专利名称：牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及鱼类红细胞的采集处理和红细胞外膜蛋白制备技术领域。
背景技术：
牙鲆在我国俗称牙片、偏口，品种优良，生长快速，肉质鲜美，是我国优 良的海水鱼类增养殖品种之一。目前随着牙鲆养殖业的发展，养殖规模的扩大， 养殖牙鲆各种病害频繁爆发，造成了巨大的经济损失。鱼类具备一个相对完善 的免疫系统，可通过特异性和非特异性免疫来防御各种病原的侵袭。外周血细
胞是鱼类非特异性免疫防御体系中的重要防线之一"2。但是有关鱼类红细胞免疫 功能以及红细胞免疫分子的研究尚未见明确报道，对于牙鲆红细胞外膜蛋白的 制备技术仍属空白。
目前针对鱼类红细胞免疫功能和红细胞外膜蛋白的研究，存在以下几个问
题
1. 鱼类红细胞的免疫功能没有引起研究人员的重视
一般认为，红细胞的主要功能是携带02和0)2，但是1981年Siegel提出了"红 细胞免疫系统的新概念，促进了红细胞免疫研究发展3。这些工作在人类以及其 他哺乳类和鸟类中开展最多，但在鱼类中有关红细胞免疫的报道很少，认识不 够。
2. 有关鱼类红细胞免疫机理的研究基础薄弱
对于鱼类红细胞免疫功能的作用机理尚不了解，参与免疫反应的重要分子 和作用方式也未査明，缺乏对红细胞免疫分子的深入分析和鉴定，无从下手开 展研究。
3. 有关鱼类红细胞外膜蛋白的制备未见报道
目前有关细胞膜蛋白的研究多集中于高等脊椎动物，而有关低等的鱼类细 胞膜的研究还未见报道4。 参考文献
1.周永灿，邢玉娜，冯全英.鱼类血细胞研究进展.海南大学学报(自然 科学版)，2003, 21 (2): 171-176。2. 邢婧，战文斌，曾晓华等.牙鲆(尸ar^ic力^^s o"race^)红细胞单克 隆抗体与五种养殖鱼类血细胞的交叉反应.海洋与湖沼，2005 36(2): 123-129。
3. Siegel I， Liu T L， Gleicher N. The red—cell immune system. Lancet. 1981 12; 2 (8246):556-9。
4. 张领兵，伦艳妮，于乐洋等SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳与液质联用技术分 离和鉴定小鼠巨噬细胞膜蛋白.中国生物工程杂志，2007, 27 (4): 77_82。
发明内容
本方法的主要原理根据外周血不同类型细胞的密度不同，选用合适比重 的分离液将红细胞从外周血细胞中分离出来获得单组分，从而排除其他细胞 的影响。利用添加了蛋白酶抑制剂的低渗溶液溶胀红细胞获得细胞膜组分，再 通过温和的膜蛋白裂解液以及冰浴涡旋搅拌的方式，将膜蛋白成分提取出来。
本发明是在经过实验摸索优化实验条件和流程，建立了牙鲆红细胞外膜蛋 白的制备技术，技术方案如下
(1) 用5 mL —次性无菌注射器分别从4条体K 20 cm左右的实验牙鲆的尾 静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血1:1 1.5混合。收集抗凝血冰盒中暂 存。
(2) 利用比重为1.08 1.09的淋巴细胞分离液分离牙鲆外周血中的红细胞。 将抗凝血用O. 1 M PBS缓冲液1:1稀释，与淋巴细胞分离液按l: 2比例混合，于 4"C条件K3000 rpm水平离心15 min。离心后外周血细胞分为4层，小心吸走上 层的分离液、白细胞和血浆，将底层的红细胞沉淀用O. 1 M PBS缓冲液4'C离心 洗涤3次，去除上清液。
(3) 向红细胞沉淀中加入20倍体积的低渗缓冲液，置于4。C条件下30 min， 使红细胞充分溶胀破膜。4。C条件下，12000 rpm离心15 min收集牙鲆红细胞膜 沉淀。
(4) 向红细胞膜沉淀中加入10 15 mL低渗缓冲液，用漩涡混合器将红细胞 膜沉淀打散，4'C条件下12000 rpm， 15 min离心，得到经洗涤的红细胞膜沉淀。 重复上述洗涤步骤2 4次。
(5) 向牙鲆红细胞膜沉淀中加入2 3倍体积的膜蛋白裂解液，磁力搅拌过 夜，以充分裂解牙鲆红细胞膜。裂解过程于冰浴中进行。(6)裂解后所得溶液于4"下，12000 rpm离心30 min，上清液即为牙鲆红 细胞膜蛋白提取液。分装后于-8(TC冰箱中保存。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒 检测牙鲆细胞膜蛋白提取液的蛋白浓度。
本制备方法相比与现有文献中描述的方法程序更为简单，效率更好，既保 证了膜蛋闩制备的高效性，乂保持il莫蛋白的生物活性。
图1.分离牙鲆红细胞；利用1. 08-1. 09的淋巴细胞分离液分离外周血细胞 中的红细胞，从上到下分别为分离液、淋巴细胞层、血浆层、红细胞层。
图2.牙鲆红细胞外膜蛋白电泳；利用SDS-PAGE电泳分析制备的牙鲆红细 胞外膜蛋白组分。
图3.根据BCA蛋白浓度测定试剂盒操作手册和实验中绘制的标准曲线可 以计算牙鲆红细胞膜蛋白提取液的蛋白浓度。
具体实施例方式
具体实施中使用的专用液配方
(1) 低渗缓冲液
5 mM PBS缓冲液(pH 7. 8) ， 0. 5 mM EDTA ， 1 u g/mL抑肽酶(Aprotinin)。
(2) 膜蛋白裂解液
50 mM Tris-HC1 (pH 7.8)， 150 raM NaCl， 1% Triton X-100， 0.1% SDS， 1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)， 1 yg/mL Aprotinin, 1% NP 40， 0. 5%去氧胆酸 钠，5 mM PBS， 0. 5 mM EDTA， 0.85%生理盐水。
(3) 阿氏抗凝剂液
葡萄糖 2.05 g 柠檬酸钠 0.8 g 柠檬酸 0.055 g 氯化钠 0.42 g加蒸馏水至100 mL，加热溶解后将pH值调到6. 1，经8磅(115。C)， 15分钟的高压灭菌后分装。 实施例l
具体操作步骤为
(1) 用5 mL —次性无菌注射器分别从4条体长20 cm左右的实验牙鲆的尾 静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙軤外周血l:l混合。收集抗凝血冰盒中暂存。
(2) 利用比重为l. 08 1. 09的淋巴细胞分离液分离牙鲆外周血中的红细胞。 将抗凝血用O. 1 M PBS缓冲液1:1稀释，与淋巴细胞分离液按l: 2比例混合，于
64。C条件下3000 rpm水平离心15 min。离心后外周血细胞分为4层，小心吸走上 层的分离液、白细胞和血浆，将底层的红细胞沉淀用O. 1 M PBS缓冲液4。C离心 洗涤3次，去除上清液。
(3) 向红细胞沉淀中加入20倍体积的低渗缓冲液，置于4"C条件下30 min， 使红细胞充分溶胀破膜。4'C条件下，12000 rpm离心15 min收集牙鲆红细胞膜 沉淀。
(4) 向红细胞膜沉淀中加入IO mL低渗缓冲液，用漩涡混合器将红细胞膜沉 淀打散，4'C条件下12000 rpm， 15 min离心得到经洗涤的红细胞膜沉淀，重复 这一洗涤3次。
(5) 向牙鲆红细胞膜沉淀中加入2倍体积的膜蛋白裂解液，磁力搅拌过夜， 以充分裂解牙鲆红细胞膜。裂解过程于冰浴中进行。
(6) 裂解后所得溶液于4。C下，12000 rpm离心30 min，上清即为牙鲆红细 胞膜蛋白提取液。分装后于-8(TC冰箱中保存。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检 测牙鲆细胞膜蛋白提取液的蛋白浓度。
样品(体积吸收值(A62。)吸收值(A舰)
00. 1080. 055
10. 1120. 064
20. 1170. 075
阳性对照样品40.1280. 105
80. 1470. 123
120. 1670. 154
160. 1890. 187
200. 2160. 228
膜蛋白提取液200.2190. 225
根据BCA蛋白浓度测定试剂盒操作手册和实验中绘制的标准曲线，计算牙 鲆红细胞膜蛋白提取液的蛋白浓度50.23 Pg/uL。 实施例2
具体操作步骤为(1) 用5 mL —次性无菌注射器分别从4条体长20 cm左右的实验牙鲆的尾静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血l: 1.5混合。收集抗凝血冰盒中暂存。
(2) 利用比重为l. 08 1. 09的淋巴细胞分离液分离牙鲆外周血中的红细胞。将抗凝血用O. 1 M PBS缓冲液1:1稀释，与淋巴细胞分离液按l: 2比例混合，于4。C条件下3000 rpm水平离心15 min。离心后外周血细胞分为4层，小心吸走h层的分离液、白细胞和血浆，将底层的红细胞沉淀用O. 1 M PBS缓冲液4。C离心洗涤3次，去除上清液。
(3) 向红细胞沉淀中加入20倍休积的低渗缓冲液，置于4。C条件下30 min，使红细胞充分溶胀破膜。4。C下，12000 rpm离心15 min收集牙鲆红细胞膜沉淀。
(4) 向红细胞膜沉淀中加入15 mL低渗缓冲液，用漩涡混合器将红细胞膜沉淀打散，4。C条件下12000 rpm， 15 min离心得红细胞膜沉淀，再将红细胞膜沉淀重复上述步骤洗涤2次，得到洗净得红细胞膜沉淀。
(5) 向牙鲆红细胞膜沉淀中加入3倍体积的膜蛋白裂解液，磁力搅拌过夜，以充分裂解牙鲆红细胞膜。裂解过程于冰浴中进行。
(6) 裂解后所得溶液于4'C下，12000 rpm离心30 min，上清即为牙鲆红细胞膜蛋白提取液。分装后于-8(TC冰箱中保存。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测牙鲆细胞膜蛋白提取液的蛋白浓度为50. 23 u g/u L。
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权利要求
1. 牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法，其特征在于操作步骤为(1)用5mL一次性无菌注射器分别从4条体长20cm左右的实验牙鲆的尾静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血1:1～1.5混合，收集抗凝血冰盒中暂存；(2)将抗凝血用0. 1M PBS缓冲液1:1稀释，与比重为1.08～1.09的淋巴细胞分离液按12比例混合，于4℃条件下3000rpm水平离心15min；离心后外周血细胞分为4层，小心吸走上层的分离液、白细胞和血浆，将底层的红细胞沉淀用0.1M PBS缓冲液4℃离心洗涤3次，去除上清液；(3)向红细胞沉淀中加入20倍体积的低渗缓冲液，置于4℃条件下30min，使红细胞充分溶胀破膜，4℃条件下，12000rpm离心15min收集牙鲆红细胞膜沉淀；(4)向红细胞膜沉淀中加入10～15mL低渗缓冲液，用漩涡混合器将红细胞膜沉淀打散，4℃条件下12000rpm，15min离心，得到经洗涤的红细胞膜沉淀，重复上述洗涤步骤2～4次；(5)向牙鲆红细胞膜沉淀中加入2～3倍体积的膜蛋白裂解液，磁力搅拌过夜，以充分裂解牙鲆红细胞膜，裂解过程于冰浴中进行；(6)裂解后所得溶液于4℃下，12000rpm离心30min，上清即为牙鲆红细胞膜蛋白提取液，分装后于-80℃冰箱中保存，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测牙鲆细胞膜蛋白提取液的蛋白浓度。
2. 根据权利要求1所述牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法，其特征在于使用的专用液配方为(1) 低渗缓冲液5 mM pH 7. 8的PBS缓冲液，0. 5 mM EDTA ， 1 u g/mL抑肽酶；(2) 膜蛋白裂解液50 mM pH 7. 8的Tris-HC1, 150 mM NaCl， 1% Triton X-100， 0.1% SDS，lmM苯甲基磺酰氟，1 ug/mL Aprotinin， 1% NP 40， 0. 5%去氧胆酸钠，5 mMPBS, 0. 5 mM EDTA， 0. 85%生理盐水；(3) 阿氏抗凝剂液葡萄糖2.05 g，柠檬酸钠0.8 g，柠檬酸0.055 g，氯化钠0.42 g，加蒸馏水至100 mL，加热溶解后将pH值调到6. 1，经8磅(115。C)， 15分钟的高压灭菌后分装。
3.根据权利要求l所述牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法，其特征在于操作步骤(4)中用低渗缓冲液重复洗涤步骤3次。
全文摘要
牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法。从牙鲆的尾静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血混合；将其用PBS缓冲液稀释并与分离液混合，于4℃条件离心，将底层的红细胞沉淀用PBS缓冲液4℃离心洗涤以去除上清液。加入低渗缓冲液，置于4℃下使红细胞充分溶胀破膜。4℃条件下离心收集牙鲆红细胞膜沉淀。加入低渗缓冲液，用漩涡混合器将红细胞膜沉淀打散，4℃条件下离心洗涤红细胞膜沉淀。加入膜蛋白裂解液，搅拌以充分裂解牙鲆红细胞膜，4℃下离心，上清即为牙鲆红细胞膜蛋白提取液。分装后于-80℃冰箱中保存。本发明的方法与现有技术相比更为简单，效率更好，既保证了膜蛋白制备的高效性，又保持了膜蛋白的生物活性。
文档编号C07K1/00GK101463071SQ20091001009
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月13日 优先权日2009年1月13日
发明者伟 张, 张振冬, 王淑芬, 邹亚男 申请人:张振冬