跨种特异性的双特异性结合剂的制作方法

专利名称：：跨种特异性的双特异性结合剂的制作方法跨种特异性的双特异性结合剂本发明涉及一种多肽，其包括能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3(e)的表位的第一人类结合域和能够结合到人类和/或非黑猩猩灵长类的EGFR、Her2/neu或IgE的第二结合域，还涉及生产所述多肽的过程。本发明进一步涉及编码所述多肽的核酸、包括所述核酸的载体和包括所述栽体的宿主细胞。在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括所述多肽及所述多肽的医疗用途。T细胞的识别通过克隆型分布的a|3和y5T细胞受体(TcR)介导，所述T细胞受体与肽MHC(pMHC)的肽负载分子相互作用(Davis&Bjorkman，Nature334(1988)，395-402)。所述TcR的抗原特异性链不具有信号传导域，但代替地与保守的多亚基信号传导器CD3偶合(Ca11,Cell111(2002)，967-979，Alarcon,Immunol.Rev.191(2003)，38-46,MalissenImmunol.Rev.191(2003)，7-27)。TcR的连接直接传达至信号传导器的机制仍然是T细胞生物学上的一个根本问题(上述引文中的Alarcon;Davis,Cell110(2002),285-287)。显而易见，持续的T细胞响应包括共同受体接合、TcR低聚和在免疫突触中的TcR-pMHC复合体的高级排列(Davis&vanderMerwe，Curr.Biol.11(2001)，R289-R291,Davis,Nat.Immunol.4(2003),217-224)。然而，非常早的TcR信号传导在不存在这些事件时发生，并可包括配体诱导的CD3￡构象变化(上述引文中的Alarcon,上述引文中的Davis(2002)，Gil,J.Biol.Chem.276(2001)，11174-11179,Gil，Cell109(2002),901-912)。所述信号传导复合体的s、y、5和；亚基互相締合以形成CD3的s-y异二聚体、CD3的异二聚体和CD3的^同二聚体(上述引文中的Call)。各种研究表明，所述CD3分子对于apTcR适当的细胞表面表达和正常的T细胞发育是重要的(Berkhout,J.Biol.Chem.263(1988),8528-8536，Wang,J.Exp.Med.188(1998)，1375-1380，K叩pes，Curr.Opin.Immunol.7(1995),441-447)。小鼠CD3的sy异二聚体胞外域片段的溶液结构显示，所述sy亚基都是C2-setIg域，所述域相互作用以形成不常见的边对边二聚体构型(Sun，Cell105(2001)，913-923)。虽然富含半胱氨酸的主干(stalk)看上去在驱使CD3二聚化上扮演重要角色(上述引文中的Su，Borroto，丄Biol.Chem.273(1998),12807-12816),但是通过CD3s和CD3y的细胞外域的相互作用足以将这些蛋白质与TcRP组合(Manolios，Eur.J.Immunol.24(1994),84-92，Manolios&Li，Immunol.CellBiol.73(1995),532-536)。尽管仍然有争议，但所述TcR的优势化学计量学最可能包括一个apTcR、一个CD3的ey异二聚体、一个CD3的e5异二聚体和一个CD3的^^同二聚体(上述引文中的Call)。鉴于人CD3的sy异二聚体在所述免疫响应中的核心作用，这个结合到治疗抗体OKT3的复合体的晶体结构最近被阐明(Kjer-Nielsen，PNAS101,(2004)，7675-7680)。若干治疗策略通过靶向TcR信号传导、特别是临床上广泛用于免疫抑制方案的抗人CD3的单克隆抗体(mAb)来调整T细胞免疫性。CD3特异性小鼠mAbOKT3是第一个被许可用于人类的mAb(Sgro，Toxicology105(1995)，23-29)并且被作为免疫抑制剂临床上广泛应用于移植(Chatenoud，Clin.Transplant7(1993)，422-430，Chatenoud，Nat.Rev.Immunol.3(2003)，123-132，Kumar,Transplant.Proc.30(1998)，1351-1352)、1型糖尿病(上述引文中的Chatenoud)和牛皮癣(Utset，丄Rheumatol.29(2002)，1907-1913)。此外，抗CD3的mAb可诱导部分的T细胞信号传导和克隆无反应性(Smith,J.Exp.Med.185(1997)，1413-1422)。OKT3在文献中已被描述为有效力的T细胞促细胞分裂剂(VanWauve，J.Immunol.124(1980),2708-18)和有效力的T细胞杀手(Wong，Transplantation50(1990)，683-9)。OKT3以时间依赖的方式展现这两种活性；在导致细胞因子释放的T细胞早期激活之后，进一步施用时，OKT3在后来阻断所有已知的T细胞功能。正是由于这后来对T细胞功能的阻断，OKT3得以作为免疫抑制剂如此广泛应用在治疗方案中以减少或甚至消除同种异体移植组织排斥。OKT3最可能通过阻断所有T细胞的功能而逆转同种异体移植组织排斥，T细胞在急性排斥中扮演主要角色。OKT3与人类T细胞膜中的CD3复合体反应并阻断其功能，所述CD3复合体与T细胞的抗原识别结构(TCR)締合并且对于信号转导是必需的。哪个TCR/CD3的亚基与OKT3结合已经成为多项研究的主题。尽管一些证据表明OKT3对TCR/CD3复合体s亚基的特异性(Tunnacliffe，Int.Immunol.1(1989)，546-50;Kjer-Nielsen，PNAS101，(2004),7675-7680)。进一步的证据已经表明，OKT3与TCR/CD3复合体的结合需要这复合体的其他亚基的存在(Salmeron,J.Immunol.147(1991)，3047-52)。对CD3分子有特异性的其他众所周知的抗体^L列于Tunnacliffe，Int.Immunol.1(1989),546-50。如上所述，这样的CD3特异性抗体能够诱导多种T细胞响应，例如淋巴因子的产生(VonWussow,J.Immunol.127(1981)，1197;Paladous,J.Immunol.128(1982),337)、增殖(VanWauve，J.Immunol.124(1980)，2708-18)和抑制性T细胞的诱导(Kunicka，in"LymphocyteTypingM"1(1986)，223)。就是说，取决于实验条件，CD3特异性单克隆抗体能抑制或诱导细胞毒性(Leewenberg，J.Immunol.134(1985)，3770;Phillips,J.Immunol.136(1986)1579;Platsoucas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(1981)，4500;Itoh，Cell.Immunol.108(1987)，283-96;Mentzer，丄Immunol.135(1985),34;Landegren，J.Exp.Med.155(1982)，1579;Choi(2001)，Eur.丄Immunol.31,94-106;Xu(2000)，CelUmmunol.200，16-26;Kimball(1995)，Transpl,Immunol.3，212-221)。虽然已经报道本领域所描述的许多CD3抗体识别CD3复合体的CD3s亚基，但是它们中的大部分事实上结合到构象表位，并且因此只识别天然环境下的TCR的CD3s。构象表位被表征为两个或更多不连续的氨基酸残基的存在，其中所述M酸残基在一级序列中是分开的，但当多肽折叠成天然蛋白/抗原时在分子表面聚集(Sela，(1969)Science166，1365和Laver，(1990)Cell61,553-6)。本领域所述净皮CD3s抗体结合的构象表位可以被分为两个组。在主要的组中，所述表位由例如CD3s链和CD3Y或CD35链的两个CD3亚基形成。例如，在若干研究中已经发现，最广泛使用的CD3s单克隆抗体OKT3、WT31、UCHT1、7D6和Leu-4不结合于被CD3-s链单转染的细胞。然而，这些抗体给被CD3s加上CD3Y或者CD35的组合双转染的细胞染色(上述引文中的Tunnacliffe;Law，Int.Immunol.14(2002)，389-400;Salmeron，J.Immunol.147(1991)，3047-52;Coulie，Eur.J.Immunol.21(1991),1703-9)。在第二个较小的组中，所述构象表位在CD3s亚基自身内部形成。这组的一个成员例如mAbAPA1/1,其针对变性的CD3s而产生(Risueno,Blood106(2005)，601-8)。合起来看，本领域所述大部分CD3￡抗体识别位于两个或多个CD3亚基的构象表位。形成这些表位的三维结构的不连续的氨基酸残基可因此位于或者CD3s亚基本身上或者CD3s亚基和其他CD3亚基例如CD3y或CD35上。另一个关于CD3抗体的问题是很多CD3抗体被发现是种特异性的。抗CD3单克隆抗体(一般适用于任何其他单克隆抗体)通过高度特异性的识别它们的靶分子的方式起作用。它们仅识别其革巴CD3分子上的单个位点或表位。例如，最广泛使用的和表征得最好的对CD3复合体有特异性的单克隆抗体之一是OKT-3。这抗体与黑猩猩CD3反应但不与其他灵长类例如猕猴的CD3同系物或狗的CD3反应(Sandusky等，J.Med.Primatol.15(1986)，441-451)。抗CD3单克隆抗体UCHT-1也与黑猩猩的CD3反应但不与猕猴的CD3反应(自己的数据)。另一方面，也有识别猕猴的抗原但不识别它们的人类对应物的单克隆抗体的例子。这组的一个例子是指向猕猴CD3的单克隆抗体FN-18(Uda等，J.Med.Primatol.30(2001)，141-147)。有趣地，已经发现，由于猕猴CD3抗原的多态性，来自约12%的短尾猴的外周淋巴细胞缺乏与抗恒河猴CD3单克隆抗体(FN-18)的反应性。Uda等描述了不和FN-18抗体反应的短尾猴CD3序列中两个氨基酸的置换，与和FN-18抗体反应的衍生自动物的CD3比较(Uda等，JMedPrimatol.32(2003),105-10;Uda等，JMedPrimatol.33(2004),34-7)。而CD3单克隆抗体及其片段所固有的这种区别能力即种特异性，对于将它们作为治疗人类疾病的治疗剂而开发是一个显著的阻力。为了获得市场许可，任何新的候选药物必须通过严格的测试。这测试可被细分为临床前和临床阶段后者(进一步细分为一般所知的临床阶段I、II和III)是在人类病人中进行，而前者是在动物中进行。临床前测试的目的是证明候选药物具有期望的活性且最重要的是安全。只有当所述候选药物在动物中的安全性和可能的有效性在临床前测试中被证实，这候选药物才将被有关监管机构许可在人中进行临床测试。候选药物在动物中测试安全性按照如下三种方式进行，(i)在相关种即所述候选药物可以识别直向同源抗原的种上，(ii)在含有人类抗原的转基因动物上和(iii)通过使用能与动物中的直向同源抗原结合的候选药物的替代物。转基因动物的限制是，这技术通常限于啮齿动物。在啮齿动物和人之间存在显著的生理差别，所述安全性结果不能容易地推测到人类。所述候选药物的替代物的限制是与实际候选药物相比不同的物质组成，以及所使用的动物往往是具有上述限制的啮齿动物。因此，在啮齿动物中生成的临床前数据对于所述候选药物具有有限的预测力。安全性测试的选择方法是使用相关物种，优选地为低等的灵长类。当前本领域中所述适合人体中治疗介入的CD3结合分子的限制是，所述相关物种是高等的灵长类，特别地是黑猩猩。黑猩猩被认为是濒危物种，并且因为它们的类人特性，使用这种动物进行药物安全性测试在欧洲是被禁止的，而且在其他地方是被高度地限制的。本发明涉及一种多肽，其包括能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s(s)链的表位的优选地为人类的第一结合域和能够结合到人类和/或非黑猩猩灵长类的EGFR、Her2/neu或IgE的第二结合域，其中所述表位是包括在由SEQIDNO.2、4、6或8组成的组中的氨基酸序列的一部分。显示在SEQIDNO.2、4、6和8的序列及其片段是独立于背景的CD3表位。本发明的优势是提供了一种多肽，其包括展现了对人类和非黑猩猩灵长类CD3s(￡)链的跨种特异性的优选地为人类的结合域，所述结合域既能用来在临床前评估这些优选地为人类的灵长类结合域的安全性、活性和/或药物代谢动力学概况，又能以相同的形式作为人类的药物。相同的分子可被用在临床前的动物研究以及人类临床研究。这导致高度可比的结果和与种特异性的替代物分子相比大大提高的动物研究预测力。在本发明中，CD3s细胞外域的N端1-27氨基酸残基多肽片段意外地被识别，所述氨基酸残基多肽片段在从它在CD3复合体中的天然环境中被取出(并且融合到异源氨基酸序列例如EpCAM或免疫球蛋白Fc部分)时维持它的三维结构完整性，这一点与所有其他本领域所描述的已知CD3s表位相反。本发明提供的所述CD3表位的背景独立性对应于CD3s前27个N端氨基酸或这27个氨基酸段的功能片段。本文所用有关CD3表位的短语"背景独立性的"意思是本文所述创造性结合分子/抗体分子的结合不导致抗原决定簇或表位周围的构象、序列或结构的变化或修饰。与此相反，被一般的CD3结合分子(例如WO99/54440或WO04/106380中的公开)识别的CD3表位位于CD3s链的C端至背景独立性表位的N端1-27氨基酸，其中它只有在被嵌入s链的其余部分并被s链与CD3y或5链的异二聚化保持在正确位置时才采用正确的构象。作为本文所提供的双特异性结合分子一部分并针对背景独立性CD3表位产生(和指导)的抗CD3结合分子提供了关于T细胞重新分布的惊人的临床改进，并且因此提供了更有利的安全性概况。不限制于理论，因为CD3表位是背景独立性的，其形成自主的自给自足的亚域而不太影响CD3复合体其余部分，所以本文提供的CD3结合分子诱导比一般CD3结合分子(例如WO99/54440中提供的分子)少的CD3构象的变构变化，所述一般CD3结合分子识别背景依赖性的CD3表位。作为双特异性结合分子一部分的本发明CD3结合分子的CD3表位的背景独立性与在使用本发明CD3结合分子治疗的起始阶段中较少的T细胞重新分布有关联，这导致本发明CD3结合分子与本领域已知的一般CD3结合分子相比有更好的安全性概况，所述本领域已知的一般CD3结合分子识别背景依赖性的CD3表位。特别地，因为在使用CD3结合分子治疗的起始阶段中的T细胞重新分布是CNS不良事件的主要危险因素，所以本发明所述CD3结合分子通过识别背景独立性而非背景依赖性CD3表位而具有胜过本领域已知的CD3结合分子的实质的安全性优势。在使用一般CD3结合分子处理的起始阶段中有与T细胞重新分布相关的CNS不良事件的患者通常遭受精神混乱和定向障碍，在某些情况下也遭受小便失禁。精神混乱是精神状态的改变，其中患者不能以他或她通常的清晰水平进行思考。所述患者通常难以集中精力，并且思考不但模糊和不清楚，还经常显著地减慢。在使用一般CD3结合分子处理的起始阶段中有与T细胞重新分布相关的CNS不良事件的患者也可能遭受记忆丧失。经常地，精神混乱导致识别人和/或地点或判断时间和日期的能力的丧失。定向障碍的感觉在精神混乱中是常见的，并且决策能力受损。在使用一般CD3结合分子处理的起始阶段中与T细胞重新分布相关的CNS不良事件可还包括;漠糊的言语和/或选词困难。此病症可损伤语言的表达和理解以及读和写。除了小便失禁，还有眩晕和头昏可伴随在一些患者中使用一般CD3结合分子处理的起始阶段中与T细胞重新分布相关的CNS不良事件。在所述CD3s的27个氨基酸的N端多肽片段中三维结构的保持可被用来产生优选地为人类的结合域，所述结合域在体外结合到N端CD3s多肽片段并且在体内以相同的结合亲和力结合到T细胞上天然的CD3复合体(的CD3s亚基)。这些数据强有力地表明，本文所述N端片段形成与它通常存在于体内的结构相似的三级构象。进行了关于CD3s的N端多肽片段l-27tt酸结构完整性的重要性的一个非常敏感的测试。CD3s的N端多肽片段1-27氨基酸中个别的tt酸被改变成丙氨酸(丙氨酸扫描)以测试CD3￡的N端多肽片段1-27氨基酸对于轻微破坏的敏感性。作为本发明双特异性结合分子一部分的CD3特异性抗体分子被用来测试与CD3s的N端多肽片段1-27氨基酸的丙氨酸突变体的结合(参见所附实施例5)。在所述片段的N端顶端的前五个氨基酸残基和在CD3s的N端多肽片段1-27氨基酸的23和25位置的两个氨基酸的个别交换对于抗体分子的结合是关键性的。将位置1-5区域的包括残基Q(在位置1的谷氨酰胺)、D(在位置2的天冬氨酸)、G(在位置3的甘氨酸)、N(在位置4的天冬酰胺)和E(在位置5的谷氨酸)的氨基酸残基替换为丙氨酸，破坏了本发明的优选地为人类的结合分子与所述片段的结合。而对至少一些本发明的优选地为人类的结合分子来说，在所述片段C端的两个氨基酸残基T(在位置23的苏氨酸)和I(在位置25的异亮氨酸)降低对本发明的优选地为人类的结合分子的结合能。出乎意料地，已经发现因此分离的优选地为人类的结合分子不仅识别人类的CD3s的N端片段，还识别对应的各种灵长类CD3s的同源片段，所述灵长类包括新世界猴(狨猴Marmoset,普通狨猴C"〃/Ahx./'acc/ms;绒顶柽杉卩猴Sagwzm/soed/p"《松鼠猴Sa/wz力、c/we/^)和旧世界猴(食蟹猕猴Macacafascicularis，也称作食蟹猴CynomolgusMonkey;或恒河猴Macacamulatta,也称作恒河猴RhesusMonkey)。因此，检测到本发明CD3结合分子的多灵长类特异性。下面的序列分析确认了人类和灵长类在CD3s的细胞外域的N端共有高度同源的序列段。在本发明中已经发现，生成CD3s特异性的优选地为人类的结合分子是可能的，其中相同的分子可用于临床前动物测试，以及临床研究、甚至人治疗。这是由于对优选地为人类的结合分子的出于意料的识别，所述结合分子除了结合人CD3s(并且由于与黑猩猩对应物可能的遗传相似性)，也结合非黑猩猩灵长类(包括新世界猴和旧世界猴)的所述抗原的同系物。如下面的实施例所示，所述CD3s特异性的优选地为人类的结合分子可被整合入双特异性单链抗体以形成针对包括但不限于癌症或免疫病症的各种疾病的疗法。因此，构建用于在系统发生(与人类相距)较远的物种中测试的替代CD3￡结合域或包含所述替代CD3s结合域的双特异性单链抗体的需要消失了。结果，可以将与预期在临床测试以及后面的市场许可和治疗药物施用中给人类施用的完全一样的分子用于动物临床前测试。使用与之后施用于人类一样的分子用于临床前动物测试的能力实际上消除了或者至少很大地减少了在临床前动物测试中获得的数据对于人的情况有受限的适用性的危险。简言之，使用与将实际在人类上施用的相同分子在动物上获得临床前安全性数据对于保证数据对人类相关情况的适用性起很大作用。与此相反，在常规的方法中使用替代物分子，所述替代物分子必须与用在临床前安全性评估的动物测试系统在分子水平相适应。因此，在人类治疗上待用的分子事实上在序列上并且还可能在结构上区别于在药物代谢动力学参数和/或生物活性临床前测试中使用的替代物分子，其结果是在临床前动物测试中获得的数据对于人类的情况具有有限的适用性/可转移性。使用替代物分子需要对完全新的构建体进行构建、生产、纯化和表征。这导致获得此分子所需的额外开发费用和时间。总而言之，替代物必须在用于人类治疗的实际药物之外单独开发，以至于不得不进行两种分子的两条开发线。因此，本文所述展现跨种特异性的人类结合分子或基于抗体的构建体的一个主要优势是相同的分子能被用在人类治疗和临床前动物测试上。优选地，针对本发明的多肽，所述能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的第一人类结合域是人类来源的。此外，由于本发明所述人类结合分子的人类来源，在向人类患者施用所述结合分子时在最大可能的程度上排除了针对所述结合分子的免疫反应的产生。作为本发明双特异性结合分子一部分的优选地是人类的CD3s特异性人类结合分子的另一个主要优势是它们在各种灵长类中临床前测试的适用性。候选药物在动物体内的行为应该理想地指示这种候选药物施用于人时的预期行为。结果，从这样的临床前测试获得的数据应因此一般地对于人类情况具有高度的预测力。然而，就像从最近关于TGN1412(—种CD28单克隆抗体)的第I阶段临床试验的悲剧后果得到的教训，一种候选药物在灵长类物种和人类中可能行为不同虽然在所述抗体的临床前测试中在短尾猴中进行的动物研究没有或只观察到有限的不良效应，但是六个人类患者在施用所述抗体后出现了多器官衰竭(Lancet368(2006),2206-7)。这些不期望的反面事件的结果表明，把临床前测试限于仅一种(灵长类)物种可能不是充分的。本发明所述CD3s特异性的人类结合分子结合到一系列新世界和旧世界猴的事实可能帮助克服上述情况中面对的问题。因此，本发明提供在开发和测试人类治疗药物时将物种效应差异最小化的手段和方法。使用作为本发明双特异性结合分子一部分的优选地是人类的跨种特异性CD3s结合域，不再需要使测试动物适应意欲施用于人类的候选药物，例如创造转基因动物。所述CD3s特异性的优选地是人类的结合分子(或含有所述结合分子的双特异性单链抗体)根据发明的用途和方法展现跨种特异性，能直接用于非黑猩猩灵长类的临床前测试，且不需要对动物的任何遗传操作。本领域技术人员众所周知，将测试动物适应于候选药物的方法总是带有危险，所述危险是指在临床前安全性测试中获得的结果由于动物的改变而对人具有较少的代表性和预测性。例如，在转基因动物中，转基因编码的蛋白质经常高度地过度表达。因此，针对这种蛋白质抗原的抗体的生物活性获得的数据对于所述蛋白质在其中以低得多的、更生理水平表达的人的预测价值可能是有限的。展现跨种特异性的、CD3s特异性的优选地是人类的结合分子(或含有所述结合分子的双特异性单链抗体)的用途的进一步优势是避免了作为濒危物种的黑猩猩用于动物测试的事实。黑猩猩与人类的亲缘关系最近，且最近根据基因组测序数据被归类于人科动物(Wildman等，PNAS100(2003)，7181)。因此，从黑猩猩获得的数据一般被认为对于人类具有高度预测性。然而，由于它们作为濒危物种的状态，可用于医学实验的黑猩猩的数量被高度限制。如上所述，维持黑猩猩用于动物测试因此既昂贵又存在伦理问题。使用本发明所述CD3s特异性的优选地是人类的结合分子(或含有所述结合分子的双特异性单链抗体)在临床前测试中避免了伦理异议和经济负担，且不妨碍获得的动物测试数据的质量，即适用性。鉴于此，使用CD3s特异性的优选地是人类的结合分子(或含有所述结合分子的双特异性单链抗体)为在黑猩猩中进行的研究提供了合理的替代选择。本发明所述CD3s特异性的优选地是人类的结合分子(或含有所述结合分子的双特异性单链抗体)的进一步优势是在用它作为动物临床前测试的一部分时，例如在药物代谢动力学动物研究过程中，抽取多个血样的能力。与较低等的动物例如小鼠相比，使用非黑猩猩灵长类能够更容易地获得多个血液抽取物。多个血样的抽取允许连续测试血液参数以确定由本此外，多个血样的抽取使研究人员能够评估本文所定义的优选地是人类的结合分子(或双特异性单链抗体)的药物代谢动力学概况。此外，可能由所述优选地是人类的结合分子(或双特异性单链抗体)诱导的反映在血液参数里的潜在副作用可以在施用所述抗体的过程中抽取的不同血液样品中测量。这允许对本文所定义的优选地是人类的结合分子(或双特异性单链抗体)的潜在毒性概况进行测定。本文所定义的展现跨种特异性的优选地是人类的结合分子(或双特异性单链抗体)的优势可简单概括如下第一，用于临床前测试的本文所定义的优选地是人类的结合分子(或双特异性单链抗体)与用于人类疗法的那个是相同的。因此，不再需要开发药物代谢动力学性质和生物活性可能不同的两种独立的分子。这是非常有利的，因为例如与常规的替代物方法相比之下药物代谢动力学结果更直接地转移和应用到人类环境。第二，使用本文所定义的优选地是人类的结合分子(或双特异性单链抗体)制备人类治疗剂与替代物方法相比需要更低的花费和劳动力。第三，本文所定义的优选地是人类的结合分子(或双特异性单链抗体)可用于不仅在一种灵长类物种中而且在一系列不同的灵长类物种中的临床前测试，因而限制了灵长类和人类之间潜在的物种差异风险。第四，避免了把濒危物种黑猩猩用于动物测试。第五，可抽取多个血液样品用于大规模的药物代谢动力学研究。第六，由于根据本发明一个优选的实施方案的优选地是人类的结合分子的人类来源，当施用于人类患者时针对所述结合分子的免疫反应的产生被最小化。排除了对衍生自非人类物种例如小鼠的候选药物特异性的抗体产生的免疫响应的诱导，所述诱导导致针对鼠来源的治疗分子的人抗人抗体(HAMA)的形成。术语"蛋白质"是本领域众所周知的，并且描述生物化合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸链(多肽)，借此氨基酸通过肽键相互连接。本文所用术语"多肽"描述一组分子，其由多于30个氨基酸组成。根据本发明，多肽的组包括"蛋白质"，只要蛋白质由单个多肽组成。并且与所述定义一致，术语"多肽"描述蛋白质片段，只要这些片段由多于30个氨基酸组成。多肽可进一步形成多聚体例如二聚体、三聚体和更高级的低聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不同的。因此，这些多聚体相应的较高级结构被称为同(homo-)或异(hetero-)二聚体、同或异三聚体等。异多聚体的一个例子是一种抗体分子，其在它的天然存在的形式下由两个相同的多肽轻链和两个相同的多肽重链组成。术语"多肽"和"蛋白质"还指天然修饰的多肽/蛋白质，其中所述修饰通过例如翻译后修饰如糖基化、乙酰化、磷酸化及诸如此类实现。这类修饰在本领域众所周知。如本文所用，"人类"和"人"指的是物种智人(//owoA'"/7,em)。就本文所述的构建体的医学用途而言，将使用同样的分子治疗人类患者。与本发明所述分子在上下文中一起使用的术语"人类来源"描述可衍生自人类基因库或具有与人类等同物对应的结构/序列的分子。因此，具有与人类序列类似物相对应的氨基酸序列的蛋白质，例如一种具有与人类种系序列相对应的骨架的氨基酸序列的抗体片段，被理解为人类来源的分子。如本文所用，"非黑猩猩灵长类"或"非黑猩灵长类"或其语法上的变体指的是除了黑猩猩之外的、即除了属于黑猩猩属的动物的任何灵长类，并且包括倭黑猩猩(尸fl"/7""&cw)和黑猩猩(尸朋frag/o办tes)种，也4皮-尔为黑《星3星y4"Ara/o/7"/7ea^frag/o^yfey或lf吳57附/flyn。"灵长类，，、"灵长类物种"、"灵长类"或其语法上的变体表示分成原猴和类人猿两种亚目的真哺乳亚纲哺乳动物目，其包括人、猿、猴和狐猴。特别地，本文所用"灵长类"包括原猴亚目^W/WZ)T/7/"/(非眼镜猴的原猴)，其包含狐猴型下目丄emw^/^w^(自身包含鼠狐猴总科C/2draga/eo,cfea和狐猴总科丄e附wra/tfeo)、指浙吳型下目C7/ra附j^/^7w^s(自身包含指浙吳牙牛/)0"/^"^"//<^￡)和懒猴型下目丄on力/onw^(自身包含懒猴科丄on^Vfoe和婴猴科Gatog/^/e)。本文所用"灵长类，，还包括简鼻亚目报3f//o/T/nw,其包含跗猴型下目自身包括跗猴科rara"Wae)、类人猿下目S,附"/o/tww(自身包括阔鼻小目尸/^)w/h'"/，或新世界猴，和狭鼻小目Cato/r/z/"/，其包含猕猴总科Cercop^ec/cfea或旧世界猴)。所述非黑猩猩灵长类物种在本发明的意义内可被理解为狐猴、眼镜猴、长臂猿、狨猴(属于巻尾猴科CeZ)/Joe的新世界猴)或旧世界猴(属于猕猴总科Cerco/7"//eco/fife(af)。如本文所用，"旧世界猴"包括落入猕猴总科Cerco/^eco/cfe的任何猴，其自身细分为以下科猕猴亚科C^ro/欣ec/"ae，其主要是非洲的但包括亚洲和北非的各种猕猴属；和疣猴亚科03/W/Mae，其包括多数亚洲属但也包括非洲疣猴。特别地，在猕猴亚科Cercop她ec/朋e中，有利的非黑猩猩灵长类可来自长尾猴族Cercop"//ec/"/，在短肢猴属^4//e朋p欣ea^内(艾伦氏沼泽猴(Allen'sSwampMonkey)，短肢猴^4〃e"cip欣ecwsm'gra由'tfo);在侏长尾猴属M/op欣ea^内(安哥拉侏长尾猴(AngolanTal邻oin)，侏长尾猴Mz'o/"/e譜to/a一"；力口蓬侏长尾猴(GabonTalapoin)，侏长尾猴A//—Ae譜ogowem7's);在赤賓吳属五r少&race6M内(Patas有美,赤浙吳i^^Z/raceZmspatoA');在绿猴属CWorace^s内(绿猴，绿猴C/j/orace^ssaZ>ace^f;黑长尾猴(Grivet),绿猴C//orace/)船a"/2/0戸；Bale山长尾黑颚猴(BaleMountainsVervet),绿猴Crat，eZws咖/w咖/wms'"';Tantalus猴,绿猴Crao^wsto"/fl/w;长尾黑顎猴(VervetMonkey)，绿猴C7/oraa^/7_yge，/7nM';狗尾猴(Malbrouck)，绿猴C7/orace/)wc戸扁m、')；或在长尾猴属Orco^"//ea/,y内(Dryas浙吳或Salongo长尾l"吳Cercop"/ec^d/^"'"Diana猴,长尾猴Cerc—fZ/eczwfifejf"a;Roloway猴，长尾猴Ce/r0p"/7ec^ra/o丽少；大斑鼻猴(GreaterSpot-nosedMonkey),长尾猴Cercop"/ec仏s蓝猴，长尾猴Cerco/7欣ecmw/to;银猴(SilverMonkey),长尾猴C'ercop/AecMStfogge加'；金猴(GoldenMonkey)，长尾猴A:朋浙Sykes氏猴，长尾猴Cerccp"/2e譜a/Zwgw/""、；Mona猴，长尾猴Ce謡p"/e，腳"a;Campbell氏Mona猴，长尾猴Ce/ro/7"/2e，cp6e〃/;Lowe氏Mona猴,长尾猴GA:甲Y/ecm/owz';有冠(crested)Mona猴,长尾猴Cerco;7"/e冊pog謹'as;Wolf氏Mona猴，长尾猴Cerco/欣e面衡购Dent氏Mona猴,长尾猴Ce/ro;欣etm小斑鼻猴(LesserSpot-nosedMonkey),长尾《吳Cercop/决ecwpetown'sto;白。乾长尾賓美(White-throatedGuenon),长尾浙吳Cerco/7/f/jeci^e77f/^ogasfe广'Sclater氏长尾猴，长尾猴Ce/r一/簡ss由e厂/;红耳长尾猴，长尾猴Cerco/7"/ecwe，/7ra/h';髭长尾猴(MoustachedGuenon)，长尾猴Ce/r0/"/7e，c一w;红尾猴,长尾猴Cq/7欣ecwa簡miM';L'Hoest氏猴,长尾猴Ce/x，'Aectw//weWz';Preuss氏浙吳，长尾《吳CeTx'op/AeawpreiM^;太阳尾浙吳(Sun-tailedMonkey),长尾猴Cera9p"/ecw,"o/ato;Hamlyn氏猴或枭面猴(Owl誦facedMonkey),长尾猴Ce/rop/Y/jecwDeBrazza氏猴,长尾猴可选择地，有利的非黑猩猩灵长类也在猕猴亚科Cerc0p//7ec/:wae中但是在狒狒族尸fl戸om"/中，可来自猕猴属Moc"cg内(地中海(Barbary)猕浙吳，猕lf吳Macao砂/vot7W,狮尾猕H猕浙吳A^afc"cflw7e/ws;南方/豕尾猕浙吳或Beruk，箱尔lf吳j匕方月豕尾浙尔猴，《弥lf吳Macaco/eow/"a;Pagai岛猕猴或Bokkoi,猕猴Macao/p，丽's;Siberut猕猴，猕猴她cac"s!力enr'沼泽猕l吳(MoorMacaque)，猕f吳Afocorc"wm/ra;穿孰猕《吳，猕猴Mao707oc/2觸to;Tonkean猕猴，猕猴McooHeck氏猕猴，猕猴Mcaca//ech';Gorontalo猕猴，猕猴Macac"w/g/wce朋；Celebes有冠猕猴或黑"类人猿"，猕猴Macac""/gra;食蟹猴(Cynomolgusmonkey)或吃螃蟹的猕猴或长尾猕猴或Kera,猕猴Macaca/aw/cw/a^;短尾猕猴(Stump-tailedMacaque)或熊猕4吳，浙尔浙吳yV/aooaan:卞o/(ieA';恒5可猕4矣，猕浙吳MflC(3caww/a"a;台湾岩石猕l"吳(FormosanRockMacaque)，猕浙吳Afocac"c;/c/o戸；日本猕猴，猕猴Mococa/wscato;Toque猕猴,猕猴Mocflca,s7力/cfl;冠毛猕猴(BonnetMacaque),猕猴Macacara&ato;地中海猕猴，猕猴Mac(7ccrAy/vaw/m";Assam穷尔猴，《弥l吳Afacacaa^a附eww's;西藏存尔浙吳或Milne-Edwards氏猕猴，猕猴MacaccrArunachal猕猴或Munzala，猕浙吳Macacawwwza/a);在丄o^/oce/n^属内(灰颊白眉lf吳,丄op/oce/w's丄o//oceZms"/6/ge"a7.o厶w对w.;黑色有冠白眉豕美，Z/0//2oce/msafew)wt^;Opdenbosch氏白眉賓吳,丄o//oceZ)Ms0/cfewZ)asc/H';高原白眉浙吳，Z/op/zoce/msh)w"/0;在狒狒属尸a//o内(阿拉伯狒狒HamadryasBaboon,狒狒尸ap/0/7flwcwf/7ay;几内亚狒《弗(GuineaBaboon)，狒3弗？a/Zo/ap/o;橄才览狒《弗(OliveBaboon),狒狒awwte;黄狒狒,狒狒尸apZoc少"ocep/7"/w;大狒狒(ChacmaBaboon),狒狒尸a戸owra/m^);在狮尾狒狒属内(狮尾狒狒，狮尾狒狒77^ra戸/;ea^ge/adfl);在白眉猴属内(乌黑白眉猴SootyMangabey,白眉有吳Cen%ce/>war(y,s';白眉有吳Ctrc'weAm'a/y'va/^'s';白眉l"吳Cerc'we6w's'/mwm/o^v;有4贞白眉《吳(CollaredMangabey)，白眉l"吳Cercoce/m,yto^wflrftw;敏才走白眉耵美(AgileMangabey)，白眉lf美Cercoce/m,sag/'fo;金腹白眉猴(Golden-belliedMangabey)，白眉猴Cercoce/mj*c//r>woga!ffer;i荅纟内5可白眉浙美(TanaRiverMangabey)，白眉賓吳Ce/roceZuwga/er"ws;刹、氏白眉浙吳(SanjeMangabey)，白眉浙吳CercoceZ)wsaw)e/);或在山魈属Mc/77t/n'〃w51内(山魈(Mandrill),山魈A/am/h〃ws^/h>u;鬼狒(Drill)，山魈M朋fifiT/〃w51/ewcop/aew51)。最优选的是食蟹猕猴Macaco/mc/cw/wM(也被称作食蟹猴(Cynomolgusmonkey)，并因此在实施例中被命名为"食蟹猴")和猕猴A^acacaww/a"a(恒河l"吳(rhesusmonkey)，^皮命名为"恒河求吳'，("rhesus"))。在疣猴亚科Co/o6/"^中，有利的非黑猩猩灵长类可来自非洲群，在疣猴属0/o6ws内(黑色疣猴，疣猴Co/MMMtomw;安哥拉疣猴，疣猴Co/o/n/sawgo/em化王沈猴(KingColobus)，祝猴CV/o/u^/o(y^画(W;熊疣猴(UrsineColobus)，疚猴Co/Mmve〃enw^;披斗篷疣猴(MantledGuereza)，祝浙吳CWo6mgz/ereza);在纟工疾l"吳属内(西方纟工疾《吳，纟工疯lf吳尸z7/oco/oZ)ws6at/z'z^;纟工祝《吳jPz7/oco/oZmsZ)"d/MsZ)aW仏v;纟工祝浙吳P/7/oco/o6w516ad/ify^w/w/wch/;纟工祝浙吳尸z7/oco/oZmsZw^/ma*wa/t/rowae;Pennant氏祝猴，红祝猴i^'/zoco/o^/e朋a齒；红疵猴尸Woco/oZ)w/7e""a""7'/7e""of"Z//;红祝猴_P/7/oco/oZ)w>spe""a""'/e//e",';红祝猴PWrt",/(7/MA'尸e"wawh//www'e/;Preuss氏纟工祝《吳，Pz7/oco/o/)iw/re仏v'v/;Thollon氏红疢猴，/^7w";/o/^"/2"〃朋/;中非红疣猴，红疵猴尸z/w",/"/^v红祝猴fV/w",/o/m'、，a/》a/;红沈猴/^'//wo/o/m'sjw'e〃/加'；红疾猴ft'/Zoco/o/msow,咖/魄红祝猴尸/Z/oco/o紐y,se附腕e腿',s';红疾猴尸z7/oco/o/nw/鋪'/wmew"'eran/m;乌干达红疵猴，红祝猴/"///oco/okfep/jro'sce/es;Uzyngwa纟工祝浙吳，纟工疢浙美尸/:/Zoco/t^Msgcwiowon/附；Zanzibar红疣猴，红疣猴尸/toco/06船A:/>A://;塔纳河红疣猴，红疣猴rw/o附"ra^s);或在纟录祝猴属尸raco/o6tts内(橄才览祝求吳OliveColobus,纟录疾猴尸raco/06ws)。在疣猴亚科Co/o&力ae中，有利的非黑猩猩灵长类可选择地来自叶猴(叶片猴子辦，在长尾叶猴属Se/w7o/7欣ea^内(尼泊尔灰叶猴(NepalGrayLangur)，长尾叶猴sc/2她c酷；克什米尔灰叶猴，长尾叶猴&附"0/"/<^q/'a义；Tarai灰叶浙吳，长尾叶賓吳Se/w/o//Y/ecz^//ecoz-;北方平原灰叶猴，长尾叶猴ew化〃iw;黑脚灰叶猴，长尾叶猴5^附w/^^eow/y^o/ewcos;南方平y^灰叶l"吳,长尾口十浙吳5^wwop"/2eowd編'廳/m';蔟毛灰叶猴(TuftedGrayLangur)，长尾叶猴pr/am);在乌叶猴属rrac/^p油eow的Z:vdw/ws群内(紫脸叶猴，乌叶猴rmcA，"/7eowve/w/ws;Nilgiri叶猴,乌叶猴rra勿//',/ecw,/w7/7);在乌叶猴属rrat力v尸"/2ecw的7:cm'to&s'群内(爪唾Lutung,乌叶猴7>acA_y/7"/^oawrartw;4艮色叶饔吳或^艮色Lutung,乌叶《吳7>ac/^/>/Aedvtr/血加；印度支那Lutung，乌叶猴rrac/z炉说ecw's1ger顧z'w/;TenasserimLutung,乌叶猴rrac/y^"/ecw51在乌叶猴属rra勿/7"Z/ecws的I！o^cwn群内(暗色叶猴(DuskyLeafMonkey)或眼镜叶猴(SpectacledLeafMonkey)，乌叶猴rra勿p她ecuvoZ^cw而；Phayre氏叶猴，乌叶猴7h3c/y//^/eo/^a少re/);在乌叶lf吳属7hc/^/zY/ecz/51的7:///<artw群内(戴帽叶猴，乌叶猴rrac/^p欣ea^p/7ea^s;Shortridge氏叶猴，乌叶猴rrac/2炉Y/eo/H/ortn喊e/;Gee氏金色叶猴，乌叶猴rra勿/7"Z/ecwsgm');在乌叶猴属rrac/2j^/Aea的7:/ra"c6^/群内(Francois氏叶猴，乌叶猴rrac/23;;^/ecM./hafwco&;Hatinh叶H乌叶f吳rrac/2少/^/7eaw/w^^em'^;白头叶猴，乌叶猴rrac/yp/Aeaw/^//oc^/wr/iw;老挝叶猴，乌叶猴7>ac/w'//eo/"她附；Delacour氏叶猴,乌叶猴rra勿;"/ecmtfe/acow"';印度支那黑色叶猴，乌叶猴rrac/y^/Aea"e/)e"M);或在叶猴属P/^/^/s内(苏门答腊叶猴(SumatranSurili)，叶猴iVe^y/"we/a/op/Kw;带紋叶猴(BandedSurili)，叶猴尸m诂jto/eworafc;沙捞越叶猴(SarawakSurili),fVe'、、6少toc力;^wme/a'v;白腿叶f吳(White-thighedSurili),叶f美尸ms'6少to'w:薩e願',s;白额叶猴(White-frontedSurili)，叶猴iVe咖to/ra咖to;爪哇叶猴(JavanSurili),叶猴/Ve勿toco腦to;Thomas氏叶猴,叶猴Pre勿to/o層'w';Hose氏叶猴，叶猴/20譜'；栗红叶猴(MaroonLeafMonkey)，叶猴/Ve勿torw6/cw"(iaf;孟他维叶猴(MentawaiLangur)或Joja，叶猴尸m^ytopofc"z/朋/;纳土纳岛叶猴(NatunaIslandSurili),叶猴尸潛6少to)。在疣猴亚科Co/o/u>we中，有利的非黑猩猩灵长类可选择地来自怪鼻猴群，在白臀叶猴属i^伊f/^/jc内(红腿白臀叶猴(Red-shankedDouc)，白臀叶猴:尸少gaA^jcwe附aew,黑腿白臀叶賓吳，白臀叶《美尸少ga^/h义"/gh/^;灰腿白臀叶猴，白臀叶猴i^gaAh;cc/werea);在仰鼻猴属i^/"o//决eaM'内(金色扁鼻猴(GoldenSnub-nosedMonkey),金丝猴她M0p"/2ecwsmxe〃朋a;黑色扁鼻猴，澳金丝猴i///"o^^ea6/幼；灰色扁鼻猴，黔金丝f吳W/2/wo/7z//^cas'Tonkin扁鼻叶有吳，越南金丝l吳A/^rto/7,//2ecwflvw"az/w、')；在长鼻猴属Mzrafe内(长鼻猴(ProboscisMonkey),长鼻猴Miva/"'/a/TOf,as');或在月豕尾叶浙吳属Sz'ot/仏s'内(豚尾叶，吳(Pig-tailedLangur)，豚尾叶《吳Sz'附/a^cowco/or)。如本文所用，术语"狨猴"(marmoset)指狨属Ca//"/mx的任何新世界猴，例如属于狨亚属a7漁/2/lx(sic!)的大西洋狨猴(常见狨猴，狨0///"/^"f07〃/Ara:7acc/2ws;黑色蔟毛狨猴(Black-tuftedMarmoset),丛尾狨CGr〃"//h:cfCfl〃"/7hxWied氏狨猴，狨Gaf〃"/zr/xfQ〃"//r/:C白头3成有吳，3成Ca〃"/^ix;fCa〃"/7hxJgeo^9r^z';黄头3成浙吳(Buffy-headedMarmoset)，狨Ca〃"/2r/xfQ〃/*/xJj7頻'c，；黄色蔟毛狨猴(Buffy-tuftedMarmoset)，3戍Q7〃"/2力x「Ca〃"/2hxjmm'to);属于A//co亚属的亚马逊3成猴(RioAcari狨猴，狨Q7〃/*ix"can.e"^;Manicore狨猴，狨Ca〃"/7r/x广M/coJ附fl/7/co;-e似/^;4艮色3成猴，《成G3〃"/2r/xfM/coJ白3成l^，3成Ca〃"/^/x^Wz'coJ/ewciip/e;Emilia氏3成浙吳，3成Cfif〃"/j/lx:6W/co,e附z7/'a(;,繁、头4成有吳，《成C"〃zY/^/jc^W/'coJm'g力ce/w;Marca氏《成lf吳，3成Ca〃"/7r/;t^A//:cci」warca/;,繁、尾《成《吳，3成Ca〃a/7^xfA//<:o附e/ow"raf;Santarem狨猴，白肩狨Q/〃她hxf"A/z'coJ/wwera/^ra;Mau6s狨猴,狨Ca〃"/^/xfA/koJwm/es/;金白3成浙吳，黄月支3戎Ca〃"/^ix(^f/coJc/o^o/ewca;Hershkovitz氏狨猴,狨C"〃z*&广M/coJ/她r附Wa;Satere狨猴，狨Ca〃"/^仕fA^'coJsarereO;属于Ct/〃z力e〃a亚属的Roosmalens氏倭3成浙吳("Ca///Z)e〃ay/m肌7w);或属于倭狨亚属CeZme〃a的侏儒狨猴(PygmyMarmoset)(Gar〃"/2/lx广Ce6we〃aJ/少gmarea)。其他属的新世界猴包括柽柳猴属Sagw/"w的绢毛猴(tamarin)(包括绒顶柽柳猴S.oec^iw群、赤掌柽柳猴S.w/^w群、黑须柽柳猴S."/gr/w〃/s说明书第18/257页群、长须柽柳猴S.群、两色柽柳猴S.^co/w群和烙印柽柳猴Xz"i^ws群)以及木^鼠猴属&/mz>7'的+>鼠猴(例如松鼠《吳Sa/m,力'sc/we"s、巴拿马木》鼠浙吳Sa/附/n'oera化6/,'、马河+>鼠有美Sdm/a7'wWw;s'、亚马逊爭>鼠猴:Sa/wz力/o//v/eM>sl"f、，擎、+》鼠浙吳Saz'附/n'vfirwzo/z'm')。术语"结合域"在本发明中表征特异性地与给定的靶结构/抗原/表位结合/相互作用的多肽的域。因此，所述结合域是"抗原相互作用位点"。依照本发明，术语"抗原相互作用位点"定义一个多肽的才莫体，其能够特异性地作用于特异性的抗原或特异性的抗原组，例如不同物种中相同的抗原。所述结合/相互作用也被理解为定义"特异性的识别"。依照本发明，术语"特异性地识别"意思是所述抗体分子能够特异性地作用于和/或结合到抗原(例如本文所定义的人CD3抗原)的至少两个、优选地至少三个、更优选地至少四个氨基酸。这种结合可通过"锁钥原则"的特异性被例证。因此，由于它们的一级、二级或三级结构以及对所述结构的二级修饰，所述结合域氨基酸序列的特异性沖莫体和所述抗原互相结合。所述抗原相互作用位点与它的特异性抗原的特异性相互作用也可导致所述位点与抗原的简单结合。此外，所述抗原相互作用位点与它的特异性抗原的特异性相互作用可选择地导致信号的启动，例如由于抗原的构象变化、抗原的低聚化等的诱导作用。符合本发明的结合域的一个优选例子是抗体。所述结合域可以是单克隆或多克隆抗体或衍生自单克隆或多克隆抗体。术语"抗体"包括仍然保持结合特异性的衍生物或其功能片段。生产抗体的技术在本领域是众所周知的，并在例如Harlow和Lane，"Antibodies,ALaboratoryManual"(抗体，实-睑室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988和Harlow和Lane"UsingAntibodies:ALaboratoryManual"(使用抗体实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1999中被描述。术语"抗体"还包括免疫球蛋白(Ig)的不同类(即IgA、1gG、IgM、IgD和IgE)和亚类(例如IgGl、lgG2等)。这些抗体可用于例如本发明的多肽或融合蛋白的免疫沉淀、亲和纯化和免疫定位，以及监测这种多肽例如在重组原核生物或真核生物细胞或生物体中的存在和量。术语"抗体"的定义还包括例如嵌合单链和人源化抗体以及抗体片段尤其是如Fab片段的实施方案。抗体片段或衍生物还包括F(ab')2、Fv、scFv片段或包括仅一个可变域的单域抗体、单可变域抗体或免疫球蛋白单可变域，所述一个可变域可以是独立于其他V区域或域而特异性地结合抗原或表位的VH或VL;参见例如上述引文中的Harlow和Lane(1998)和(1999)。这种免疫球蛋白单可变域不仅包含一个分离的抗体单可变域多肽，还包含更大的多肽，其中所述更大的多肽包括抗体单可变域多肽序列的一个或多个单体。多种程序是本领域已知的并可用来生产这种抗体和/或片段。因此，所述(抗体)衍生物可通过模拟肽产生。进一步地，用来产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778)可适应于生产对所选多肽具有特异性的单链抗体。而且，转基因动物可用于表达对本发明的多肽和融合蛋白具有特异性的人源化抗体。对于单克隆抗体的制备，可以使用提供由连续细胞系培养物所产生的抗体的任何技术。这种技术的例子包括杂交瘤技术(K6hler和Milstein，Nature256(1975),495-497)、三源杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor，ImmunologyToday4(1983)，72)和生产人类单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy(单克隆抗体和癌症治疗)，AlanR.Liss，Inc.(1985)，77-96)。在BlAcore系统中使用的表面等离子体共振可用来提高噬菌体抗体的功效，所述噬菌体抗体结合到靶多肽如CD3s的表位(Schier,HumanAntibodiesHybridomas7(1996)，97-105;Malmborg，J.Immunol.Methods183(1995),7-13)。本发明的上下文中还设想，术语"抗体"包括抗体构建体，其可如下文所述表达在宿主中，例如可通过尤其是病毒或质粒载体被转染和/或转导的抗体构建体。按照本发明所用，术语"特异性相互作用，，意思是结合(域)分子不或不显著地与多肽交叉反应，其中所述多肽具有与那些被结合分子结合的多肽相似的结构，且可能被表达在与感兴趣的多肽相同的细胞中。正在研究中的一组结合分子的交叉反应性可通过例如在常规的条件下评估所述组的结合分子的结合而被测试(参见例如Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual(抗体实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1988和UsingAntibodies:ALaboratoryManual(4吏用抗体实-验室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999)。结合域与特异性抗原的特异性相互作用的例子包括它的受体的配体的特异性。所述定义特別地包括配体的相互作用，其中所述配体与它的特异性受体结合后诱发信号。抗体的结合域(抗原结合位点)的相互作用。本文所用术语"跨种特异性"或"种间特异性"意思是本文所述的结合域与人类和非黑猩猩灵长类中相同的靶分子的结合。因此，"跨种特异性"或"种间特异性"会被理解为对于表达在不同种的相同分子X的种间反应性，但不是对于除了X之外的分子。识别例如人CD3s的单克隆抗体对于非黑猩猩灵长类CD3s例如猕猴CD3s的跨种特异性可通过例如FACS分析而确定。所述FACS分析以如下方式实行，对相应的单克隆抗体测试其对分别表达所述人类和非黑猩猩灵长类CD3s抗原的人类和非黑猩猩灵长类细胞例如猕猴细胞的结合。一个适当的测定显示在下面的实施例中。如本文所用，CD3s表示的是以T细胞受体的一部分表达的分子，且具有在现有技术中通常归于它的意义。在人类上，它包括单独的或独立地组合的形式的所有已知CD3亚基，例如CD3￡、CD35、CD3y、CD3G、CD3ct和CD3p。本文所述非黑猩猩灵长类CD3抗原是例如食蟹猕猴Macaca/avczra/flmCD3和猕猴A/acwa"w/atoCD3。在食蟹猕猴A^cacfl/^c/cwton、上，它包括CD3eFN-18阴性和CD3￡FN-18阳性、CD3y和CD3S。在猕猴M"cac"mw/加to上，它包括CD3s、CD3y和CD3S。优选地，如本文所用所述CD3是CD3s。所述人CD3e在GenBank登录号NM—000733中被指明，并包括SEQIDNO.1。所述人CD3y在GenBank登录号NM—000073中被指明。所述人CD35在GenBank登录号NM_000732中被指明。食蟹猕猴Afocaca/flsc/cwtom的所述CD3s"N-18阴性"(即由于上文所述多态性而不被单克隆抗体FN-18识别的CD35)在GenBank登录号AB073994中被指明。食蟹猕猴Macaca./^c/cwton;s的所述CD3s"FN-18阳性"(即被单克隆抗体FN-18识别的CD3s)在GenBank登录号AB073993中被指明。食蟹猕猴A/acaca/o^/cM/an^的所述CD3y在GenBank登录号AB073992中被指明。食蟹猕猴/a^/cw/a^的所述CD35在GenBank登录号AB073991中被指明。猕猴A/acacamw/ator的相应的CD3s、y和5同系物的核酸序列和氨基酸序列可通过本领域所述重组技术而被鉴定和分离(Sambrook等MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)；ColdSpringHarborLaboratoryPress,第三版，2001)。力口以必要的变更，这适用于本文所定义的其他非黑猩猩灵长类的CD3s、y和5同系物。普通狨l"吳Ca〃"/A7^;7'acc/ws、+》鼠有吳Sa/'附/厂/6'c/w化w和纟戎顶柽杉卩猴Sagiz/w^oa/^w的氨基酸序列的鉴定在所附实施例中有描述。普通狨猴a〃/'//njc^cc/ms的CD3e的细胞外域的氩基酸序列在SEQIDNO:3中叙述，绒顶柽柳猴Sagw/ww,s1oe(i/;my的在SEQIDNO:5中叙述，以及松鼠猴S"/附/'n:sc/i/re^的在SEQIDNO:7中叙述。与上述一致，术语"表位"定义一个抗原决定簇，其被上述所定义的结合分子所特异性地结合/鉴定。所述结合域或分子可特异性地结合到/作用于构象或连续表位，其对于靶结构例如人类和非黑猩猩灵长类的CD3e链是独特的。多肽抗原的构象或不连续表位被表征为两个或更多不连续的氨基酸残基的存在，其中所述氨基酸残基在一级序列中是分开的，但当多肽折叠成天然蛋白/抗原时在分子表面聚集(Sela，(1969)Science166，1365和Laver,(19卯)Cell61,553-6)。贡献于所述表位的两个或更多不连续的氨基酸残基存在于一个或多个多肽链的分离部分中。当所述多肽链折叠成三维结构以构成所述表位时，这些残基在分子表面聚集。与此相反，连续或线性表位由两个或更多不连续的氨基酸残基组成，其中所述氨基酸残基存在于多肽链的单线性区段。在本发明中，"背景依赖性的"CD3表位指的是所述表位的构象。位于CD3s链的这样的背景依赖性的表位只能在被嵌入s链的其余部分并被e链与CD3y或5链的异二聚化保持在正确位置时产生正确的构象。与此相反，本文所提供的背景独立性的CD3表位指的是CD3s的N端l-27氨基酸残基多肽或其功能片段。这N端1-27氨基酸残基多肽或其功能片段在从它在CD3复合体中的天然环境中^皮取出时，维持它的三维结构完整性和正确的构象。因此，作为CD3s细胞外域一部分的N端1-27氨基酸残基多肽或其功能片段的所述背景独立性，代表一个与WO2004/106380中制备人类结合分子方法有关的描述的CD3s的表位完全不同的表位。所述方法使用单独表达的重组CD3e。这种单独表达的重组CD3e的构象不同于它的天然形式所采用的构象，即在其中TCR/CD3复合体的CD3-s亚基作为与TCR/CD3复合体的CD3-5或CD3-y亚基的非共价复合体的一部分存在的形式。当这种单独表达的重组CD3-s蛋白质^f皮用作从抗体库选择抗体的抗原时，对这种抗原有特异性的抗体从所述库被鉴定，虽然这种库不含对于自体抗原/自身抗原具有特异性的抗体。这是由于如下事实单独表达的重组CD3-s蛋白质不存在于体内；它不是自身抗原。因而，表达对这种蛋白质具有特异性的抗体的B细胞亚群在体内还没有清除；从这种B细胞构建的抗体库将含有对于单独表达的重组CD3-s蛋白质具有特异性的抗体的遗传物质。然而，因为背景独立的N端1-27酸残基多肽或其功能片段是一个以它的天然形式折叠的表位，根据本发明的结合域不能被基于WO04/106380中所述途径的方法鉴定。因此，可以通过测试证实，WO04/106380中公开的结合分子不能结合到CD3s链的N端1-27氨基酸残基。所以，常规的抗CD3结合分子或抗CD3抗体分子(例如WO99/54440中所公开)在一个位置结合CD3s链，其中所述位置比本文所提供的背景独立性的N端1-27氨基酸残基多肽或功能片段距C端更近。现有技术的抗体分子OKT3和UCHT-1也在氨基酸残基35至85之间具有对TCR/CD3复合体的s亚基的特异性，并且相应地，这些抗体的表位也是距C端更近。此外，UCHT-1在氨基酸残基43至77之间的区域结合CD3￡链(Tunnacliffe，Int.Immunol.1(1989)，546-50;Kjer-Nielsen，PNAS101，(2004)，7675-7680;Salmeron，J.Immunol.147(1991)，3047-52)。因此，现有技术的抗CD3分子不结合且不直接针对本文所定义的背景独立性的N端1-27氨基酸残基表位(或其功能片段)。为了产生包括在本发明的多肽例如本文所定义的双特异性单链抗体中的优选地为人类的结合域，可以使用例如结合到人类CD3s和非黑猩猩灵长类CD3s(例如猕猴CD3s)二者的单克隆抗体。在本发明的多肽的一个优选的实施方案中，所述非黑猩猩灵长类是旧世界猴。在所述多肽的一个更优选的实施方案中，所述旧世界猴是狒狒属(Papiogenus)猕猴属(Macaquegenus)的猴。最优选地，所述猕猴属的猴是阿萨姆(Assamese)猕猴(Macacaa^a附em^)，地中海猕猴(A/acacas少/v證w)，冠毛猕猴(Macfifc"ratZ/oto)，穿孰或苏拉威西(Sulawesi)穿靴猕f吳(Macacaochreata)，苏4立威西有冠(crested)猕浙吳(Mflcflcaw/gra)，台湾岩石称猴(Mac"cac少c/o/ww)，日本雪猕猴或日本猕猴(A/"rac"乂ks'cflto),食蟹猴或食蟹猕猴或长尾猕猴或爪哇猕猴(Macaca/as'c/a//"/^)，《师尾箱尔求吳(MaoccrW/em^),豚尾浙尔賓吳(Macflcawewe^/7'"")，恒河猕、《吳(M"c'aca扁toto)，西藏猕猴(Macwa)，Tonkean猕猴(MacwaMw&fl"fl)，Toque猕猴(A/aacaWmca)，短尾猕猴或红脸猕猴或熊猴(A/"cflcoaTTtoWe,y)，或沼泽猕猴(Mac"c")。最优选地,所述狒狒属的猴是阿拉伯狒狒，尸ap/0/7aw^/o^f;几内亚狒狒，尸a/7/opa;/o;橄榄狒狒，P一o朋m/^;黄狒狒，尸fl//'oc;;"oc一"/ms;大狒狒，尸一o肌/wrs。在本发明的多肽的一个可选地优选的实施方案中，所述非黑猩猩灵长类是新世界猴。在所述多肽的一个更优选的实施方案中，所述新世界猴是Call油rix属(狨猴)、Saguinus属或Samiri属的猴。最优选地，所述Callithrix属的猴是普通狨猴(0〃"/^:c^cc/m,s)，所述Saguinus属的猴是绒顶柽柳猴(S"gw/"ws)并且所述Samiri属的猴是松鼠猴(sc/脏w)。如本文上面所述，本发明的多肽用第一结合域与人类和非黑猩猩灵长类CD3e(e)链的表位结合，其中所述表位是一个氨基酸序列的一部分，其中所述氨基酸序列被包括在由SEQIDNO.2、4、6或8所示的27个氨基酸残基组成的组中。与本发明一致，对于本发明的多肽而言优选的是，所述表位是一个氨基酸序列的一部分，其中所述氨基酸序列包括26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸。更优选地，其中所述表位至少包括氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(Q-D-G画N-E-D)。在本发明中，"N端l-27氨基酸残基的功能片段"表示所述功能片段仍然是一个背景独立性的表位，其在从它在CD3复合体中的天然环境中被取出(并且融合到异源氨基酸序列例如EpCAM或免疫球蛋白Fc部分，例如实施例3.1所示)时，维持它的三维结构完整性。在CD3s的27个氨基酸N端多肽或其功能片段中的三维结构的维持可被用来产生结合域，其中所述结合域在体外结合到N端CD3s多肽片段并且以相同的结合亲和力在体内结合到T细胞上的天然CD3复合体(的CD3s亚基)。在本发明中，N端1-27氨基酸残基的功能片段表示本文所提供的CD3结合分子仍然能以背景独立性的方式结合这种功能片段。本领域技术人员知道用于确定表位的哪个氨基酸残基被这种抗CD3结合分子识别的表位定位方法(例如丙氨酸扫描或pep斑点分析)。在本发明一个优选的实施方案中，本发明的多肽包括能够结合人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的(第一)结合域和能够结合细胞表面抗原的第二结合域。本文所用术语"细胞表面抗原，，指的是出现在细胞表面的分子。在多数情况下，这种分子将位于细胞的质膜内或质膜上以至于这种分子的至少一部分在三级形式上保持从细胞外的可接近性。位于质膜内的细胞表面分子的一个非限制性的例子是跨膜蛋白，其在它的三级构象中包括亲水和疏水的区域。在此处，至少一个疏水区域允许细胞表面分子嵌入或插入细胞的疏水质膜，而所述疏水区域在质膜两侧分别延伸至细胞质和细胞外空间。位于质膜上的细胞表面分子的非限制性的例子是半胱氨酸残基被修饰而带有棕榈酰基的蛋白质、C端半胱氨酸残基被修饰而带有法尼基的蛋白质或C端被修饰而带有糖基磷脂酰肌醇("GPI")锚的蛋白质。这些基团允许蛋白质共价连接到质膜的外表面，在其上它们保持可接近性以被细胞外分子例如抗体识别。细胞表面抗原的例子包括EGFR、EGFRvIII、MCSP、碳酸酐酶IX(CAIX)、CD30、CD33、Her2/neu、IgE、CD44v6和Muc曙l。此外，相应的细胞表面抗体的例子包括特定疾病或疾患即癌症、自身免疫性疾病或包括病毒性感染的传染性疾病的特征性抗原。因此，术语"细胞表面抗原"明确地包括病毒蛋白质例如暴露在受感染细胞的表面上的天然的、未加工的病毒蛋白质(净皮描述尤其是肝炎病毒乙型、丙型和HIV-1的包膜蛋白)。细胞毒性T细胞的一个防御功能是感染病毒的细胞的破坏，因此，本发明的双特异性结合分子激活和重定向细胞毒性T细胞而不考虑它们自身特异性的独特性质对于慢性病毒感染的广阔领域具有很大影响。对于这些感染中的大多数，消灭被持续地感染的细胞是治愈的唯一机会。当前，继承性T细胞疗法目前正针对慢性CMV和EBV感染而被开发(Rooney，CM.等，Useofgene-modifiedvirus-specificTlymphocytestocontrolEpstein-Barr-vims-relatedlymphoproliferation.(<吏用基因1多饰的病毒特异性的T淋巴细胞控制Epstein-Barr病毒相关的淋巴组织增生)Lancet,1995.345(8941):p.9-13;Walter,EA等,ReconstitutionofcellularimmunityagainstcytomegalovirusinrecipientsofallogeneicbonemarrowbytransferofT-cellclonesfromthedonor(通过转移来自供给者的T细胞克隆而将针对于同种异体骨髓接受者体内细胞巨化病毒的细胞免疫性再生)，NEnglJMed，1995.333(16):p.1038-44)。慢性乙型肝炎感染明显地是最受关注和最有回报的适应症。全世界有3.5至4亿人受HBV的感染。目前对于慢性HBV肝炎的治疗依靠干扰素y和核普或核苷酸类似物，是伴有严重副作用的长期治疗，所述副作用例如诱导肝炎发作、发烧、肌痛、血小板减少和抑郁。虽然现在有多于4种许可的治疗方案，但很少实现对病毒的消灭。慢性乙型肝炎中持续的炎症在多于25%的患者中导致肝硬化和肝细胞癌。此外，多至40%的慢性乙型肝炎患者会死于严重的并发症，导致世界上每年50至100万的死亡。HBV，即嗜肝DNA病毒的原型，是包膜病毒，其松弛的环状(rc)基因组被反转录成RNA前基因组。感染后所述rcDNA被引入肝细胞核，在其中它被完成为含有四个重叠读框的共价闭环DNA(cccDNA)。它充当前基因组RNA和三个亚基因组RNA的转录才莫板。所述RNA前基因组起mRNA的作用以翻译病毒核心和聚合酶蛋白。受感染的细胞连续地从cccDNA产生HBV表面蛋白(HBsAg)，即使在HBV的复制停止时。HBsAg由小(S)表面蛋白和大(L)表面蛋白组成，其中小表面蛋白有非常少的中部部分。HBV的S和L二者都靶向内质网(ER)膜，从那里它们在膜囊中通过反面高尔基器向质膜运输(Gorelick,F.S.和C.Shugme,Exitingtheendoplasmicreticulum(退出内质网).MolCellEndocrinol,2001.177(1-2):p.13-8)。S和L蛋白永久地被表达在复制HBV的肝细胞表面上，如近期所示(Chu，CM.和Y.F.Liaw,MembranestainingforhepatitisBsurfaceantigenonhepatocytes:asensitiveandspecificmarkerofactiveviralreplicationinhepatitis(肝细胞上乙型肝炎表面抗原的膜染色肝炎中活动性病毒复制的灵敏且特异性标志)，B.JClinPathol，1995.48(5):p.470-3)。在细胞表面暴露包膜蛋白的原型病毒是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和HTV-l,它们都代表全球巨大的疾病负担。对于HTV-l病毒适应症，近期显示，使用带有Fv抗体构建体的嵌合TCR修饰的T细胞可以杀死HIV-1感染的靶细胞，其中所述Fv抗体构建体指向即120包月莫蛋白(Masiero，S.等，T-cellengineeringbyachimericT-cellreceptorwithantibody-typespecificityfortheHIV-1gpl20(使用具有对HIV-1gpl20的抗体型特异性的嵌合T细胞受体的T细胞工程)，GeneTher,2005,12(4):p.299-310)。在肝炎DNA病毒中，乙型肝炎病毒表达包膜蛋白复合体HBsAg，其中所述HBsAg被连续地从附加型(episomal)cccDNA产生，即便在HBV的复制下降时也一样。作为完整的S和L的HBV蛋白质在细胞表面上的表达使它们可以被抗体接近，其是当患者从急性感染期恢复和从循环的HBAg变成抗乙型肝炎表面抗体(antiHB)时血清转变的标志。如果不发生血清转变，多至30%的肝细胞也在长期高活性抗病毒治疗后继续表达HBV的S蛋白。因此，除了特异性地识别细胞内加工的HBV肽并被MHC分子呈现在细胞表面的T淋巴细胞之外，其他形式的T细胞接合是可行的，目标是完整的表面蛋白例如从细胞膜外可接近的S和L抗原。使用识别乙型肝炎病毒小(S)和大(L)包膜蛋白的单链抗体片段，生产了人工T细胞受体，其允许将移植的T细胞导向受感染的肝细胞，并且在与抗原接触之后允许这些T细胞被激活以分泌细胞因子并杀死受感染的肝细胞。这方法的限制是，(i)T细胞需要在细胞外操作，(ii)用来转移T细胞受体的反转录病毒可能导致T细胞中的插入诱变，和(iii)一旦T细胞被转移，细胞毒性反应不能被限制。为了克服这些限制，可以生产双特异性单链抗体分子，其包括对人类和非黑猩猩灵长类CD3e抗原有结合特异性的第一域(如本发明上下文所提供)以及对受感染的肝细胞的HBV或HCV包膜蛋白有结合特异性的第二域，并且这些是在本发明的范围内。在本发明中，进一步优选的是，第二结合域结合到人类细胞表面抗原和/或人类细胞表面抗原的非黑猩猩灵长类对应物，其中所述抗原选自EGFR、Her2/neu或IgE。为了生产本发明所述多肽例如本文所定义的双特异性单链抗体的第二结合域，可以使用结合到相应人类和/或非黑猩猩灵长类细胞表面抗原二者的单克隆抗体。例如，本文所定义的双特异性多肽的适当的结合域可通过本领域所描述的重组方法衍生自跨种特异性的单克隆抗体。结合到人类细胞表面抗原和非黑猩猩灵长类中所述细胞表面抗原同系物的单克隆抗体能够用FACS测定按上文所述进行测试。对于本领域技术人员来说很明显，跨种特异性抗体还能够由文献中所述的杂交瘤技术产生(Milstein和K6hler，Nature256(1975)，495-7)。例如，小鼠可选地被人类和非黑猩猩灵长类CD33免疫。从这些小鼠，产生跨种特异性抗体的杂交瘤细胞通过杂交瘤技术被分离并用FACS按上文所述被分析。双特异性多肽例如本文所述展现跨种特异性的双特异性单链抗体的产生和分析显示在如下实施例中。展现跨种特异性的双特异性单链抗体的优点包括如下列举的各点。对于本发明的多肽特别优选的是，能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的第一结合域包括VL区域，其中所述VL区域包括选自如下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3:(a)SEQIDNO.27所示CDR-L1、SEQIDNO.28所示CDR-L2和SEQIDNO.29所示CDR-L3;(b)SEQIDNO.117所示CDR陽Ll、SEQIDNO.118所示CDR-L2和SEQIDNO.119所示CDR-L3;以及(c)SEQIDNO.153所示CDR國L1、SEQIDNO.154所示CDR-L2和SEQIDNO.155所示CDR-L3。所述可变区域即可变轻链("VL"的"L")和可变重链("H"或"VH")在本领域被理解为提供抗体的结合域。这种可变区域含有互补决定区。术语"互补决定区"(CDR)在本领域众所周知决定抗体的抗原特异性。术语"CDR-L"或"LCDR"指的是VL中的CDR，而术语"CDR-H"或"HCDR"指的是VH中的CDR。在本发明所迷多肽的一个可选择地优选的实施方案中，能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3e链的表位的第一结合域包括VH区域，其中所述VH区域包括选自如下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3:(a)SEQIDNO.12所示CDR-H1、SEQIDNO.13所示CDR-H2和SEQIDNO.14所示CDR-H3;(b)SEQIDNO.30所示CDR-H1、SEQIDNO.31所示CDR-H2和SEQIDNO.32所示CDR-H3;(c)SEQTDNO.48所示CDR誦Hl、SEQIDNO.49所示CDR誦H2和SEQIDNO.50所示CDR-H3;(d)SEQIDNO.66所示CDR-H1、SEQIDNO.67所示CDR-H2和SEQIDNO.68所示CDR-H3;(e)SEQIDNO.84所示CDR-H1、SEQIDNO.85所示CDR-H2和SEQIDNO.86所示CDR-H3;(f)SEQIDNO.102所示CDR-H1、SEQIDNO.103所示CDR-H2和SEQIDNO.104所示CDR-H3;(g)SEQIDNO.120所示CDR-H1、SEQIDNO.121所示CDR-H2和SEQIDNO.122所示CDR-H3;(h)SEQIDNO.138所示CDR-H1、SEQIDNO.139所示CDR-H2和SEQIDNO.140所示CDR-H3;(i)SEQIDNO.156所示CDR-Hl、SEQIDNO.157所示CDR-H2和SEQIDNO.158所示CDR-H3;以及(j)SEQIDNO.174所示CDR誦Hl、SEQIDNO.175所示CDR-H2和SEQIDNO.176所示CDR-H3。进一步优选的是，能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的第一结合域包括VL区域，其中所述VL区域选自由SEQIDNO.35、39、125、129、161或]65所示VL区域组成的组。可选择地优选的是，能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3e链的表位的第一结合域包括VH区域，其中所述VH区域选自由SEQIDNO.15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181所示VH区域组成的组。更优选地，本发明的多肽被表征为能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3e链的表位的第一结合域，其包括选自由如下所组成的组的VL区域和VH区域(a)SEQIDNO.17或21所示VL区域和SEQIDNO.15或19所示VH区域；(b)SEQIDNO.35或39所示VL区域和SEQIDNO.33或37所示VH区域；(c)SEQIDNO.53或57所示VL区域和SEQIDNO.51或55所示VH区域；(d)SEQIDNO.71或75所示VL区域和SEQIDNO.69或73所示VH区域；(e)SEQIDNO.89或93所示VL区域和SEQIDNO.87或91所示VH区域；(f)SEQIDNO.107或111所示VL区域和SEQIDNO.105或10936所示VH区域；(g)SEQIDNO.125或129所示VL区域和SEQIDNO.123或127所示VH区域；(h)SEQTDNO.143或147所示VL区域和SEQIDNO.141或145所示VH区域；(i)SEQIDNO.161或165所示VL区域和SEQIDNO.159或163所示VH区域；以及(j)SEQIDNO.179或183所示VL区域和SEQIDNO.177或181所示VH区域。根据本发明所述多肽的一个优选的实施方案，成对的VH区域和VL区域是以单链抗体(scFv)的形式存在。所述VH和VL区域以VH-VL或VL-VH的顺序排列。优选的是，所述VH区域N端定位于连接体序列。所述VL区域C端定位于所述连接体序列。本发明中上述多肽的一个优选的实施方案被表征为能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的第一结合域，其包括选自由SEQIDNO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187所组成的组的氩基酸序列。本发明进一步涉及上迷多肽，其中所述第二结合域结合到细胞表面抗原，其优选地为肿瘤抗原。本文所用术语"肿瘤抗原"可被理解为肿瘤细胞呈现的那些抗原。这些抗原可被呈现在细胞表面上，带有经常与所述分子的跨膜和细胞质部分结合在一起的细胞外部分。这些抗原有时只可被肿瘤细胞而不能被正常细胞呈现。肺瘤抗原可被专门地表达在肿瘤细胞上或与正常细胞相比可代表肿瘤特异性的突变。这时，它们被叫做肿瘤特异性抗原。更常见的是由肿瘤细胞和正常细胞所呈现的抗原，并且它们被叫做肿瘤相关性抗原。这些肿瘤相关性抗原与正常细胞相比可一皮过表达，或由于肿瘤组织与正常组织相比具有较不紧凑的结构而容易用于肿瘤细胞内的抗体结合。本文所用肿瘤抗原的非限制性的例子是EGFR(Liu,Br.J.Cancer82/12(2000)，1991-1999;Bonner,Semin.Radiat.Oncol.12(2002)，11-20;Kiyota,Oncology63/1(2002)，92-98;Kuan,BrainTumorPathol.17/2(2000)，71-78)。EGFR(也被称作c-erbl或HER1)属于erbB受体酪氨酸激酶家族。当通过与来自生长因子EGF家族的配体结合而被激活时，EGFR与第二个EGFR或另一个erbB受体家族成员分别地同二聚化或异二聚化，通过促分裂原活化蛋白激酶和其他转录因子而启动信号级联，导致增殖、分化和修复(Olayioye，EMBOJ.19(2000)，3159-67)。EGFR在许多上皮癌中过表达，包括结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌和头颈癌(Mendelsohn,J.Clin.Oncol.21(2003)，2787-99;Mendelsohn,J.Clin.Oncol.20(18,Suppl.)(2002)，1S-13S;Prewett,Clin.CancerRes.8(2002),994-1003)。恶性肺瘤细胞中EGFR的过表达和/或变异导致激酶活性的组成性活化，引起增殖、血管生成、入侵、转移和细胞凋亡的抑制(上述引文中的Mendelsohn(2003);Ciardiello，Clin.C肌cerRes.7(2001)，2958-70;Perez-Soler,Oncologist9(2004)，58-67)。靶向EGFR的细胞外配体结合域或细胞内酪氨酸激酶信号级联的单克隆抗体已经显示作为抗肺瘤耙的效力(Laskin，CancerTreat.Review30(2004),1-17)。例如，竟争性地抑制EGFR的细胞外域以抑制受体的配体激活的西妥昔单抗(Erbitux)，即EGFR的一种人源化的单克隆抗体，在2004年纟皮食品与药物管理局(FDA)许可与拓朴异构酶抑制剂依立替康(irinotecan)配合使用而治疗转移性结肠癌。在本发明一个优选的实施方案中，所述多肽是双特异性单链抗体分子。如果所述候选药物是双特异性抗体，例如双特异性单链抗体，上文描述的有关用于临床前研究的替代物分子开发的问题进一步加剧。这样的双特异性抗体需要被识别的两种抗原对给定动物物种都是跨种特异性的，以允许在这种动物上进行安全性测试。还如上文所述，本发明提供多肽，其包括能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的第一结合域和能够结合到选自EGFR、Her2/neu或IgE的细胞表面抗原的第二结合域，其中所述第二结合域优选地还结合人类和/或非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原。双特异性单链抗体分子作为满足本发明优选多肽要求的候选药物的优点是在临床前动物测试以及临床研究甚至人类治疗中使用这种分子。在本发明跨种特异性的双特异性单链抗体的一个优选的实施方案中，所述能够结合到细胞表面抗原的第二结合域是源自人类的。在根据本发明的跨种特异性的双特异性分子中，能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的结合域以VH-VL或VL-VH的顺序位于双特异性分子的N端或C端。以第一和第二结合域中VH和VL链的不同排列形式存在的根据本发明的跨种特异性的双特异性分子在所附实施例中被描述。如本文所用，"双特异性单链抗体"指的是包括两个结合域的单多肽链。每个结合域包括一个来自抗体重链("VH区域")的可变区域，其中所述第一结合域的VH区域特异性地结合到CD3s分子，而所述第二结合域的VH区域特异性地结合到细胞表面抗原，如下文更详细所述。所述两个结合域可选地通过一个短多肽间隔区互相连_|妻。多肽间隔区的一个非限制性例子是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G-G-G-S)及其重复序列。每个结合域可另外包括一个来自抗体轻链的可变区域("VL区域")，在第一和第二结合域各自中的VH区域和VL区域通过例如EP623679Bl中公开和要求的类型的多肽连接体互相连接，但是在任何情况下足够长以允许第一结合域的VH区域和VL区域同第二结合域的VH区域和VL区域互相配对以使它们一起能特异性地结合对应的第一和第二分子。根据本发明的一个优选的实施方案，上述表征的双特异性单链抗体分子包括一组如下序列，如选自SEQIDNO:441-446，SEQIDNO:453-458，SEQIDNO:463-468,SEQIDNO:481-486的第二结合域中的CDRHl、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。本发明一个特别地优选的实施方案有关上述表征的多肽，其中所述双特异性单链抗体分子包括选自如下的序列(a)SEQIDNO:389、391、393、395、397、399、409、411、413、415、417、419、429、431、433、435、437、439、447、449、451、469、471、473、475、477、479、495、497、499、501、503和505中任何一个所述的氨基酸序列；以及(b)由SEQIDNO:390、392、394、396、398、400、410、412、414、416、418、420、430、432、434、436、438、440、448、450、452、470、472、474、476、478、480、496、498、500、502、504和506中任何一个所述的核酸序列所编码的氩基酸序列。在本发明一个优选的实施方案中，所述双特异性单链抗体对CD3s和被它们的第二结合域所识别的胂瘤抗原是跨种特异性的。在一个可选的实施方案中，本发明提供了一种编码本发明上述多肽的核酸序列。本发明还涉及一种载体，其包括本发明所述核酸分子。很多适合的载体是分子生物学领域技术人员已知的，并包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和在遗传工程中惯用的其他载体，载体的选择取决于所期望的功能。本领域技术人员众所周知的方法可被用来构建各种质粒和载体；参见例如Sambrook等(上述引文)以及Ausubel，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《最新分子生物学实验方法汇编》)，GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience，N.Y.(1989)、(1994)中所述的技术。可选择地，本发明多核苷酸和载体可被重组进入脂质体以输送到靶细胞。如下进一步的详细讨论，克隆载体被用来分离单独的DNA序列。相关序列可被转移至表达载体，其中需要特定多肽的表达。通常的克隆载体包括pBluescriptSK、pGEM、pUC9、pBR322和pGBT9。通常的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-l、pOP13CAT。优选地，所述载体包括核酸序列，其是可操作地连接到本文所定义的所述核酸序列的调节序列。术语"调节序列"指的是DNA序列，其对于实现连接于其上的编码序列的表达是必要的。这种控制序列的性质依据宿主生物体而有差异。在原核生物中，控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，控制序列一般包括启动子、终止子和在某些情况下的增强子、反式激活蛋白或转录因子。术语"控制序列"意在包括至少其存在对于表达是必要的所有成分，并还可包括另外的有利成分。术语"可操作地连接"指其中如此表述的组分的相互关系允许它们以其预期方式起作用的并列。"可操作地连接"到编码序列的控制序列以使所述编码序列的表达是在与所述控制序列相适合的条件下实现的方式连接。在所述控制序列是启动子的情况下，优选地使用双链核酸对于技术人员是显而易见的。因此，所陈述的载体优选地是表达载体。"表达载体"是可用于转化所选宿主的构建体，并且提供编码序列在所选宿主中的表达。表达载体可以是例如克隆载体、二元载体或整合型载体。表达包括核酸分子优选地转录为可翻译的mRNA。保证原核生物和/或真核生物细胞中的表达的调节元件是本领域技术人员众所周知的。至于真核细胞，它们通常包括保证转录起始的启动子以及可选择的保证转录终止和转录产物稳定的多聚腺苦酸信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包括例如大肠杆菌中的PL、/ac、^T或toc启动子，而且允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的例子是酵母中的爿OW或启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或球蛋白内含子。除了负责转录起始的元件之外，这样的调节元件还可包括位于所述多聚核香酸下游的转录终止信号，例如SV40-多聚腺苷酸位点或tk-多聚腺苷酸位点。此外，取决于所使用的表达系统，能够将所述多肽导向细胞区室或将其分泌至培养基的前导序列可^f皮添加至所陈述的核酸序列的编码序列，这些是本领域众所周知的；也参见所附实施例。所述前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装，并且优选地为能够指导被翻译的蛋白或其一部分分泌入周质间隙或细胞外培养基的前导序列。可选地，所述异源序列可编码包括赋予期望特性的N端识别肽的融合蛋白，其中所述特性包括例如^皮表达的重组产物的稳定或简化的纯化；见上文。关于这点，适合的表达载体在本领域是已知的，例如Okayama-BergcDNA表达载体pcDVl(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAl、pcDNA3(In-vitrogene)、pEF誦DHFR、pEF-ADA或pEF-neo(Mack等，PNAS(1995)92，7021-702541和Raum等，CancerImmunolImmunother(2001)50(3)，141-150)或pSPORTl(GIBCOBRL)。优选地，所述表达控制序列将会是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可使用原核宿主的控制序列。一旦载体被引入适当的宿主，所述宿主就;故维持在适合高水平表达所述核苷酸序列的条件下，并且根据需要可接着收集和纯化本发明多肽；参见例如所附实施例。一种可选的能用来表达细胞周期相互作用蛋白的表达系统，是一种昆虫系统。在一个这样的系统中，苜蓿银紋夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)被用作载体以在表皮球菌(S;wdoptera/rag/》eArfo)细胞或粉紋夜蛾(7卜zd20//w^)幼虫中表达外来基因。所陈述的核酸分子的编码序列可被克隆到所述病毒的非必需区域例如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制之下。所述编码序列的成功插入将使得所述多角体蛋白基因失活并产生缺少外壳蛋白的外壳的重组病毒。所述重组病毒然后被用来感染其中表达本发明蛋白的表皮球菌细胞或粉紋夜蛾幼虫(Smith,J.Virol.46(1983)，584;Engelhard,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91(1994),3224-3227)。另外的调节元件可包括转录以及翻译增强子。有利地，本发明上述载体包括可选择的(selectable)和/或可取得的(scorable)标志物。用于选择转化细胞以及例如植物组织和植物的可选择的标志物基因对本领域技术人员是众所周知的，而且包括例如作为下述选择基础的抗代谢物抗性赋予对氨甲蝶呤抗性的dhfr(Reiss,PlantPhysiol.(LifeSci.Adv.)13(1994)，143-149);赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素抗性的npt(Herrera-Estrella,EMBOJ.2(1983),987-995)以及赋予对潮霉素抗性的hygro(Marsh，Gene32(1984),481-485)。已描述另外的可选择的基因，即允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB;允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸的hisD(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988),8047);允许细胞利用甘露糖(WO94/20627)的甘露糖-6-磷酸异构酶和赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue,1987，于CurrentCommunicationsinMolecularBiology(现代分子生物学通讯)，ColdSpringHarborLaboratory编)或者赋予对杀稻痘素S抗性的来自土曲霉(Aspergillusterreus)的脱氨基酶(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995)，2336-2338)。有用的可取得的标志物也是本领域技术人员已知的，而且是商业上可取得的。有利地，所述标志物是编码荧光素酶(Giacomin，P1.Sci.116(1996)，59-72;Scikantha，丄Bact.178(1996)，121)、绿色荧光蛋白(Gerdes，FEBSLett.389(1996),44-47)或p-葡糖醛酸酶(Jefferson,EMBOJ.6(1987)，3901-3907)的基因。这个实施方案对于含有所述载体的细胞、组织和生物体的简单且快速筛选特别地有用。如上所述，所陈述的核酸分子可^f皮单独使用或作为载体的一部分以在细胞内表达本发明所述多肽，为了例如纯化也为了基因疗法的目的。含有编码本发明任何一个上述多肽的DNA序列的核酸分子或载体被引入细胞，结果所述细胞产生感兴趣的多肽。基于使用离体(ex-vivo)或体内(in-vivo)技术将治疗基因引入细胞的基因疗法，M因转移的最重要的应用之一。体外(in-vitro)或体内(in-vivo)基因疗法的适合的载体、方法或基因输送系统在文献中被描述，并且对于本领域技术人员是已知的；参见例如Giordano,NatureMedicine2(1996),534-539;Schaper，Circ.Res.79(1996),911-919;Anderson,Science256(1992),808-813;Verma，Nature389(1994)，239;Isner，Lancet348(1996),370-374;Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086;Onodera,Blood91(1998),30-36;Verma,GeneTher.5(1998),692-699;Nabel，Ann,N.Y.Acad.Sci.811(1997)，289-292;Verzeletti,Hum.GeneTher.9(1998),2243-51;Wang，NatureMedicine2(1996)，714-716;WO94/29469;WO97/00957，US5,580,859;US5,589,466;或Schaper,CurrentOpinioninBiotechnology7(1996)，635-640。可以为了直接引入或通过脂质体或病毒载体(例如腺病毒、反转录病毒)引入细胞而设计所陈述的核酸分子和载体。优选地，所述细胞是种系细胞、胚细胞或卵细胞或从其衍生出来的细胞，优选地所述细胞是千细胞。胚胎干细胞的例子可以尤其是如Nagy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)，8424-8428中所述的干细胞。本发明还提供了使用本发明所述载体转化或转染的宿主。所述宿主可进入所述宿主的基因组或^皮保持在染色体外。所述宿主可以是任何原核或真核细胞。术语"原核生物"意在包括所有细菌，其可以被DNA或RNA分子转化或转染以表达本发明所述蛋白质。原核宿主可包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、粘质沙雷氏杆菌(Serratiamarcescens)和枯草杆菌(Bacillussubtilis)。术语"真核生物的"意在包括酵母、高等植物、昆虫和优选地哺乳动物细胞。取决于在重组生产过程中所釆用的宿主，由本发明所述多聚核苷酸编码的蛋白可以是糖基化的或非糖基化的。特别优选的是使用含有本发明所述多肽的编码序列的质粒或病毒，并用遗传学手^向其中融合N端的FLAG标记和/或C端的His标记。优选地，所述FLAG标记的长度是约4至8个氨基酸，最优选地是8个氨基酸。使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术，上述多聚核苷酸可被用来转化或转染所述宿主。此外，制备融合的、被可操作地连接的基因并将它们表达在例如哺乳动物细胞和细菌中的方法是本领域众所周知的(上述引文中的Sambrook)。优选地，所述宿主是细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。特别设想，所陈述的宿主可以是哺乳动物细胞。特别优选的宿主细胞包括CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞系如SP2/0或NS/0。如所附实施例所说明，特别优选的是CHO细胞作为宿主。更优选地，所述宿主细胞是人类细胞或人类细胞系，例如per.c6(Kroos，Biotechnol.Prog.，2003，19:163-168)。在一个进一步的实施方案中，本发明因此涉及生产本发明所述多肽的过程，其中所述过程包括在允许本发明所述多肽表达的条件下培养本发明的宿主，以及从培养物中回收所生成的多肽。可将所述被转化的宿主接种在发酵罐中并根据本领域已知技术培养以达到最佳的细胞生长。然后可从生长培养基、细胞溶解产物或细胞膜成分中分离本发明多肽。例如微生物表达的本发明多肽的离析和纯化可通过任何常规方法例如制备色谱分离和免疫分离而进行，其中所述免疫分离例如包括使用被导向例如本发明多肽的标记的单克隆或多克隆抗体，或如所附实施例所述的那些。允许所述表达的培养宿主的条件在本领域已知取决于在此过程中所用的宿主系统和表达系统/载体。为了实现允许重组多肽的表达的条件而待修改的参数是本领域已知的。因此，适合的条件可由本领域技术人员确定，而不需要进一步的创造性努力。一旦表达，本发明多肽可根据本领域标准步骤被纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和层析柱、柱层析、凝胶电泳和类似手段；参见Scopes,"ProteinPurification",Springer-Verlag,N.Y.(1982)。对于药用来说，具有至少约90至95%的均一性的大致纯的多肽是优选的，而98至99%或更高的均一性是最优选的。一旦如所期望地被部分地纯化或纯化至均一，本发明多肽然后可被用作治疗(包括体外地)或开发和进行测定程序。此外，从培养物中回收本发明多肽的方法的例子在所附实施例中详细描述。此外，本发明提供了一种组合物，其包括本发明多肽或按上述公开的过程生产的多肽。优选地，所述组合物是一种药物组合物。根据本发明，术语"药物组合物"涉及施用给患者，优选地为人类患者的组合物。本发明特别优选的药物组合物包括被导向背景独立性的CD3表位并针对其生成的结合分子。优选地，所述药物组合物包括适合的载体、稳定剂和/或赋形剂的制剂。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包括用于肠胃外、透皮、管腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中的组合物。特别设想，所述组合物通过输注或注射施用于患者。适合的组合物的施用可以通过不同的方式实行，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。特别地，本发明提供对适合的组合物的不间断的施用。作为一个非限制性的例子，不间断的即连续的施用可通过小泵系统实现，其中所述小泵系统被戴在患者中以测量流入患者身体的45治疗剂。本发明所述包括被导向背景独立性的CD3表位并针对其生成的结合分子的所述药物组合物可使用所述泵系统施用。这样的泵系统在本领域一般是已知的，而且通常依靠于药筒的周期性交换，其中所述药筒含有待输注的治疗剂。当交换这种泵系统中的所述药筒时，会跟着发生进入患者身体的治疗剂流动的暂时中断，否则其流动就是连续的。在这种情况下，替换药筒之前的施用阶段和替换药筒之后的施用阶段仍将被认为是在本发明的药物治疗手段和方法的范围内，并且一起组成这种治疗剂的一个"不间断的施用"。本发明所述这些被导向背景独立性的CD3表位并针对其生成的结合分子的所述连续或不间断的施用可以是通过流体输送设备或小泵系统而静脉内或皮下施用的，其中所述流体输送设备或小泵系统包含一个用来将流体从容器中推出的流体推动装置和一个用来驱动所述推动装置的驱动装置。皮下施用所用的泵系统可包括用来穿透患者皮肤并将适合的组合物输送进患者身体的针头或插管。所述泵系统可被直接固定或连接在独立于静脉、动脉或血管的患者皮肤上，因而允许所述泵系统与患者皮肤之间直接接触。所述泵系统可以是小尺寸的并带有一个小容积的容器。作为一个非限制性的例子，待施用的适合药物组合物的容器的容积可以是在0.1和50ml之间。所述连续的施用可以是通过被戴在皮肤上并隔一段时间更换的贴片透皮进行。本领域技术人员知道适合此目的的输送药物的贴片系统。值得注意的是，透皮施用特别经受得起不间断的施用，因为第一个用尽的贴片的更换可以有利地在即将除去第一个用尽的贴片之前、例如在紧邻第一个用尽的贴片的皮肤表面上用一个新的第二个贴片替换来同时完成。流动中断和电池故障的问题没有发生。特别地包括被导向背景独立性的CD3表位并针对其生成的结合分子的本发明的组合物可还包括药学上可接受的载体。适合的药物载体的例子是本领域众所周知的，并包括溶液，例如磷酸盐緩沖盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各类湿润剂、无菌溶液、脂质体等。包括这些载体的组合物可按照众所周知的常规方法配制。制剂可包括碳水化合物、緩冲溶液、氨基酸和/或表面活性剂。碳水化合物可以是非还原糖，优选地为海藻糖、蔗糖、八硫酸酯(octasulfate)、山梨醇或木糖醇。这种制剂可用于静脉内或皮下连续施用，带有和/或不带有泵系统。氨基酸可以是带电的氨基酸，优选地为赖氨酸、醋酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸。表面活性剂可以是优选地具有>1.2KD的分子量的去污剂和/或优选地具有>3KD的分子量的聚醚。优选的去污剂的非限制性例子是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85。优选的聚醚的非限制性例子是PEG3000、PEG3350、PEG4000或PEG5000。本发明使用的緩冲系统可具有优选的5-9的pH，并可包括柠檬酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸和醋酸盐。本发明的组合物能以适合的剂量施用于受治疗者，其中所述剂量可通过例如剂量升级研究而被确定，其中所述剂量升级研究通过施用增加的剂量的、展现本文所迷对非黑猩猩灵长类例如猕猴的跨种特异性的本发明多肽。如上所述，展现本文所述跨种特异性的本发明多肽可以有利地以相同的形式被用于非黑猩猩灵长类的临床前测试以及用作人类的药物。这些组合物也可与其他蛋白质性质的和非蛋白质性质的药物结合施用。这些药物也可与包括本文所定义的本发明多肽的组合物同时或以及时确定的间隔和剂量在施用所迷多肽前或后分别施用。剂量方案将根据主治医师和临床因素而确定。如医疗领域众所周知的，对任何一个患者的剂量取决于很多因素，包括患者的尺寸、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康和同时施用的其他药物。肠胃外施用的准备工作包括无菌的水或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和注射用有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和緩冲介质。肠胃外的媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或非挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)及其类似物。防腐剂和其他添加剂也可存在，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体及其类似物。此外，本发明的组合物可包括蛋白质性质的载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，其优选地为人类来源。设想，本发明所述组合物除了本文所定义的本发明所述多肽之外，可还包括生物活性剂，这取决于所述组合物的预期用途。这种剂可以是作用在胃肠系统的药物、用作细胞抑制剂的药物、防止高尿酸血症(hyperurikemia)的药物、抑制免疫反应的药物(如皮质类固醇)、调节炎症反应的药物、作用在循环系统的药物和/或本领域已知的例如细胞因子的剂。本文所定义的药物组合物的生物活性可例如通过如下实施例和WO99/54440中或Schlereth等(CancerImmunol.Immunother.20(2005)，1-12)所述的细胞毒性测定而确定。本文所用"效力"或"体内效力，，指的是对本发明所述药物组合物治疗的响应，其使用例如标准化的NCI响应标准。使用本发明药物组合物的疗法的成功或体内效力指的是所述组合物对它想要的目的的有效性，即所述组合物导致它期望的作用即清除病理性细胞例如肿瘤细胞的能力。体内效力可由针对各自疾病实体确立的标准方法监测，其中所述方法包括但不限于白细胞计数、微分(differentials)、荧光激活细胞分选术、骨髓穿刺。另外，可以使用各种疾病特异性的临床化学参数和其他确立的标准方法。此外，可以使用计算机辅助的局部成像、X-射线、核磁共振局部成像(例如基于国立癌症研究所(NCI)标准的响应评估[ChesonBD,HorningSJ，Coi伍erB,ShippMA，FisherRI,Connors濕，ListerTA,VoseJ，Grillo-LopezA，HagenbeekA,CabanillasF,KlippenstenD，HiddemannW，CastellinoR，HarrisNL，ArmitageJO，CarterW，HoppeR，CanellosGP.Reportofaninternationalworkshoptostandardizeresponsecriteriafornon-Hodgkin，slymphomas(标准化非霍奇金淋巴瘤响应标准的国际研讨会报告)。NCI发起的国际研讨会。JClinOncol.1999Apr;17(4):1244])、正电子发射局部成像扫描、白细胞计数、微分(differentials)、荧光激活细胞分选术、骨髓穿刺、淋巴结活组织检验/组织学和各种淋巴瘤特异性的临床化学参数(例如乳酸脱氩酶)和其他确立的标准方法。开发例如本发明所述药物组合物的药物的另一个主要挑战是药物代谢动力学性质的可预测的调节。为此，建立所述候选药物的药物代谢动力学概况，即实现特定药物治疗给定病状的能力的药物代谢动力学参数的概况。影响药物治疗特定疾病实体的能力的药物的药物代谢动力学参数包括但不限于半衰期、分布容积、肝脏首过代谢和血清结合度。给定药剂的效力可被上述参数的每一个影响。"半衰期，，指的是50%的被施用药物通过生物学过程例如代谢、排泄等被消除所用的时间。"肝脏首过代谢"指的是药物在第一次与肝脏接触的时候即在它第一次通过肝脏的过程中被代谢的倾向。"分布容积"指的是药物在全身各个区室例如细胞内和细胞外间隙、组织和器官等的保留度，以及所述药物在这些区室中的分布。"血清结合度，，指的是药物与血清蛋白质例如白蛋白相互作用和结合的倾向，导致所述药物生物活性的减少或丧失。药物代谢动力学参数还包括给定量的所施用药物的生物利用率、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收率、更多起效(moreonset)和/或Cmax。"生物利用率"指的是血液区室中的药物量。"滞后时间，，指的是在所述药物的施用和它在血液和血浆中裙L检测和测量到之间的时间延迟。"Tmax，，是所述药物达到最大血液浓度的时间，而"Cmax"是给定药物所能得到的最大血液浓度。达到所述药物的生物效应所必需的血液或组织浓度的时间受所有参数影响。例如Schlereth等(CancerImmunol.Immunother.20(2005)，1-12)的出版物也陈述了双特异性单链抗体即本发明所述展现了跨种特异性的多肽的一个优选的实施方案的药物代谢动力学参数，其可以在如上所列的非黑猩猩灵长类中进行的临床前动物测试中-波确定。本文所用术语"毒性"指的是药物显露在不良事件或严重的不良事件中的毒性作用。这些副作用可以指施用后药物的全身耐受性的缺乏和/或局部耐受性的缺乏。毒性还可包括药物导致的引起畸形或致癌的作用。本文所用术语"安全性"、"体内安全性"或"耐受性"定义了在所述药物的施用后立刻(局部耐受性)和长期应用中不诱发严重不良事件的药物施用。"安全性"、"体内安全性"或"耐受性"可在例如治疗和随访期中定期评估。测量包括临床评估例如器官表现，以及实验室异常的筛查。临床评估可以被实施并偏向于根据NCI-CTC和/或MedDRA标准记录的/编码的正常发现。器官表现可包括例如不良事件通用术语标准v3.049(CTCAE)中所列的标准，例如过敏反应/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝结及类似物。可被测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝结概况和尿液分析和其他体液如血清、血浆、淋巴或脊髓液、液体及类似物的检查。安全性可因此被评价，例如通过身体检查、成像技术(即超声波、X-射线、CT扫描、磁共振成像(MRI))、使用技术设备(即心电图)的其他测量、生命特征、通过测量实验室参数和记录不良事件。例如，在根据本发明所述的用途和方法中的非黑猩猩灵长类的不良事件可通过组织病理学和/或组织化学的方法械j企查。本文所用术语"有效的和无毒的剂量，，指的是本文所定义的双特异性单链抗体的可耐受剂量，所述剂量足够高以导致病理性细胞的清除、肿瘤的消灭、肿瘤的收縮或疾病的稳定，而不会或基本不会导致主要的毒性作用。这种有效的和无毒的剂量可以通过例如本领域所述剂量升级研究而确定，并应该低于诱导严重不良副作用(剂量限制性毒性，DLT)的剂量。上述术i吾在侈'j々口Preclinicalsafetyevaluationofbiotechnology-derivedpharmaceuticalsS6(生物技术衍生药物制剂的临床前安全性评估S6);ICHHarmonisedTripartiteGuideline(ICH协调的三方准则);1997年7月16日的ICHSteeringCommitteemeeting(ICH指导委员会会议)中也被提及。此外，本发明涉及包括本发明多肽的药物组合物(即包括能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的至少一个结合域的多肽，其中所述表位是一种氨基酸序列的一部分，其中所述氨基酸序列被包括在由根据本发明所述的SEQIDNO.2、4、6或8组成的组中或者按照根据本发明所述的步骤被生成)用来预防、治疗或改善选自增生性疾病、肿瘤性疾病或免疫性病症的疾病。优选地，所述药物组合物还包括适合的载体、稳定剂和/或U武形剂配方。本发明进一步的一个方面涉及上文所定义的或根据上文所定义的过程生成的多肽制备用于预防、治疗或改善疾病的药物组合物的用途。优选地，所述疾病是增生性疾病、肿瘤性疾病或免疫性病症。进一步优选的是，所述肿瘤性疾病是恶性疾病，其优选地为癌症。在另一个优选的使用本发明所述多肽的实施方案中，所述药物组合物适合与其他药物联合施用，即作为综合疗法的一部分。在所述综合疗法中，一种活性剂可以被选择性地包含在与本发明所述多肽相同的药物组合物中，或可以被包含在分开的药物组合物中。在后面的这种情况下，所述分开的药物组合物适合于在施用包括本发明所述多肽的所述药物组合物之前、同时或之后施用。所述添加的药物或药物组合物可以是非蛋白质性质的化合物或蛋白质性质的化合物。在所述添加的药物是蛋白质性质的化合物的情况下，有利的是，所述蛋白质性质的化合物能够为免疫效应细胞提供活化信号。优选地，可同时或不同时施用所述蛋白质性质的化合物或非蛋白质性质的化合物，与本发明所述多肽、在上文所定义的核酸分子、在上文所定义的载体或在上文所定义的宿主。本发明的另一个方面涉及一种方法，用来预防、治疗或改善有此需要的受治疗者的疾病，其中所述方法包括施用有效量的本发明所述药物组合物的步骤。优选地，所述疾病是增生性疾病、胂瘤性疾病或免疫性病症。更优选地，所述肿瘤性疾病是恶性疾病，其优选地为癌症。在本发明所述方法的另一个优选的实施方案中，所述药物组合物适合与其他药物联合施用，即作为综合疗法的一部分。在所述综合疗法中，一种活性剂可以被选择性地包含在与本发明所述多肽相同的药物组合物中，或可以被包含在分开的药物组合物中。在后面的这种情况下，所述分开的药物组合物适合于在施用包括本发明所述多肽的所述药物组合物之前、同时或之后施用。所述添加的药物或药物组合物可以是非蛋白质性质的化合物或蛋白质性质的化合物。在所述添加的药物是蛋白质性质的化合物的情况下，有利的是，所述蛋白质性质的化合物能够为免疫效应细胞提供活化信号。优选地，可同时或不同时施用所述蛋白质性质的化合物或非蛋白质性质的化合物，与本发明所述多肽、在上文所定义的核酸分子、在上文所定义的载体或在上文所定义的宿主。优选地，对于本发明上述方法，所述受治疗者是人。在进一步的一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括本发明的多肽、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主。本发明进一步4皮表征为如下列表中的各项项1.一种鉴定多肽的方法，其中所述多肽包括能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s(CD3s)的表位的跨种特异性的结合域，所述方法包括如下步骤(a)将所述多肽与含有最多27个氨基酸的CD3e细胞外域的N端片段接触，其中所述N端片段包括氨基酸序列Gln-Asp墨Gly-Asn-Glu-Glu誦Met-Gly(SEQTDNO.381)或Gln-Asp誦Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-GIy(SEQIDNO.382)，并通过它的C端固定在固相；(b)从所述片段洗脱被结合的多肽；以及(c)从(b)的洗脱物分离所述多肽。优选地，由本发明上述方法鉴定的多肽是人类来源的。本"鉴定多肽的方法"被理解为从多个候选多肽分离对CD3s细胞外域片段具有相同特异性的一个或多个不同多肽的方法以及从溶液中纯化多肽的方法，其中所述片段在它的N端包括氨基酸序列Gln國Asp國Gly隱Asn國Glu-Glu誦Met-Gly(SEQTDNO.381)或Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu隱Ile-Gly(SEQIDNO.382)。分离对CD3s细胞外域片段具有相同特异性的一个或多个不同多肽的方法的非限制性的实施方案包括选择抗原特异性的结合实体的方法，例如通常用于杂交瘤筛选的、用于篩选瞬时/稳定地转染的真核宿主细胞克隆的或用在噬菌体展示方法中的淘选方法。从溶液中纯化多肽的后面的方法的一个非限制性的例子是例如从培养物上清液或这种培养物的预处理液纯化重组表达的多肽。如上所述，本发明所述方法中所用的片段是所述灵长类CD3s分子的细胞外域的N端片段。不同灵长类CD3s分子的细胞外域的氨基酸序列在SEQIDNO:1、3、5和7中净皮描述。所述N端八聚体的两种形式在SEQIDNO:381和382中^皮描述。优选地，此N端对将用本发明所述方法鉴定的多肽的结合是自由地可用的。术语"自由地可用的"在本发明的背景中被理解为没有附加动机(motives)例如His标记。这种His标记对本发明所述方法鉴定的结合分子的千扰在所附实施例6中被描述。根据本发明所述方法，所述片段通过它的C端被固定在固相。本领域技术人员将容易地且不需任何创造性努力地按照所用的本发明所述方法的实施方案选择一个适合的固相支持体。固相支持体的例子包括但不限于基质例如珠子(例如，琼脂糖珠子、琼脂糖凝胶珠子、聚苯乙烯珠子、葡聚糖珠子)、平板(培养平板或MultiWell板)以及已知的例如来自Biacore决于所述固相支持体的选择。固定/固定化常用的方法是通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯偶合。这种偶合背后的化学原理以及固定/固定化可选择的方法是本领域技术人员已知的，例如来自Hermanson,"BioconjugateTechniques",AcademicPress,Inc.(1996)。为了固定/固定化在色谱支持体上，下述手段通常被用到NHS激活的琼脂糖凝胶(例如通用电气生命科学-Amersham的HiTr叩-NHS)、CnBr激活的琼脂糖凝胶(例如通用电气生命科学-Amersham)、NHS激活的葡聚糖珠子(Sigma)或激活的聚曱基丙烯酸酯。这些试剂也可用于批处理方式。此外，包括氧化铁的葡聚糖珠子(例如从Miltenyi可获得)可用于批处理方式。这些珠子可以和用于将所述珠子从溶液分离的磁体联合使用。多肽可通过使用NHS激活的羧曱基葡聚糖(carboxymethyldextran)被固定在Biacore芯片(例如CM5芯片)上。适当的固相支持体的进一步的例子是胺反应性的MultiWell板(例如NuncImmobilizer板)。根据本发明所述方法，所述CD3s细胞外域的片段可被直接地或通过一段氨基酸偶合在固相支持体上，其中所述一段氨基酸可以是连接体或另一个蛋白质/多肽部分。可选地，所述CD3s细胞外域可通过一个或多个衔接分子被间接偶合。洗脱结合到固定化表位的多肽的手段和方法是本领域众所周知的。对于从洗脱物分离所鉴定的多肽的方法也是一样。与本发明一致，从多个候选多肽分离对在它的N端包括氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly的CD3s细胞外域片段具有相同特异性的一个或多个不同多肽的方法可包括选择抗原特异性实体的下述方法的一个或多个步骤CD3s特异性结合分子可选自抗体衍生的所有组成成分。噬菌体展示文库可基于标准程序构建，例如在"PhageDisplay:ALaboratoryManual"(《噬菌体展示实验室手册》)；编辑Barbas，Burton,Scott&Silverman;ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001中所公开的。在抗体库中的抗体片段的形式可以是scFv,但通常还可以是一个Fab片段或甚至是单域抗体片段。对于抗体片段的分离，可以使用原初抗体片段库。为了在之后的治疗用途中选择潜在的低免疫原性结合实体，人类抗体片段库有利于直接选择人类抗体片段。在一些情况下，它们可形成合成抗体库的基础(Knappik等，JMol.Biol.2000，296:57ff)。相应的形式可以是Fab、scFv(如下所述)或域抗体(dAb，如Holt等，TrendsBiotechnol.2003，21:484ff中所综述的)。本领域已知，在许多情况下，不存在针对靶抗原的可用的免疫人抗体源。因此，使用靶抗原来为动物免疫并从动物组织例如脾脏或PBMC分离的相应的抗体库。所述N端片段可被生物素酰化(biotinylated)或共价连接到蛋白质如KLH或牛血清白蛋白(BSA)。根据通常的方法，啮齿动物被用于免疫。非人类来源的一些免疫抗体的所有组成成分可因为其他原因而特别有利，其中所述原因例如衍生自骆驼种的单域抗体(VHH)的存在(如Muyldermans，JBiotechnol.74:277;DeGenst等,DevComoImmunol.2006，30:187ff中所述)。因此，所述抗体库的对应形式可以是Fab、scFv(如下所述)或单域抗体(VHH)。在一个可能的方法中，来自balb/cxC57black杂交的十周大的Fl小鼠可被例如表达跨膜EpCAM的完整细胞免疫，其中所述EpCAM以翻译融合的方式在N端显示成熟CD3e链的N端氨基酸1至27。可选地，小鼠可被1-27CD3e-Fc融合蛋白免疫(相应的方法在所附实施例2中被描述)。在加强免疫后，可以取血样并在例如FACS分析中测定针对所述CD3阳性T细胞的抗体血清滴定度。通常地，纟皮免疫的动物的血清滴定度显著54地高于未^皮免疫的动物。被免疫的动物可形成构建免疫抗体库的基础。这种库的例子包括噬菌体展示文库。这种库通常可基于标准程序构建，例如"PhageDisplay:ALaboratoryManual";编辑Barbas，Burton,Scott&Silverman;ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001中所公开的。由于生成更多种多样的抗体库，所述非人类抗体也可通过噬菌体展示而被人源化，其中所述抗体库可接下来在选择中被结合剂富集。在噬菌体展示方法中，显示抗体库的噬菌体库中任何一个形成选择结合实体的基础，其使用相应抗原作为靶分子。分离抗原特异性的抗原结合噬菌体的核心步骤被称作淘选。由于抗体片段在噬菌体表面的展示，这种一般的方法被叫做噬菌体展示。一个优选的选择方法是使用例如丝状噬菌体N2域的小蛋白，其翻译地融合到所述噬菌体展示的scFv的N端。另一个本领域已知的展示方法是核糖体展示方法，其可被用来分离结合实体(在Groves&Osbourn，ExpertOpinBiolTher.2005，5:125ff;Lipovsek&Pluckthun，JImmunolMethods2004，2卯52ff所综述)。为了证明scFv噬菌体颗粒对1-27CD3s-Fc融合蛋白的结合，载有被克隆的scFv所有组成成分的噬菌体文库可由PEG(聚乙二醇)从相应的培养物上清液中收集。scFv噬菌体颗粒可用固定化的CD3sFc融合蛋白孵化。所述固定化的CD3eFc融合蛋白可被涂布在固相上。结合实体可被洗脱，而洗脱物可纟皮用来感染新鲜的未^皮感染的细菌宿主。成功地被编码人类scFv片段的噬菌粒拷贝转导的细菌宿主可再次进行羧千青霉素抗性选择，并接着被例如VCMS13辅助噬菌体感染而开始第二轮抗体展示和体外选择。通常总共进行4至5轮选择。分离的结合实体的结合可使用流式细胞测定在载有融合到表面展示的EpCAM的N端CD3e序列的CD3s阳性Jurkat细胞、HPBall细胞、PBMC或纟皮转染的真核细胞上测试(参见所附实施例4)。项2.项1中所述方法，其中所述多肽包括被鉴定的结合域，其作为能够结合细胞表面抗原的第一结合域和第二结合域。为了生成由本发明所述方法所鉴定的多肽(如本文所述双特异性单链抗体)的第二结合域，可以使用结合到人类和非黑猩猩灵长类二者相应的细胞表面抗原的单克隆抗体。本文所定义的双特异性多肽的适当的结合域例如可通过本领域所述重组方法衍生自跨种特异性的单克隆抗体。可用上述FACS测定来测试结合到人类细胞表面抗原和所述细胞表面抗原在非黑猩猩灵长类中的同系物的单克隆抗体。文献中所述杂交瘤技术(Milstein和KOhler，Nature256(1975),495-7)也可被用来生成跨种特异性的抗体。例如，小鼠可被人类和非黑猩猩灵长类CD33交替免疫。从这些小鼠，产生跨种特异性的抗体的杂交瘤细胞可通过杂交瘤技术被分离，并被上述FACS分析。本文所述展现跨种特异性的双特异性多肽例如双特异性单链抗体被显示在下述实施例中。展现跨种特异性的双特异性单链抗体的优点包括如下列举的要点。项3.项2中所述方法，其中所述第二结合域结合到人类和/或非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原。项4.项1至3中任一项所述方法，其中所述第一结合域是抗体。项5.项4中所述方法，其中所述抗体是单链抗体。项6.项2至5中任一项所述方法，其中所述第二结合域是抗体。项7.项1至6中任一项所述方法，其中所述CD3s细胞外域的片段由具有SEQIDNO.2、4、6或8中所述任一个氨基酸序列的多肽的一个或多个片段组成。项8.项7中所述方法，其中所述片段长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27个氨基酸残基。项9.项1至8中任一项所述方法，其中所述鉴定方法是筛选多个多肽的方法，其中所述多肽包括能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s的表位的跨种特异性的结合域。项10.项1至8中任一项所述方法，其中所述鉴定方法是纯化/分离多肽的方法，其中所述多肽包括能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s的表位的跨种特异性的结合域。项11.最多27个M酸的CD3s细胞外域的N端片段产生跨种特异性的结合域的用途，其中所述片段包括所述氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn誦Glu隱Glu匿Met-Gly(SEQIDNO.381)或Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly(SEQIDNO.382)。按照本发明所述用途，优选地，所产生的跨种特异性的结合域是人类来源的。项12.根据项11中所述的用途，其中所述跨种特异性的结合域是抗体。项13.根据项12中所述的用途，其中所述抗体是单链抗体。项14.根据项12至13中所述的用途，其中所述抗体是双特异性抗体。这些和其他实施方案通过本发明的描述和实施例而祐:公开和包括。免疫学中的重组技术和方法在例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,第3版2001;Lefkovits，ImmunologyMethodsManual,TheComprehensiveSourcebookofTechniques(免疫学方法手册，综合技术参考资料),AcademicPress,1997;Golemis，Protein-ProteinInteractions:AMolecularCloningManual(蛋白质-蛋白质相互作用分子克隆手册)，ColdSpringLaboratoryPress,2002中被描述。关于根据本发明所使用的抗体、方法、用途和化合物中任一个的进一步的文献可从公共图书馆和数据库使用例如电子设备检索。例如，在互联网上可获得的公共数据库"Medline"可以^皮4吏用，例iD在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。<列"i(口http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/或歹'J在EMBLl良务主页http:〃www.embl.de/services/index.html的进一步的数据库和网址是本领域才支术人员已知的，并也可4吏用例如http:〃www.google.com而获得。附图显示图1灵长类CD3s的N端氣基酸l-27与异源可溶蛋白的融合。图2此图显示在瞬时转染的293细胞上清液中检测由融合到的人类IgGl的铰链和Fcy部分的成熟人CD3s链的N端氨基酸l-27和C端6组氨酸标记组成的构建体的存在的ELISA测定中测量的四个重复样品的平均吸收值。标注"27aahuCD3E"的第一个柱显示所述构建体的平均吸收值，标注"无关SN"的第二个柱显示被作为阴性对照的无关构建体转染的293细胞上清液的平均值。所述构建体获得的值与阴性对照获得的值的比较清晰地证明了重组构建体的存在。图3此图显示在检测以在细胞周质表达的单链抗体的粗制品形式存在的跨种特异性的抗CD3结合分子与构建体的结合的ELISA测定中测量的四个重复样品的平均吸收值，其中所述构建体包括融合到人类IgGl的铰链和Fcy部分的成熟人cd3e链的n端"27氨JJ臾和c端6组氨酸标记。柱从左到右显示称为A2JHLP、T2CHLPE2MHLP、F70HLP、G4HHLP、H2CHLP、E1LHLP、F12QHLP、F6AHLP和HIEHLP的特异性的平均吸收值。标注"阴性对照，，的最右边的柱显示作为阴性对照的鼠抗人CD3抗体的单链制品的平均吸收值。所述抗CD3特异性所获得的值与阴性对照所获得的值的比较清晰地证明了抗CD3特异性与成熟人CD3e链的N端l-27氨基酸的强结合。图4灵长类CD3s的N端氨基酸1-27与异源的膜结合蛋白的融合。图5检测重组跨膜融合蛋白的存在的FACS测定中被测试的不同转染子的直方重叠图，其中所述重组跨膜融合蛋白由食蟹猴EpCAM和人类、狨猴、绢毛猴、松鼠猴和家猪各自的CD3s链的N端1-27氩基酸组成。从左至右和从上至下的直方重叠图分别显示表达包括人类27mer、狨猴27mer、绢毛猴27mer、松鼠猴27mer和猪27mer的构建体的转染子的结果。在单个重叠图上，细线代表用含有2%的FCS而非抗FlagM2抗体的PBS卯孚化的样品作为阴性对照，而粗线显示用抗FlagM2抗体孵化的样品。对于每种构建体，所述直方重叠图显示抗FlagM2抗体对转染子的结合，其清楚地证明所述重组构建体在转染子上的表达。图6检测以在细胞周质表达的单链抗体的粗制品形式存在的跨种特异性抗CD3结合分子与分别融合到食蟹猴EpCAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3e链N端氨基酸1-27结合的FACS测定中被测试的不同转染子的直方重叠图。图6A:从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括人类27mer的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP和G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。图6B:从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括狨猴27mer的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP和G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。图6C:从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括绢毛猴27mer的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP和G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。图6D:从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括松鼠猴27mer的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP和G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。图6E:从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括猪27mer的1-2759CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2CHLP、F12QHLP、E2MHLP和G4HHLP的CD3特异性结合分子测试。在单个重叠图上，细线代表用鼠抗人CD3抗体的单链制品孵化的样品作为阴性对照，而粗线显示用所示相应的抗CD3结合分子孵化的样品。考虑到对猪27mer转染子的结合的缺乏和显示在图5中的构建体的表达水平，直方图的重叠图显示被测试的完全跨种特异性的人类双特异性单链抗体的抗CD3特异性对表达包括分别融合到食蟹猴EpCAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3e链N端氨基酸1-27的重组跨膜融合蛋白的细胞的特异性强结合，并因此显示所述抗CD3结合分子的多灵长类跨种特异性。图7在被转染的鼠EL4T细胞上检测人CD3s的FACS测定。图像分析显示直方图的重叠图。粗线显示用抗人CD3抗体UCHT-1孵化的被转染细胞。细线代表用小鼠IgGl同种型对照孵化的细胞。抗CD3抗体UCHT1的结合清楚地显示人CD3s链在被转染的鼠EL4T细胞的细胞表面的表达。图8在丙氨酸扫描实验中跨种特异性的抗CD3抗体与丙氨酸突变体的结合。在单独的图中，柱从左到右显示以对数刻度任意单位的野生型转染子(WT)和位置1至27的所有丙氨酸突变体的计算结合值。所述结合值用下式计算样品(x,力-阴性对照(JC)_样品<直0，力=-(f/C//T-1W-阴性对照(f阴性对照—)—t/C/fT—1(w/)—阴性对照(wO在这个方程式中，"样品值"指的是任意单位的结合值，其描述特定的抗CD3抗体与如图所示特定的丙氨酸突变体的结合程度，"样品"指的是在特定的丙氨酸扫描转染子上测定的特定的抗CD3抗体所获得的几何平均荧光值，"阴性对照，，指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的阴性对照所获得的几何平均荧光值，UCHT-1指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的UCHT-1抗体所获得的几何平均荧光值，WT指的是在野生型转染子上测定的特异性的抗CD3抗体所获得的几何平均荧光值，x表示相应的转染子，y表示相应的抗CD3抗体并且wt表示相应的转染子是野生型。单独的丙氨酸突变位置用野生型氨基酸的单字母代码和该位置的数字标注。图8A:此图显示跨种特异性的抗CD3抗体A2JHLP作为嵌合IgG分子被表达的结果。在位置4(天冬酰胺)、位置23(苏氨酸)和位置25(异亮氨酸)突变成丙氨酸后观察到降低的结合活性。在位置l(谷氨酰胺)、位置2(天冬氨酸)、位置3(甘氨酸)和位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸后观察到结合的完全丧失。图8B:此图显示跨种特异性的抗CD3抗体E2MHLP作为嵌合IgG分子^皮表达的结果。在位置4(天冬酰胺)、位置23(苏氨酸)和位置25(异亮氨酸)突变成丙氨酸后观察到降低的结合活性。在位置l(谷氨酰胺)、位置2(天冬氨酸)、位置3(甘氨酸)和位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸后观察到结合的完全丧失。图8C:此图显示跨种特异性的抗CD3抗体H2CHLP作为嵌合IgG分子被表达的结果。在位置4(天冬酰胺)突变成丙氨酸后观察到降低的结合活性。在位置1(谷氨酰胺)、位置2(天冬氨酸)、位置3(甘氨酸)和位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸谷氨酰胺后观察到结合的完全丧失。图8D:显示跨种特异性的抗CD3抗体F12QHLP作为在细胞周质被表达的单链抗体被测试的结果。在位置l(谷氨酰胺)、位置2(天冬氨酸)、位置3(甘氨酸)和位置5(谷氨酸)突变成丙氨酸后观察到结合的完全丧失。图9检测跨种特异性的抗CD3结合分子H2CHLP与带有和不带有N端His6标记的人CD3结合的FACS测定。绘制了被野生型人CD3s链(左侧直方图)或带有N端His6标记的人CD3s链(右侧直方图)转染的EL4细胞系在检测跨种特异性的结合分子H2CHLP的FACS测定中^f皮测试的直方重叠图。使用作为阴性对照的适当的同种型对照(细线)、作为阳性对照的抗人CD3抗体UCHT-1(虚线)和嵌合IgG分子形式的跨种特异性抗CD3抗体H2CHLP(粗线)孵化样品。直方重叠图显示UCHT-1抗体对两个转染子的结合与同种型对照相当，证明了两个重组构建体的表达。直方重叠图还显示抗CD3结合分子H2CHLP只结合野生型人CD3￡链但不结合His6-人CD3s链。这些结果证明游离的N端对于跨种特异性的抗CD3结合分子H2CHLP的结合是必要的。图10人CD3阳性PBMC上的EGFR-21-63LHxH2C的饱和结合，其通过FACS分析来确定细胞上CD3结合的KD值。按照实施例7中所述进行所述测定。图11标明的跨种特异性的双特异性单链构建体对被人EGFR转染的CHO细胞、人CD3+T细胞系HPB-ALL、被食蟹猴EGFR转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例12中所述进行。粗线代表使用2pg/ml纯化的蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着被抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。图12由被重新送入所指的靶细胞系的标明的跨种特异性的EGFR特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)和B)被激发的CD4VCD56-人PBMC被用作效应细胞，被人EGFR转染的CHO细胞被用作靶细胞。按照实施例13中所述进行所述测定。62图13由被重新送入所指的靶细胞系的标明的跨种特异性的EGFR特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)和B)猕猴T细胞系4119LnPx被用作效应细胞，被食蟹猴EGFR转染的CHO细胞被用作靶细胞。按照实施例13中所述进行所述测定。图14标明的跨种特异性的双特异性单链构建体对被人MCSPD3转染的CHO细胞、人CD3+T细胞系HPB-ALL、被食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例17中所述进行。粗线代表使用2ng/ml纯化的蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着被抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。图15标明的跨种特异性的双特异性单链构建体对被人MCSPD3转染的CHO细胞、人CD3+T细胞系HPB-ALL、被食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例17中所述进行。粗线代表使用2pg/ml纯化的蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着被抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。图16标明的跨种特异性的双特异性单链构建体对被人MCSPD3转染的CHO细胞、人CD3+T细胞系HPB-ALL、被食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例17中所述进行。粗线代表使用2ng/ml纯化的单体蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着被抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。图17由被重新送入所指的靶细胞系的标明的跨种特异性的MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)被激发的CD47CD56-人PBMC被用作效应细胞，被人MCSPD3转染的CHO细胞被用作靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx被用作效应细胞，被食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞被用作靶细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。图18由被重新送入所指的靶细胞系的标明的跨种特异性的MCSP特异性单链构建体诸导的细胞毒性活性。A)和B)猕猴T细胞系4119LnPx被用作效应细胞，被食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞被用作靶细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。图19由被重新送入所指的靶细胞系的标明的跨种特异性的MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)和B)被激发的CD4VCD56-人PBMC被用作效应细胞，被人MCSPD3转染的CHO细胞被用作乾细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。图20由被重新送入所指的靶细胞系的标明的跨种特异性的MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)被激发的CD4VCD56-人PBMC被用作效应细胞，被人MCSPD3转染的CHO细胞i皮用作靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx被用作效应细胞，被食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞被用作靶细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。图21由被重新送入所指的靶细胞系的标明的跨种特异性的MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)被激发的CD4-ZCD56-人PBMC被用作效应细胞，被人MCSPD3转染的CHO细胞纟皮用作靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx被用作效应细胞，被食蟹猴MCSPD3转染的CHO细胞被用作耙细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。图22通过标明的单链构建体样品诱导的细胞毒性活性测量检测的MCSP和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体的血浆稳定性，所述样品使用50%的人血浆分别在37。C和4。C孵化24小时，或在细胞毒性测试之前即刻加入50%的人血浆，或者不加入血浆。被人MCSP转染的CHO细胞被用作靶细胞系，而被激发的CD4-/CD56-人PBMC被用作效应细胞。按照实施例19中所述进行所述测定。图23标明的跨种特异性的双特异性单链构建体对被人HER2转染的CHO细胞、人CD3+T细胞系HPB-ALL、被猕猴HER2转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx相应的FACS结合分析。FACS染色按照实施例23.4中所述进行。粗线代表使用2pg/ml纯化的双特异性单链构建体孵化的细胞。细线表示阴性对照。含有2%FCS的PBS被用作阴性对照。对每个跨种特异性的双特异性单链构建体，所述直方图的重叠图显示所述构建体对人和猕猴HER2以及人和猕猴CD3的特异性结合。图24所述图显示测量由被重新送入所指的靶细胞系的标明的跨种特异性的HER2特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性的铬释放测定的结果。效应细胞也按照所指使用。按照实施例23.5中所述进行所述测定。对于每个被显示的构建体，所述图清楚地证明分别针对被人和猕猴HER2转染的CHO细胞的人和猕猴效应细胞的毒性活性的有力征用。图25含有Flag标记的所选克隆的scFv蛋白片段的周质制品的CD3特异性ELISA分析。可溶性scFv蛋白片段的周质制品被加入ELISA板的孔内，其中所述孔已被可溶性人CD3￡(氨基酸1-27)-Fc融合蛋白所涂布，并且又被含3%BSA的PBS封闭。通过单克隆抗Flag-生物素标记的抗体，然后通过过氧化物酶结合的链霉抗生物素蛋白进行检测。使用ABTS底物溶液将ELISA显影。使用ELISA读数器在405nm测量OD值(y轴)。克隆的名称显示在x轴。图26含有Flag标记的所选克隆的scFv蛋白片段的周质制品的ELISA分析。与图25中相同的可溶性scFv蛋白片段的周质制品被加入ELISA板的孔内，其中所述孔未被人CD3￡(氨基酸1-27)-Fc融合蛋白而是被hulgGl(Sigma)所涂布，并且被含3%BSA的PBS封闭。通过单克隆抗Flag-生物素标记的抗体，然后通过过氧化物酶结合的链霉抗生物素蛋白进行检测。使用ABTS底物溶液将ELISA显影。使用ELISA读数器在405nm测量OD值(y轴)。克隆的名称显示在x轴。另外，本发明通过下面说明性的非限制性实施例被描述，其中所述实施例提供对于本发明及其诸多优点的更好的理解。实施例1.从非人灵长类的血液样品中获得的CD3s序列的鉴定下列非人灵长类的血样被用来鉴定CD3￡:普通狨猴(Ca//^njcyacc/zitf)、绒顶格柳猴(Sagw/'/ms'oe却ws)和松鼠猴("w厂a^)。按照制造者的实验方案制备用新鲜肝素处理的全血样以分离总细胞RNA(QIAampRNABloodMiniKit,Qiagen)。根据发表的实验方案，提取的mRNA被转录成cDNA。简言之，用1.2pl的10x六核苷酸混合物(Roche)在7(TC下将10pi沉淀的RNA孵化10分钟并储存在水上。加入由4^的5xSuperScriptII緩冲液、0.2pi的0.1M二硫苏糖醇、0.8pi的SuperscriptII(Invitrogen)、1.2^的脱氧核糖核苷三磷酸(25pM)、0.8^的RNA酶抑制剂(Roche)和1.8pi的无DNA酶和RNA酶的水(Roth)组成的反应混合物。所述反应混合物在室温下孵化10分钟，接着在42。C下孵化50分钟并在90。C下孵化5分钟。在水上将反应冷却，然后加入0.8的RNA酶H(1U4tl，Roche)并在37。C下孵化20分钟。来自各个物种的第一链cDNA经过了分开的35个循环的聚合酶链式反应，其使用TaqDNA聚合酶(Sigma)和根据数据库研究而设计的如下引物组合正向引物5'-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3'(SEQIDNO:377);反向引物5'-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3'(SEQIDNO:378)。被扩增的550bp的条带被凝胶纯化(凝胶纯化试剂盒,Qiagen)并测序(Sequiserve,Vaterstetten/德国，见序列表)。CD3s普通狨猴(G3〃"/r/jc/Qfcc/ms)核苷酸CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATAATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGAGGTGGAT氨基酸EVDCD3s绒顶楂杉卩猴(Sa砂/"ws6>W,)核苷酸CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATAATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT氨基酸EVDCD3s松鼠猴(Sfl/ffl/n:yc/wrews)核苷酸CAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAATGGCTCGTAAATGATCAAAACAAAGAAGAGGTGGAT絲酸QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD2.结合到人和不同非黑猩猩灵长类CD3s的N端氨基酸1-27的跨种特异性单链抗体片段(scFv)的产生2.1.使用通过融合至异源的可溶性蛋白从它的天然CD3背景分离的CD3e的N端对小鼠进行的免疫由balb/cxC57black杂交的十周大的Fl小鼠被载有最多的成熟人和/或松鼠猴CD3s链N端氨基酸1-27的CD3￡-Fc融合蛋白(1-27CD3-Fc)免疫。为此目的，于300pl的PBS中的40吗的1-27CD3-Fc融合蛋白与10nmol的硫代酸酯(thioate)修饰的CpG-低聚核苷酸(5'-tccatgacgttcctgatgct-3')被注射进每只小鼠的腹膜内。小鼠在21、42和可选择地63天后以相同方式得到加强免疫。第一次加强免疫后十天，取血液样品并用ELISA测试针对1-27CD3-Fc融合蛋白iwa的抗体血清滴定度。另外，使用流式细胞计量术按照标准的实验方案测试针对CD3阳性人类T细胞系HPBall的滴定度。血清滴定度在免疫的动物中比在未免疫68的动物中高得多。2.2.免疫鼠抗体scFv库的产生组合的抗体库和噬菌体展示的构建最后一次注射后三天，鼠脾细胞被收集以根据标准的实验方案制备总RNA。鼠免疫球蛋白(Ig)轻链(k)可变区域(VK)和Ig重链可变区域(VH)的DNA片段库通过基于鼠脾RNA的RT-PCR使用VK和VH特异性引物而被构建。根据标准的实验方案合成cDNA。按照产生扩增的重链V片段的5'-Xho1和3'-BstEII的识别位点和扩增的VKDNA片段的5'-SacI和3'-Spel的识别位点的方式设计引物。为了对VHDNA片段进行PCR扩增，八个不同的5'-VH家族特异性引物(MVHl(GC)AGGTGCAGCTCGAGGAGTCAGGACCT;MVH2GAGGTCCAGCTCGAGCAGTCTGGACCT;MVH3CAGGTCCAACTCGAGCAGCCTGGGGCT;MVH4GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGGGCA;MVH5GA(AG)GTGAAGCTCGAGGAGTCTGGAGGA;MVH6GAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGT;MVH7GAAGTGAAGCTCGAGGAGTCTGGGGGA;MVH8GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGAGCT)各自与一个3'-VH引物(3'MuVHBs伍I1tgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccag)组合；为了对VK链片,殳进行PCR扩增，七个不同的5'-VK家族特异性引物(MUVKlCCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT;画VK2CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC;MUVK3CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA;MUVK4CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA;而VK5CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA;而VK6CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTC自与一个3'誦VH引物(3'MuVkHindIII/BsiWltggtgcactagtcgtacgtttgatetcaagcttggtccc)组合。使用下述PCR程序进行扩增在94°C变性20秒；在52°C引物退火50秒和在72°C引物延伸60秒，并进行40个循环，之后在72T进行10分钟的最后一次延伸。450ng的k轻链片段(Sacl-Spel消化的)与1400ng的噬菌粒pComb3H5Bhis(Sacl-Spel消化的；大片段)相连接。所得的组合抗体库然后通过电穿孔(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯，25uFD，200Ohm,Biorad的gene-pulser电穿孔仪)被转化进300pl的电感受态大肠杆菌XL1Blue细胞，得到多于107个独立克隆的库容量。在一小时的表现型表达之后，在100ml的液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5Bhis载体编码的羧千青霉素抗性的阳性转化体。然后通过离心收集细胞并使用商业上可得的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒的制备。2800ng的含有VK库(XhoI-Bs伍II消化的；大片段)的这种质粒-DNA与900ng的重链V片段(XhoI-BsffiII消化的)相连接然后再一次通过电穿孑L(2.5kV，0.2cm间隙的电击杯，25uFD，200Ohm)4皮转化进两个300nl份的电感受态大肠杆菌XLlBlue细胞，得到多于107个独立克隆的VH-VKscFv(单链可变片段)库总容量。在表现型表达和对羧爷青霉素的緩慢适应之后，含有所述抗体库的大肠杆菌细胞被转移到SB-羧千青霉素(50^g/ml)选择培养基。含有所述抗体库的大肠杆菌细胞然后被感染性剂量的1012个辅助噬菌体VCSM13颗粒感染而导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中所迷噬菌体颗粒含有编码鼠scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为与噬菌体外壳蛋白III的翻译融合的相应scFv蛋白。这个展示抗体库的噬菌体库然后被用来选择抗原结合实体。2.3.基于噬菌体展示的CD3特异性结合剂的选择使用PEG8000/NaCl沉淀和离心，从对应的培养物上清液收集载有被克隆的scFv所有组成成分的噬菌体库。大约1011至1012个scFv噬菌体颗粒在0.4ml的PBS/0.1。/。的BSA中重悬，并且与105至107个Jurkat细胞(CD3阳性人类T细胞系)在水上緩慢搅拌下赙化1小时。这些Jurkat细胞被提前种在富含胎牛血清(10%)、谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI培养基中，通过离心被收集，用PBS冲洗并在PBS/1。/。的FCS(含有叠氮化纳)中重悬。不特异性地结合至Jurkat细胞的scFv噬菌体通过多至五步使用PBS/l。/。的FCS(含有叠氮化纳)的清洗步骤而被清除。在冲洗后，通过将细胞重悬于pH2.2的HCl-甘氨酸(孵化10分钟并接着涡旋振荡)而从细胞中将结合实体洗脱，并且在用pH12的2MTris中和后，将洗脱物用于感染新鲜的未被感染的大肠杆菌XLlBlue培养物(OD600>0.5)。含有被编码人类scFv片段的噬菌粒拷贝成功转导的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再一次进行羧千青霉素抗性选择，并接着被VCMS3辅助噬菌体感染而开始第二轮抗体展示和体外选择。通常总共进行4至5轮选择。2.4.筛选CD3特异性的结合剂在选择后，对应于4和5轮淘洗的质粒DNA从大肠杆菌培养物中被分离。为了产生可溶性scFv蛋白，VH-VL-DNA片段从所述质粒(Xhol-Spel)被切除。这些片段通过质粒pComb3H5BFlag/His中相同限制位点-敗克隆，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原型pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体(例如scFv)包含在scFv和His6标记之间的Flag标记(TGDYKDDDDK)以及其他的噬菌体蛋白^皮删除。在连接之后，每个质粒DNA库(不同淘洗轮次)被转化进100pl热激感受态大肠杆菌TG1或XL1blue并被铺在羧千青霉素LB-琼脂上。单克隆被挑选放入100Hl的LB羧千青霉素(50吗/ml)。在切除基因III片段和使用1mM的IPTG诱导后，含有VL和VH片段的pComb3H5BHis转化的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv。由于适合的信号序列，所述scFv链被输出到周质并在其中折叠成功能构象。来自转化平板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落纟皮:挑选用于周质小量制备，并被种在补充了20mM的MgCl2和羧千青霉素50ng/ml的SB培养基中(例如IOml),并且在收集后被再溶解于PBS(例如lml)。通过四轮在-70。C下冷冻和在37。C下解冻，细菌的外层膜被温度沖击而毁坏，而包括scFv在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。在通过离心消除了完整细胞和细胞碎屑后，含有人抗人CD3-scFv的上清液被收集并用于进一步的检验。2.5.CD3特异性结合剂的鉴定通过流式细胞计量术在真核细胞上测试分离的scFv的结合，其中所述真核细胞在他们的表面上表达异源性的蛋白，其中所述蛋白在它的N端呈现CD3s的所述前27个N端氨基酸。如实施例4中所述，人类T细胞受体复合体的成熟CD3s链的N端序列的前1-27个氨基酸(氨基酸序列QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT)被融合到跨膜蛋白EpCAM的N端，以致于所述N端位于细胞外表面。另外，FLAG表位被插入N端1-27CD3s序列和EpCAM序列之间。这种融合产物被表达在人胚肾(HEK)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。呈现其他灵长类物种的成熟CD3s的所述27个最N端氨基酸的真核细胞使用相同方法被制备Sa!m,:n:(松鼠猴)(CD3e的N端氨基酸序列QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)、普通狨猴(CD3s的N端氨基酸序列QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)和绒顶柽柳猴Sa^wz'"wsoefift/w(CD3e的N端氨基酸序歹'j:QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT)。对于流式细胞计量术，2,5xl()s个细胞用50pl的上清液或用5pg/ml的纯化的构建体孵化，其中所述构建体是在含有2%FCS的50plPBS中。所述构建体的结合使用抗His抗体(5His抗体，无BSA,QiagenGmbh，Hilden,FRG)被检测，其中所述抗体在含有2%FCS的50plPBS中的浓度是2ng/ml。作为第二步试剂，使用R-藻红蛋白偶合的亲和力纯化的F(ab')2片段，羊抗鼠Ig(KFc-y片段特异性的)，其在含有2%FCS(Dianova，Hamburg,FRG)的50[ilPBS中被稀释1:100。所述样品在FACSscan(BDbiosciences,Heidelberg,FRG)上4皮观'〗量。结合总是通过如前面关于人和不同灵长类(如松鼠猴、普通狨猴、绒顶柽柳猴)原代T细胞的段落所述的流式细胞计量术被确认。2.6.非人CD3s特异性的scFv的人/人源化的等同物的生成鼠抗CD3的scFv的VH区域按照人抗体种系氨基酸序列被对比。选择具有与非人VH最近同源性的人抗体种系VH序列并进行两个tt酸序列的直接对比。有若干非人VH的骨架残基，其区别于人VH骨架区域("不同骨架位置")。一些这种残基可促进抗体与其靶的结合与活性。为了构建含有鼠CDR并在每个骨架位置区别于所选人VH序列二者可能性(人和母鼠氨基酸残基)的文库，变性的低聚核香酸被合成。这些低聚核苷酸在不同的位置含有75%几率的人残基和25%几率的鼠残基。对于一个人VH，必须得合成例如六个这种低聚核苷酸，其中所述低聚核苷酸在末段约20个核苷酸处重叠。为此目的，每种第二引物都是反义引物。在低聚核苦酸中稍后的克隆所需的限制位点被删除。这些引物可具有为60至90个的核苷酸长度，取决于对跨越整个V序列所需要的引物数量。这些例如六个引物以等量被混合(例如1^的每种引物(20至100nM的引物储液)加入20pl的PCR反应中)并加入由PCR緩冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物。在PCR循环控制装置中，这混合物在94。C孵化3分钟，在65。C孵化1分钟，在62。C蜉化1分钟，在59。C赙化1分钟，在56。C將化1分钟，在52。C將化1分钟，在50。C孵化1分钟，然后在72。C孵化10分钟。接着，用琼脂糖凝胶电泳测试所述产物，并根据标准方法将200至400大小的产物从凝胶中分离。这PCR产物然后被用作标准PCR反应的模板，其中所述标准PCR反应使用包含N端和C端适合的克隆限制位点的引物。根据标准方法使用琼脂糖凝胶电泳分离具有正确大小的所述DNA片段(对VH为大约350个核苷酸)。用这种方法扩增充足的VHDNA片段。这VH片段现在是VH片段库，其中每一个在相应的不同骨架位置具有不同量的人和鼠残基(人源化的VH库)。对于鼠抗CD3scFv的VL区域进行相同程序(人源化的VL库)。所述人源化的VH库然后与所述人源化的VL库在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis上合并以形成功能性的scFv库，从其中所述库(在呈现在丝状噬菌体后)选择、筛选、鉴定和确认抗CD3结合剂，如上所述关于亲本的非人(鼠)抗CD3scFv。然后分析单克隆的良好特性和氨基酸序列。那些在氨基酸序列同源性上与人种系V片段最近的scFv是优选的，特别是在其中至少一个的CDR显示与所有人种系V片段的关系最近的相应CDR具有多于80%氨基酸序列同一性的那些，其中所述CDR是在VH的CDRI和II以及VLk的CDRI和II或者VIA的CDRI和II当中。抗CD3scFv如以下的实施例10和16中所述^皮转换成重组双特异性单链抗体，并被进一步表征。3.融合到IgGl的Fc部分的人CD3s链的N端氨基酸1-27的重组融合蛋白(l-27CD3-Fc)的生成3.1.1-27CD3-Fc的克隆和表达融合到人免疫球蛋白TgGl铰链和FcY区域以及6组氨酸标记的人CD3s链的l-27N端氨基酸的编码序列按照标准的实验方案通过基因合成被获得(重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列被列在SEQIDNO350和349中)。设计所述基因合成片段以使之首先含有构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框内接着是成熟人CD3s链的细胞外部分的前27个氨基酸的编码序列，框内接着是人1gGl的铰链区域和Fcy部分的编码序列，框内接着是6组氨酸标记和一个终止密码子的编码序列(图1)。还设计所述基因合成片段以便在编码所述融合蛋白的cDNA的始端和末端引入限制位点。所述被引入的限制位点，即在5'端的EcoRI和在3'端的Sail,被用在如下克隆程序中。所述基因合成片段根据标准的实验方案通过EcoRI和Sail被克隆进称做pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR在Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025中被描述)。根据制造者的实验方案，序列祐:证实的质粒在FreeStyle293表达系统(InvitrogenGmbH,Karlsruhe,德国)中被用于转染。3天后，收集转染子的细胞培养物的上清液并在ELISA测定中测试重组构建体的存在。羊抗人IgG、Fc-y片段特异性抗体(获得自JacksonImmunoResearchEuropeLtd.,Newmarket,Suffolk,英国)在PBS中被稀释到5^g/ml，并以每孔100pi的量^皮涂布在MaxiSorp的96孔ELISA板(NuncGmbH&Co.KG，Wiesbaden,德国)于4。C过夜。使用含有0.05%吐温20的PBS(PBS/吐温)沖洗孔并用PBS中的3%BSA(牛白蛋白，级分V，Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，Germany)在室温(RT)下封闭60分钟。接下来，再次用PBS/吐温沖洗孔，然后将之与细胞培养物上清液在RT下孵化60分钟。在冲洗后，使用过氧化物酶偶合的抗His6抗体(RocheDiagnosticsGmbH，RocheAppliedScience,Mannheim,德、国)^寻孑L在RT下孵化60分钟，其中所述过氧化物酶偶合的抗His6抗体被含有1%BSA的PBS按1:500稀释。接下来，根据制造者的实验方案，用200piPBS/吐温沖洗孔，并加入100pi的SIGMAFASTOPD(SIGMAFASTOPD[二盐酸邻苯二胺])底物溶液(Sigma-AldrichChemieGmbH,Taufkirchen，德国)。通过加入100pi的1MH2S04而终止反应。使用PowerWaveX微量培养板分光光度计(BioTekInstruments,Inc.,Winooski，Vermont,美国)在490nm测量颜色反应并减去在620nm的背景吸收。如图2所示，与用作阴性对照的假转染的HEK293细胞的不相关上清液相对比，可以清楚地检测到所述构建体的存在。3.2.跨种特异性单链抗体与l-27CD3-Fc的结合测定周质表达的对CD3s有特异性的跨种特异性单链抗体粗制品对1-27CD3-Fc的结合在ELISA测定中被测试。羊抗人IgG、Fc-y片段特异性抗体(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.,Newmarket,Suffolk,英国)在PBS中被稀释到5pg/ml，并以每孔100^的量被涂布在MaxiSorp的96孔ELISA板(NuncGmbH&Co.KG，Wiesbaden,德国)于4'C过夜。使用含有0.05%吐温20的PBS(PBS/吐温)沖洗孔并用含有3°/。BSA的PBS(牛白蛋白，级分V，Sigma-AldrichChemieGmbH,Taufkirchen，德国)在室温(RT)下封闭60分钟。接下来，用PBS/吐温冲洗孔，并将之与表达1-27CD3-Fc构建体的细胞的上清液在RT下孵化60分钟。用PBS/吐温冲洗孔，并将之与周质表达的跨种特异性单链抗体粗制品按上述在室温下孵化60分钟。在用PBS/吐温冲洗后，使用过氧化物酶偶合的抗FlagM2抗体(Sigma-AldrichChemieGmbH,Taufkirchen,德国)将孔在RT下孵化60分钟，其中所述过氧化物酶偶合的抗FlagM2抗体纟皮含有1%BSA的PBS按1:10000稀释。根据制造者的实验方案，用PBS/吐温沖洗孔，并用100^tl的SIGMAFASTOPD(OPD[二盐酸邻苯二胺])底物溶液(Sigma-AldrichChemieGmbH,Taufkirchen,德国)孵化。使用100pi的1MH2S04终止颜色反应，并使用PowerWaveX微量培养板分光光度计(BioTekInstruments,Inc.,Winooski，Vermont,美国)在490nm测量并减去在620nm的背景吸收。与鼠抗CD3单链抗体相比较，观察到对CD3s有特异性的跨种特异性单链抗体对1-27CD3-Fc构建体的强的结合(图3)。4.融合到来自食蟹猴EpCAM的来自不同非黑猩猩灵长类CD3s的N端M酸l-27的重组跨膜融合蛋白(1-27CD3-EpCAM)的生成4.1.l-27CD3-EpCAM的克隆和表达从不同非黑猩猩灵长类(狨猴、绢毛猴、松鼠猴)和猪中分离CD3s。融合到Flag标记的食蟹猴EpCAM的N端的成熟人、普通狨猴(Ca〃"/j/lx:乂accZm.O、纟戎顶柽杉卩有吳(Sflgwz'mwoed,^w)、普通木>鼠1^(S"/w/n'5rz'w尸ew,s)和家猪(S^wra/a，用作阴性对照)CD3s链的1-27N端氨基酸的编码序列按照标准的实验方案通过基因合成被获得。重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列被列在SEQIDNO351至360中。设计所述基因合成片段以使之首先含有BsrGI位点以允许与已经存在于靶表达载体中的含19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列一起融合进正确的阅读框架，在框内接着是成熟CD3s链的细胞外部分的N端1-27个氨基酸的编码序列，在框内接着是Flag标记的编码序列，在框内接着是成熟食蟹猴EpCAM跨膜蛋白的编码序列(图4)。还设计所述基因合成片段以便在编码所述融合蛋白的cDNA的末端引入限制位点。所述被引入的限制位点即在5'端的BsrGI和在3'端的Sa11，被用在如下克隆程序中。根据标准的实验方案，所述基因合成片段然后通过BsrGI和Sail被克隆进称做pEF-DHFR的质粒的衍生物(pEF-DHFR在Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025中被描述)，其中所述衍生物已经包含所述含19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列。根据制造者的实验方案，序列被证实的质粒被用来瞬时转染293-HEK细胞，其使用MATra-A试剂(IBAGmbH，G。ttingen，德国)并对于175ml细胞培养瓶中的附着的293-HEK细胞使用12吗质粒DNA。细胞培养三天后，根据标准的实验方案通过FACS测定而测试转染子重组跨膜蛋白的细胞表面表达。为此目的，若干2.5x105个细胞与溶于含有2%FCS的PBS的5tig/ml抗FlagM2抗体(Sigma-AldrichChemieGmbH,Taufkirchen，德国)醉化。被结合的抗体被R-藻红蛋白偶合的亲和纯化的F(ab')2片段、羊抗鼠IgG、Fc-Y片段特异性的1:100在含有2%FCS的PBS(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.，Newmarket,Suffolk,英国)中被检测。所述样品在FACScalibur(BDbiosciences,Heidelberg,德国)上被测量。Flag标记的分别由食蟹猴EpCAM以及人、狨猴、绢毛猴、松鼠猴和猪CD3￡链的]-27N端氨基酸组成的重组跨膜融合蛋白在被转染细胞上的表达可以被清楚地检测到(图5)。4.2.跨种特异性的抗CD3单链抗体与1-27CD3-EpCAM的结合根据标准的实验方案，周质表达的跨种特异性的抗CD3单链抗体的粗制品对分别融合到食蟹猴Ep-CAM的人、狨猴、绢毛猴、松鼠猴CD3s链的1-27N端氣基酸的结合通过FACS测定被测试。为此目的，若干2.5x105个细胞与周质表达的跨种特异性的抗CD3单链抗体的粗制品(制备是如上述根据标准的实验方案被进行)孵化，并用单链鼠抗人CD3抗体作为阴性对照。作为二抗，使用溶解在含有2%FCS的50^PBS的浓度为5吗/ml的5His抗体(QiagenGmbH，Hildesheim，德国)。抗体的结合被R-藻红蛋白偶合的亲和纯化的f(ab')2片段、羊抗鼠IgG、Fc-y片段特异性的，在按1:100的比例稀释后在含有2%FCS的PBS(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.，Newmarket,Suffolk,英国)中被检测。所述样品在FACScalibur(BDbiosciences,Heidelberg,德国)上^皮测量。如图6(A至E)所示，观察到单链抗体对表达由融合到食蟹猴EpCAM的人、狨猴、绢毛猴、松鼠猴CD3s的1-27N端氨基酸所组成的重组跨膜融合蛋白的转染子的结合。没有观察到跨种特异性单链抗体对由融合到食蟹猴EpCAM的猪1-27N端CD3s所组成的融合蛋白的结合，其中所述融合蛋白被用作阴性对照。显示了抗CD3单链抗体的多灵长类跨种特异性。由抗FlagM2抗体和跨种特异性单链抗体所获得的信号是相当的，这表明了跨种特异性单链抗体对CD3￡的N端氨基酸1-27的强的结合活性。5.使用被人CD3s链及其丙氨酸突变体转染的小鼠细胞的丙氨酸扫描而进行的跨种特异性的抗CD3单链抗体的结合分析5.1.人野生型CD3s的克隆和表达人CD3s链的编码序列按照标准的实验方案通过基因合成被获得(人CD3s链的cDNA序列和氨基酸序列被列在SEQIDNO362和361中)。设计所述基因合成片段以使之含有构建体的真核表达的Kozak位点和在编码人CD3s的cDNA的始端和末端的限制位点。所述被引入的限制位点即在5'端的EcoRI和在3'端的Sail,被用在如下克隆程序中。根据标准的实验方案，所述基因合成片段然后通过EcoRI和Sail被克隆进称做pEFNEO的质粒。使用常用的分子克隆方法通过用新霉素抗性的cDNA替换DHFR的cDNA而将pEFNEO衍生自pEFDHFR(Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。序列被证实的质粒被用来转染培养在37°C、95%湿度和7%C02的条件下的RPMI中的鼠T细胞系EL4(ATCC号TIB-39),其中所述RPMI含有稳定的L-谷氨酰胺并补充有10%FCS、1%青霉素/链霉素、1%HEPES、1%丙酮酸盐、1%非必需氨基酸(都来自BiochromAGBerlin,德国)。根据制造者的实验方案，转染使用SuperFect转染试剂(QiagenGmbH,Hilden，德国)和2昭质粒DNA进行。24小时后，用PBS冲洗细胞并再次培养在前面提到的含有600pg/mlG418用于选择的细月包培养基中(PAALaboratoriesGmbH,Pasching，Austria)。转染16至20天后，观察到抗性细胞的生成。在另外7至14天后，根据标准的实验方案使用FACS分析来测试人CD3s在细胞的表达。2.5x105个细胞与溶于含有2%FCS的PBS的5pg/ml抗人CD3抗体(BDbiosciences,Heidelberg,德国)孵化。抗体的结合被R-藻红蛋白偶合的亲和纯化的F(ab')2片段、羊抗鼠IgG、Fc-Y片段特异性的，在按1:100的比例稀释后在含有2%FCS的PBS(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.,Newmarket,Suffolk,英国)中一皮检测。所述样品在FACSCalibur(BDbiosciences,Heidelberg,德国)上被测量。人野生型CD3在被转染的EL4细胞上的表达显示在图7中。5.2.作为IgGl抗体的跨种特异性的抗CD3单链抗体的克隆和表达为了提供改进的检测跨种特异性单链抗CD3抗体的结合的方法，H2CHLP、抗体。根据标准的实验方案，编码相应的IgG抗体的重链和轻链的cDNA序列通过基因合成而被获得。设计每种特异性的基因合成片段以使之首先含有允许构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽(SEQIDN0364和363)，在框内接着是相应重链可变区域或相应轻链可变区域的编码序列，在框内接着相应的是鼠IgGl的重链恒定区域的编码序列(SEQIDNO366和365)或人入的轻链恒定区域的编码序列(SEQIDNO368和367)。限制位点被引入编码融合蛋白的cDNA的始端和末端。在5'端的EcoRI和在3'端的Sail限制位点被用在如下克隆程序中。根据标准的实验方案，所述基因合成片段通过EcoRI和Sail被克隆进对应于重链构建体的称做pEFDHFR的质粒(Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)和对应于轻链构建体的称做pEFADA的质粒(pEFADA在Raum等，CancerImmunolImmunother.，50(3)，(2001)，141-50中被描述)。根据制造者的实验方案，序列被证实的质粒被用于相应的轻链和重链构建体在Freestyle293表达系统(InvitrogenGmbH，Karlsruhe,德国)中的共转染。3天后，收集所述转染子的细胞培养物的上清液并用作丙氨酸扫描实验。5.3.用作丙氨酸扫描的人CD3e的丙氨酸突变体的克隆和表达通过基因合成而获得编码人CD3s链的27个cDNA片段，其中所述人CD3s野生型序列的一个密码子被交换成编码丙氨酸的密码子，这是对于相应的成熟人CD3s链细胞外域的氨基酸1-27中的每个氨基酸来说。除了被交换的密码子，所述cDNA片段与前面提到的人野生型CD3cDNA片段是相同的。与上述人野生型CD3cDNA片段相比，在每个构建体中只有一个密码子被替换。与野生型构建体相比，限制位点EcoRI和Sail在相同位置被引入cDNA片段。所有丙氨酸扫描构建体被克隆进pEFNEO，而且序列被证实的质粒被转染进EL4细胞。转染子的转染和选择如上所述进行。结果，获得一组4支表达的构建体，其中所述人CD3s链的第一个氨基酸，即在位置1的谷氨酰胺(Q，Gln)被丙氨酸替换。被丙氨酸替换的最后一个氨基酸是在成熟人野生型CD3s的位置27的苏氨酸(T，Thr)。对于在谷氨酰胺1和苏氨酸27之间的每个氨基酸，带有将野生型氨基酸79交换为丙氨酸的对应的转染子被生成。5.4.丙氨酸扫描实验在2)中所述的嵌合IgG抗体和对CD3s有特异性的跨种特异性单链抗体在丙氨酸扫描实验中被测试。根据标准的实验方案，通过FACS测定来测试所述抗体对被如3)所述人CD3e丙氨酸突变体构建体转染的EL4细胞系的结合。2.5x105个相应转染子的细胞与含有所述嵌合IgG抗体的50pi细胞培养物上清液或与50pl周质表达的单链抗体的粗制品孵化。对于用所述周质表达的单链抗体的粗制品孵化的样品，所述抗FlagM2抗体(Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufldrchen,德国)以5ng/ml的浓度溶解于含有2%FCS的50PBS而被用作二抗。对于用所述嵌合1gG抗体孵化的样品，二抗不是必需的。对于所有样品，所述抗体分子的结合被R-藻红蛋白偶合的亲和纯化的F(ab')2片段、羊抗鼠IgG、Fc-y片段特异性的，在按1:100的比例稀释后在含有2%FCS的PBS(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.,Newmarket,Suffolk,英国)中被检测。样品在FACScalibur(BDbiosciences,Heidelberg,德国)上^皮测量。嵌合IgG分子或跨种特异性单链抗体与被人CD3s的丙氨酸突变体转染的EL4细胞系的差异结合被检测。作为阴性对照，相应地使用同种型对照或具有不相关特异性的周质表达的单链抗体的粗制品。UCHT-1抗体被用作人CD3s的丙氨酸突变体表达水平的阳性对照。成熟CD3e链在位置15的酪氨酸、在位置17的缬氨酸、在位置19的异亮氨酸、在位置24的缬氨酸或在位置26的亮氨酸等氨基酸的丙氨酸突变体转染的EL4细胞系没有被评估，由于非常低的表达水平(数据未显示)。跨种特异性单链抗体和嵌合IgG形式的单链抗体与被人CD3s丙氨酸突变体转染的EL4细胞系的结合在图8(A-D)中被显示为以任意单位表示的从所有相应的几何平均荧光样品值减去相应的阴性对照的几何平均焚光值而得的相对结合。为了补偿不同的表达水平，特定的转染子的所有样品值然后除以相应的转染子的UCHT-1抗体的几何平均荧光值。为了与特异性的野生型样品值比较，相应的特异性的所有样品值最后除以野生型样品值，从而将野生型样品值设置为1个任意单位的结合。所使用的计算详细显示在下式中说明书第74/257页样品值"力-_样品"，力一,—对照")^o/r-1W-P綠对照(f.阴性对照(w,)t/c//r一100-阴'n对照(wf)在这个方程式中，"样品值，，指的是任意单位的结合值，其描述特定的抗CD3抗体与如图8(A-D)所示特定的丙氨酸突变体的结合程度，"样品"指的是为在特定的丙氨酸扫描转染子上测定的特异性抗CD3抗体而获得的几何平均荧光值，"阴性对照"指的是为在特定的丙氨酸突变体上测定的阴性对照而获得的几何平均荧光值，UCHT-1指的是为在特定的丙氨酸突变体上测定的UCHT-1抗体而获得的几何平均荧光值，WT指的是为x表示相应的转染子，y表示相应的抗CD3抗体并且wt表示相应的转染子是野生型。如图8(A-D)中所示，IgG抗体A2JHLP显示了对在成熟CD3s链的位置4的天冬酰胺、位置23的苏氨酸和位置25的异亮氨酸等氨基酸的结合的显著丧失。观察到IgG抗体A2JHLP对在成熟CD3￡链的位置1的谷氨酰胺、位置2的天冬氨酸、位置3的甘氨酸和位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的完全丧失。IgG抗体E2MHLP显示了对在成熟CD3s链的位置4的天冬酰胺、位置23的苏氨酸和位置25的异亮氨酸等氨基酸的结合的显著丧失。IgG抗体E2MHLP显示了对在成熟CD3s链的位置1的谷氨酰胺、位置2的天冬氨酸、位置3的甘氨酸和位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的完全丧失。IgG抗体H2CHLP显示了对在成熟CD3e链的位置4的天冬酰胺氨基酸的结合的中级丧失，并显示了对在成熟CD3e链的位置1的谷氨酰胺、位置2的天冬氨酸、位置3的甘氨酸和位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的完全丧失。单链抗体F12QHLP显示了对在成熟CD3s链的位置1的谷氨酰胺、位置2的天冬氨酸、位置3的甘氨酸和位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的基本完全丧失。6.跨种特异性抗CD3结合分子H2CHLP对转染进鼠T细胞系EL4的含有和不含有N端His6标记的人CD3s链的结合分析6.1.含有N端6组氨酸标记(His6标记)的人CD3s链的克隆和表达编码含有N端His6标记的人CD3s链的cDNA片段通过基因合成被获得。设计所述基因合成片段以使之首先含有允许构建体的真核表达的Kozak位点，在框内接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，在框内接着是His6标记的编码序列，在框内接着是成熟人CD3s链的编码序列(所述构建体的cDNA和氨基酸序列被列在SEQIDNO380和379)。还设计所述基因合成片段以便在所述cDNA的始端和末端含有限制位点。所述被引入的限制位点即在5'端的EcoRI和在3'端的Sail,被用在如下克隆程序中。根据标准的实验方案，所述基因合成片段然后通过EcoRI和Sail被克隆进称做pEF-NEO的质粒(如上述)。序列被证实的质粒被用于转染鼠T细胞系EL4。转染和转染子的选择如上述进行。细胞培养34天后，所述转染子被用作下述测定。6.2.跨种特异性的抗CD3结合分子H2CHLP与含有和不含有N端His6标记的人CD36链的结合测试了对CD3e有特异性的具有所述结合特异性的嵌合IgG抗体H2CHLP对含有和不含有N端His6标记的人CD3s的结合。根据标准的实验方案，使用FACS测定而测试了所述抗体对分别被His6人CD3e和野生型人CD3s转染的EL4细胞系的结合。2.5x105个转染子的细胞与含有所述嵌合IgG抗体的50pl细胞培养物上清液或与50nl以5pg/ml的浓度溶解于含有2%FCS的PBS的相应的对照抗体一起孵化。相应地使用适当的同种型对照作为阴性对照，并使用所述CD3特异性抗体UCHT-1作为构建体表达的阳性对照。所述抗体的结合被R-藻红蛋白偶合的亲和纯化的F(ab')2片段、羊抗鼠IgG、Fc-y片段特异性的，在按1:100的比例稀释后在含有2%FCS的PBS(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.,Newmarket,Suffolk,英国)中被检测。样品在FACScalibur(BDbiosciences,Heidelberg,德国)上被测量。与被野生型人CD3s转染的EL4细胞系相比较，检测到具有结合特异性H2CHLP的嵌合IgG对含有N端His6标记的人CD3s的结合的清晰丧失。这些结果显示CD3s的游离N端对于跨种特异性抗CD3结合特异性H2CHLP对人CD3s链的结合是必要的(图9)。7.使用等离子体表面共振测量确定对灵长类EGFR和灵长类CD3(EGFRLHxH2CHLP)有跨种特异性的双特异性单链抗体对融合蛋白1-27CD3-Fc的结合常数KD,与使用荧光激活细胞分选仪(FACS)测量的对表达CD3的PBMC的结合相比较7.1.等离子体表面共振测量为了确定完全跨种特异性的双特异性单链抗体EGFR-21-63LHxH2CHLP对人CD3s链的N端氨基酸1-27的结合亲和力，使用由融合于人IgGl的Fc部分的成熟人CD3e链的N端氨基酸1-27组成的重组融合蛋白(1-27CD3-Fc)进行了等离子体表面共振测量。为此目的，在Biacore2000系统(Biacore,Uppsala，Sweden)上安装了Biacore羧曱基葡聚糖CM5芯片(Biacore,Uppsala，Sweden)。才艮据标准程序，一个流动池(flowcell)被盐酸N-(3-二曱基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺/N-幾基琥珀酰亚胺溶液激活。之后加入融合蛋白1-27CD3-Fc的溶液，产生所述蛋白与Biacore芯片上葡聚糖层的稳定共价连接。通过大量沖洗除去未结合的蛋白，随后通过加入乙醇胺溶液而封闭未反应的剩余NHS激活的羧基。与偶合前信号相比，由响应元件测得的更高的信号确认了蛋白偶合的成功。如所述准备了一个参比池(referencecell)但不加入蛋白溶液。在Slide-A-Lyzer⑧微型透析设备(Pierce,Rockford-II,美国)上将纯化的双特异性抗体EGFR-21-63LHxH2CHLP对HBS-EP緩冲液(Biacore，Uppsala,Sweden)透析。使用UV280nm吸收确定透析后的蛋白浓度，得到43吗/ml的浓度。将所述蛋白溶液转移到96孔板并用HBS-EP緩冲液以1:1的比例连续稀释到另外IO个孔中。通过分别对所有11个孔取样，进行表面等离子体共振测量。在测量之间使用醋酸盐緩沖液将所述流动池再生而释放被结合的蛋白。通过从与1-27CD3-Fc蛋白偶合的测量池(measurementcell)的信号减去参比池的信号而获得双特异性抗体分子的结合信号。締合与解离曲线由响应元件测量并被记录。基于Langmuir模型，使用Biacore⑧曲线拟合软件计算结合常数。在前五个浓度上计算得到的结合常数KD被确定为1.52xl(T7M。7.2.由FACS测量确定CD3结合常数为了测试跨种特异性的双特异性抗体分子就对天然的人CD3的结合强度而言的亲和力，进行了另外的饱和FACS结合分析。使用所选的双特异性抗体分子EGFR-21-63LHxH2CHLP以1:1.5的比例和63.3pg/ml的起始浓度建立稀释排列。所述双特异性抗体分子在这些不同浓度下分别于4。C与1.25xl()S个人PBMC孵化1小时，接着在4。C下进行两个PBS的冲洗步骤。通过使用在含2%FCS的50plPBS中5pg/ml的5His抗体(QiagenGmbH，Hildesheim，德国)，进行被结合的双特异性抗体分子的检测。在4。C下孵化45分钟和两个沖洗步骤之后，所述5His抗体结合被R-藻红蛋白偶合的亲和纯化的F(ab')2片段、羊抗鼠IgG、Fc-Y片段特异性的，在按1:100的比例稀释后在含有2%FCS的PBS(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.,Newmarket,Suffolk,英国)中祐:才企测。在FACS陽CantoII仪器上进行流式细胞计量术，使用FACSDiva软件获取并分析数据(BectonDickinsonbiosciences,Heidelberg)。按照CurrentProtocolsinImmunology(《免疫学实验室指南》XColigan,Kruisbeek，Margulies,Shevach和Strober，Wiley-Interscience,2002)中所述进行FACS染色和焚光强度的测量。所获得的荧光强度平均值作为所使用的双特异性抗体分子浓度的函数被绘制，并且被生物数学软件Prism中的一侧结合分析(双曲线)所分析。所述软件计算了相应的KD值，其中所述KD值描述了遵守质量作用定律的配体(所述双特异性抗体分子)与受体(所述CD3阳性PBMC亚组分)的结合。依据的式如下Y=BmaxxX/(Kd+X),其中所述Bmax是最大结合。KD是达到最大结合的一半所需要的配体浓度。所述FACS染色一式二份地进行，所述R2值好于0.95。所述双特异性抗体分子EGFR-21-63LHxH2CHLP的所确定的最大结合的一半在浓度为8472ng/ml时达到，其相当于在给定分子量55000道尔顿下的154nM(1.54xl0-7M)(图10)。84因此，EGFR-21-63LHxH2CHLP对从他们的天然CD3背景分离出来的人CD3s链的N端氨基酸l-27的亲和力被证明与EGFR-21-63LHxH2CHLP对完整T细胞中天然CD3的亲和力相等。8.EGFR转染的CHO细胞的生成对人EGFR为阳性的细胞系，A431(表皮样癌细胞系，CRL-1555，美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)被用来获得根据试剂盒说明书分离的总RNA(Qiagen，RNeasyMiniKit,Hilden，德国)。所获得的RNA通过随机引物反转录被用作cDNA合成。对于人EGFR抗原全长序列的克隆，使用下面的低聚核苷酸5'EGFRAGXbal5'-GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG-3'3'EGFRAGSail5'-TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-3'所述编码序列通过PCR4皮扩增(对于第一个循环，在94。C变性5分钟，在58。C退火1分钟，在72。C延伸2分钟；对于30个循环，在94。C变性1分钟，在58。C退火1分钟，在72。C延伸2分钟；在72。C末端延长5分钟)。PCR产物随后被XbaII和Sail消化，连接到适当地消化表达载体pEF-DHFR中(Raum等，CancerImmunol.Immunother.2001;50:141-150)，并被转化进大肠杆菌。根据标准的实验方案，进行前面提到的程序(Sambrook,MolecularCloning;ALaboratoryManual(分子克隆；实验室手册),第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork(2001))。为了构建体的真核表达，含有序列被证实的核苷酸序列(SEQID370，氨基酸序列SEQID369)的克隆被转染进DHFR缺陷的CHO细胞。真核蛋白在DHFR缺陷的CHO细胞中的表达按照KaufmannR丄(1990)MethodsEnzymol.185，537-566中所述的进行。所述构建体的基因扩增由将氨甲蝶呤(MTX)的浓度增加到终浓度多达20nMMTX而被谦导。8.表达食蟹猴EGFR的细胞外域的CHO细胞的生成食蟹猴EGFR的细胞外域的cDNA序列由一组含有两个对食蟹猴结肠cDNA(产品目录弁C1534090-Cy-BC;获得自BioCatGmbH,Heidelberg,德国)的PCR获得，其使用如下反应条件1个循环在94。C进行3分钟，接着是35个循环在94。C进行1分钟，在53。C进行1分钟和在72。C进行2分钟，接着是末端循环在72。C进行3分钟。使用下面的引物1.正向引物5'画CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC隱3'反向引物5'-CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC曙3'2.正向引物5'國ACATCCGGAGGTGACAGATCACGGCTCGTGC誦3'反向引物5'-CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTTCGC-3'那些PCR产生两种重叠的片段(A:1-869，B:848-1923)，其根据标准的实验方案使用PCR引物被分离和测序，并由此提供食蟹猴EGFR的cDNA序列的1923bp的部分，其中所述部分是从成熟蛋白的密码子+1的第三个核苷酸到跨膜域的第21个密码子。为了生成表达食蟹猴EGFR的构建体，根据标准的实验方案通过基因合成而获得cDNA片段(所述cDNA和构建体的氨基酸序列被列在SEQIDNO372和371)。在这个构建体中，从成熟EGFR蛋白的氨基酸+2至+641的食蟹猴EGFR编码序列被融合进人EGFR的编码序列从而代替氨基酸+2至+641的编码序列。还设计所述基因合成片段以使之含有构建体真核表达的Kozak位点以及在实质上编码融合进人EGFR跨膜和细胞内域的食蟹猴EGFR细胞外域的cDNA的始端和末端的限制位点。此外，为了克隆的目的，在氨基酸627(跨膜域的第4个氨基酸)引入保守突变，将缬氨酸突变成亮氨酸以生成限制位点(Sphl)。在5'端引入的Xbal和在3'端引入的Sail限制位点被用在下列克隆程序中。然后将所述基因合成片段通过Xbal和Sail克隆进被称作pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR在Mack等Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025中被描述)。这种质粒的序列被证实的克隆按上述被用来转染010/池&-细胞。10.EGFR和CD3跨种特异性的双特异性单链分子的生成10.1.跨种特异性的结合分子的克隆通常地，双特异性单链抗体分子各自包括对人和非黑猩猩灵长类CD3s跨种特异性的具有结合特异性的域，以及对人和非黑猩猩灵长类EGFR跨种特异性的具有结合特异性的域，按照列在下面的表1设计所述双特异性单链抗体分子表1:抗CD3和抗EGFR跨种特异性的双特异性单链抗体分子的形式<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>通过基因合成而获得前面提到的含有对人和食蟹猴EGFR具有跨种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)域的构建体。设计所述基因合成片段以使之首先含有构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，在框内接着是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，在框内接着是6组氨酸标记的编码序列和一个终止密码子。还设计所述基因合成片段以引入适合的N和C端限制位点。根据标准的实验方案(Sambrook,MolecularCloning;ALaboratoryManual(分子克隆；实-睑室手册),第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork(2001)),通过这些限制位点将所述基因合成片段克隆进被称作pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR在Raum等CancerImmunollmmunother50(2001)141-150中^皮描述)。为了所述构建体的真核表达，含有序列^皮证实的核苷酸序列的克隆被转染进二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。所述构建体通过电穿孔被稳定地或瞬时转染进DHFR缺陷的CHO细胞(ATCC号CRL90%)，或者可选地根据标准的实验方案以瞬时的方式被转染进HEK293(人胚肾细胞，ATCC号CRL-1573)。10.2.双特异性单链抗体分子的表达和纯化在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达所述双特异性单链抗体分子。按照KaufmannR,J.(1990)MethodsEnzymol.185，537-566中所述在DHFR缺陷的CHO细胞中进行真核蛋白表达。所述构建体的基因扩增通过将MTX的最终浓度提高到20nM而被诱导。在静止培养两代后，所述细胞在装有不含核苷的HyQPFCHO液体大豆培养基(含4.0mML-谷氨酰胺和0.1%的PluronicF-68;HyClone)的滚瓶中培养7天后收获。通过离心去除所述细胞，并将含有被表达蛋白的上清液储存在-20。C。可选地，将构建体瞬时表达在HEK293细胞中。根据制造者的实验方案，使用293fectin试剂(Invitrogen，#12347-019)进行转染。AktaExplorerSystem(GEHealthSystems)和Unicorn⑧软件被用作层析。根据制造者提供的实验方案，使用与ZnC12—同装入的FractogelEMDchelate(Merck)进行固定化金属亲和层析("IMAC")。使用緩冲液A(20mM磷酸钠緩冲液，pH7.2,0.1MNaCl)平衡柱子，并以3ml/min的流速将所述细胞培养上清液(500ml)应用在所述柱子(10ml)。使用緩冲液A沖洗所述柱子以去除未被结合的样品。使用两步骤梯度的緩冲液B(20mM磷酸钠緩沖液，pH7.2，O.lMNaCl，0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白，其根据如下步骤1:6个柱容积的20%緩冲液B步骤2:6个柱容积的100%緩冲液B步骤2的被洗脱的蛋白组分被集中在一起而进一步纯化。所有化学制品都是研究级的，并购买自Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。在使用Equi緩冲液(25mM柠檬酸盐，200mM细胞溶素，5%甘油，pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级的柱子(GE/Amersham)上进行凝胶过滤层析。将被洗脱的蛋白样品(流速lml/min)经过标准的SDS-PAGE和Western印迹进行检测。在纯化前，为了确定分子量而校准所述柱子(分子量标志物试剂盒，SigmaMWGF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。在还原性条件下使用SDSPAGE分析;故纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE使用预制的4-12%BisTris胶(Invitrogen)进行。根据制造者提供的实验方案，进行样品的制备和应用。使用MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。使用胶态的Coomassie(Invitrogen实验方案)对凝胶进行染色。用SDS-PAGE确定的被分离的蛋白的纯度是>95%。如PBS中凝胶过滤所确定，所述双特异性单链抗体在天然状态下具有约52kDa的分子量。根据这种方法纯化所有构建体。根据制造者提供的实验方案，使用OptitranBA-S83膜和InvitrogenBlotModule进行Western印迹。所-使用的抗体^皮导向His标记(5His，Qiagen)和碱性磷酸酶(APXSigma)标记的羊抗鼠Ig，并且使用BC1P/NBT(Sigma)作为底物。在52kD检测到单个条带，其对应于被纯化的双特异性单链抗体。11.使用表面等离子体共振测量进行的，完全跨种特异性的双特异性单链抗体对融合蛋白1-27CD3-Fc的结合常数KD的确定链抗体分子对成熟人CD35链的N端氨基酸1-27的结合亲和力，使用由融合于人IgGl的Fc部分的人CD3s链的N端氨基酸1-27组成的重组融合蛋白(1-27CD3-Fc)进行了表面等离子体共振测量。为此目的，在Biacore2000系统(Biacore,Uppsala,Sweden)上安装了Biacore羧曱基葡聚糖CM5芯片(Biacore,Uppsala,Sweden)。根据标准程序，一个流动池(flowcell)被盐酸N-(3-二曱基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液激活。之后加入融合蛋白1-27CD3-Fc的溶液，产生所述蛋白与Biacore芯片上葡聚糖层的稳定共价连接。通过大量冲洗除去未结合的蛋白，随后通过加入乙醇胺溶液而封闭剩余未反应的NHS激活的羧基。与偶合前信号相比，由响应元件测得的更高的信号确认了蛋白偶合的成功。如所述准备了一个参比池但不加入蛋白溶液。使用HBS-EP缓沖液(Biacore,Uppsala,Sweden)将列在下面的纯化的双特异性单链抗体调节到5pg/ml，并转移到96孔板，其中每孔加入的容积为150pl。对全部样品进行表面等离子体共振测量，并在测量之间使用醋酸盐緩冲液将所述流动池再生而释放被结合的蛋白(全部根据标准的实验方案)。通过从与1-27CD3-Fc蛋白偶合的测量池的信号减去参比池的信号而获得双特异性单链抗体的结合信号。締合与解离曲线由响应元件测量并被记录。基于Langmuir模型，使用Biacore曲线拟合软件计算结合常数。被测的完全跨种特异性的双特异性单链分子对人CD3s的N端氨基酸1-27的计算所得的亲和力作为KD值在下面给出，其范围是从2.54xl(T6M至2.49xl(T7M。"LH"指的是可变域以VL-VH顺序的排列。"HL"指的是可变域以VH-VL顺序的排列。G4H、F70、A2J、E1L、E2M、H1E和F6A指的是不同跨种特异性的CD3结合分子。双特异性抗体分子KD(M)<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>12.EGFR和CD3跨种特异性的双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析为了测试跨种特异性的双特异性抗体构建体关于对人和食蟹猴EGFR和CD3相应的结合能力的功能性，进行FACS分析。为此目的，被实施例8中所述人EGFR转染的CHO细胞和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)被用来测试对人抗原的结合。使用实施例9中所述生成的食蟹猴EGFR转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授,HygieneInstitute,Virology,Erlangen-Nuernberg友好地提供；发表在KnappeA等，和FickenscherH.,Blood2000，95,3256-61)测试食蟹猴抗原的结合反应性。200,000个细胞的相应细胞群与50pl跨种特异性的双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(2pg/ml)在冰上孵化30分钟。可选择地，使用瞬时产生的蛋白的细胞培养物上清液。将所述细胞在PBS中冲洗两次，并使用鼠5His抗体(Qiagen;以1:20在含有2%FCS的50^PBS中稀释)检测所述构建体的结合。沖洗之后，使用以1:100在含有2%FCS的PBS中稀释的偶合到藻红蛋白的Fcy特异性的抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。使用新鲜的培养基作为阴性对照。在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞计量术，使用CellQuest软件获取和分析数据(BectonDickinsonbiosciences,Heidelberg)。按照CurrentProtocolsinImmunology(《免疫学实马全室指南》)(Coligan,Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中所述进行FACS染色和荧光强度的测量。如图11所示，对于EGFR有特异性的以及对人和非黑猩猩灵长类CD3有跨种特异性的一些双特异性单链分子的结合能力是可清楚地检测到的。在FACS分析中，对比于作为阴性对照的培养基以及第一和第二检测抗体，所有构建体显示了对CD3和EGFR的结合。证明了所述双特异性抗体对人和食蟹猴CD3和EGFR抗原的跨种特异性。13.EGFR和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体的生物活性使用实施例8和9中描述的EGFR阳性细胞系，通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定而分析所生成的双特异性单链抗体的生物活性。作为效应细胞，相应地使用被激发的人CD8阳性T细胞或猕猴T细胞系4119LnPx。被激发的CD8+T细胞的生成按照如下进行使用终浓度为1pg/ml的商业上可得的抗CD3特异性抗体对培养JDi(直径145mm;Greiner)在37。C进行预涂布1小时。通过使用PBS的一个冲洗步骤去除未结合的蛋白。根据标准的实验方案，使用Ficoll梯度离心将新鲜的PBMC从外周血(30-50ml人血)中分离。在120mlRPMI1640/10%FCS/IL-220U/ml(Proleukin,Chiron)中的3-5xl0个PBMC被加入所述预涂布的培养皿，并被激发2天。在第三天，收集所述细胞，用RPMI1640冲洗一次。加入IL-2至终浓度20U/ml，并再培养一天。通过清除CD4+T细胞和CD56+NK细胞而分离CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。使用PBS沖洗靶细胞两次，并用含有50%FCS的终体积为100pl的RPMI中的11,1MBq5，Cr在37。C标记45分钟。接着，使用5mlRPMI将被标记的靶细胞沖洗3次，然后用于细胞毒性测定。所述测定在96孔板中的总体积为250〖il的、E:T比率为10:1的#1补充RPMI(如上)中进行。1昭/ml的跨种特异性的双特异性单链抗体分子及其20个三倍稀释物被应用。可选地，瞬时产生的蛋白的细胞培养物上清液在1:2步骤中^Ji续稀释。所述测定的时间是18小时，并且细胞毒性测量为上清液中释;^丈的铬相对于最大细胞溶解(加入Triton-X)和自发溶解(不含效应细胞)之间的差值的相对值。所有测量都一式四4分地进行。^洛在上清液中活性的测量是通过Wizard3、计数器(PerkinElmerLifeSciencesGmbH，K6ln,德国)而进行的。实验数据的分析是通过Prism4forWindows(版本4.02,GraphPadSoftwareInc.，SanDiego,California,美国)进4亍的。如所述软件所确定的S形的剂量响应曲线通常具有112值>0.90。通过所述分析程序计算的EC5o值被用于生物活性的比较。如图12和13所示，全部所生成的^"种特异性的双特异性单链抗体构建体显示了由人CD8+细胞引出的针对人EGFR阳性靶细胞的和由猕猴T细胞系4119LnPx引出的针对食蟹猴EGFR阳性乾细胞的细胞毒性活性。含有不同靶特异性的双特异性单链抗体被用作阴性对照。14.人MCSP的C端、跨膜和截短的细胞外域的克隆和表达根据标准的实验方案，人MCSP(氨基酸1538-2322)的C端、跨膜和截短的细胞外域的编码序列通过基因合成而被获得(用于表达人MCSP的C端、跨膜和截短的细胞外域(表示为人D3)的所述重组构建体的cDNA序列和氨基酸序列被列在SEQIDNO374和373)。设计所述基因合成片段以使之首先含有允许构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，在框架内接着是FLAG标记，在框架内接着是含有若干克隆目的的限制位点和编码含9个氨基酸的人工连接体(SRTRSGSQL)的序列，在框架内接着是人MCSP的C端、跨膜和截短的细胞外域的编码序列和一个终止密码子。限制位点被引入所述DNA片段的始端和末端。在5'端的EcoRI和在3'端的Sail限制位点被用在如下克隆程序中。根据标准的实验方案，所述片段被EcoRI和Sail消化并被克隆进pEF誦DHFR(pEF-DHFR在Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025中被描述)。序列祐:证实的质粒被用于转染CHO/dhfr-细胞(ATCC号CRL9096)。在37。C、95%湿度和7%C02的培养箱中，细胞被培养在含有稳定的谷氨酰胺的RPMI1640中，其中所述RPMI1640被补充10。/oFCS、1%青霉素/链霉素(全部获得自BiochromAGBerlin,德国)和来自细胞培养级试剂的储液的核苷(Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufldrchen,德国)以达到终浓度为10ng/ml的腺噪呤核苷、10(ig/ml的脱氧腺苷和10〖ig/ml的胸腺嘧啶核苷。根据制造者的实验方案，使用PolyFect转染试剂(QiagenGmbH,Hilden，德国)和5质粒DNA进行转染。在培养24小时后，用PBS沖洗细胞一次并再次用含有稳定的谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养。因此，所述细胞培养基不含有核苷并从而将选择应用在被转染细胞上。转染后大约14天，观察到抗性细胞的生成。在另外7至14天后，使用FACS分析来测试转染子构建体的表达。2.5xl()5个细胞与被含有2%FCS的PBS稀释到5ng/ml的50pl抗Flag-M2抗体(Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，德国)孵化。抗体的结合被R-藻红蛋白偶合的亲和纯化的F(ab')2片段、羊抗鼠IgG、Fc-Y片段特异性的，在按1:100的比例稀释后在含有2%FCS的PBS(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.，Newmarket,Suffolk,英国)中被检测到。所述样品在FACScalibur(BDbiosciences,Heidelberg,德国)上被测量。15.猕猴MCSP的C端、跨膜和截短的细胞外域的克隆和表达猕猴MCSP的C端、跨膜和截短的细胞外域(表示为猕猴D3)的cDNA序列通过一组三个的PCR从猕猴皮肤cDNA(产品目录号C1534218-Cy-BC;BioCatGmbH，Heidelberg,德国)而获得，其使用下面的反应条件1个循环在94。C进行3分钟，40个循环在94。C进行0.5分钟，在52。C进行0.5分钟和在72。C进行1.75分钟，末端循环在72。C进行3分钟。使用下面的引物正向引物5'-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3'反向引物5'-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3'正向引物5'-TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3'反向引物5'-CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3'正向引物5'-GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3'反向引物5'-GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3'那些PCR产生三种重叠的片段(A:1-1329,B:1229-2428，C:1782-2547)，其根据标准的实验方案使用PCR引物被分离和测序，并由此提供猕猴MCSP的cDNA序列的2547bp的部分(猕猴MCSP的这部分cDNA序列和tt酸序列被列在SEQIDNO376和375)，其中所述2547bp的部分是从C端域的编码序列上游74bp至终止密码子下游121bp。使用另一个PCR来融合前面提到的反应A和B的PCR产物，其使用如下反应条件1个循环在94。C进行3分钟，10个循环在94。C进行1分钟，在52。C进行1分钟和在72。C进行2.5分钟，末端循环在72。C进行3分钟。使用下面的引物正向引物5'-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg誦3'反向引4勿5'-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3'设计这个PCR的引物以在编码猕猴MCSP的C端、跨膜和截短的细胞外域的cDNA片段的始端和末端引入限制位点。所引入的在5'端的Mfel和在3'端的Sail限制位点被用在如下克隆程序中。然后所述PCR片段通过Mfel和Sail被克隆进含有前面提到的质粒pEF-DHFR(pEF-DHFR在Raum等CancerImmunollmmunother50(2001)141-150中被描述)的EcoR固feI片段的Blulescript质粒，其中所述克隆的过程替换了猕猴MCSP的C端、跨膜和截短的细胞外域。所述基因合成片段含有免疫球蛋白前导肽和Flag标记以及人工连接体(SRTRSGSQL)的编码序列，其中所述人工连接体在框内连接在编码猕猴MCSP的C端、跨膜和截短的细胞外域的cDNA片段的5'端。这个载体被用于转染CHO/dhfr-细胞(ATCC号CRL9096)。在37°C、95%湿度和7%C02的培养箱中，细胞被培养在含有稳定的谷氨酰胺的RPMI1640中，其中所述RPMI1640被补充10%FCS、1%青霉素/链霉素(全部来自BiochromAGBerlin,德国)和来自含有细胞培养级试剂的储存溶液的核苷(Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，德国)以达到终浓度为10吗/ml的腺噪呤核苷、10ng/ml的脱氧腺苷和10pg/ml的胸腺嘧啶核苷。根据制造者的实验方案，使用PolyFect转染试剂(QiagenGmbH,Hilden，德国)和5ng质粒DNA进行转染。在培养24小时后，用PBS冲洗细胞一次并再次用含有稳定的谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养。因此，所述细胞培养基不含有核苷并从而将选择应用在被转染细胞上。转染后大约14天，观察到抗性细胞的生成。在另外7至14天后，使用FACS来测试转染子的重组构建体的表达。2.5xl()S个细胞与被含有2%FCS的PBS稀释到5昭/ml的50pi抗Flag-M2抗体(Sigma-AldrichChemieGmbH,Taufkirchen,德国)孵化。结合的抗体净皮R-藻红蛋白偶合的亲和纯化的F(ab')2片段、羊抗鼠IgG、Fc-y片段特异性的，在按1:100的比例稀释后在含有2%FCS的PBS(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.,Newmarket,Suffolk,英国)中#皮4企观寸。所述样品在FACScalibur(BDbiosciences,Heidelberg,德国)上i皮测量。16.MCSP和CD3跨种特异性的双特异性单链分子的产生和表征双特异性单链抗体分子各自包括对人和非黑猩猩灵长类CD3e具有跨种特异性的结合域以及对人和非黑猩猩灵长类MCSP具有跨种特异性的结合域，其按照下面表2所述纟皮设计表2:MCSP和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体的形式<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>通过基因合成而获得前面提到的含有对人和猕猴MCSPD3具有跨种特异性的可变重链(VH)和可变轻链(VL)域的以及对人和猕猴CD3具有跨种特异性的VH和VL域的构建体。设计所述基因合成片段以使之首先含有构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，在框内接着是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，在框内接着是组氨酸6标记的编码序列和一个终止密码子。还设计所述基因合成片段以引入适合的N和C端限制位点。根据标准的实验方案(Sambrook，MolecularCloning;ALaboratoryManual(分子克隆；实验室手册)，第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork(2001))，通过这些限制位点将所述基因合成片段克隆进被称作pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR在Raum等CancerImmunollmmunother50(2001)141-150中被描述)。所述构建体通过电穿孔被稳定地或瞬时转染进DHFR缺陷的CHO细胞(ATCC号CRL9096),或者可选地根据标准的实验方案以瞬时的方式被转染进HEK293(人胚肾细胞，ATCC号CRL-1573)。按照KaufmannR.J.(1990)MethodsEnzymol.185,537-566中所述在DHFR缺陷的CHO细胞中进行真核蛋白表达。所述构建体的基因扩增通过加入增加浓度的氨甲蝶呤(MTX)到终浓度20nMMTX而被诱导。在静止培养两代后，所述细胞在装有不含核普的HyQPFCHO液体大豆培养基(含4.0mML-谷氨酰胺和0.1%的PluronicF-68;HyClone)的滚瓶中培养7天后收获。通过离心去除所述细胞，并将含有被表达蛋白的上清液储存在-20。C。AktaExplorerSystem(GEHealthSystems)和Unicorn⑧软件被用作层析。根据制造者提供的实验方案，使用与ZnCl2—同装入的FractogelEMDchelate(Merck)进行固定化金属亲和层析("IMAC")。使用緩冲液A(20mM磷酸钠緩冲液，pH7.2，0.1MNaCl)平衡所述柱子，并以3ml/min的流速将所述细胞培养上清液(500ml)应用在所述柱子(10ml)。使用緩沖液A冲洗所述柱子以去除未被结合的样品。使用两步骤梯度的緩沖液B(20mM磷酸钠緩冲液，pH7.2，0.1MNaCl，0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白，其根据如下步骤1:6个柱容积的20%緩冲液B步骤2:6个柱容积的100%緩冲液B步骤2的被洗脱的蛋白组分被集中在一起而进一步纯化。所有化学制品都是研究级的，并购买自Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。在使用Equi緩冲液(25mM柠檬酸盐，200mM赖氨酸，5%甘油，pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级的柱子(GE/Amersham)上进行凝胶过滤层析。将被洗脱的蛋白样品(流速lml/min)经过标准的SDS-PAGE和Western印迹进行检测。在纯化前，为了确定分子量而校准所述柱子(分子量标志物试剂盒，SigmaMWGF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。在还原性条件下使用SDSPAGE分析被纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE使用预制的4-12%BisTris胶(Invitrogen)进行。根据制造者提供的实验方案，进行样品的制备和应用。使用MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。使用胶态的Coomassie(Invitrogen实验方案)对凝胶进行染色。用SDS-PAGE确定的被分离的蛋白的纯度是>95%。如磷酸盐緩沖盐水(PBS)中凝胶过滤所确定，所述双特异性单链抗体在天然状态下具有约52kDa的分子量。根据这种方法纯化所有构建体。根据制造者提供的实验方案，使用OptitranBA-S83膜和InvitrogenBlotModule进行Western印迹。为了4佥测所述双特异性单链抗体蛋白抗体，使用了抗His标记抗体(5His，Qiagen)。石威性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的羊抗鼠Ig抗体净皮用作二抗，并且使用BCIP/NBT(Sigma)作为底物。在52kD检测到单个条带，其对应于被纯化的双特异性单链抗体。可选择地，构建体被瞬时表达在DHFR缺陷的CHO细胞中。简言之，在转染前一天，在37。C、95%湿度和7%C02的培养箱中，每种构建体的4xl()S个细胞被培养在3ml含有稳定的谷氨酰胺的RPMI1640全培养基中，其中所述RPMI1640全培养基被补充10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和来自含有细胞培养级试剂的储存溶液的核芬(Sigma-AldrichChemieGmbH，Taufkirchen，德国)以达到终浓度为10pg/ml的腺噤呤核苷、10吗/ml的脱氧腺苷和10pg/ml的胸腺嘧啶核苷。根据制造者的实验方案，使用Fugene6转染试剂(Roche，#11815091001)进行转染。将94plOptiMEM培养基(Invitrogen)和6piFugene6混合并在室温下孵化5分钟。接下来，对于每种构建体加入1.5吗DNA,混合并在室温下孵化15分钟。同时，使用1xPBS冲洗DHFR缺陷的CHO细胞，并在1.5ml的RPMI1640全培养基中重悬。使用600piRPMI1640全培养基稀释所述转染混合物，加到细胞上并在37。C、95%湿度和7%C02孵化过夜。转染后次日，每种方法的孵化体积被增加到5mlRPMI1640全培养。孵化3天后，收获上清液。17.MCSP和CD3跨种特异性的双特异性抗体的流式细胞结合分析为了测试跨种特异性的双特异性抗体构建体关于对人和猕猴MCSPD3和CD3相应的结合能力的功能性，进行FACS分析。为此目的，#皮人MCSPD3转染的CHO细胞(如实施例14中所述)和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig,ACC483)被用来测试对人抗原的结合。使用生成的猕猴MCSPD3转染子(如实施例15中所述)和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授，HygieneInstitute,Virology,Erlangen-Nuernberg友好地提供；发表在KnappeA等,和FickenscherH.，Blood2000,95，3256-61)测试猕猴抗原的结合反应性。相应细胞系的200,000个细胞与50^纯化的跨种特异性的双特异性抗体构建体蛋白(2吗/ml)或表达跨种特异性的双特异性抗体构建体的被转染细胞的细胞培养物上清液一起在冰上孵化30分钟。将所述细胞在含有2%FCS的PBS中冲洗两次，并使用鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen;以1:20在含有2%FCS的50piPBS中稀释)检测所述构建体的结合。沖洗之后，使用以1:100在含有2%FCS的PBS中稀释的偶合到藻红蛋白的Fcy特异性的抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未被转染的CHO细胞上清液纟皮用作对所述T细胞系的结合的阴性对照。具有不相关耙特异性的单链构建体被用作对MCSP-D3转染的CHO细胞的结合的阴性对照。在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞计量术；使用CellQuest软件获取和分析数据(BectonDickinsonbiosciences,Heidelberg)。按照CurrentProtocolsinImmunology(《免疫学实验室指南》)(Coligan,Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)中所述进行FACS染色和荧光强度的测量。如图14、15、16和58所示，对于MCSPD3有跨种特异性的以及对人和猕猴CD3有跨种特异性的如上所列单链分子的双特异性结合是可被清楚地3全测到的。在FACS分析中，对比于相应的阴性对照，所有构建体显示了对CD3和MCSPD3的结合。证明了所述双特异性抗体对人和猕猴CD3和MCSPD3抗原的跨种特异性。18.MCSP和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体的生物活性如图17和21所示，全部所生成的跨种特异性的双特异性单链抗体构建体显示了由人CD8+细胞引出的针对人MCSP阳性乾细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引出的针对食蟹猴MCSP阳性靶细胞的细胞毒性活性。含有不同靶特异性的双特异性单链抗体被用作阴性对照。19.MCSP和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体的血浆稳定性通过在50%的人血浆中于37。C和4。C将所述双特异性单链抗体孵化24小时和接下来对生物活性的测试来分析在人血浆中所生成的双特异性单链抗体的稳定性。使用MCSP阳性CHO细胞系(表达根据实施例14或15而克隆的MCSP)作为靶和被激发的CD8阳性T细胞作为效应细胞，通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定而研究生物活性。通过上述分析程序计算的ECso值被用于生物活性的比较，其中所述生物活性的比较是在50%的人血浆中分别于37。C和4。C孵化24小时的双特异性单链抗体与不加入血浆或与相同量血浆在测定前即刻混合的双特异性单链抗体的比较。如图22和表3所示，G4H-LxI2CH-L、G4H-LxH2CH-L和G4H-LxF12QH-L双特异性抗体的生物活性与不加入血浆或在测试生物活性前即刻加入血浆的对照相比，没有显著减少。表3:不加入或加入血浆的双特异性抗体的生物活性<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>20.人EGFR和CD3跨种特异性的双特异性单链分子的产生含有对人和食蟹猴CD3具有跨种特异性的结合域以及对人EGFR具有跨种特异性的结合域的双特异性单链抗体分子，按照下面表4所述被设计表4:EGFR和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体的形式<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>通过基因合成而获得前面提到的含有对人和食蟹猴EGFR具有跨种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)域的构建体。设计所述基因合成片段以使之首先含有构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，在框内接着是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，在框内接着是6组氨酸标记的编码序列和一个终止密码子。还设计所述基因合成片段以引入适合的N和C端限制位点。根据标准的实验方案(Sambrook,MolecularCloning;ALaboratoryManual(分子克隆；实验室手册)，第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork(2001)),通过这些限制位点将所述基因合成片段克隆进被称作pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR在Raum等CancerImmunollmmunother50(2001)141-150中被描述)。所述构建体被稳定地转染进DHFR缺陷的CHO细胞(ATCC号CRL9096)，以及按照实施例10中所述^皮生成和纯化。21.人EGFR和CD3跨种特异性的双特异性单链分子的产生含有对人和食蟹猴CD3具有跨种特异性的结合域以及对人EGFR具有跨种特异性的结合域的双特异性单链抗体分子，按照下面表5所述被设计:表5:EGFR和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体的形式<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>通过基因合成而获得前面提到的含有对人和食蟹猴EGFR具有跨种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)域的构建体。设计所述基因合成片段以使之首先含有构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，在框内接着是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，在框内接着是6组氨酸标记的编码序列和一个终止密码子。还设计所述基因合成片段以引入适合的N和C端限制位点。根据标准的实验方案(Sambrook，MolecularCloning;ALaboratoryManual(分子克隆；实验室手册)，第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork(2001))，通过这些限制位点将所述基因合成片段克隆进被称作pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR在Raum等CancerImmunollmmunother50(2001)141-150中被描述)。所述构建体被稳定地转染进DHFR缺陷的CHO细胞(ATCC号CRL9096)，以及按照实施例10中所述被生成和纯化。22.人Her2/neu和CD3跨种特异性的双特异性单链分子的产生含有对人和食蟹猴CD3具有跨种特异性的结合域以及对人Her2/neu具有跨种特异性的结合域的双特异性单链抗体分子，按照下面表6所述被设计表6:Her2/neu和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体的形式<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>通过基因合成而获得前面提到的含有对人和食蟹猴Her2/neu具有跨种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)域的构建体。设计所述基因合成片段以使之首先含有构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，在框内接着是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，在框内接着是6组氨酸标记的编码序列和一个终止密码子。还设计所述基因合成片段以引入适合的N和C端限制位点。根据标准的实-睑方案(Sambrook，MolecularCloning;ALaboratoryManual(分子克隆；实验室手册)，第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork(2001))，通过这些限制位点将所述基因合成片段克隆进被称作pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR在Raum等CancerImmunollmmunother50(2001)141-150中被描述)。所述构建体it稳定地转染进DHFR缺陷的CHO细胞(ATCC号CRL9096)，以及按照实施例10中所述^^皮生成和纯化。23.1.表i^AHER2的CHO细胞的产生如GenBank(登录号X03363)中所发表的人HER2的编码序列按照标准的实验方案通过基因合成被获得。设计所述基因合成片段以使之含有包括它的前导肽的人HER2蛋白的编码序列(所述构建体的cDNA和氨基酸序列被列在SEQIDNO459和460)。还设计所述基因合成片段以在所述片段的始端和末端引入限制位点。所述被引入的限制位点，即在5'端的Xbal和在3'端的Sa11，被用在如下克隆程序中。根据标准的实验方案，所述基因合成片段通过Xbal和Sail被克隆进称做pEFDHFR的质粒(pEFDHFR在Raum等CancerImmunollmmunother50(2001)141-150中被描述)。根净居标准的实验方案(Sambrook，MolecularCloning;ALaboratoryManual(分子克隆；实验室手册)，第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork(2001))，进行前面提到的程序。为构建体的真核表达，带有序列被证实的核苷酸序列的克隆被转染进DHFR缺陷的CHO细胞。按照KaufmannR丄(1990)MethodsEnzymol.185，537-566中所述在DHFR缺陷的CHO细胞中进行真核蛋白表达。所述构建体的基因扩增通过增加氨甲i莱呤(MTX)的浓度到终浓度达20nMMTX而被诱导。23.2.表达猕猴Her2的细胞外域的CHO细胞的产生修饰上述人Her2的编码序列以编码如GenBank(登录号XP—001090430)中所发表的猕猴Her2蛋白的氨基酸123至1038。根据标准的实验方案通过基因合成而获得这种嵌合蛋白的编码序列(所述构建体的cDNA和氨基酸序列被列在SEQIDNO461和462)。还设计所述基因合成片段以使之含有构建体真核表达的Kozak位点和在所述片段始端和末端的限制位点。所述被引入的限制位点即在5'端的Xbal和在3'端的Sail,被用在如下克隆程序中。所述基因合成片段然后通过Xbal和Sail被克隆进称做pEFDHFR的质粒(pEFDHFR在Raum等CancerImmunollmmunother50(2001)141-150中被描述)。如上所述，这种质粒的序列被证实的克隆被用来转染CHO/dhfr-细胞。23.3.HER2和CD3跨种特异性的双特异性单链分子的产生3丄跨种特异性的结合分子的克隆通常地，各包括对人和猕猴CD3s具有跨种特异性的结合特异性的域以及对人和猕猴HER2具有跨种特异性的结合特异性的域的双特异性单链抗体分子，按照下面表7所述ifc没计表7:抗CD3和抗HER2跨种特异性的双特异性单链抗体分子的形式<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>通过基因合成而获得前面提到的含有对人和猕猴HER2具有跨种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)域以及对人和猕猴CD3具有跨种特异性的CD3特异性的VH和VL的组合的构建体。设计所述基因合成片段以使之首先含有构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，在框内接着是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，在框内接着是6组氨酸标记的编码序列和一个终止密码子。还设计所述基因合成片段以在所述片段始端和末端引入适合的限制位点。所述被引入的限制位点被用在如下克隆程序中。根据标准的实验方案，所述基因合成片段通过这些限制位点被克隆进称做pEFDHFR的质粒(pEFDHFR在Raum等CancerImmunollmmimother50(2001)141-150中被描述)。根据标准的实-睑方案(Sambrook，MolecularCloning;ALaboratoryManual(分子克隆；实验室手册)，第3版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork(2001)),进行前面提到的步骤。为构建体的真核表达，带有序列被证实的核苷酸序列的克隆被转染进DHFR缺陷的CHO细胞。按照KaufmannR丄(1990)MethodsEnzymol.185，537-566中所述在DHFR缺陷的CHO细胞中进行真核蛋白表达。所述构建体的基因扩增通过增加氨曱蝶呤(MTX)的浓度到终浓度达20nMMTX而被诱导。3.2.双特异性单链抗体分子的表达和纯化在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达所述双特异性单链抗体分子。按照KaufmannR丄(1990)MethodsEnzymol.185，537-566中所述在DHFR缺陷的CHO细胞中进行真核蛋白表达。所述构建体的基因扩增通过加入增加浓度的氨甲蝶呤(MTX)到终浓度20nMMTX而祐:i秀导。在爷争止培养两代后，所述细胞在装有不含核苷的HyQPFCHO液体大豆培养基(含4.0mML-谷氨酰胺和0.1%的PluronicF-68;HyClone)的滚瓶中培养7天后收获。通过离心去除所述细胞，并将含有#皮表达蛋白的上清液储存在-80°C。根据制造者的实验方案，使用293fectin试剂(Invitrogen,#12347-019)进行转染。AktaExplorerSystem(GEHealthSystems)和Unicorn⑧软件被用作层析。根据制造者提供的实验方案，使用与ZnCl2—同装入的FractogelEMDchelate(Merck)进行固定化金属亲和层析("IMAC")。使用緩冲液A(20mM磷酸钠緩冲液，pH7.2,0.1MNaCl)平衡所述柱子，并以3ml/min的流速将所述细胞培养上清液(500ml)应用在所述柱子(10ml)。使用緩沖液A沖洗所述柱子以去除未被结合的样品。使用两步骤梯度的緩冲液B(20mM磷酸钠緩沖液，pH7.2，O.lMNaCl，0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白，其根据如下步骤1:6个柱容积的20%緩沖液B步骤2:6个柱容积的100%緩冲液B步骤2的被洗脱的蛋白组分被集中在一起而进一步纯化。所有化学制品都是研究级的，并购买自Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。在使用Equi緩冲液(25mM种檬酸盐，200mM赖氨酸，5%甘油，pH7.2)平衡的HiLoad16/60S叩erdex200制备级的柱子(GE/Amersham)上进行凝胶过滤层析。将被洗脱的蛋白样品(流速lml/min)经过标准的SDS-PAGE和Western印迹进行检测。在纯化前，为了确定分子量而校准所述柱子(分子量标志物试剂盒，SigmaMWGF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。在还原性条件下使用SDSPAGE分析;故纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE使用预制的4-12%BisTris胶(Invitrogen)进行。根据制造者提供的实验方案，进行样品的制备和应用。使用MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。使用胶态的Coomassie(Invitrogen实验方案)对凝胶进行染色。用SDS-PAGE确定的被分离的蛋白的纯度是〉95%。如PBS中凝胶过滤所确定，所述双特异性单链抗体在天然状态下具有约52kDa的分子量。根据这种方法纯化所有构建体。根据制造者提供的实验方案，使用OptitranBA-S83膜和InvitrogenBlotModule进行Western印迹。为了检测所述双特异性单链抗体蛋白抗体，使用了抗His标记抗体(5His，Qiagen)。碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的羊抗鼠Ig抗体被用作二抗，并且使用BCIP/NBT(Sigma)作为底物。在52kD检测到单个条带，其对应于被纯化的双特异性单链抗体。23.4.HER2和CD3跨种特异性的双特异性抗体的流式细胞结合分析为了测试跨种特异性的双特异性抗体构建体关于对人和猕猴HER2和CD3相应的结合能力的功能性，进行FACS分析。为此目的，如实施例23.1中所述被人HER2转染的CHO细胞和人CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ，Braunschweig,ACC483)被用来测试对人抗原的结合。使用如实施例23.2中所述生成的猕猴HER2转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授,HygieneInstitute,Virology，Erlangen-Nuernberg友好地提供；发表在KnappeA等,和FickenscherH.，Blood2000，95，3256-61)测试猕猴抗原的结合反应性。相应细胞系的200,000个细胞与50pl跨种特异性的双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(2吗/ml)—起在水上孵化30分钟。将所述细胞在含有2%FCS的PBS中冲洗两次，并使用鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen;以1:20在含有2%FCS的50^PBS中稀释)检测所述构建体的结合。冲洗之后，使用以1:100在含有2%FCS的PBS中稀释的偶合到藻红蛋白的FcY特异性的抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。含有2%FCS的PBS被用作对所述T细胞系以及对HER2转染的CHO细胞的结合的阴性对照。在FACS-Calibur仪器上进行流式细胞计量术；使用CellQuest软件获取和分冲斤数才居(BectonDickinsonbiosciences,Heidelberg)。4姿照、CurrentProtocolsinImmunology(《免疫学实-睑室指南》)(Coligan，Kruisbeek，Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience，2002)中所述进行FACS染色和荧光强度的测量。如图23所示，对于HER2有跨种特异性的以及对人和非黑猩猩灵长类CD3有跨种特异性的如上所列单链分子的双特异性结合是可被清楚地检测到的。在FACS分析中，对比于相应的阴性对照，所有构建体显示了对CD3和HER2的结合。证明了所述双特异性抗体对人和猕猴CD3和HER2抗原的跨种特异性。23.5.HER2和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体的生物活性使用实施例23.1和23.2中描述的HER2阳性细胞系，通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定而分析所生成的双特异性单链抗体的生物活性。作为效应细胞，使用被激发的人CD4/CD56清除的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx，如在相应的图中所详细i兌明。被激发的CD4/CD56清除的PBMC的生成按照如下进行使用终浓度为1pg/ml的商业上可得的抗CD3特异性抗体(例如0KT3、Othoclone)对培养皿(直径85mm,Nunc)在37。C进行涂布1小时。通过使用PBS的一个冲洗步骤去除未结合的蛋白。根据标准的实验方案，使用Ficoll梯度离心将新鲜的PBMC从外周血(30-50ml人血)中分离。在50ml含有稳定的谷氨酰胺的RPMI1640/10%FCS/TL-220U/ml(Proleukin,Chiron)中的3-5x107个PBMC被加入所述预涂布的培养皿，并被激发2天。在第三天，收集所述细胞，用RPMI1640冲洗一次。加入IL-2至终浓度20U/ml，并在与上述相同的细胞培养基中再将所述细胞培养一天。根据标准的实验方案清除CD4+T细胞和CD56+NK细胞，而使CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)富集。使用PBS冲洗輩巴细胞两次，并用含有50%FCS的终体积为100pl的RPMI中的1UMBq51Cr在37。C标记45分钟。接着，使用5mlRPMI将被标记的靶细胞沖洗3次，然后用于细胞毒性测定。所述测定在96孔板中的总体积为250pi的、E:T比率为1:1或10:1的^皮补充RPMI(如上)中进行，其在相应的图中被详细说明。l吗/ml的跨种特异性的双特异性单链抗体分子及其15-21个五倍稀释物;故应用。所述测定的时间是18小时，并且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大细胞溶解(加入Triton-X)和自发溶解(不含效应细胞)之间的差值的相对值。所有测量都一式四份地进行。铬在上清液中活性的测量是通过Wizard3、计数器(PerkinElmerLifeSciencesGmbH,K6ln，德国)而进行的。实验数据的分析是通过Prism4forWindows(版本4.02,GraphPadSoftwareInc.,SanDiego,California,美国)进行的。如所述寿t件所确定的S形的剂量响应曲线通常具有112值>0.90。通过所述分析程序计算的EC5o值被用于生物活性的比较。如图24所示，跨种特异性的双特异性单链抗体构建体证明由被激发的人CD4/CD56清除的PBMC引出的针对人HER2阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引出的针对猕猴HER2阳性耙细胞的细胞毒性活性。实施例24:人和猕猴的膜结合形式的IgE的克隆和表达鼠细月包系J558L(获得自InterlabProject,IstitutoNazionaleperlaRicercasulCancro，Genova,Italy,ECACC88032902)，即一种合成和分泌入轻链的自发性重链丧失的变异体骨髓瘤细胞系，被相应地附加有人和猕猴IgE的一种膜结合重链变异体。为了生成这种构建体，根据标准的实验方案，通过基因合成而获得合成的分子(所述构建体的核香酸序列被列在SEQIDNO507和508)。在这些构建体中，人和猕猴ce链的编码序列相应地被融合进人IgE的跨膜区域。VH链特异性的建立是针对半抗原(4-羟基-3-硝基-苯基)乙酰基)(NP)。还设计所述基因合成片段以使之含有构建体的真核表达的Kozak位点和免疫球蛋白的前导和在DNA的始端和末端的限制位点。所述^皮引入的限制位点即在5'端的EcoRI和在3'端的Sail在克隆入被称作pEFDHFR的表达质粒的步骤中使用。在序列被证实后(猕猴XM—001116734猕猴macacamulatta的Igs的C区域，mRNA;人NC—000014智人的染色体14，完整序歹寸，NationalCenterforBiotechnologyTnformadon(国家生物技术信息中心),http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)，所述质粒按照上述被用来转染CHO/dhfr-细胞。按照KaufmannR丄(1990)MethodsEnzymol.185，537-566中所述在DHFR缺陷的CHO细胞中进行真核蛋白表达。所述构建体的基因扩增通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度到终浓度达20nMMTX而被诱导。实施例25:IgE和CD3跨种特异性的双特异性单链分子的产生通常地，各包括对人和食蟹猴CD3抗原具有结合特异性的域以及对人和猕猴IgE抗原具有结合特异性的域的双特异性单链抗体分子，按照下面表8所述被设计表8:抗CD3和抗IgEi夸种特异性的双特异性单链抗体分子的形式<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>通过基因合成而获得前面提到的含有对人和猕猴IgE具有跨种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)域以及含有对人和猕猴CD3具有跨种特异性的CD3特异性的VH和VL的组合的构建体。设计所述基因合成片段以使之首先含有构建体的真核表达的Kozak位点，接着是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，在框内接着是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，在框内接着是6组氨酸标记的编码序列和一个终止密码子。还设计所述基因合成片段以在所述片段始端和末端引入适合的限制位点。所述被引入的限制位点被用在如下克隆程序中。根据标准的实验方案，所述基因合成片段通过这些限制位点被克隆进称做pEFDHFR的质粒。为构建体的真核表达，带有序列被证实的核苷酸序列的克隆被转染进DHFR缺陷的CHO细胞。按照KaufmannR.J.(1990)MethodsEnzymol.185，537-566中所述在DHFR缺陷的CHO细胞中进行真核蛋白表达。所述构建体的基因扩增通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度到终浓度达20nMMTX而被诸导。可选择地，根据标准的实验方案，所述构建体以瞬时方式被转染进DHFR缺陷的CHO细胞。使用人IgE转染的J558L细胞系进行所述FACS结合实验以评估对人IgE的结合能力。通过使用被猕猴IgE转染的J558L细胞而测试对猕猴IgE阳性细胞的跨种特异性。相同的细胞系变化也应用于使用IgE和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体进行的细胞毒性测定。除此之外，如实施例4和5中所述进行所述测定。如图23中所示，生成的IgE和CD3跨种特异性的双特异性单链抗体证明了对人和食蟹猴抗原二者的结合，并证明了是完全跨种特异性的。如图24中所示，所有生成的跨种特异性的双特异性单链抗体构建体揭示了由人CD8+细胞引出的针对人IgE阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引出的针对猕猴IgE阳性靶细胞的细胞毒性活性。作为阴性对照，使用不相关的双特异性单链抗体。实施例26:scFv克隆对人CD3s的N端的特异性结合26.1.scFv构建体在大肠杆菌XL1Blue中的细菌表达如前所述，被含有VL和VH片段的pComb3H5Bhis/Flag转化的大肠杆菌XL1Blue在切除基因III片段并用1mMIPTG诱导后产生足够量的可溶性scFv。所述scFv链被输出到周质中，在其中它折叠成功能构象。下面的scFv克隆被选作此实验i)如WO2004/106380中所述的scFv4隱10、3-106、3-114、3-148、4-48、3-190和3-271。ii)如本文所述的来自人抗CD3s结合克隆H2C、F12Q和I2C的scFv。对于周质制品，^皮含有允许周质表达的质粒的相应的scFv转化的细菌细胞被种在补充有20mMMgCl2和50ng/ml羧卡青霉素的SB培养基中，并在收获后重新溶解在PBS中。通过在-70。C冷冻并在37。C解冻四次，细菌的外膜被渗透压冲击而被破坏，而且包括scFv在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。在通过离心清除了完整细胞和细胞碎屑后，含有人抗人CD3-scFv的所述上清液被收集并用作进一步的检验。这些含有scFv的原始上清液将被进一步命名为周质制品(PPP)。26.2.scFv对人CD3s(aa1-27)-Fc融合蛋白的结合通过将人CD3s(aa1-27)-Fc融合蛋白涂布在96孔塑料板(Nunc，maxisorb)的孔中，通常于4。C过夜进行ELISA实验。然后去除抗原涂布溶液，用PBS/0.05%吐温20冲洗孔一次，并接着用PBS/3%BSA封闭至少一小时。在去除所述封闭溶液后，将PPP和对照溶液加入孔中并通常在室温下孵化一小时。然后用PBS/0.05%吐温20沖洗孔三次。使用生物素标记的抗FLAG标记抗体(M2抗Flag-Bio,Sigma,通常纟冬浓度为1pg/mlPBS)进行对结合至固定化的抗原的scFv的检测，并且用过氧化物酶标记的链霉抗生物素(Streptavidine)(Dianova，1pg/mlPBS)检测。通过加入ABTS底物溶液显示所述信号，并在405nm波长处4全测。所述测试样品对封闭剂和/或人CD3s(aa1-27)-Fc融合蛋白的人IgGl部分的非特异性同时间的相同测定而得到检验。PBS被用作阴性对照。如图25所示，scFvH2C、F12Q和I2C在人CD3s(aa1-27)-Fc融合蛋白上显示强的结合信号。人scFv3-106、3-114、3-]48、3-190、3-271、4-10和4-48(如WO2004/106380中所述)不显示任何显著高于阴性对照水平的结合。为了排除scFvH2C、F12Q和I2C对涂布有人CD3s(aa1-27)-Fc融合蛋白的孔的阳性结合可能是由于对BSA(被用作封闭剂)和/或人CD3s(aa1-27)-Fc融合蛋白的人TgGlFc-y部分的结合所致的可能性，平行地进行第二个ELISA实验。在这第二个ELTSA实验中，所有参数都与第一个EUSA实验中的那些一样，除了在第二个ELTSA实验中使用人IgGl(Sigma)代替人CD3e(aa1-27)-Fc融合蛋白进行涂布。如图26所示，被测的scFv中没有一个显示任何高于背景水平的对BSA和/或人IgGl的显著结合。总之，这些结果允许这样的结论scFv4-10、3-271、3-148、3-190、4-48、3-106和3-U4不对人CD3s(1-27)区域特异性地结合，然而scFvH2C、F12Q和I2C清楚地显示对人CD3s的N端27个氨基酸的特异性结合。<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>ESEEEEE三EEEiEEEEE39H2C的VL-P人工的氨基酸GSIiGGKAALTXSGVQPEDEAEYYCAIjWYSNRWVFGGGTKLTVL40H2C的VL-P人工的核香酸TA41H2C的VH-VL人工的氨基酸42H2C的VH-VL人工的核普酸EEEEEEEEEEiEEEEEEEi200880014225.5势溢也被lll/257:a;<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>50HIE的CDR-H3人工的氨基酸HGNFGNSYLSFWAY51HIE的VH人工的氨基酸=============■52HIE的VH人工的核芬酸TATCCTTCTGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCCTC53HIE的VL人工的氨基酸GSKLGGKAALTLSGVGPEDEAEYYCALWYSNRWVrcGGTKLTVIi54H1E的VL人工的核苷酸TA55HIE的VH-P人工的氨基酸============YYADS56HIE的VH-P人工的核苦酸ESESEEES三EEEEEEE200880014225.5势溢也被113/257:a;<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>G4H的VL-P人工的核苷酸EEEEEEEEEE三EEEEEETA77G4H的VH-VL人工的氨基酸SEEEEEEEEEESiEEES===78G4H的VH-VL人工的核香酸EEESEEEEEEiEEEEEEEiTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA79G4H的VH-VL-P人工的氨基酸200880014225.5势溢也被117/257:a;<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>LAPGTPARFSGSLLGG画TLSGVQ隨AEYYCALWYSN丽GGGTKL，114E1L的VH-VL人工的核普酸i三EEEiiiEEEEEEiEiTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA115EIL的VH-VL-P人工的氨基酸116EIL的VH-VL-P人工的核苦酸200880014225.5势溢1被123/257:a;<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table>AAGTGGATATCAAA233MCSP-D2的VH-VL人工的氨基酸VPDRFSGSGSGTDFTLT工SGIjQAEDVAVYYCQQHYSTPFTFGPGTKVD工K234MCSP-D2的VH-VL人工的核香酸GGACCAAAGTGGATATCAAA235MCSP-D2的VH-VL-P人工的氨基酸236MCSP-D2的VH-VL-P人工的核普酸======================200880014225.5势溢1被142/257:a;<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage177</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage178</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage179</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage180</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage183</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage184</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage185</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage186</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage187</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage188</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage189</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage190</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage191</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage192</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage193</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage194</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage195</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage196</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage197</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage198</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage199</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage200</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage201</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage202</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage203</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage204</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage205</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage206</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage207</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage208</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage209</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage210</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage211</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage212</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage213</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage214</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage215</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage216</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage217</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage218</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage219</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage220</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage221</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage222</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage223</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage224</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage225</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage226</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage227</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage228</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage229</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage230</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage231</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage232</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage233</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage234</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage235</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage236</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage237</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage238</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage239</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage240</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage241</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage242</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage243</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage244</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage245</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage246</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage247</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage248</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage249</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage250</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage251</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage252</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage253</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage254</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage255</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage256</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage257</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage258</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage259</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage260</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage261</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage262</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage263</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage264</column></row><table>权利要求1.一种多肽，其包括能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3ε(ε)链的表位的第一结合域和能够结合到人类和/或非黑猩猩灵长类的EGFR、Her2/neu或IgE的第二结合域，其中所述表位是包括在由SEQIDNO.2、4、6或8组成的组中的氨基酸序列的一部分。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3e(s)链的表位的第一结合域是人类来源的。3.根据权利要求1或2中任一项所述的多肽，其中所述能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的第一结合域包括VL区域，所述VL区域包括选自如下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3:(a)SEQIDNO.27所示CDR-L1、SEQIDNO.28所示CDR-L2和SEQIDNO.29所示CDR-L3;(b)SEQIDNO.117所示CDR-L1、SEQIDNO.118所示CDR-L2和SEQIDNO.119所示CDR-L3;以及(c)SEQIDNO.153所示CDR-L1、SEQIDNO.154所示CDR-L2和SEQIDNO.155所示CDR-L3。4.根据权利要求1或2中任一项所述的多肽，其中所述能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3e链的表位的第一结合域包括VH区域，其中所述VH区域包括选自如下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3:(a)SEQIDNO.12所示CDR-H1、SEQIDNO.13所示CDR-H2和SEQIDNO.14所示CDR-H3;(b)SEQIDNO.30所示CDR-H1、SEQIDNO.31所示CDR-H2和SEQIDNO.32所示CDR-H3;(c)SEQIDNO.48所示CDR-H1、SEQIDNO.49所示CDR-H2和SEQIDNO.50所示CDR-H3;(d)SEQIDNO.66所示CDR-H1、SEQIDNO.67所示CDR-H2和SEQIDNO.68所示CDR-H3;(e)SEQIDNO.84所示CDR-Hl、SEQIDNO.85所示CDR-H2和SEQIDNO.86所示CDR-H3;(f)SEQIDNO.102所示CDR-Hl、SEQIDNO.103所示CDR-H2和SEQIDNO.104所示CDR-H3;(g)SEQIDNO.120所示CDR-Hl、SEQIDNO.121所示CDR-H2和SEQIDNO.122所示CDR-H3;(h)SEQIDNO.138所示CDR-Hl、SEQIDNO.139所示CDR-H2和SEQIDNO.140所示CDR-H3;(i)SEQIDNO.156所示CDR-Hl、SEQIDNO.157所示CDR-H2和SEQIDNO.158所示CDR-H3;以及(j)SEQIDNO.174所示CDR画Hl、SEQIDNO.175所示CDR-H2和SEQIDNO.176所示CDR腸H3。5.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3e链的表位的第一结合域包括VL区域，所述VL区域选自由SEQIDNO.35、39、125、129、161或165所示VL区域组成的组。6.根据权利要求1或2和4中任一项所述的多肽，其中所述能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的第一结合域包括VH区域，所述VH区域选自由SEQIDNO.15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181所示VH区i或组成的组。7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的第一结合域包括选自由如下所组成的组的VL区域和VH区域(a)SEQIDNO.17或21所示VL区域和SEQIDNO.15或19所示VH区域；(b)SEQIDNO.35或39所示VL区域和SEQIDNO.33或37所示VH区域；(c)SEQIDNO.53或57所示VL区域和SEQIDNO.51或55所示VH区域；(d)SEQTDNO.71或75所示VL区域和SEQIDNO.69或73所示VH区域；(e)SEQIDNO.89或93所示VL区域和SEQIDNO.87或91所示VH区域；(f)SEQIDNO.107或111所示VL区域和SEQIDNO.105或109所示VH区域；(g)SEQIDNO.125或129所示VL区域和SEQIDNO.123或127所示VH区域；(h)SEQIDNO.143或147所示VL区域和SEQIDNO.141或145所示VH区域；(i)SEQIDNO.161或165所示VL区域和SEQIDNO.159或163所示VH区域；以及(j)SEQIDNO.179或183所示VL区域和SEQIDNO.177或181所示VH区域。8.根据权利要求7中所述的多肽，其中所述能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3s链的表位的第一结合域包括选自由SEQIDNO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187所组成的组的氨基酸序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中所述多肽是双特异性单链抗体分子。10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述双特异性单链抗体分子包括一组如下序列选自SEQIDNO:44卜446、SEQIDNO:453-458、SEQIDNO:463-468、SEQIDNO:481-486的第二结合域中的CDRHI、CDRH2、CDRH3、CDRLI、CDRL2和CDRL3。11.根据权利要求9所述的多肽，其中所述双特异性单链抗体分子包括选自如下的序列(a)SEQIDNO:389、391、393、395、397、399、409、411、413、415、417、419、429、431、433、435、437、439、447、449、451、469、471、473、475、477、479、495、497、499、501、503和505中任何一个所示的氨基酸序列；以及(b)SEQIDNO:390、392、394、396、398、400、410、412、414、416、418、420、430、432、434、436、438、440、448、450、452、470、472、474、476、478、480、496、498、500、502、504和506中任何一个所示的核酸序列所编码的M酸序列。12.—种核酸序列，其编码权利要求1至11中任一项所定义的多肽。13.—种载体，其包括权利要求12所定义的核酸序列。14.根据权利要求13所述的载体，其中所述载体还包括调节序列，所述调节序列可操作地连接到权利要求12定义的所述核酸序列。15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体是表达载体。16.—种宿主，其被权利要求13至15中任一项所定义的载体转化或转染。17.—种生产根据权利要求1至11中任一项的多肽的过程，所述过程包括在允许权利要求1至11中任一项所定义的多肽表达的条件下培养权利要求16定义的宿主，并从培养物中收集产生的多肽。18.—种药物组合物，其包括根据权利要求1至11中任一项的多肽或根据权利要求17所述的过程生产的多肽。19.根据权利要求18所述的药物组合物，其还包括载体、稳定剂和/或赋形剂的适合制剂。20.—种药物组合物，其包括根据权利要求1至11中任一项的多肽或根据权利要求17所述的过程生产的多肽，用于预防、治疗或改善选自增生性疾病、肺瘤性疾病或免疫性病症的疾病。21.根据权利要求20所述的药物组合物，其还包括载体、稳定剂和/或赋形剂的适合制剂。22.根据权利要求1至11中任一项所定义的多肽或根据权利要求17生产的多肽制备用于预防、治疗或改善疾病的药物组合物的用途。23.根据权利要求22所述的用途，其中所述疾病是增生性疾病、胂瘤性疾病或免疫性病症。24.根据权利要求23所述的用途，其中所述肿瘤性疾病是恶性疾病。25.根据权利要求22至24中任一项所述的用途，其中所述药物组合物适合与其他药物联合施用。26.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物是非蛋白质性质的化合物或蛋白质性质的化合物。27.根据权利要求26所述的用途，其中所述蛋白质性质的化合物或非蛋白质性质的化合物与根据权利要求18或19的药物组合物同时或不同时施用。28.—种用来预防、治疗或改善有此需要的受治疗者的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求8或9的药物组合物的步骤。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述疾病是增生性疾病、肺瘤性疾病或免疫性病症。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述肺瘤性疾病是恶性疾病。31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述药物组合物与其他药物联合施用。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述药物是非蛋白质性质的化合物或蛋白质性质的化合物。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述蛋白质性质的化合物或非蛋白质性质的化合物与根据权利要求18或19的药物组合物同时或不同时施用。34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述受治疗者是人。35.—种试剂盒，其包括权利要求1至11中任一项所定义的多肽、权利要求12所定义的核酸分子、权利要求13至15中任一项所定义的载体或权利要求16所定义的宿主。全文摘要本发明涉及一种多肽，其包括能够结合到人类和非黑猩猩灵长类CD3(ε)链的表位的第一人类结合域和能够结合到人类和/或非黑猩猩灵长类的EGFR、Her2/neu或IgE的第二结合域，还涉及生产所述多肽的过程。本发明进一步涉及编码所述多肽的核酸、包括所述核酸的载体和包括所述载体的宿主细胞。在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括所述多肽及所述多肽的医疗用途。文档编号C07K14/725GK101675077SQ200880014225公开日2010年3月17日申请日期2008年4月3日优先权日2007年4月3日发明者帕特里克·霍夫曼,彼得·库菲,托拜厄斯·劳姆,拉尔夫·鲁特布瑟,桃瑞丝·芳,罗曼·基谢尔,苏珊娜·曼高德,马赛厄斯·克林格申请人:米克罗麦特股份公司