶切片段B，凝胶回收试剂盒回收酶切后的片段，与经过vWel和双酶切后回收的载体pET30a在16"C过夜连接，得到重组载体pET30aVio，重组载体pET30aVio用热激法转化入E.coliDH5ct中，转化产物涂于含卡那霉素(50mg/L)的LB平板上，挑取转化子培养后采用碱裂解法提取重组载体pET30aVio，pET30aVio插入的A和B两个片段分别编码VioA(氨基酸序列为序列表中的序列2)、VioB(氨基酸序列为序列表中的序列3)、VioC(氨基酸序列为序列表中的序列4)、VioD(氨基酸序列为序列表中的序列5)和VioE(氨基酸序列为序列表中的序列6)五个蛋白。二、杜擀氏菌属(Z收朋el/a印.)B2cgmccNq2056紫色杆菌素合成相关基因簇的功能将重组载体pET30aVio转入￡coiiBL21-CodonPlus(DE3)-RIL构建重组菌株f.co7iBL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET30aVio。将pET30a载体转入AcohBL21-CodonPlus(DE3)-RIL，获得的重组菌Ecolz'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET30a作为对照。分别挑取￡BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET30aVio和f.coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET30a单菌落接种至3mL含有氯霉素30ug/mL、卡那霉素50ug/mL的LB液体培养基，37°C，200rpm振荡培养过夜。次日按1%的接种量，分别接种至新鲜的LB培养基(含有相应的抗生素)中37"C继续培养2-3h，0D,为0.5-0.6时加lmmol/L的IPTG进行诱导，2(TC诱导培养20h。将50mL上述培养液在7000Xg下离心10min，弃上清液，在沉淀物中加入无水乙醇5mL，用漩涡混合器将其混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡0.5h，将振荡液9000Xg离心5min，保留乙醇溶液。由￡coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET30aVio培养液制备的乙醇溶液中含有蓝紫色物质，而由对照菌培养液制备的乙醇溶液不含有蓝紫色物质。将蓝紫色物质的甲醇溶液进行高效液相色谱分析，使用Agilent-1100高效液相色谱仪，色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18，150mmX4腿，5um;柱温30°C;洗脱剂为体积比为70%的甲醇水溶液；流速1.0mL/min;检测波长570nm。高效液相色谱检测结果如图4所示，表明由重组菌￡co7iBL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET30aVio合成的蓝紫色物质包含两种物质，分别与杜擀氏菌属""gs/7e77sB2CGMCC2056合成的紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素洗脱时间时间一致(分别为3.0min和4.9min)。上述实验结果表明，构建的载体pET30aVio在菌株Acoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中成功表达紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素合成相关的酶，并在体内催化合成紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素。图4中，I:杜擀氏菌属(Duganellasp.)B2CGMCC2056所产色素高效液相色谱图，第一峰为紫色杆菌素，第二峰为脱氧紫色杆菌素；II:BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET30aVio所产紫色物质的粗提物的高效液相谱图。序列表<110〉清华大学<120>紫色杆菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用<130〉CGGNARW81612〈160〉1<210〉1〈211〉7315〈212〉DNA<213>杜擀氏菌属(Z7〃^3/e27a5"/.)B2CGMCC2056〈400〉1atgacaaattattctgacatttgcatagttggcgcaggcatagggggcctcagttgtgcg603cccagttgatcaacgccgccgccggcaag犯tttacggatcagggtgttCg3C3tgg3t120scgscggtgggcgggcgcatccagtcgcataaagtagacgaggaggaaatcgccgaactc180ggcgccgcccgctactcgccgcaactccatccgcatttcgagea_acteatgceigg犯tgc240gggctggcgcatgcgacct3ccctttcacccaggtggtgtcgctcgatcaggegcaggag300aaactgaaggcaactctgctgagcctgagtgcgatgctgaaaaaacatccgaacgattcc360ttccttgaattcgtcagccagtacctgggcgccgccgaagcgacccgcatgatcaaggcg420accggttacgacgccttgctgctgccggtggtctcggcagegatggectacgacatcatc■cggaaacacaaagctttaccgaaaacgccgccaacgagtggcgctatgcc540accgacggctacagcgagctgctgcgtcagttgcagcgccaggeccaggacgccggcgtg600gaattccggctggggcatxgcttgctgtcggttgaagiagtccggcaccgaccatgtcctc660gccttccgccatatgggcgatactcagatgcaccgggcgcgccatgtgatcacgaccctc720ccgccgaccgccatgaagcgcctgaacatggattttccggccgccttcagtcccttccag780tacgattccctgcctttgttcaaaggattcctgaccttcgaaacagcctggtgggacgcg840ctcgggctgaccgacaaagtgctgaitggccgataatcctcttcggaaaatctacttcaag■ggcgacaaatacctggtgttctacaccgacagcgccagcgccacctattggegggagtae960ctggagcaaggggaagacgtttacctggaccgggtccgccatcacctgaaagaagtgctg1020ccgctgaacggtcagccgctgccgcagatcaaggcgcatttttacaagceictggccgcat1080ggcgtcgagttcagcctggagccggaagccga^gceitccagcaaccctgctccaccgcgac1140ggcatcatctcctgctcggacgcgtatacctCgCElttgCggctggatggaaggcagcttg1200atcagcgccgggcacgctacccgcctgttgctggaacggctcagccatccgccagcacaa126012tccgggcacgactttaccctcgccacctctcttactgagcgcgcatgagcattctcgact1320ttccccgctttcattttcgggggtttgcccgcgctaatgtgcccactgccaaccgcaata1380cgcacggccatatcgatatcgcgacgaatgcggtatcgatcgcgggcgaaccattcgaicc1440tgagccgcccgccgtcggaattccatgagcacatgaaacagcttgctcccaggttcgatg1500cggcgggcaagccggatccggagggcatcttcagcgaggcggccggctacaatttttgcg1560gcaacaatcacttttcgtgggaaaacgccaggatcaccggcgtccagctgcgcgatggcg1620aggtcgataccgaggacgcgctggtcggcgccaagctggccctgtggggacattacaacg1680actatctgcgcaccacggtcaaccgcgccagatgggtcgacaacaaccccgccgagccgg1740acaccaccctcatttacgcgggccagttcacgctcagcggcaagcaagccacgcccaaca1800caccgagcctgttcagcgccgatatcgggcaggcgcattcggtacgctgggtcggcagcg1860gccatatcagcgagcgcagcgggcattttctcgacgatgaattcggccgttccaggctgt1920tccagttttccgtggcgaagctcgatccgcatttcctcttcaatccggacacaccgctgc1980cggccagcatgcgcgccttgcaagaggcgcttgccgacgaggatgtgctggggctgacgg2040tccagtatgcgctgttcaatatgtcgacgccgcagaaacccgattcgccggtgttctacg2100acctggccggcggcatcggcctgtggcgccgcgacgagctggccacctatccggccggcc2160gtttgctgctgccgcgccagagcagcctggggccggtactggtgaaggtgcatgcggacc2220gggtgtcggtgaatatgccgacggccatcccgttcaccacgcgcgaggccggcgccgtgt2280ccgaacagcatcctacccatgcgctgggcggcaagcttgcgctgggcgatctcatgctgc2340acggtgccaccggcaagctgatcgcccgcatcccgcaacagctgtacctcgactactggc2400gccatcatggtgtcttcgatgtgccgctgctccacccggccacggcctcgggttcgctca2460gcatgtccagcgcgcaggcgcagtgggacgaagccgactgggtgctgcagtccgacagca2520accatctgtatctggaagcgcccaaccggcaacgacagcaiggactttccgcageicgatca2580cggtacaaagccgcttgcgcggcgagctggcggcgcatccggcgctgacggcgcaggcgc2640aggatggcgagatcgtcggcgtgcgcgtggcgccatcggcgctgggagttggctatgcgg2700acctgaccctcacgggccgccgttcaggcgcgacccgcatcatgctgggcgaggcacagg2760ggcagcagttcatcggcgcgagggtgctgcccgacgactggcatctggacgacataccgg2820ccgaacaggtcgattacgcctttctctaccagcacgtgatgagctactacgagctggtct2880atcccttcatgtcggacaaggtgttcagcctggcggaccactgcaagtgcgaaacctatt2940cgcgcctgatgtggcagatgtgcgatccgcagaaccgggacaagagctattacatgccga3000gcacgcgtgaactgtcgctgccgaaatcgcgcctgttcctgaaatacctgacccaggtcg3060aagcggccgccaagtccacgcttcctcaagcggtcgcaccgcatgtcatcggctgcaagg3120ccgagtggatcgccgagctgaaaaaggcgatcgacctggaactgtcgctcatgctgcagt3180acctgtacgccgcgtatgccattcccaactatgcgcagggagtgaaactggtcgaggccg3240gccgctggctgccggacgagctggagctggcctgcggcaccgaggaccggcgccgcaaca3300gcggagcgcgtggcgccctgctcgaaatcgcccatgaagaaa/tgattcactacctgatgg3360tcaacaatgtgctgatggcgctcggcgagccgttctacgccggcgccccggcgctgggag3420aacaggcgcgccagcgcttcggcctggacacggaatttgccttcgaccctttttccgagc3480atgtgctggccagattcgtgcgtttcgagtcgatcgccaccttctatgcggcgatccgcc2LCgCCgaCggCggC8L獄gCggCggCg3gCgcgcctatcccgcctatcagctggaagttaacttcgtcaccg認agggcgaaggggtggatttccagcggctgcgcgccctggccggcccggccgtgccggcgctga肌aatccggtacccgatcccaaggcccgttcgctgatgcagccgctgatggcgcaccacttcgcgcaaaagctgaatgcctccatcgaceitcatgaccggttacatgccgtccggcgtacccgggcgcaacgccgccatcagcagtgactacagcctgggattggcgcagtacgcgcgcagcctggaggccgtggagttctttaatcagcaactgaccgattgaatgcacaaaatcatcatcgtgggcggcgtggcgcagcgcggacatgaggtccacgttaagtcagccaacgccgatccggtcaactcgcgcatcaaggcagtgctggcggccggcatcacggtcgtcggcatggcattttcggtcggcgtcgaaggcttgtttcccttgtcgctggaccacgccgtcatgcacaaagtgaactattactacaagaaatccgtgctgatccagggcccggtgatcatcggggccgacggcgcccactccgggcgcttccagttcgaacaatccttcttcc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