专利名称：：一种海星皂苷类抗肿瘤化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是从海洋生物中分离有抗痛活性的化合物，具体地说jt^面包海星中提取分离到的一种海星皂苷类抗肿瘤化合物。
背景技术：
：海星(stofeh)属觫皮动物门海星纲，现存约1500种，为海生底栖动物，分布广泛.近二十年来，国外关于海星活性化学成分特别是海星甾体皂苷的研究非常活跃，对海星皂苷的研究已魏邻余种结构新穎的化合物的发现。这些海星皂苷具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、Na+-K、ATP酶抑制、抗澳疡、溶血等多种多样的药理活性。海星皂苷(asterosaponins)为海星甾体皇苷中的一类特定的化合物，其结构特征为具有AW"-3p,6ft-二羟基甾体母核，并在3位硫酸化，6位糖募化》苷元賴链至少有1个位置被氧化，寡糖基一般由5或6个单糖构成，并具有相似的连接方式和连接位点，寡糖基由3个单糖构成的情况非常少见(汤海峰，易杨华，张淑l&，等.海星皂苷的研究进展-中国海洋药物，2004，23(6):48-57和forizziM、DeMarinoS，Zd，oRSteroidal0iig嘴lycosidesfromlhea幼eroidean.CurreatOfgiricChen、2001，5(9):951)。我国南海生物资源极为丰富，是世界上海星集中分布的海域之一，特别是面包海星(C"fctoffiww^uifww)的l^量巨大。我们从采自三亚海域的面包海星中分离鉴定了16种具有生物活性的海星菪苷，包括ll种新化合物，这是国内外首次对面包海星中的海星皂苷类化合物进行分离和鉴定》其中一种新化^fCEDS对K-562人白血病和BEL-7402人肝癌等8种肿瘤细胞有明显的抑制作用，其化学结构和抗胂瘤活性未见有过报道。对l类创新药物(单体化合物药物辦制的大量实践和报道证实化学结构决定药理作用，新的化学结构预示着更强的生物活性、更低的毒副作用或更适于在临床使用。因此，迫切需要发現更多不同类别的新的化合物，以供进一歩开发为高效低毒的抗癌新药。
发明内容本发明的目的旨在提供一种具有抗肿瘤作用的、提取分离自面包海星的海星皂苷类化合物a本发明的目的是这样实现的，一种海星皂苷类抗肿瘤化合物，其特征是式l所示化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式I上述结构其化学名称为(20/2必>601力-[3"0-甲基4-1>吡喃奎诺糖基><1—2沖-EMt喃木糖基<1—3H^EV吡喃葡萄糖基p5ot-胆甾-9(11>烯-3&》二琉酸钠盐((20iU45>6cfO-[3^-9(11Hd"3^24^sulfetedisodi咖salt),是从面包海星中提取分离的新的海星皂苷类化合物，以下简称其为CEDS所述的从面包海星中提取分离1M式I化合物CEDS的方法，其步骤如下:以新鲜采集的面包海星为原料，,经剪碎后，按重量体积比加入35倍原料重的95%乙醇，回流提取3次，每次24小时；合并提取液，回收溶剂，得乙醇提取物，提取物分敢于按重量fl^比3倍的水中，分别用和水等体积的石油醚萃取3次，萃取后的水相再分别用与水等#的正丁醇萃取5次，合并正丁醇萃取液，蒸千得到总苷提取物；总苷提取物应用硅胶柱层析,以体积比为2:1:0-力:6:l的氯仿-水饱和的正丁醇-甲醇混合溶剂洗脱,得到含式l化合物CEDS的海星皂舒混合物-，该海星皂苷混合物应用S^>hadexLH-20凝胶ttJg析和中压液相柱层析纯化，均分别采用^^比为i:l的甲醇-水混合^^i洗脱，合并含式I化合物CEDS的流份，再经高效液相色谱仪分离纯化，用体积比为48:5249:51的甲醇-水混合溶剂为流动相洗脱，得到式l化合物CEDS的纯品。所述的从面包海星中提取分离式I化合物CEDS的方法，除应用常规的溶剂提取、溶剂萃取和各种色谱分离技术外，在应用硅胶柱层析方法从总苷提取物制备含式I化合物CEDS的海星變-苷混合物时，对该海星皂苷混合物的确定是采用如下手段来检査的以硅胶薄层层析检溯，M柳比为12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶剂或^lR比为80:18:2的氯仿-甲醇-水混合溶剂展开，收集Rr值在0_20~0_25处显示紫红色斑点的流份，即为含式I化合物CEDS的海星皂苷混合物。所述的式1化合物CEDS对K-562人白血病、BE1"402人肝癌等S种不同的肿瘤细胞株均显示显著的抑制作用，半数有效抑,度(IC5o值难0.712_2funol/L之间。所述的式I化^CEDS在采用两步法微管蛋白聚合筛选模型(HuW,DongH，Li仏HuXT,HanGJ，QuYB.A)righ~throughputmoddforscrewinganti-tumoragentscapableofpromotingpolynierizatkHiof加lMi]ininvitro.ActaPbarmactdSin,2(M>4，25(6):775-782)进行的体外试验中，显示显著的促进微管蛋白聚合作用，在10將/mL浓度时的终点促聚指数(A值)为4(Bi,动力学促聚指数(A值)为145%,而阳性对照药物紫杉醇在10吗/mL浓度时的户e值和A值分别为31%和100%,表明CEDS^JT傲管蛋白聚合的作用强于紫杉醇。所述的式I化合物CETO!在作为药物使用时，可以是单独使用，也可以是与其他成分混合在临床应用时，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，如注射剂、或散剂、或丸剂、或胶囊剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂等。本发明的特点是-式化合物CEDS是从面包海星中提取分离的新的海星皂苷类化合物，而且结构特征非常罕见它是首次发现的具有硫酸化儺链的海星皂苷类化合物，也是非常少见的寡糖基由3个单ttM成的海星阜苷类化合物，它所含有的甲氧基单糖在海星皂苷类化合物中也不多见。式I化^tfCEDS对多种不同肿瘤细胞株的显著抑制作用也表明其可以迸一步作为新的抗肿瘤药物进行研究开发。通过促进徵管蛋白聚合作用机制发挥抗癌作用的紫杉醇在临床的成功应用，使得微管稳定剂成为国内外抗痛药物研究的主要热点之一，但目前从天然界发现的具有该作用的化^J非常少，迫切需要发现更多不同类别的新的化合物，以供进一步开发为高效低毒的^t痛新药.式1化合物CEDS能够促进微管蛋白聚合，并且该作用强于紫杉醇，显示其具有良好的开发潜力。本发明从面包海星中通过提取、分离纯化得到式I化合物CEDS，该化合物可用于制备治疗Jl^痛症的药物，为研制新的抗肿瘤药物提供了先导化合物。具体实錄方式下面结合具体实施例来说明本发明的实质，应理解,这些实施例仅用于证实本发明而不用于跟制本发明的菘围-下述实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照SU&厂商所建i交的条件。化^H的提取和分离制备实施例化合物的原料为采用潜水和拖网手段采集自海南三亚海域的面包海星，原料重KM公斤，共130个面包海星，经剪碎后，加入400升浓度为95%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次4小时。合并提取液，减压回收溶瓶减压回收即本行业通常所采用的袖滤方法，下同)，得乙醇提取物4.8公斤。提取物分敢于15升水中，用石油醚萃取3次，每次15升。萃取后的水相再用正丁醇萃取5次，每次15升，合并正丁醇萃取液，蒸干得到总昔提取物170克。将总苷提取物进行硅胶柱层析，以氯仿-水饱和的正丁醇-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为2出0(取下层作为洗脱液)，O:l:O和0:6:1，按750mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检測(薄层展开溶剂采用体积比为12:3:5的正丁秦乙酸-水混合溶剂，显色剂为体枳比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105t:加热显色)，收集&值在0.20~0.25处显示紫红色斑点的流份，即为含如下式I化合物CEDS的海星皂苷混合物，共2.0克。对该海星皂苷混合物采用Sq)hadexLH-20凝胶柱(Pharaiada公司诚行柱层析'用体积比为1:1的甲l水混合溶翻洗脱，按15毫升为一个流份接收，薄层层析检測，合并含如下式1化合物CEDS的第26邻流份，减压蒸干溶剂后得到0.5克样品。该样品再采用Merek公司的Lobar柱(LichtoprepRP-18,B塱诚行中压液相柱层析，柱压力(K30.4MPa,用体积比为1:1的甲醇-水混合溶剂洗脱，按50毫升为1个流份接收，薄层层析检測，合并含如下式1化合物CEDS的第510流份，减压蒸千溶剂后得到0J8克样品。对该样品采用高效液相色谱仪(戴安公司滩行分离纯化(高效液相色谱条件为大连依利特公司StaoChromODS"BP色谱柱250mmX10mm,48.5%甲酵为流动相，流速2mL/mitt,室温，206nm紫外检測)，得到如下式I化合物CEDS的纯品170毫克。上述结构其化学名称为(20/U4S)^6a-(H3力-甲基-P-D-吡喃奎诺糖基"(l-^2)"p-D"吡喃木糖基"(1~>3>^1>吡喃葡萄糖基]>5€1-胆甾-9(11>烯-3队24<二硫酸钠盐((20iU4y>6a"￡M3"O9(11)^1i-3p^34"dfaalfetedisodimn幼！0,是从面包海星中提取分离的海星皂舒类化合物，简称其为采用潜水和拖网手段采集自海南三亚海域的面包海星作为原料，原料重67公斤，共88个实施树2:面包海星，经剪碎后，加入330升浓度为95%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时。合取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物3J2公斤。提取物分散于IO升水中，用石油醚萃取3次，每次10升。萃取后的水相再用正丁醇萃取5次，每次10升，合并正丁醇萃取液，蒸干得到总苷提取物148克。将总苷提取物进行硅胶柱层析，以氯仿-水饱和的正丁^甲醇混合溶布诚ffli度洗脱，洗脱液的体积比分别为2:l:0(取下层作为洗脱銜，O:l:O和0:6:1，按500mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检測(薄层展开溶剂采用体积比为80:18:2的氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲酵溶液，喷显色剂后于1051C加热显色)，收集Rf值在0J20~O25处显#红色斑点的流份，即为含实施例1式l化合物CEDS的海星皂苷混合物，共1.4克对该海星皂苷混合物采用SephadexLH-20凝胶柱(Pharmacia公司锁行柱层析，用体积比为1:1的甲f水混合溶剂洗脱，按10毫升为一个流份接收，薄层层析检測，合并含实施例l式I化合物CEDS的第2538流份，减压蒸干溶剂后得到(U3克样品。该样品再采用Merck公司的Lobar柱(UchioprepRP-18,B型诚行中压液相柱层析，柱压力030.4MPa,用体积比为1:1的甲f水混合溶剂洗脱，按30毫升为1个流份接收，薄层层析检測，合并含实施例l式l化合物CEDS的第713流份，减压蒸干溶剂后得到0_26克样品。对该样品采用高效液相色谱仪(戴安公司锁行分离纯化(高效液相色谱条件为大连依利特公司SinoChromODS-BP色谱柱250mmX10mm,48%甲醇为流动相，流速2mL/min,室温，206mn紫外检瀕)，得到实施例1式化合物CEDS的纯品118毫克。实施併3:从海南三亚海域.紫用潜水和拖网手段采集面包海星作为原料，原料重68公斤，共85个面包海星，经剪碎后，加入210升浓度为95%的乙醇迸行回流提取，共提取3次，每次2小时。合*取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物3.1公斤。提取物分散于10升水中，用石油醚萃取3次，每次10升*萃取后的水栩再用正丁醇萃取5次，每次10升，合并正丁醇萃取液，蒸干得到总發提取物138克将总苷提取物进行硅胶柱层析，以氯仿-水饱和的正丁^甲醇混合溶剂进f滩度洗脱，洗脱液的体积比分别为2.1:0(取下层作为液)，0:1:0和0:6:1，按500mL为—个流份接收，并用鞋胶薄层层析检測(薄层展开溶剂采用体积比为80:18:2的氯仿-甲醇-水混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的琉酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105r加热显色)，收集Rf值在O20~25处显示紫红色斑点的流份，即为含实施倒1式I化合物CEDS的海星皂苷混合物，共135克。对该海星皂苷混合物采用SephadexLH-20凝胶柱(Pharaiacia公司)进行柱层析，用体积比为1:1的甲醇-水混合溶剂洗脱，按10毫升为一个流份接收，薄层层析检測，合并含实施例l式I化合物CEDS的第2436流份，J^E蒸干溶剂后得到031克样品。该样品再采用Merek公司的Lobar柱(LichroprepRP-18,B型)进行中压液相柱层析，柱压力0.3~0.4MPa,用体积比为1:1的甲,水混合溶剂洗脱，按30毫升为1个流份接收，薄层层析检测，合并含实施例1式1化合物CEDS的第612流份，^E蒸干溶剂后得到0.24克样品-对该样品采用高效液相色谱仪(戴安公司班行分离纯化(高效液相色谱条件为大连依利特公司StaoChromOD&BP色谱柱250mmX10mm，49%甲醇为流动相，流速2mL/min,室温，206nm紫外检測)，得到实施例1式I化合物CEDS的纯品105毫克。化^4lr的结构鉴定实施例1式I化合物CEDS为无色结晶性粉末，分子式为Q5H74022S2Na2，熔点为231~232°C,+19.8°(c0.85，吡啶),，Liebe加咖-Burehani和Molish反应均为阳性。对化合物进行酸水解和相应分析，具体方法为-取3.0mg样品，溶于2raoI/LCF3COOHlmL,置2mL安缻中，充氮气，封管，于烘箱中120r加热反应2h,40t减压蒸干，反复加KfeOH(ImLX3)后WE抽干以除去CF3COOHf残渣以CH2qWHaO(5mL/5mL)分配，CHjCk层鹏蒸干，采用高效液相色谱仪(戴安公司域行分离纯化(高效液相色谱緒为大连依利特公司SinoamHnODS"BP色谱柱250mmX10imn,90%甲醇为流动相，流速2mlimin,室温，206nm紫外检溯)，得到CEDS的脱琉酸基苷元。该苷元加入新蒸馏的(+)nx-甲氣基w(三氟甲基)"苯乙酰氯10pL和无水吡啶50hL，放置反应I小时，减压除去溶剂，得到相应的3,24>二<>MW)"MTPA醮，测试其核磁共振复谱(600M取CDC13):fi0.63(3H，M"8X0.84(3!i4/=6,6Hz>Me-27、0.87(3H,4/=6.6取Me德26)^0.93(3H，dlJ^6.6Hz;Me-21、0.95Nfo"19X3-52(1H，取H^6X4-51(1H,m，H-24X(1H，取H-3X532(1H，hnt^=5-4取H-11)-±^试验结果表明CEDS的苷元镧链具有24S构型，并且在24位连接W^酸钠基。酸水解后的水层减压蒸干，加入以下试剂(外1_氨基-2-丙醇/甲醇(体积比1:8)20mU乙膨甲醇(体积比l:4)17nU和3WNa(BH3CN]的甲醇溶液13jiL,在65。C反应1_5小时，冷却至室温，用3mol/LCFjCOOH调整pH值为l2,减压蒸千，残渣加入吡啶和療酐各0.5mL，100°<:反应1小时。反应产物用CH^C1^H^)(5mli5mL)分配，CHaCls层依次用饱和NaHCO3溶液0.5mL和水0.5mL(2次)IS;涤后蒸千，得到#^|的I-(S)rAr-acetyK2-hydroxyiHt)pyl咖ino)H"deoxyaklitolacetote衍生-物，溶于CHCb(X3mL,取lML进行GC分析。单糖对照品IX木糖和1>葡，各5mg,分别按相同衍生方法制备单糖衍生物，作为GC分析时的对照。GC分析采用Fi加iganVoyagerGC/MS联用仪，配ULTRA-2毛细管色谱柱(50mX02mm),GC对比分析表明实施例1式I化合物CEDS至少含有2种糖基IH^IKfe=40.05min)和D"木糖(1r-29J22min),组成比为:L为鉴定CEDS中的LW^甲基奎诺糖，对CEDS傲了甲醇解和相应衍生及分析，具体方法为取样品10mg溶于2mol/L无水盐酸甲醇溶液0.5mL中，在100°C加热4小时。用Ag^O^中和反应液后离心，上清液蒸干，残査加入，溴苯甲酰氯l5mg，冬二甲氨基吡啶l鸣和无水蠍啶0.5mL,^氮气保护的^#下在60°C搅拌过夜，反应液以CHaO/H^(5mL/5mL)分配，CHsq2层依次用饱和NaHC03溶液0.5mL和水0.5mL(2次)洗涤后蒸干，所获得的产物溶于CHCl3中，进行硅胶柱层析(硅胶柱为l咖X10cm),来用正己烷-乙敏7:3)汰脱，收,先,的30mL溶液，蒸千，采用高效液枏色谱仪(戴安公司)进行分离纯化(高效液相色谱条件为-HKaiomeBesLuna3硅自谱柱3l50nunX4.6mm,体积比为1:4的乙勝正己烷作为流动相，流速Iml/min,室温，260mn紫外检測)，得到甲基^二^0命溴苯甲酰>"3"0-甲基《-1>吡喃奎诺糖。核磁共振氣谱数据(600MHz^CDCI3>:各1.33(3H,4/=6.0私Me^X3.40(OMe),3.45(QMeX《00取H-5X3.98(IHt/=9.0H-3X5.0卜5.10(3H，m，H-l，H-2油dH4)^7.59-7.98(8fi取ArH)。以上试验结果表明CEDS中含有1>30甲基奎诺糖。通过高分辨质谱和核磁共振谱特别是二维核磁共振谱的综合解析，确定了该化合物的结构。其波谱数据如下ESI-MS(正离子模式)mfe1099[M+Nal*,997[M+Na-SOjNa+Hr，979J>f+Na-NaHSOf,鄉IM德-MeQn0859lM+Ha~2xNaHS04;T，819197^MeQui]699[859-MeQui]68819~XyI]477[MeQwi+Xyl+Glc^af，315[MeQai+Xyl+Mar;ESI-MS(负离子模式)1053[M—NaJ",951[M-Na—SQjNa+Hf，柳[M-Na-MeQuir，761r，599t761~GfcnHRESI-MS(正离子模式)1099.3809[M+Naf(计算值C^t^jaSaNaj:1099.3806)。其1H和13C核磁共振数据见表1.表1实施树1式I化合物CEDS的'H和13C核磁共搌数据"(測试溶剂氚代吡啶)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>"核磁数据经由DQCOSY，TOCSXNOESXDEPT，HSQC和HMBC谱的分析得以确定。*括号'内为偶合常数(Hz),饥葡萄糖，Xyl:木糖，MeQoi:3"0甲基奎诺糖。化^体^癍作用的研究对实施例1式1化合物CEDS进行了体外抗肿瘤试验，；5^^采用的细胞株分别为K-562人白血病，U87MG人恶性胶貭癯、BEL"7402人肝痛，A-549人肺癌、MKN-28人胃癌、HCT-U6人结肠癌、MDA-Mfr435人乳腺痛、HL60人白血病细胞。其中，对前2种肿瘤细胞采用MTT法，对后6种肿瘤细自用SRB法渕试，在測试对K-562人白血病和BEL-7402人肝痛的细胞毒性时采用临床柳的織药物10^審树械作为阳性对照；在測《对U87MG人恶性胶质瘤的细跑毒性时采用轔床抗痛药物盐酸尼莫司汀作为阳性对照a(1)MTT法澜试根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以4000个细鹏孔接种于96孔培养坂，貼壁生长24小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度本发明化合物的溶液200pL,每个浓度设3个复孔，并设生理盐水对照和无细胞调零孔》肿瘤细胞在37C、5%002~95%02条件下培养48小时，然后加入PBS溶解的浓度为10m^mL的Nnr(Signra公司):20ML,在同样条件下孵育4小时。最后，每孔加入200fiL的二甲基亚砜，混匀，将96孔板置酶标仪上溯定各孔在490nm处的吸爐(OD泡。按下式计算被测物对肿癍细胞生长的抑制率-胂瘤抑制率-(l一洽疗组OD值/对照组OD值)X100%半数有效抑制浓度IC邻值采用Logit法计算。试验结果见表2。其中，阳性对照药物I(MS基蕃树碱抑制K-562人白血病细胞生长的IC邻值为0.18±0.05拜d/L,阳性对照药物盐酸尼莫司汀神制U87MG人恶性胶蹄细胞生长的ICso值为0邻土0.06jimol/L。(2)SRB法瀕试根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以90p!7孔接种于邻，养板，貼壁生长24小时，加不同浓度的本发明化合物10nU孔，每个浓度设3个复孔，并设生理盐水对照和无细胞调零孔。胂瘤细胞在37r;、5%0>2条件下培养7:2小时，然后倾去培养液，用IO齡TCA固定细胞，4'C放置I小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然千燥。然后加入由1%冰醋酸配制的浓度为4mg/mL的SRB(Sigma公司)溶液100jiU孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1%^^洗涤5次，空气中，，加入150jiL/孔的Tris溶液。将邻孔板置酶标仪上测定各孔在520nm处的吸光度(OD难。按下式计算被测物对肿瘤细胞生长的抑制率.-肿瘤抑制率-(l—治疗组OD傻/对照组OD值)X100%半数有效抑制浓度IC5o值采用Logh法计算。试验结果见表2。其中，阳性对照药物1(K羟基蓦树滅抑制BEL-74C2人肝痛细胞生长的ICs8值为0.40±0.08pmd/L。_表2实施例1式l化合物CEDS对肿瘤细胞的抑制作用__<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>化合物促进微管蛋白聚合作用的研究采用两步法微管蛋白聚合筛选模型(HuW，DongH,Li仏HuXT,H油GJ，QuYB.Ahigh-IhriHighputnuxidforscreeninganti-tumoragentscapableofpromotingpolymerizationoftubulininvitro.ActaPbannacolSin,2004，25(6):775-782沐研究实施例1式I化合物CEDS对微管蛋白聚合的促进作用，具体方法为(1)制备微管蛋白微管蛋白由猪脑组织制备，取新鲜猪脑，用含lmol/L谷氨酸钠和O.lmaiol/LGTP的水溶液匀浆，匀浆液在IOOOOO嗜条件下离心1小时，取上清液进行DEAE-Sepbadex柱层析，依次以含0.8moI/L谷氨酸钠和0.1mmol/LGTP的水溶液以及含lmol/LNaCl、imol/L谷氨酸钠和(U加加1/LGTP的水溶液汰脱，收集后一种洗脱液，即为DEAE-微管蛋白的溶液》DEAE魂管蛋白混悬于含Inuno!/LGTP的水溶液中，在37。C孵化45分钟，然后在IQ0000嗜和37"C条件下离心I小时，得到热聚合的微管沉淀。将沉淀分散于含mol/L谷氨酸钠和0.1mmol/LGTP的水溶液中，在0。C下放置30分钟，然后在100000xg和4°C条件下离心40分钟，得到冷上清液，即为纯化的微管蛋白。该微管蛋白储存于液氣中，可用于下一步的终点促聚i^B将该微管蛋白进行SephadexG-50柱层析'以1mol/L谷氨酸钠水溶維皿，收集^M液即得到无GDP氾TP的微管蛋白，可用于下一步的动力学促聚试验。微管蛋白的聚合是通过测定含微管蛋白的溶液在350鹏处的吸M(OD难来反映的。试验中采用抗癌药紫杉醇作为阳性对照。(2)终点促聚试验-溯试溶液含l^L微管蛋白、0.1mmol/LGTP、0.mmd/LCaCl2、10蹄^iL样品或对照品，总体积O.l!￡(含4%Me2JSO)。按照试验设计方案，将測试溶液在2°C条件下加入96孔培养板的每一孔中，立即采用酶标仪在2C条件下測定每孔的OD值。然后将培养板移到37C孵箱中,孵育20分钟，之后再在37°C条件下溯定每孔的OD值。化合物促进微管蛋白聚合的活性以终点促聚指数(户。值)表示:A=[(OD^"OD('(OD,"OD/hlxI00%,其中OIX37，OD^，OD^和OD/分别为測试样品在37。C和2°C以及溶剂阴性对照在37T和2°C測得的平均OD值《试验结果表明实施例1式1化合物CEDS在10ng/mL浓度时的&值为40%,而阳性对照紫杉醇在10蹄'mL浓度时的&值为31%。(3)动力学促聚试验測试溶液含1g/L无GTP的微管蛋白、0.1mmol/LCaa2、10略化L样品或对照品，总体积O.lmL(含4，iMe2SO)。按照试验设计方案，将测试溶液在2"C条件下加入邻孔培养板的每一孔中，立即移到酶标仪上，在37^C条件下溯定每孔OD值，并连续瀕定25分钟《记录从6分钟到16分钟之间OD值变化的斜率，作为计算活性结果之用。化合物ajt微管蛋白聚合的话性以动力学促聚指数(A值)表示A=-JWxI00%,其中fefe和^分别为湄试样品、溶剂阴性对照和阳性对照的斜率平均值。it验结果表明-实施例l式I化合物CEIW在10pg/mL浓度时的A值为"5%,而阳性对照紫杉醇在10陶/mL浓度时的±^试验结果表明-实施例1式I化合物CEDS,促进微管蛋白聚合，并且该作用强于紫杉醇，可望开发成为一种结构类型与紫杉醇不同的激管稳定剂类抗癌药物。糊的制备汰射剂配方2mgCEDS,50ramol/L磷酸缓冲液，pH7.0,总体积1mL。制法-取实施例1式I化合物CEDS200oig,加50nund/L磷酸缓冲液(pH7.0)100mL,在无菌条件下完全溶解，分别经过(B和G6玻砂过滤器过滤，翻于1mL安瓿中，100"C灭菌30分钟，得100支。口服制郭魇方-5毫克CEDS,50毫克甘露醇，100毫克可溶性淀粉，共制得l个单位(包、粒、片等》。制法取实施例1式I化合物CEDS5毫克，加50毫克甘露醇和100毫克可溶性淀粉.充分混匀后制粒，所制颡粒包装即得颗粒剂所制颗粒装于空胶囊壳中，即得胶囊剂；所制颗粒直接压片，包薄膜衣，即得片剂。权利要求1.一种海星皂苷类抗肿瘤化合物，其特征在于化学结构式如下上述式1结构的化学名称为(20R，24S)-6α-O-[3-O-甲基-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基]-5α-胆甾-9(11)-烯-3β，24-二硫酸钠盐((20R，24S)-6α-O-[3-O-methyl-β-D-quinovopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyransoyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl]-5α-cholest-9(11)-en-3β，24-disulfatedisodiumsalt)，以下简称其为CEDS。2.权利要求I所述一种海星皇苷类抗肿瘤化合物，其制备方法是以新鲜采集的面包海星为原料，原料经剪碎后，按璽量体积比加入35倍原料重的95%乙醇，回流提取3次，每次24小时；合并提取液，回收^M,得乙醇提取物，提取物分散于縫量f^m比3倍的水中，分别用和水等体积的石油醚^t3次，萃取后的水相再分别用与水等体积的正丁醇萃取5次，合并正丁醇萃取液，蒸千得到总苷提取物总苷提取物应用硅胶柱层析，以体积比为2:1力M):6:1的氯仿-水,的正丁,甲醇混合溶剂洗脱，得到含式l化合物CEDS的海星皂苷混合物；该海星皂皆混合物J^用ScphadexLH-20凝胶柱层析和中压液相柱层析纯化，均分别采用体积比为1:1的甲醇-水混合溶剂舰，合并含式I化合物CEDS的流份，再经高效液相色谱仪分离纯化，用^!R比为48:524免51的甲醇-水混合溶剂为流动相汰脱，得到式I化合物CEDS的纯品。3.根据权利要求2所述的一种海星皂苷类ttSt瘤化^f的制备方法，其特征在于除应用常規的溶剂提取、溶剂萃取和各种色谱分离技术外，在应用硅胶柱层析方法从总苷提取物制备含式I化合物CEDS的海星皇苷混^l时，对该海星皂苷混合物的确定是采用如下手段来检査齣以硅胶薄层层析检瀬，采用体积比为12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合^W或体积比为80:18:2的氣仿-甲"水混合溶剂展开，收集Rf值在0_20~O25处显示紫红色斑点的流份，即为含式I化合物CEDS的海星皂苷混^J。4.权利要求1所述一种海星皂苷类,瘤化合物，其特征在于所述的一种海星慈苷类抗肿痛化合物可以在制备抗肿瘤药物中，使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，如糊剂、或敢剂、或丸剂、或胶囊剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膀剂、或裔剂、或酊剂、或颡粒剂、或气雾剂。5.权利要求4所述一种海星皂苷类抗肿癯化，，其特征在于所述的式I化，CEDS制备成抗肿癍药物对K-562人白血病、BEL-7402人肝癌等8种不同的肿瘤细胞株均显示抑制作用-全文摘要本发明提供了一种海星皂苷类化合物，分子式为C<sub>45</sub>H<sub>74</sub>O<sub>22</sub>S<sub>2</sub>Na<sub>2</sub>。采用波谱解析和化学手段，确定该化合物的化学结构为(20R，24S)-6α-O-[3-O-甲基-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基]-5α-胆甾-9(11)-烯-3β，24-二硫酸钠盐((20R，24S)-6α-O-[3-O-methyl-β-D-quinovopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl]-5α-cholest-9(11)-en-3β，24-disulfatedisodiumsalt)。体外抗肿瘤试验表明，该化合物对K-562人白血病和BEL-7402人肝癌等8种肿瘤细胞有明显的抑制作用。该化合物在体外试验中还能够促进微管蛋白聚合。本发明可为研制新的抗肿瘤药物提供先导化合物，可望成为治疗癌症的药物。文档编号C07J17/00GK101362790SQ20081015108公开日2009年2月11日申请日期2008年9月24日优先权日2008年9月24日发明者军巫,文爱东,杨志福,汤海峰,光程,赵越平申请人:中国人民解放军第四军医大学