专利名称：鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗 抗原蛋白与应用。
背景技术：
鳗利斯顿氏菌U&to"e〃am2gw/〃an/w)是一种革兰氏阴性杆状细菌， 是淡水和海水养殖鱼类和野生鱼类的病原菌，引起鱼类的出血性败血症， 造成世界范围鱼类养殖的重大经济损失。在我国，鳗利斯顿氏菌不仅是 养殖对虫下红腿病症的病原，还是舻鱼、牙鲆、大菱鲆、石斑鱼和欧洲鳗 鲡等鱼类的皮肤肌肉溃烂、出血症病原，对我国养殖鱼类的危害巨大。
VI型分泌系统(Type VI Secret System, T6SS )是最近确定的一种新 的细菌分泌系统，它参与细菌的致病作用，并已经在多个植物或动物的 病原菌中发现。目前的研究表明，革兰氏阴性细菌的T6SS基因簇结构比 较保守， 一般由12至25个基因组成，其中包括一个基质蛋白基因/2^。 /^p基因在不同细菌中具有较高的保守性，它编码的蛋白在T6SS的分泌 过程中具有重要作用，研究表明它可能作为T6SS的基质蛋白参与组装分 泌通道，/zc/7基因的缺失可以阻断T6SS的分泌。但目前还没有关于HCP 蛋白具有免疫保护效果的文献报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。
为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为
鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白鳗利斯顿氏菌"力cp基因核酸 碱基序列如序列表SEQ ID N0: 1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌 亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO: 2所示。
鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白的应用所述鳗利斯顿氏菌亚单 位疫苗抗原蛋白具有激发鱼体对鳗利斯顿氏菌病的免疫力。
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂或不完全 弗氏佐剂，按体积1:1比例将其混合，而后以20吗蛋白/g鱼体重-0.2ing 蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于鱼体。
本发明所具有优点如下
1. /^p基因在细菌中的保守性较高，本发明以/"/zw基因的表达蛋白 制备的亚单位疫苗可以拓宽疫苗保护谱、增加疫苗的免疫协同作用，诱 导水产养殖动物的非特异性和特异性免疫应答，并提供保护效应。
2. 本发明表达蛋白可激发鱼体产生特异性抗体，抵抗鳗利斯顿氏菌的感染，可用于水产鱼类养殖中鳗利斯顿氏菌引起疾病的预防中。
3.本发明的抗原蛋白制备方法简单，可应用于大规模工业化生产。
图1为本发明鳗利斯顿氏菌/a/2C/7基因核酸电泳图。
图2为本发明鳗利斯顿氏菌LAHCP表达纯化蛋白SDS-PAGE电泳图。
图3为本发明鳗利斯顿氏菌LAHCP表达纯化蛋白质谱分析结果。 图4为使用本发明疫苗免疫牙鲆后鳗利斯顿氏菌感染牙鲆死亡情况图。
图5为使用本发明疫苗免疫蓝鳗龙后鳗利斯顿氏菌感染蓝鳗龙死亡 情况图。为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆血清抗鳗利斯顿氏菌抗体效价 变化情况图。
图6为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆血清抗LAHCP抗体效价变化情 况图。
具体实施例方式
下面根据
和实施例对本发明作进一 步说明。 实施例1
根据鳗利斯顿氏菌T6SS基质蛋白基因^的核酸序列，以及载体 pETDuet (购自Novagen公司)的酶切图谱设计扩增引物
lahcp國for-EcoRI: 5，-GGCGAATTCATGCCAACTGCATG-3，(下划线 碱基序列为限制性内切酶EcoRI的识别位点)；
lahcp-rev画SalI: 5，-ATCGGTCGACTTACGCTTCAACAG3，(下划线 碱基序列为限制性内切酶Sail的识别位点)。
以鳗利斯顿氏菌基因组DNA为模板进行PCR扩增反应(PCR仪购 自Takara公司，型号TP600),反应体系与反应参数如下(试剂尽量用 中文表示)
PCR反应体系(25pL)
10xPCR buffer 2.5 pL
dNTP混合液 0.5pL (各0.2 mM)
MgCl2 2攀(1.5mM) 引物lahcp画for-EcoRI 0.5jiL (0.5 pM)
引物lahcp-rev-SalI 0.5pL (0.5 pM)
鳗利斯顿氏菌基因组DNA 1 .(VL (30 ng)
Taq酶 0.25jnL(5U/VL) 灭备双蒸水 17.75pL 反应体系 25.0jiL PCR反应参数
95 °C 3min<formula>formula see original document page 5</formula>
反应结東后，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得一个 519bp的DNA片段(参见图1 )。使用PCR产物纯化试剂盒(Invitrogen 公司)回收目的片断，将目的片断与pGMT (tiangen公司)载体连接， 连接反应体系如下
连接反应体系(10pL)
10xligation buffer 1 (iL
聚乙二醇 luL pGM-T l^L PCR产物 3pL T4连接酶 lpL 灭菌双蒸水 3)aL 反应体系 lO)iL 反应混合物于16"C恒温过夜。取全部连接产物转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，釆用抗生素(氨苄青霉素)与a互补实验筛选目标重组质 粒阳性大肠杆菌单菌落，提质粒，将此重组质粒命名为pGMT-lahcp,对 其进行测序(上海博亚公司)，测序结果表明获得了序列正确的鳗利斯顿 氏菌/a/zcp基因片断(参见序列表SEQIDNO: 1)。 SEQIDNO: 1
GAAGCGTAA a)序列特征
參长度519bp
*类型碱基序列 *链型单链 *拓扑结构线性
<image>image see original document page 5</image>(b) 分子类型双链DNA
(c) 假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源鳗利斯顿氏菌
将pGMT-lahcp用限制性内切酶EcoR和Sail ( Takara公司)进行双 酶切，酶切体系如下
H-buffer lpL
质粒(Plasmid) lpL
Eco脆SalI 4o.5|iiL
超纯水(DDw) 7pL
反应总体系 10pL 将酶切产物用T4 DNA连接酶(Takara公司)连接入载体pETDuet 的EcoRI和Sall酶切位点之间，连接反应体系如下 连接反应体系(lOpL)
10 x ligation buffer 1 fxL
PEG4000 lpL
pETDuet 1.5|aL
酶切产物 4.5pL
T4连接酶 lpL
灭菌双蒸水 lpL
反应体系 lO)iL 反应混合物于16。C恒温过夜。取全部连接产物转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，釆用抗生素(氨苄青霉素)筛选目标重组质粒阳性大肠杆 菌单菌落，提质粒，将此重组质粒命名为pETDuet-lahcp。
将构建好的质粒pETDuet-lahcp,转化入大肠杆菌表达工程菌 BL21(DE3)中，采用抗生素(氨节青霉素)筛选阳性大肠杆菌菌落，接种 于5mlLB液体培养基中，在37C下培养12小时，然后按照1 : 100的比 例将菌液接种于含0.1mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37'C下 培养3-4小时至OD600达0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为l匪ol/L,在 相同条件下继续培养4小时。培养结東后，离心收集菌体，用PBS洗涤 两遍，完全除去培养液，最后重悬于PBS;用超声波裂解细菌，超声5s 间隔10s, 200W,破菌时间为90min-120min,直至菌液澄清。
因重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，用镍鳌合的琼脂 糖柱Ni-Sepharose (购自Qiagen公司)进行亲合纯化，纯化步骤依照产品 说明书进行。首先将初步纯化的蛋白溶液加到平衡好的Ni-Sepharose上， 以清洗液(50mM磷酸缓冲液，200mM氯化钠，pH7.8)洗3 ~ 5个柱体积； 然后以含有梯度浓度咪唑的洗涤液(50mM磷酸纟i冲液，200mM氯化钠， 10-400mM咪唑，pH7.8)各洗3个柱体积，释放重组蛋白。进行SDS-PAGE 电泳检测纯化结果(参见图2)。通过蛋白质质谱分析，得纯化的表达蛋白LAHCP,即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白(参见图3和序列表 2)。
VSMSYRKILWDHVNAGTSGSDDWRKPVEA
(a) 序列特征
*长度172氨基酸残基 *类型氨基酸序列 链型单链 參拓扑结构线性
(b) 分子类型双链DNA
(c) 假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源鳗利斯顿氏菌
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂(Sigma), 按体积1:1比例将其混合，而后以2吗蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注 射于牙鲆体内，免疫后30天仍按上述的剂量进行加强免疫，同时将上述 完全弗氏佐剂釆用不完全弗氏佐剂(Sigma)替换，仍按按体积1:1比例将 其与鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白混合，按2pg蛋白/g鱼体重的接 种剂量，腹腔注射于牙鲆体内。
实施例2
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按体积 1:1比例将其混合，而后以2吗蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于大 菱鲆体内。
实施例3
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按体积 1:1比例将其混合，而后以20吗蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于 蓝鳗龙体内。
实施例4
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与不完全弗氏佐剂，按体 积1:1比例将其混合，而后以2jig蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于 蓝鳗龙体内。
实施例5
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与不完全弗氏佐剂，按体 积l:l比例将其混合，而后以0.2pg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射 于蓝鳗龙体内。
应用例1
} ￡ p K
g正G E
D w s w
…，
…
化V K
M T L
7将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按体积 1:1比例将其混合，而后以2吗蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于牙
鲆体内，免疫后30天进行加强免疫。再将上述蛋白与不完全弗氏佐剂按 体积l:l比例将其混合，而后以蛋白注射用量2pg蛋白/g鱼体重的接种 剂量，腹腔注射于牙鲆体内。
第二次免疫后第30天取免疫牙鲆，以鳗利斯顿氏菌进行注射攻毒实 验，鳗利斯顿氏菌的感染浓度为1.28 x 107cells/mL，每尾注射O.lmL,持 续观察8天，记录各组死亡情况(参见图4)。
应用例2
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与不完全弗氏佐剂，按体 积1:1比例将其混合，而后以0.2)ig蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射 于蓝鳗龙体内。免疫后第30天取免疫鱼，以鳗利斯顿氏菌进行注射攻毒 实验，鳗利斯顿氏菌的感染浓度为2.13x l04cells/mL，每尾注射O.lmL， 持续观察8天，记录各组死亡情况(参见图5)。
应用例3
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按1:1 比例将其混合，而后以2吗蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于大菱 鲆体内，分别于免疫后的第7、 14、 21、 28天，釆集免疫大菱鲆的血液 制备血清，通过ELISA方法检测抗体效价(参见图6)。<110〉 <120> <130〉
序列表.txt
SEQUENCE LISTING 中国科学院海洋研究所 鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用
<160〉 〈170〉
3
Patentln version 3. 1
<210> <211> 〈212〉 <213>
1
519 DNA
鳗利斯顿氏菌
〈220〉 <221〉 <222〉 <223〉
CDS (l)..
(519)
〈400〉 atg Met 1
Pro
act Thr
gca tgt Ala Cys 5
tat Tyr
ate lie
tct Ser
ate lie
Glu 10
ggc Gly
gaa act Glu Thr
cag Gin
ggc Gly 15
ctg Leu
48
ate act get ggt get ctg tct act gat tea etc ggt g3t gcg ttc gtt lie Thr Ala Gly Ala. Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val 20 25 30
96
gaa ggt cat gaa gac caa atg ttg gtt caet c朋ttt gac cac gtt gta Glu Gly His Glu Asp Gin Met Leu Val Gin Gin Phe Asp His Val Val 35 40 45
144
act gta ccg act gat cca caa tea ggt cag cct tct ggt caa cgt gtt Thr Val Pro Thr Asp Pro Gin Ser Gly Gin Pro Ser Gly Gin Arg Val 50 55 60
192
cac aaa cca ttt aaa ttc acc gta gcg eta aac aaa gcg gtt cct ctt His I>ys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro [>eu 65 70 75 80
240
ctt tat aac gca ctg gcg tct ggc gag aag atg aaa teg gtt gag eta Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu 85 90 95
288
aaa tgg tac cgc act tct ate gaa ggt aag caa gag aac ttc ttc act Lys Trp Tyr Arg Thr Ser lie Glu Glv Lys Gin Glu Asn Phe Phe Thr 100 10^ 110
336
act aca etc gaa age gcg tct ate gtg gac att cac tgt gaa atg cca Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser lie Val Asp lie His Cys Glu Met Pro 115 120 125
384
cac tgc caa gat cca gcg aac ggc gac ttc aca caa aac gtt acg gtt His Cys Gin Asp Pro Ala. Asn Gly Asp Phe Thr Gin Asn Val Thr Val 130 135 140
432
tct atg tct tac cgt aaa ate ctg tgg gat cac gtg aat gcg ggt act 480 Ser Met Ser Tyr Arg Lys lie Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr 145 150 155 160
tea ggc tct gac gac tgg cgc aag cct gtt gaa gcg taa 519 Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala 165 170
<210〉 2
<211〉 172
<212〉 PRT
<213>鳗利斯顿氏菌
<400> 2
Met Pro Thr Ala Cys Tyr lie Ser lie Glu Gly Glu Thr Gin Gly Leu10 15
lie Thr Ala Glv Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val 20 25 30
Glu Gly His Glu Asp Gin Met Leu Val Gin Gin Phe Asp His Val Val 35 40 45
Thr Val Pro Thr Asp Pro Gin Ser Gly Gin Pro Ser Gly Gin Arg Val 50 55 60
His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu 65 70 75 80
Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu 85 90 95
Lys Trp Tyr Arg Thr Ser lie Glu Glv Lys Gin Glu Asn Phe Phe Thr 100 105 110
Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser lie Val Asp lie His Cys Glu Met Pro 115 120 125
His Cys Gin Asp Pro Ala Asn Glv Asp Phe Thr Gin Asn Val Thr Val 130 135 140
Ser Met Ser Tyr Arg Lys lie Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr 145 150 155 160
Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala 165 170
<2t0〉 <211〉 <212> <213>
<220> 〈221> <222> <223>
3
172 PRT
鳗利斯顿氏菌
PRT
(l).. (172)
<400〉 3
Met Pro Thr Ala Cys Tyr lie Ser lie Glu Gly Glu Thr Gin Gly Leu 15 10 15
lie Thr Ala Gly Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val 20 25 30
Glu Gly His Glu Asp Gin Met Leu Val Gin Gin Phe Asp His Val Val 35 40 45
Thr Val Pro Thr Asp Pro Gin Ser Gly Gin Pro Ser Gly Gin Arg Val 50 55 60
His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu 65 70 75 80Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu 85 90 95
Lys Trp Tyr Arg Thr Ser lie Glu Gly Lys Gin Glu Asn Phe Phe Thr 100 105 110
Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser lie Val Asp lie His Cys Glu Met Pro 115 120 125
His Cys Gin Asp Pro Ala Asn Gly Asp Phe Thr Gin Asn Val Thr Val liBO 135 140
Ser Met Ser Tyr Arg Lys lie Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr 145 比O 155 160
Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala 165 170
1权利要求
1.一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白，其特征在于鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸碱基序列如序列表SEQ ID NO1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO2所示。
2. —种按权利要求1所述的鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白的应 用，其特征在于所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白具有激发鱼体对鳗利斯顿氏菌病的免疫力。
3. 按权利要求2所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白的应用，其 特征在于将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂或 不完全弗氏佐剂，按体积1:1比例将其混合，而后以20吗蛋白/g鱼体重~ 0.2吗蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于鱼体。
全文摘要
本发明涉及免疫学领域，具体地说是一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸碱基序列如序列表SEQ IDNO1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO2所示。所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白具有激发鱼体对鳗利斯顿氏菌病的免疫力。本发明表达蛋白可激发鱼体产生特异性抗体，抵抗鳗利斯顿氏菌的感染，可用于水产鱼类养殖中鳗利斯顿氏菌引起疾病的预防中。该表达蛋白制备方法简单，可应用于大规模工业化生产。
文档编号C07K14/195GK101525378SQ20091002008
公开日2009年9月9日 申请日期2009年3月28日 优先权日2009年3月28日
发明者杰 李, 波 王, 鹏 肖, 莫照兰 申请人:中国科学院海洋研究所