专利名称：重组蛋白a基因及其表达产物的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组蛋白A基因，以及含有这种重组基因的载体、转化的菌株和重组蛋白A基因表达的产物，及其纯化方法和亲和填料的制备和用途。
背景技术：
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal ProteinA， SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中含有一种物质，在双向扩散试验中，能与正常人血清形成沉淀。1959年Jensen也发现了类似现象，将其命名为A抗原。1963年Lofkvist等人分离了 A物质，证明它是一种蛋白质，且与糖有不同；1960年Grov命名其为葡萄球菌蛋白A，简称SPA (ProteinA)。编码SPA的基因于1983年被克隆并在大肠杆菌中表达。Uhlen等在1984年阐明了蛋白A的全基因序列和相应的氨基酸序列。对蛋白A的结构和功能研究发现，SPA包括A、B、C、D、E等5个同源结构域，每个结构域都有与大多数哺乳动物IgG的Fc区独立结合的能力。2003年，L. Yang等应用表面张力探针证明每个蛋白A分子可结合两个IgG分子。 重组蛋白A是抗体纯化首选介质。尽管目前国内抗体大规模生产的产量还相对较低，但随着我国许多抗体药物大规模生产计划的实施，抗体生产量将在近几年内迅速增加，由此市场对蛋白A及其亲和填料的需求量会迅速提高。 目前我们所使用的蛋白A及填料多依赖于进口 ，价格昂贵，而国内同类产品存在产量低、活性差等不足，这些都严重限制了其广泛大量应用。急需一种改进的蛋白A制备琼脂糖凝胶，以获得更高IgG纯度、载量及低proA脱落的稳定的亲和填料，用于抗体的高效纯化。 目前所使用的蛋白A免疫吸附材料采用的基质是琼脂糖凝胶，与蛋白A的偶联方式多为溴化氰或环氧氯丙烷活化偶联，这2种活化方式有着明显不足(l)溴化氰是一种剧毒物质，合成过程对人体和环境危害较大；(2)环氧活化时，环氧基在碱性条件下易水解，活化效率低；本研究采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯化法(NHS)活化载体，活化条件温和，对蛋白A配体活性影响小，且由于活化过程中引入间隔臂，使单位体积的蛋白A亲和填料可结合更多的IgG，可明显提高其IgG结合载量。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一种新的重组蛋白A的基因序列，以克服现有技术的不足。 本发明需要解决的技术问题之二是提供该重组蛋白A的氨基酸序列，以克服现有技术的不足。 本发明需要解决的技术问题之三是提供含有该重组蛋白A基因的载体。 本发明需要解决的技术问题之四是提供被含有重组蛋白A基因的表达载体转化宿主细胞。 本发明需要解决的技术问题之五是提供该重组蛋白A的制备方法。 本发明需要解决的技术问题之六是提供该重组蛋白A的用途。 本发明需要解决的技术问题之七是提供一种由该重组蛋白A和层析介质载体组
成的亲和层析介质。 本发明的技术方案如下 本发明提供的重组蛋白A基因是以6个人工合成的重组蛋白A基因单体(基因序 列根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行了优化)串联而成，5'端Ala-Asp变成Val-Asp，以 形成Accl酶切位点，各重组蛋白A基因单体间以Accl酶切位点相连，其中第一个重组蛋白 A基因单体前端引入与表达载体pBV220 —致的EcoRI酶切位点及6个His标签，最后一个 重组蛋白A基因单体末端加入终止密码子TAA及与表达载体一致的BamHI酶切位点。该基 因由1073个核苷酸组成，编码352个氨基酸。该基因序列及编码的氨基酸序列见序列表 SEQ No. 1和SEQ No. 2。 本发明还构建了含有上述重组蛋白A基因的重组表达载体，构建方法是将化学合 成的重组蛋白A基因单体用EcoRI和BamHI双酶切后连接到同样酶切的pBV220载体上，再 以Accl内切酶进行单酶切，构建含6个串联重组蛋白A基因单体的重组蛋白A基因表达载 体。 本发明还提供了利用上述含大肠杆菌重组表达载体的大肠杆菌生产重组蛋白A 的方法，该方法是将菌株进行发酵，高效表达重组蛋白A，再离心菌液收集菌体，超声破碎， 取离心上清进行分离纯化，获得重组蛋白A产品。 本发明生产的重组蛋白A为可溶性表达，且具有表达量高(占细菌可溶性蛋白总 量的80%以上)、表达时间短(仅数小时)、易于纯化、成本低等优点，有利于基因工程重组 蛋白A的产业化生产。 本发明的重组蛋白A基因的表达产物重组蛋白A用于与琼脂糖凝胶等层析介质载 体偶联制备亲和层析填料用于抗体(药物)的分离纯化。 本发明生产的重组蛋白A具有IgG结合活性强、纯度及产量高等优点。 本发明生产的重组蛋白A亲和填料具有IgG载量高、结合特异性强、亲和力好、蛋
白A配体脱落少等优点，各项指标等同于或优于目前市售的protein A S印harose 4Fast
Flow。
图1是本发明构建的重组表达载体pBV220-P，是在载体pBV220中加入protein A基因。 图2重组蛋白A表达产物分步纯化的SDS-PAGE电泳图。其中泳道1是低分子蛋 白marker ;泳道2是经诱导的DH5a/pBV220-P菌体超声破菌后的离心上清；泳道3是样品 经金属镍亲和层析柱纯化的重组蛋白A ;泳道4是经分子筛S印hacryl S200纯化的重组蛋 白A。 图3是本发明的重组蛋白A与市售的几种蛋白A的ELISA活性比较图。 图4是用人IgG s印harose 6FF测定重组蛋白A的hlgG结合活性的色谱图。图中第1个峰为蛋白A流穿峰，第二个峰为洗脱的蛋白A。 图5是重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF分离兔血清中的IgG的分离纯化色谱图。 图6是重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF分离兔血清中的IgG的SDS-PAGE电泳图，其
中泳道1 :低分子量marker ;泳道2 :兔血清；泳道3 :纯化的兔IgG。 图7是在不同条件下的重组蛋白A的活性ELISA检测结果条形图。 图8是重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF的IgG载量稳定性检测的分离纯化色谱图。 图9是重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF纯化的IgG样品中脱落配基蛋白A检测的标
准曲线图。
具体实施例方式
实施例1重组蛋白A基因单体的合成 为促进金黄色葡萄球菌蛋白A基因在大肠杆菌中的表达，根据大肠杆菌密码子的 偏爱性，优化蛋白A的B结构域基因中某些碱基序列(有多种优化方案，序列表SEQNo. 1为 其中一种优化后序列)，通过化学合成的方法，设计合成重组蛋白A基因单体序列，其序列 长度为174bp，两端是AccI酶切位点，用于多个重组蛋白A基因单体连接的接头。此外，还 包括起始密码子ATG，终止密码子TAA、克隆用EcoRI和BamHI限制性内切酶位点及5'端 6XHis标签序列。 实施例2含有一个重组蛋白A基因单体的pBV220表达载体的构建 将化学合成的重组蛋白A基因单体用EcoRI和BamHI双酶切后连接到同样酶切的
pBV220载体上，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，抽提质粒经PCR、酶切
及测序鉴定后证明重组蛋白A基因单体已克隆至pBV220中。 实施例3含有重组蛋白A基因的pBV220-P表达载体的构建 将上述的含一个重组蛋白A基因单体的pBV220载体及重组蛋白A基因单体以 Accl酶切，回收相应片段后连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，抽提 质粒经PCR、酶切及测序鉴定后证明重组蛋白A基因(6个蛋白A基因单体串联)已克隆至 pBV220中。结果如说明书附图l所示。
实施例4pBV220-P表达载体转化大肠杆菌 pBV220-P用CaCl2法转化E. coli DH5 a ，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转
化子，经PCR、酶切及测序鉴定获得含有pBV220-P的克隆子。 实施例5利用工程菌E. coli DH5 a /pBV220-P生产重组蛋白A 1)菌种的培养发酵 按l : 50将大肠杆菌工程菌E. coli DH5a/pBV220-P接种于新鲜LB培养基中， 3(TC培养过夜；次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1 : 20接种至发酵培养基 中，3(TC培养至0D6。。达到0. 5-0. 8时，升温至42。C诱导，诱导4h后离心收菌。
2)表达产物的纯化 取发酵诱导菌用PBS洗涤3次，溶解，超声破碎，4t:离心，收集上清，用0. 45 y m滤 器过滤，适当稀释后，用金属螯合镍琼脂糖凝胶亲和层析柱进行纯化，收集洗脱峰，再将洗 脱液进行S印hacryl S200分子筛进行纯化，收集特征峰即为纯化的重组蛋白A，其纯化可 达95%以上，而在菌体上清蛋白中蛋白A含量已超过80% (含量明显高于其它相关专利报道)。结果如说明书附2所示。 实施例6重组蛋白A的ELISA活性 1)兔IgG(2ug/ml)包被，37。C，2h 2)37"，封闭2h，洗板 3)加入不同浓度的重组蛋白A，37t:，lh，洗板 4)加入1 : 1000的辣根标记兔IgG抗体，37t: lh，洗板 5)显色，酶标仪读数0D450 经ELISA检测表明，本发明的重组蛋白A与兔IgG有很好的结合活性，其活性高于 目前市售的几种重组蛋白A，且每孔加入lng重组蛋白A即可获得明显检测信号。结果见附 3。 实施例7重组蛋白A的人IgG结合活性 人IgG s印harose 6FF胶装柱1ml (配基含量为18mg IgG/ml胶) 1)填料装柱后，用平衡缓冲液流PBS洗5 10个柱床体积平衡柱子。 2)将样品(蛋白A浓度约10mg/ml)稀释10倍上柱，上样流速0. 5ml/min。 3)平衡缓冲液再洗5 10个柱床体积，把UV洗至基线。 4)洗脱缓冲液0. 1M glycine-HCl， pH 3. 0洗脱，收集洗脱峰，立即用PBS中和到 中性。 5) 0. 1M glycine-HCl洗脱缓冲液流洗3 5个柱床体积。再用PBS流洗3 5个
柱床体积。 结果 用BCA法测洗脱峰蛋白量为2. 5mg.由此得知本发明的重组蛋白A的人IgG结合
活性为7. 2mglgG/mg proA。 色谱图见说明书附4 。 实施例8重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF的制备 1)室温下将琼脂糖凝胶6B FF与0. lmol 二环己基碳二亚胺(DCC)和0. lmol/L
N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的无水二氧六环反应90min。 2)合成的酯用二氧六环和甲醇充分洗涤以除去沉淀的二环己基脲。 3)在pH7. 5，4t:和磷酸盐缓冲液的条件下，加入重组蛋白A(8mg/ml胶)反应6h。 4)偶联反应结束后，将凝胶在室温和pH9的条件下与lmol/L甘氨酸反应2h，以破
坏残留的活性酯。 5)用磷酸盐缓冲液充分洗涤。 重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF具有以下特点 1)基质6%的交联琼脂糖凝胶 2)配体重组蛋白A 3)配体密度约6mg重组蛋白A/ml 4)吸附载量30-40mg人IgG/ml 5)蛋白A脱落少，结合特异性高 6)最大流速300cm/h 7)pH范围3-10
8)使用温度室温 9)保存温度及液体4-8°C ， 20%乙醇 10)稳定性高亲和填料可重复使用多次而IgG载量无明显下降。
实施例9重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF从兔血清中分离纯化IgG
1)重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF装柱。 2)用缓冲液A洗5 10个柱床体积平衡柱子，流速为lml/min。 3)将兔血清用缓冲液A稀释10倍，0. 45 ii m滤膜过滤，上样，流速为lml/min。4)用缓冲液A再洗5 10个柱床体积，流速为lml/min。 5)用缓冲液B洗脱，流速为lml/min，收集洗脱峰，立即用中和缓冲液中和到中性。
5)用纯水洗10个柱床体积，再用20%的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/ min，柱子置于4-8t:保存。 6)将分离纯化的IgG样品进行SDS-PAGE电泳分析。
缓冲液组成 缓冲液A :20mM磷酸盐缓冲液，pH7. 4。 配制0. 2M NaH2P0419ml， 0. 2M Na2HP0481ml， NaCl 9g加水至1000ml 。 缓冲液B :20mM柠檬酸缓冲液，pH4. 0。配制柠檬酸2. lg加水950ml，用5M NaOH 调至pH4. O，加水至1000ml。
结果 分离纯化色谱图见图5 ;SDS-PAGE电泳分析结果见图6，泳道1为低分子量蛋白 marker,泳道2为兔血清，泳道3为本发明的重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF亲和填料所装的 柱子洗脱峰样品，其上下两条带分别是IgG的重链和轻链。实验结果表明，用本发明的重组 蛋白A琼脂糖凝胶6B FF亲和层析介质经一步纯化就可以得到纯度大于95 %的IgG，用BCA 法测洗脱IgG量为35mg/ml胶。 实施例10本发明的重组蛋白A不同条件下稳定性检测取本发明的重组蛋白A(lmg/ml)分别置于4°C 、室温7天及pH3和pHll条件下2h， 反复冻融10次，分别取样4次，进行ELISA活性测定，观察蛋白A在不同条件下稳定性情况。 ELISA活性测定见实施例6重组蛋白A的ELISA活性
结果 除在室温下重组蛋白A活性呈明显下降趋势，在其他条件下蛋白活性无显著降 低，这表明在常见条件下蛋白A活性稳定性较好。
结果见图7。 实施例11重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF稳定性检测 方法见实施例8重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF从兔血清中分离纯化IgG 上述试验重复进行10次 结果 BCA法测10次洗脱峰蛋白量都在30-40mg/ml胶范围内。 从纯化峰图及BCA所测IgG浓度结果看，重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF经过10次 兔血清纯化试验IgG载量无下降趋势，这表明本发明的重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF的IgG 载量稳定性很好。分离纯化色谱图见图8。
实施例12重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF纯化IgG样品中脱落配基蛋白A检测 用cygnus protein A ELISA试剂盒F400进行IgG样品的残留蛋白A检测。 方法见cygnus protein A ELISA试剂盒F400使用说明书。 结果 蛋白A ELISA标准曲线见图9。 根据此标准曲线计算IgG样品中残留蛋白A含量〈lng/mg IgG，普遍低于国内外
同类产品水平。 序列表 1. —般信息 发明名称高效抗体纯化介质_重组蛋白A及其亲和填料的制备 序列数目2 2. SEQ ID Nol的信息 Organization Applicant -------------------- Street :北京经济技术开发区永昌中路6号 City:北京 State: Country :中国 PostalCode :100176 PhoneNumber :86-10-67871177 FaxNumber :86-10-67877776 EmailAddress :gong_zl@agtc. com. cn 〈110>bastName :zhaolong 〈110>FirstName :gong 〈110〉Middlelnitial : 〈110〉Suffix: Application Proj ect ------------------- 〈120〉Title :重组蛋白A基因及其表达产物的制备 〈130>AppFileReference :Cloned Genes Encoding Recombinant protein A 〈140>CurrentAppNumber : 〈141〉CurrentFilingDate :2008-12-21 Sequence -------- 〈213>0rganismName -Staphylococcus aureus 〈400〉PreSequenceString : g朋ttcatet ggtggtggat朋ca朋ttc;a 3C3朋g3gca gcag朋cgcg ttctecgaga 60 tcctgcatct gccgaacctg aacgaagaac agcgteacgc cttcatccag tctctgaaag 120 atgacccatc tcaaagcgct aaccttctgg cagaagctea gaagctg朋t gatgctcagg 180
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LYS LYS LEU ASN ASP ALA GLN 〈212>Type:PRT 〈211〉Length :352 SequenceName :protein A
ALA PRO LYS VAL ASP
权利要求
一种人工重组蛋白A的基因表达序列，其特征是1)其序列根据宿主菌大肠杆菌密码子的特点进行了优化；2)包含6个人工重组蛋白A的基因单体重复序列；3)包含his标签序列。
2. 根据权利要求1，所述的基因序列为SEQ Nol。
3. 根据权利要求l，所述的重组蛋白A的氨基酸序列为SEQ No2。
4. 根据权利要求l，所述的重组蛋白A基因表达载体为原核表达载体，其特征为所述表达载体优先为pBV220。
5. —种重组蛋白A琼脂糖凝胶，其特征是以琼脂糖凝胶为基质，采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯化法(NHS)活化载体，将所述的蛋白A以共价键的方式固定在载体表面，从而合成了蛋白A琼脂糖凝胶。
6. 根据权利要求5，所述的琼脂糖凝胶可以用于抗体分离纯化。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域。本发明是将蛋白A的B结构域基因单体根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化，构建六串体插入热诱导型大肠杆菌载体pBV220，构建了含有该基因的大肠杆菌表达载体及其转化的大肠杆菌DH5α重组株和利用此菌株生产重组蛋白A的方法。此菌株所产生的可溶性重组蛋白A达到细菌可溶性蛋白总量的80％以上，以后只经镍离子螯合层析和分子筛柱层析即可将重组蛋白A纯化到95％以上纯度，且该蛋白具有表达量高、成本低、易纯化等优点。用其制备的重组蛋白A亲和填料具有人IgG吸附载量高、proA脱落少等优点。本发明为获得质量高且价格便宜的抗体(药物)纯化介质重组蛋白A提供了一条切实可行的途径。
文档编号C07K1/00GK101760466SQ20081024055
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月24日 优先权日2008年12月24日
发明者何新舟, 宫照龙, 曹晖, 许允立 申请人:本元正阳基因技术有限公司