与免疫抗体相结合的多肽及其应用的制作方法

专利名称：与免疫抗体相结合的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及与免疫抗体结合的多肽，尤其涉及与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，更具体的是涉及一种有三个精氨酸被修饰的与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的 多肽。
背景技术：
临床上自身免疫疾病主要有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、皮肌 炎、多发性肌炎、系统(多发)性硬化症、硬皮病等，这些疾病曾被命名为“结缔组织病”，后 来国外和国内均将它们归为风湿性疾病。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种较常见的以慢性多关节炎症为 主要表现的系统性自身免疫疾病，其病程长，多反复，且会造成组织不可逆的损伤，而给患 者造成很大痛苦。该病的发病率在世界范围内为0.5-1%，中国的发病率约为0.36%。患 者发病年龄多在20 50岁，女性多于男性，男女之比为1 3。最近流行病学统计，类风湿 关节炎有逐年增加的趋势，其突出的早期临床表现为对称性关节红肿热痛、常见四肢小关 节、指间近端关节肿胀、掌指、腕、肘和踝等关节肿痛及活动困难、晨间关节僵硬、午后逐渐 减轻、关节外症状约有20%患者可出现皮下结节；长久不愈的晚期症状则有不同程度的关 节畸形和强直，以及关节功能丧失等现象，还会损伤脏器和多组织器官，造成骨头缺血性坏 死，对人体消耗大，致残率高。类风湿关节炎的病因至今尚不十分清楚，且早期临床表现也不典型。在国 内外临床实践中，该疾病的常用诊断工具是美国风湿学学会(American College of Rheumatology, ACR)在 1987 年制定的类风湿分类标准(Arthritis Rheum 1988，31， 315-24)，该标准更依赖于类风湿关节炎所表现出的临床病症。但是，在该疾病早期，这些临 床指标通常是不易操作的。因此，目前普遍认为这一标准不能较好适应于早期类风湿关节 炎的诊断(Arthritis Rheum 2001，44，2485-91 ；Neth J Med 2002，60，383-8)。而目前使用 的治疗类风湿关节炎的方法主要是采用消炎方法，这种方法虽能使得关节肿胀(swelling) 和侵蚀(erosive)的程度得以减慢，却无法使疾病得到治愈。当前人们共同的观点认为， 在该疾病早期采用多种方法治疗能得到最佳的治疗效果(Autoimmunity Reviews 2006，6， 37-41)。由此，具有高专一性(Specificity)和高灵敏度(Sensitivity)的血清学检测标 记对于类风湿关节炎在骨关节遭受损伤之前的早期诊断就显得尤为必要(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239—62)。研究发现一些自身免疫抗体虽然与类风湿关节炎疾病相联系，如抗 calpastatin 抗体(Proc Natl Acad Sci USA 1995，92，7267-71)、抗中性粒细胞胞质抗体 (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)(IntArch Allergy Immunol 1996, 109，201-6)、核抗原抗体(anti-nuclearantigens，ANA) (Scand J Rheumatol 1986,15， 185-92)、抗 II 型胶原抗体(anti-collagen type II) (J Immunol Methods 2001,247, 191-203)和抗葡萄糖 6 磷酸异构酶(anti-glucose-6-phosphate isomerase, anti-GPI)(Nat Immunol2001, 2, 746-53)等也都能在患有其它自身免疫疾病的病人中，甚至于在健康个体中检测出来(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-62)。其中的某些抗体虽然能应 用于风湿性疾病的识别，而且筛选这些抗体也有助于疾病监测和预测，但由于其对类风湿 关节炎缺乏专一性，这些抗体中的绝大多数都很少应用于类风湿关节炎早期诊断(Clinica Chimica Acta 2004，350，17—34)。对于类风湿关节炎早期诊断的理想标记(Marker)应当至少满足4个标准(1)高 灵敏度，能检测的病人达到高百分比；(2)高专一性，尽可能地限制错误阳性结果的发生； (3)能适用于早期诊断；(4)能预见到某些病人会发展成侵蚀性疾病(erosive disease) (AutoimmunityReviews 2006，6，37-41 ；MEDICINE 2006，34，441-4)。类风湿因子(rheumatoid factor，RF)抗体作为血清学检测方法应用于ACR标 准中，被公认为是IgG分子上Fc结构域的直接抗体。虽然其检测灵敏度范围可以达到 60-80%，但其对于类风湿关节炎的专一性也比较一般，为60%。此外，RF同样可以在其 它患有自身免疫疾病的病人中、患有感染性疾病的病人中以及3-5 %健康人群中(其中 10-30% 的老年人)检测到(Ann Rheum Dis 2003，62，261-3)。抗BiP(p68)抗体，抗Sa抗体和抗环状胍氨酸化蛋白抗体(APF、AKA、抗fiIaggrin 和抗CCP)则对类风湿关节炎有更高的专一性。64%的类风湿关节炎病人能产生直接针对 BiP的抗体，还有报道称其对该疾病具有高度的专一性，但目前没有数据支持BiP在预测类 风湿关节炎方面具有作用，而且这些报道的BiP抗体还需要等待进一步通过独立的临床研 究加以确认(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。抗Sa抗体是源自于人脾脏和胎盘 的提取物当中，分子量为50kDa的蛋白(Internal Medicine 2005，44，1122-6)。另有研究 揭示Sa抗原对于类风湿关节炎的专一性可以高达92-99 %，但其灵敏度则显得一般，仅为 30-40% (J Rheumatol 1994，21，1027-33 ;J Rheumatol 1999，26，7-13)。抗核周因子(antiperinuclear factor, APF)首次披露于1964年。经研究这些自 身免疫抗体对类风湿关节炎具有专一性，并能通过以人颊粘膜细胞为抗原底物的免疫荧光 法间接测得(Ann Rheum Dis 1964，23，302-5)。1979年研究者描述了一种类风湿关节炎专一性角质蛋白抗体，它能直接抑制 角质层上皮细胞角质化，并将这类抗体的名称暂定为抗角质蛋白抗体(anti-keratin andtibody，AKA) (BMJ 1979,2,97-9)。之后的研究证实，虽然AKA和APF的发现是互相 独立的，但是两者所直接对应的抗原是一致的(J.Clin. Invest 1995，95，2672-9)。许多 研究进一步表明AKA和APF具有许多共同的特性，它们均对于RA患者表现出高度的专一 性(Internal Medicine 2005，44，1122-6)。Filaggrin(filamentaggregating protein) 是一种互相交联的角蛋白丝状体，作用是形成非常坚固的细胞骨架结构，其也是AKA和 APF 的常见抗原(Clin AppliedImmunol Rev 2004，4，239-62)。其中，APF 的目标抗原为 profilaggrin，而 AKA 的抗原为 filaggrin(J Clin Invest 1995，95，2672-9)。虽然AKA和APF对于类风湿关节炎具有专一性，但其缺陷也很突出。这两种抗体 的检测灵敏度严重依赖于filaggrin的纯化方法。实践中，由于难以分离得到纯的且胍基 含量具有可重复性的抗原，再加上其检测手段不简便，以及荧光免疫检测过程需要耗费较 大的工作量，从而使得实验室间难以形成标准化，导致AKA和APF没有成为类风湿关节炎检 测的主流方法(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-62)。
基于filaggrin和profiIaggrin是AKA和APF抗体靶点的知识，人们合成了 含有瓜氨酸的多肽以检测类风湿关节炎血清中AKA和APF抗体的活性。由于瓜氨酸不 是基本氨基酸而无法在蛋白质翻译中加入，因此通常的方法是通过肽精氨酸脱亚胺酶 (peptidylargnine deiminine, PAD, EC3. 5. 3. 15)催化精氨酸残基脱氨基得到。根据这 些事实，一些从filaggrin序列中衍生出来的精氨酸侧链经修饰的，尤其是含有瓜氨酸的 多肽被合成出来，并用于类风湿关节炎抗体的体外检测(US6，858，438)。在用酶联免疫吸 附(Enzyme-Linked immunosorbent Assay, ELISA)方法检测实验中，这一方法合成的含有 瓜氨酸直线性多肽能从类风湿关节炎患者血清中检测出抗瓜氨酸肽抗体，在保持高专一性 (大于90%)的情况下，还大大提高了检测的灵敏度(达到63%)。实验还证明，只有含 瓜氨酸的多肽才能实现该反应，若将多肽中的瓜氨酸用其它氨基酸代替则完全没有反应发 生。这些结果表明，瓜氨酸部分是决定能被AKA和APF抗体识别的抗原决定因子(J Clin Invest 1998，101，273-81)。其它研究者发现将含有瓜氨酸的直线性多肽通过二硫键(S-S键)形成环形结 构的方式能模拟类似转角结构，从而模仿最初抗原决定簇的转角结构，并可增 加多肽-抗体的亲和力(FASEB J 1995,9,37-42 ；Mol Immunol 1985，22，1255-64)。由 此，一种环状肽被人工合成出来，其将filaggrin主要表位上的两个丝氨酸换成半胱 氨酸后，再由二硫键环化形成，即第一代环瓜氨酸肽(the first generation cyclic citrullinatedpeptide, CCP1) (Internal Medicine 2005，44，1122-6)。研究者将一条由 19个氨基酸残基组成的瓜氨酸肽中两个丝氨酸替换为半胱氨酸形成与β -转角具有相似 结构的二硫键，得到人工合成CCP，并将CCPl与直线肽的检测结果作了比较。结果显示， 采用CCPl为抗原的多肽用ELISA法检测RA患者的抗CCP抗体，灵敏度较用直线性瓜氨酸 肽为抗原有显著提高，分别为68%和49%，二者专一性相似(Arthritis Rheum 2000,43, 155-63)。穆荣等人在266例RA患者和186例对照者血清中检测RF和AKA抗体、APF和抗 CCP抗体的方式，评估了抗聚丝蛋白抗体群(anti-filaggrin antibodies,AFAs)与RF联合 检测的意义。由于AKA和APF的敏感性太低，临床上以RF和抗CCP抗体的联合测定更为实 用(北京大学学报(医学版)2005，37，894)。研究还发现，通过检测抗CCP抗体还能作为类 风湿关节炎早期病人一项重要指标，为这类人群的早期防治提供参考(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-6)，其还能预测侵蚀性疾病(Clin Applied Immunol Rev 2004,4, 239-62)。在含有不同瓜氨酸多肽的反应模式中，类风湿关节炎血清检测表现出巨大的可变性。类风湿关节炎患者的血清/血浆中除了 filaggrin精氨酸残基被瓜氨酸化外，Sa抗原、 胶原蛋白(I和II型)、组蛋白、髓磷脂碱蛋白、纤维连接蛋白等也出现瓜氨酸化，并产生抗 CCP抗体。深入研究表明，瓜氨酸化的自身抗原中并非所有精氨酸脱氨基转化为瓜氨酸；已 瓜氨酸化的瓜氨酸也不完全参与形成抗原表位，即产生抗CCP抗体。综上，抗瓜氨酸抗体 的产生与瓜氨酸密切相关，并且瓜氨酸的侧翼序列对抗瓜氨酸抗体的产生起重要作用，这 一事实暗示着瓜氨酸残基的周边氨基酸对于抗原表位(antigen episode)具有重要作用， 以及抗瓜氨酸化蛋白(如AKA和APF抗体)活性是多克隆反应(J Clin Invest 1998， 101，273-81)。基于filaggrin的属性，它被认为是模拟瓜氨酸抗原表位的天然库藏(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239—62)。
第二代CCP(CCP2)检测方法产生于2002年，通过将含有瓜氨酸的多肽库与类风湿关节炎血清筛选得到与filaggrin无关的第二代CCP，其具有更有利于抗体检测的表位 (Report on the 5th Dresden symposium onautoantibodies. Lengerich, Germany :Pabst Science Publishers ；2000. p. 140-5)。将CCPl和CCP2经同一组病人测试后表明，CCP2不仅 保持了较高专一性(96% )，而且其分析灵敏度也有显著的提高(Arm. Rheum. Dis. 2005，64， 1510-2)。许多研究者在最近5年的研究证明，抗含瓜氨酸多肽的测试的灵敏度具有较高的 可变性，范围在 40% -94% (Clin. ExpRheumatol. 2005, 23 (Suppl39), 569-76 ；Ann. Rheum. Dis. 2006，65，845-51)。CCP2在类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测中得到应用说明了在 该领域的检测抗原的筛选并不需要仅仅依赖filaggrin，也说明与filaggrin不同的结合 表位能更有利于体外检测。Bizzaro N 等人(Clin Chem 2007，53，1527-33)和 Lutteri L 等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)分别针对现在市场上使用的第二代和第三代CCP试剂盒 (Kit)进行了比较，结果发现，伊诺瓦诊断(InovaDiagnostics)公司开发的三种检测方法 中，其CCP3试剂盒与使用CCP2为抗原的方法相比仅仅略有改善，各自的灵敏度分别为67 % 和64%。相反地，用于抗IgG的CCP3. 0与即能检测IgG又能检测IgA的CCP3. 1的检测方 法相比后发现，两者竟然没有丝毫差别。可见，同时检测IgG和IgA抗体的方法并没有象看 上去那样有显著改进。他们的结论是由于测试的诊断试剂盒灵敏度可能与胍基化精氨酸残 基的位置和数量有关，而专一性则可能受到蛋白质或杂多肽序列的影响，因此，对此二者而 言，抗原的种类显得更为重要。两者综合考虑，实验数据表明抗原的制备是决定测定方法优 劣的最重要的可变因素。Lutteri L等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)的研究还发现了抗CCP 的另一个价值，他们指出，IgM-RF是最灵敏的标记，能在77. 9%的类风湿关节炎患者中发 现。必须注意的是，作为ACR标准中的RF，其类风湿关节炎诊断中灵敏度不能直接与那些没 有包括在诊断标准中的其它方法相比较。IgM-RF被认为在疾病专一性方面略有欠缺。使用 IgM-RF检测类风湿关节炎患者，其中有13-19%的人为RF阴性，与之相比，当这些患者使用 抗CCP方法检测时均为阳性。类风湿关节炎的遗传因素会影响瓜氨酸化蛋白的出现和产生，也会影响针对 这些修饰蛋白的抗体产物(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。一系列相关研 究表明，类风湿关节炎与某些HLA-DR等位基因有密切联系，尤其是HLA-DRB1*0401和 HLA-DRB 1*0404 (Cell 1996，85，307-10)。与相应的含有精氨酸的多肽相比，将多肽瓜氨 酸化就能与HLA-DRB 1*0401和HLA_DRB1*0404两种“袋形”抗原更好地结合(J India Rheumatol Assoc 2004,12,143-6) 在不同地区的人群中，这些等位基因也略有不同。 DRB1*0401主要出现在北欧和北美地区的人群中，有证据表明该基因与类风湿关节炎 所导致的“特大关节”表征(extraarticular manifestations)有联系，在 DRB1*0401/ DRB1*0404 杂合基因型中尤为突出。DRB1*0403、DRB1*0406 和 DRB1*0407 与 DRB1*0401、 *0404或*0101基因组合后会增加类风湿关节炎病情的发展可能。DRB1*0404与DRB1*0408 只要存在于白色人种中。DRB1*0405很少在北欧人群中，但在亚洲和环地中海沿岸国家 的人群中极其普遍。DRB1*0101主要存在于北欧和北美人群中。美洲印第安人群中则为 DRB1*1402和*1406(Hum Immuno 2000，61，1254-1261)。虽然这些与类风湿关节炎相关的基因在各地区人群中各有不同，但研究发现在DRBl的第三高度可变区(HV3)具有共享表位 (shared epitope, SE)，在 70-74 位氨基酸残基都为 QKRAA、QRRAA 或RRRAA (ClinicaChimica Acta 2004，350，17-34)。将一群有几个共享表位基因型的类风湿关节炎患者与具有抗CCP2抗体的患 者比较研究表明，一种共享表位等位基因与抗CCP2抗体的产生具有密切的内在联系 (Arthritis Rheum 2000,50,2113-21 ；Arthritis ResTher 2004，6，R303-8)。经证实，这一 关联是由于MHC分子共享表位β链的70-74位氨基酸残基(Q/R，K/R，R，A，A)形成第4个 锚定袋(P4)，其与电中性或负电荷氨基酸具有高度亲和性(J Immuno 2003，171，538-541)。 当带正电荷精氨酸在PAD酶作用下转换成电中性的瓜氨酸后，得到的翻译后修饰蛋白/多 肽亲和力远远大于精氨酸与P4的亲和力，并能够激活⑶4+T细胞，这些“瓜氨酸特异T细 胞”可有助于抗瓜氨酸蛋白(多肽)抗体的产生(J Immuno 2003，171，538-541 ；Arthritis Rheuml987,30,1205-13 ；Rheum Dis Clin North Am 1992,18,741-59 ；ArthritisRheum 2005，52，1063-68)。这些结果表明具有共享表位的DBRl等位基因能激活类风湿关节炎患 者自身免疫反应。综合目前的研究结果，抗CCP抗体对RA具有较高的专一性，能将RA与其它与RA相 似的疾病相区分，这类抗体存在于绝大多数的病人体内，在疾病的早期就能检测到，有助于 对疾病的预测，能通过简单的方式加以检测(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-6)。

发明内容
本发明的一个目的在于提供一种与免疫抗体相结合的多肽。本发明的另一个目的在于提供一种与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的多肽。本发明的又一个目的在于提供一种既能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合，同 时还能与HLA-DR具有高亲和力的多肽。本发明的再一个目的在于提供一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的 多肽。本发明所述的与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序 列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal为 His 或 Ala ；Xaa2 为 Gln 或 Arg ；Xaa3 为 Arg 或 Gln ；Xaa4 为 Phe 或 Met ；Xaa5 为 Arg ；Xaa6 为 Arg ；Xaa7 为 Arg ；Xaa8 为 Ser 或 Arg ；Xaa9 为 Arg 或 Leu ；XaalO 为Ala或Ile ；Xaall为Ala或Arg，其中有三个精氨酸被修饰。另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal为 His 或 Ala ；Xaa2 为 Gln 或 Arg ；Xaa3 为 Arg 或 Gln ；Xaa4 为 Phe 或 Met ；Xaa5 为修饰的 Arg ；Xaa6 为修饰的 Arg ；Xaa7 为修饰的 Arg ；Xaa8 为 Ser 或 Arg ；Xaa9 为 Arg 或 Leu ；XaalO 为 Ala 或 Ile ；Xaall 为 Ala 或 Arg0另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列
His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln ；Xaa2为Phe或Met ；Xaa3为修饰的Arg ；Xaa4为修饰的Arg ；Xaa5 为修饰的 Arg ；Xaa6 为 Ser 或 Arg ；Xaa7 为 Arg 或 Leu ；Xaa8 为 Ala 或 Ile ；Xaa9 为 Ala 或 Arg0另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Ala-Ala-Cy s-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln ；Xaa2为Phe或Met ；Xaa3为修饰的Arg ；Xaa4为修饰的 Arg ；Xaa5 为修饰的 Arg ；Xaa6 为 Ser 或 Arg ；Xaa7 为 Arg 或 Leu0另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Ala-Ala-Cys-Gly,其中，Xaal为修饰的Arg ；Xaa2为修饰的Arg ；Xaa3为修饰的Arg ；Xaa4为Ser或 Arg ； Xaa5 为 Arg 或 Leu0上述与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，所述修饰的Arg为侧链修饰的Arg， 其侧链具有通式(I)所述的结构。Gi式 I<formula>formula see original document page 8</formula>其中Gl 为 0、NH 或 CH2 ；G2 为 NH2, CH3> NHCH3 或 N(CH3) 2 ；G3 为 0、NH、NHCH3> NHCH3 ； η为2、3或4 ；其中当Gl为NH，G2为NH2时，G3不为ΝΗ。另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal为 His 或 Ala ；Xaa2 为 Gln 或 Arg ；Xaa3 为 Arg 或 Gln ；Xaa4 为 Phe 或 Met ；Xaa5 为修饰的 Arg ；Xaa6 为修饰的 Arg ；Xaa7 为修饰的 Arg ；Xaa8 为 Ser 或 Arg ；Xaa9 为 Arg 或 Leu ；XaalO 为 Ala 或 Ile ；Xaall 为 Ala 或 Arg0所述的修饰的Arg为瓜氨酸(Cit)，即当Gl为NH，G2为NH2, G3为0，及η为3。另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Cys -Gly,其中，Xaal为 Arg 或 Gln ；Xaa2 为 Phe 或 Met ；Xaa3 为 Ser 或 Arg ；Xaa4 为 Arg 或 Leu ；Xaa5 为 Ala 或 Ile ；Xaa6 为 Ala 或 Arg0另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Ala-Ala-Cys-GIy，其中，Xaal为 Arg 或 Gln ；Xaa2 为 Phe 或 Met ；Xaa3 为 Ser 或 Arg ；Xaa4 为 Arg 或 Leu0上述与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽能与自身免疫抗体相结合，形成抗原_抗体复合物(Complex)。上述多肽能与HLA-DR分子具有高亲和力，与HLA-DR相结合形成HLA-DR-多肽复 合物。多肽通过序列中不相邻的两个Cys之间形成二硫键。所形成的二硫键能使该多肽 具有环状结构并能模拟β “转角结构，使得该多肽不仅具有与HLA-DR分子的高亲和力，与 HLA-DR相结合形成HLA-DR-多肽复合物；还能与抗CCP抗体高效结合，形成抗原-抗体复 合物。另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列，该序 列中第三位的Cys与第十六位的Cys之间形成二硫键His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal为 His 或 Ala ；Xaa2 为 Gln 或 Arg ；Xaa3 为 Arg 或 Gln ；Xaa4 为 Phe 或 Met ；Xaa5 为 Cit ；Xaa6 为 Cit ；Xaa7 为 Cit ；Xaa8 为 Ser Arg ；Xaa9 为 Arg Leu ；XaalO 为 Ala 或 Ile ；Xaall 为 Ala 或 Arg0另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列，该序 列中第三位的Cys与第十六位的Cys之间形成二硫键His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Cys -Gly,其中，Xaal为 Arg 或 Gln ；Xaa2 为 Phe 或 Met ；Xaa3 为 Ser 或 Arg ；Xaa4 为 Arg 或 Leu ；Xaa5 为 Ala 或 Ile ；Xaa6 为 Ala 或 Arg0另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列，该序 列中第三位的Cys与第十六位的Cys之间形成二硫键His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Ala-Ala-Cys-G ly，其中，Xaal为 Arg 或 Gln ；Xaa2 为 Phe 或 Met ；Xaa3 为 Ser 或 Arg ；Xaa4 为 Arg 或 Leu0另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含的氨基酸序列为His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly (SEQ ID No :1)，其第 三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。上述与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含的氨基酸序列如SEQ ID No 2-178所示。其序列第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。上述多肽的制备方法为多肽的化学方法直接合成，或者先由化学合成或基因工程 方法合成，即将从表达载体(J.萨姆布鲁克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯，分子克隆[M]，科 学出版社，1994)中分离纯化得到的的多肽再经过修饰精氨酸侧链的步骤得到。上述多肽的一种制备方法为通过化学方法直接合成。
上述多肽的另一种制备方法为先通过化学方法合成后，再由PAD酶修饰精氨酸侧链得到。本发明所述的多肽能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合。一种与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于90%的多肽，其氨基酸系列如下:His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xaa 1I-Cys-Gly,其中，Xaal为 His 或 Ala ；Xaa2 为 Gln 或 Arg ；Xaa3 为 Arg 或 Gln ；Xaa4 为 Phe 或 Met ；Xaa5 为 Cit ；Xaa6 为 Cit ；Xaa7 为 Cit ；Xaa8 为 Ser Arg ；Xaa9 为 Arg Leu ；XaalO 为 Ala 或 Ile ；Xaall 为 Ala 或 Arg0另一种与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于95%的多肽，其氨基酸 系列如下:His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-X aalI-Cys-Gly,其中，Xaal为 His 或 Ala ；Xaa2 为 Gln 或 Arg ；Xaa3 为 Arg 或 Gln ；Xaa4 为 Phe 或 Met ；Xaa5 为 Cit ；Xaa6 为 Cit ；Xaa7 为 Cit ；Xaa8 为 Ser Arg ；Xaa9 为 Arg Leu ；XaalO 为Ala或Ile ；Xaall为Ala或Arg，该序列中第三位的Cys与第十六位的Cys之间形成二 硫键。另一种与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于95%的多肽，其氨基酸 系列如下His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly, 其第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。另一种与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于95%的多肽，其氨基酸 系列如SEQ ID No 2-178所示，多肽的第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。—种与类风湿关节炎自身免疫抗体检测灵敏度大于70%的多肽，其氨基酸系列如 T" :His-Gln-CyS-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-C ys-Gly,其中，Xaal为 His 或 Ala ；Xaa2 为 Gln 或 Arg ；Xaa3 为 Arg 或 Gln ；Xaa4 为 Phe 或 Met ；Xaa5 为 Cit ；Xaa6 为 Cit ；Xaa7 为 Cit ；Xaa8 为 Ser Arg ；Xaa9 为 Arg Leu ；XaalO 为 Ala 或 Ile ；Xaall 为 Ala 或 Arg0另一种与类风湿关节炎自身免疫抗体测灵敏度大于75%的多肽，其氨基酸系列如 T" :His-Gln-CyS-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-C ys-Gly,其中，Xaal为 His 或 Ala ；Xaa2 为 Gln 或 Arg ；Xaa3 为 Arg 或 Gln ；Xaa4 为 Phe 或 Met ；Xaa5 为 Cit ；Xaa6 为 Cit ；Xaa7 为 Cit ；Xaa8 为 Ser Arg ；Xaa9 为 Arg Leu ；XaalO 为Ala或Ile ；Xaall为Ala或Arg，该序列中第三位的Cys与第十六位的Cys之间形成二 硫键。另一种与类风湿关节炎自身免疫抗体测灵敏度大于75%的多肽，其氨基酸系列如 下His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly, 其第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。
另一种与类风湿关节炎自身免疫抗体测灵敏度大于75%的多肽，其氨基酸系列如 SEQ ID No 2-178所示，多肽的第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。上述多肽对HLA-DR具有高亲和力，与HLA-DR相结合形成HLA-DR-多肽复合物。上述多肽还包括在其氨基酸序列骨架上进行化学修饰或生物修饰后所得的产 物。用于修饰的分子选自于高分子聚合物或有机小分子。其修饰修饰方式包括聚乙二醇化 (PEGylation)(Adv. Drug deliv. Rev. 28,275-299 ；Adv. Drug deliv. Rev. 54,453-609 ；Adv. Drug deliv. Rev. 60，1-88)、酰基化(Acylation) (J. Pharma. Sci. 86，768—773 ;J. Pharma. Sci.86，1365-1368)、糖基化(Glycosylation)(J. Pharma. Sci. 87，326-332 ；Adv. Drug deliv. Rev. 6，103-131 ；Adv. Drug deliv. Rev. 13，251-267)和有机小分子修饰等。用以修饰多肽的分子与多肽氨基酸骨架之间通常以酰胺键(amidebond)或尿键 (urine bond)连接。所述多肽经过上述修饰能显著增加多肽的化学稳定性(如抗酶解) 和物理稳定性(如抗凝聚(aggregation)、抗热变性和抗机械力等)，还能增强与抗体的免 疫应答。
高分子聚合物是指分子量大于2，000Da的化合物，分子间由结构单位 (structural unit)或单体经由共价键相互连接在一起。所述聚合物具体选自于聚乙二醇、 聚氨基酸、聚核苷酸、聚乳酸、聚赖氨酸、聚亚胺和10个以上单糖通过糖苷键形成的多聚糖 (polysaccharide)，如淀粉及其水解产物、纤维素、甲壳素或葡聚糖。有机小分子具体选自于各类氨基酸、各类单糖、各类维生素(Vitamin)、由两个单 糖单元通过糖苷键形成的二糖(disaccharide)(如蔗糖、乳糖或麦芽糖)、由2_10单糖通 过糖苷键形成的寡聚糖(oligosaccharide)(如低聚异麦芽糖、低聚木糖或低聚半乳糖) 和分子量在20-2，OOODa的聚合物。聚乙二醇化修饰所用的聚乙二醇为一端封闭的聚乙二醇，封闭基团可以为 C1-C30的烷基，C1-C30的脂肪酸或糖基。聚乙二醇为分子量2，000-100, OOODa，一般选择 2，000-50, OOODa，优先选择 5，000-50, OOODa0 烷基与聚乙二醇一端通常形成醚键，也可以由酯键相连接。链长可以选择Cl-ClO 的烷基，优先选择甲基、乙基或丙基。脂肪酸与聚乙二醇一端通常形成酯键，脂肪酸链长一般选择C1-C18的脂肪酸，优 先选择链长为C10、C12、C16和C18的脂肪酸。酰基化使用C1-C30的脂肪酸，优先选择C1-C18的脂肪酸。有机小分子指具有C、H、0或C、H、0、N、P、S等几种元素组成的分子量小于2，OOODa 的有机小分子。具体地指各类氨基酸、各类单糖或多糖、各类维生素(Vitamin)、生物素和分 子量在20-2，OOODa的聚合物，如聚乙二醇、多肽、寡聚糖和多聚糖(葡聚糖、淀粉和甲壳素 等)和核苷等。上述多肽能应用于类风湿关节炎自身免疫抗体的体外检测。所述的类风湿关节炎自身免疫抗体的体外检测的应用，其一般方法为将待测血清 (serums)与包含有上述的多肽(即抗原)试剂混合，检测所述多肽与血清中抗体所形成的 复合物。检测结果呈阳性表明，该血清中具有类风湿关节炎疾病自身免疫抗体。—种类风湿关节炎自身免疫抗体的体外检测的方法ELISA检测，其具体的实验步 骤可以参见US6，858，438中的相应部分。
其基本原理是多肽(抗原)包被在酶标板表面，将稀释后的待检血清/血浆和对 照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗CCP抗体，经温育后，则血清/血浆中 特异性抗体与反应板孔中的CCP抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的 血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相CCP抗原(多肽)结合的 抗CCP抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物， 并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据试剂盒内的对照物，可对抗CCP抗 体进行定量或定性测定。所述的抗人IgG抗体为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的 抗人IgG抗体。一种具体配制方式为，取20 μ 1储存液，加800ml抗体稀释液作1 40000稀释，混勻，分装标准小瓶，每瓶15ml，2 8°C下保存。其中HRP标记的抗人IgG抗体底物A配制方式为称取柠檬酸17. 9g和 Na2HPO4 · 1220 4. 67g溶解于400ml去离子水中，然后缓慢加入30 % Η202330 μ L，搅拌均勻 后，加水至500ml，2 8°C下保存。其中HRP标记的抗人IgG抗体底物B配制方式为称取四甲基联苯氨 (tetramethyl benzidine, TMB) 0. Ig 于 IOOml 去离子水中，加入二甲基亚砜(DMSO) 2. 5ml, 在搅拌的同时，缓慢加入0.5ml 6M HC1，直至完全溶解，最后加水至500ml，2 8°C下保存。其中HRP标记的抗人IgG抗体底物反应终止液的配制方式分别量取55ml 98% H2SO4和去离子水445ml，然后将浓硫酸缓慢加入到去离子水中，混勻，2 8°C下保存。酶标仪测定波长设定在450nm，30分钟内测定各孔OD45tl值。另一种应用于类风湿关节炎自身免疫抗体的ELISA体外检测方法，将上述多肽先 经生物素(Biotin)标记，其能与亲和素或链霉亲和素非共价结合。然后再使用上述ELISA 体外检测方法。所述的亲和素(Avidin)是一种相对分子质量为68，OOODa, pi为10. 5的一种碱性
糖蛋白，又称卵白素，在鸡蛋清中含量比较丰富，一般从蛋白清中提取。所述的链霉亲和素 (Streptavidin)是一种从链霉菌(Str印tomycesavidinii)培养物中提取的蛋白质，相对 分子质量60，OOODa,不具有糖链。其特性与亲和素一样，也具有4个生物素结合位点，与生 物素具有高亲和力。所述的多肽与生物素标记相结合的方法可以通过先由固相合成或基因工程表达 并纯化，所得多肽再与生物素连接并纯化(如申请号为200310108264. 0中国发明专利所 公开的技术方案)。所述的多肽与生物素标记相结合的方法还可以在多肽的固相合成过程中先与生 物素连接再纯化的方式(P印t. Res. 1989，2，189-194)。具体地说，所述的结合有生物素的多肽，其上生物素与多肽的N末端相结合。本发明技术方案实现的有益效果本发明所述的多肽，其上序列有三个精氨酸侧链经修饰后呈现电中性或电负性， 并优先选择瓜氨酸。这些多肽序列上两个不相邻的半胱氨酸侧链巯基形成二硫键而成环 状。这类多肽不仅能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合，同时还能对HLA-DR具有高亲和 力。经过实验验证，该类多肽与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于95%，对类风湿关节炎自身免疫抗体的检测灵敏度大于75%。与市场上销售的同类产品相比，其灵敏 度得到显著提高，更有利于类风湿关节炎自身免疫抗体的体外检测。所述多肽经生物素标记后能进一步提高与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的 专一性和灵敏度。本发明所涉及的术语与其一般概念相同。所述的“C1-C30烷基”和“C1-C10烷基”指直链或支链烷基，数字表示基团所含的
碳原子数。所述的“聚乙二醇”指直线型(Linear)或分叉型(Branched)或多臂型 (Multi-arm)结构，聚合物分叉数量或多臂数量不能限制本发明。所述的“C1-C18的脂肪酸”、“C10脂肪酸”、“C12脂肪酸”、“C16脂肪酸”和“C18脂
肪酸”指直链或支链的饱和或不饱和脂肪酸，数字表示碳原子数。
具体实施例方式以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而 非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。实施例1多肽的制备多肽采用Fmoc化学方法，通过固相合成技术合成。该方法的具体步骤参见Eur. J. Immunol. 1994，24，3188-3193 J. Org. Chem. 1972，37，3404-3409 ；黄惟德，陈常庆多肽合 成[M]，北京科学出版社，1985。二硫键的形成方法及其步骤可以参见文献黄惟德，陈常庆多肽合成[M]，北京
1985, ρ85 ；Michael W. Pennington PeptideSynthesis Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press,1994, p91_169通过上述步骤，合成多肽的具体序列为多肽=His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly (SEQ ID No :1)，其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结 构，并能模拟转角结构。先将蛋白质或多肽末端的保护基在二甲基酰胺(DMF)溶剂中脱保护，中和。再 用氟化氢将多肽从合成树脂上切下，得到的粗产物经过反相色谱C18或C8柱(如5μπι， 250X4. 6mm)，以流动相A(0. 1% (ν/ν)三氟乙酸乙腈溶液)和流动相B (0. 1% (ν/ν)三氟 乙酸水溶液)为梯度洗脱溶剂。在45分钟内，流动相A占Α、Β两相总体积0% (ν/ν)变化 至IJ100% (ν/ν)收集得到目标多肽，通过脱盐色谱柱(GE Healthcare)或旋转蒸发去除有机 溶剂后，得到目标多肽。(参见中国分析化学2002，30，1126-9)得到的多肽通过反相色谱(RP-HPLC)测定，其具体方法为4. 6 X 250mm 5ym C18 分析柱(Kromasil)；流动相 A 为三氟乙酸(trifluoroacetic, TFA)加入 100% 乙腈(acetonitrile, ACN)中，使得TFA浓度为0. 1 % (ν/ν)；
流动相B为TFA加入100%水中，使得TFA浓度为0. 1% (ν/ν)；流速为 1. Oml/min ；检测波长为220nm;洗脱梯度以流动相A占A、B两相总体积10% (ν/ν)的比例平衡，进样后，采用线 性梯度洗脱(Gradient Elution)，在25分钟内流动相A占A、B两相总体积从10% (ν/ν) 改变至35% (ν/ν)的比例，之后以100% (ν/ν)流动相A平衡5分钟。多肽的保留时间(Retention Time)为9. 32，其纯度大于95%。通过ESI质谱测定多肽分子量，其具体条件为质谱(Probe)ESI质谱电压(Probe bias)+4. 5kv喷雾器流速(NebulizerGas Flow)1. 5L/min检测器(Detector)1. 5kv样品电离化装置(CDL)-20. Ov流动相流速(Τ.Flow)0. 2ml/minCDL 温度(CDL Temp)250 °C缓冲液浓度(B.conc)50% H2O, 50% ACN加热块温度(BlockTemp)200°C多肽分子量为2017. 26Da。实施例2生物素标记的多肽的制备生物素-多肽(SEQ ID No 1)采用在固相合成过程中先与生物素连接再纯化的 方式分别进行，其具体方式参见 Deibel，M.R.，Jr. ,Lobl, Τ. J. and Yem, Α. W.，A technique for rapid purification of low yield products :B iotinylation ofchemically synthesized proteins on-resin. Pept. Res. 1989,2,189-194。当生物素通过缩合剂在多肽合成时直接缩合后，使用Kaiser test检测缩合反 应是否完全。该反应的详细说明请参见Sigma-Aldrich 60017产品说明(60017 Data Sheet)，该方法可不仅应用于定性(Analytical Biochemistryl970, 34，595)，还能进行定 量(Analytical Biochemistry 1981，117，147)检测。在树脂上进行生物素标记。首先，蛋白质或多肽末端在二甲基酰胺(DMF)溶剂中 脱保护，中和；然后与N-羟基琥珀酰亚胺生物素反应(即生物素化)，反应条件为45°C 24 小时；再用氟化氢将标记有生物素的多肽切下，得到的粗产物经过亲和素偶联琼脂的亲和 层析柱(GEHealthcare)，用磷酸盐缓冲液洗涤，去除未结合的成分，最后用0. IM的甘氨酸 溶液(PH2. 0)洗脱，得到生物素化的蛋白质或多肽。通过实施例1公开的二硫键形成方法，在多肽第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构。得到的的环形生物素_多肽通过反相色谱(RP-HPLC)测定，其具体方法为4. 6 X 250mm 5ym C18 分析柱(Kromasil)；流动相 A 为三氟乙酸(trifluoroacetic, TFA)加入 100% 乙腈(acetonitrile, ACN)中，使得TFA浓度为0. 1% (ν/ν)；流动相B为TFA加入100%水中，使得TFA浓度为0. 1% (ν/ν)；
流速为 1. Oml/min ；检测波长为220nm;洗脱梯度以流动相A占A、B两相总体积15% (ν/ν)的比例平衡，进样后，采用线 性梯度洗脱(Gradient Elution)，在25分钟内流动相A占A、B两相总体积从15% (ν/ν) 改变至40% (ν/ν)的比例，之后以100% (ν/ν)流动相A平衡5分钟。生物素-环形多肽的保留时间(Retention Time)为17. 76，其纯度大于95%。通过ESI质谱分别测定多肽的分子量，其具体条件为
质谱(Probe)ESI质谱电压(Probe bias)+4. 5kv喷雾器流速(NebulizerGas Flow) 1. 5L/min检测器(Detector)1. 5kv样品电离化装置(CDL)-20. Ov流动相流速(Τ.Flow)0. 2ml/minCDL 温度(CDL Temp)250 °C缓冲液浓度(B.conc)50 % H2O, 50 % ACN加热块温度(BlockTemp)200°C所得生物素-环形多肽分子量为2243. 57Da。实施例3类风湿关节炎抗体的体外检测使用ELISA方法检测类风湿关节炎患者的血清中自身免疫抗体，具体的实验步骤 可以参见US6，858，438中关于ELISA检测的相应部分。其基本原理是多肽(抗原)包被在酶标板表面，将稀释后的待检血清/血浆和对 照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗CCP抗体，经温育后，则血清/血浆中 特异性抗体与反应板孔中的CCP抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的 血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相CCP抗原(多肽)结合的 抗CCP抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物， 并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据试剂盒内的对照物，可对抗CCP抗 体进行定量或定性测定。抗人IgG抗体为HRP标记的兔抗人IgG抗体采购于武汉博士德生物工程有限公司 (货号BA1070)。其具体配制方式为，取20 μ L储存液，加800ml抗体稀释液作1 40000 稀释，混勻，分装标准小瓶，每瓶15ml，2 8°C下保存。抗体稀释液购自Pierce公司(货 号=37552)。HRP标记的抗人IgG抗体底物A配制称取柠檬酸17. 9g和Na2HPO4 · 1220 4. 67g 溶解于400ml去离子水中，然后缓慢加入30% Η202330 μ L，搅拌均勻后，加水至500ml，2 8°C下保存。HRP标记的抗人IgG抗体底物B配制称取四甲基联苯氨(tetramethylbenzidine， TMB) 0. Ig于100ml去离子水中，加入二甲基亚砜(DMSO) 2. 5ml，在搅拌的同时，缓慢加入 0.5ml 6M HC1，直至完全溶解，最后加水至500ml，2 8°C下保存。HRP标记的抗人IgG抗体底物反应终止液的配制分别量取55ml98% H2SO4和去离 子水445ml，然后将浓硫酸缓慢加入到去离子水中，混勻，2 8°C下保存。
酶标仪测定波长设定在450nm，30分钟内测定各孔OD450值。将实施例1中合成的环形多肽分别与类风湿关节炎患者血清进行验。
多肽(SEQ IDNo 1)
假阴性72
合计256多肽灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)=184/256 = 71.88%将实施例1中合成的环形多肽分别与非类风湿关节炎患者血清进行实验。
多肽(SEQ ID No 1)假阳性11
真阴性245
合计256_多肽专一性=真阴性/(真阴性+假阳性)=245/256 = 95. 70%实施例4生物素标记多肽用于类风湿关节炎抗体的体外检测加有0. 05% (v/v) Tween-20的pH7. 4磷酸缓冲盐溶液(PBST)稀释链霉亲和素，使 其浓度为5μ g/ml。然后加入到酶标板各孔中，4°C过夜，取出酶标板，去除包被液，用pH7. 4 的PBST溶液洗2次，然后加入PBST稀释的生物素标记的多肽，室温孵育1小时(在脱色摇 床上混勻)，洗板，备用。将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存 在抗CCP抗体，经温育后，则血清/血浆中特异性抗体与反应板孔中的CCP抗原多肽结合， 形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG 抗体，温育，固相CCP抗原(多肽)结合的抗CCP抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗 去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反 应。根据试剂盒内的对照物，可对抗CCP抗体进行定量或定性测定。后续操作及所用试剂与实施例3记载相一致。合成的环形生物素_多肽类风湿关节炎患者血清进行实验。
生物素—多肽(SEQ ID No 1) Γ 真阳性202
假阴性54
合计256多肽灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)=202/256 = 78. 9%将合成的环形生物素_多肽分别与非类风湿关节炎患者血清进行实验。生物素—多肽(SEQ ID Nol)假阳性5
真阴性251 合计_256_多肽专一性=真阴性/(真阴性+假阳性)=251/256 = 98. 05%序列表<110>上海荣盛生物药业有限公司<120>与免疫抗体相结合的多肽及其应用<130)0911089<160>178<170>PatentIn version 3.3<210>SEQ ID No 1<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>1His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 2<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>2His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 3<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>3His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 4<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>4His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 5<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>5His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 6<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>6His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 7<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>7His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 8<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>8His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 9<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>9His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 10<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>10His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 11<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>11His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 12<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa为瓜氨酸
<400>12His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 13<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>13His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 14<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>14His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 15<211>17<212>PRT<213>入工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>15His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 16<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>16His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 17<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>17His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 18<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>18His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 19<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>19His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 20<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa为瓜氨酸<400>20His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 21<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>21His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 22<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>22His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 23<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>23His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 24<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>24His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 25<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸.
<400>25His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 26<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>26His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 27<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>27His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 28<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>28His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 29<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>29His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 30<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>30His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 31<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>31His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 32<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>32His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 33<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>33His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 34
<211>17
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<400>38His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 39<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>39His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 40<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>40His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 41<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>41His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 42<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>42His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 43<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>43His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 44<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>44His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 45<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>45His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 46<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>46His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 47<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>47His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 48<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>48His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 49<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>49His Gln Cys His Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 50<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>50His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 51<211>17<212>PRT<213>人工合成.
<223>Xaa 为瓜氨酸
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Gly<210>SEQ ID No 56<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>56His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 57<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>57His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 58<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>58His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 59<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>59His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 60<211>17
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Gly<210>SEQ ID No 69<211>17
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<400>77His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly
<210>SEQ ID No 78<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>78His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 79<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>79His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 80<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>80His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 81<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>81His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 82<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>82His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 83<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>83His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 84<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>84His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 85<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>85His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 86<211>17.
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>86His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 87<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>87His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 88<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>88His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 89<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>89His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 90<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸[1004]<400>90His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 91 [1009]<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>91His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 92<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>92His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 93<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>93His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 94<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>94His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015[1043]Gly<210>SEQ ID No 95<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>95His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 96<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>96His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 97<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>97His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 98<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa为瓜氨酸<400>98His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 99<211>17[1082]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>99His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly [1089]<210>SEQ ID No 100<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>100His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 101<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>101His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 102<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>102His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 103<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸[1121]<400>103His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 104<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>104His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 105<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>105His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 106<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>106His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 107<211>17<212>PRT<213> 人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>107His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015[1160]Gly<210>SEQ ID No 108<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>108His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 109<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>109His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 110<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>110His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 111<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>111His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 112<211>17[1199]<212>PRT[1200]<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>112His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa His Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 113<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>113His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 114<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>114His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 115<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>115His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Leu Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 116<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸[1238]<400>116His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala lie Cys151015Gly<210>SEQ ID No 117<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>117His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 118<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>118His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 119<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>119His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 120<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>120His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015[1277]Gly<210>SEQ ID No 121<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>121His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 122<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>122His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 123<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>123His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 124<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>124His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 125<211>17.[1316]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>125His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 126<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>126His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 127<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>127His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 128<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>128His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 129<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸.[1355]<400>129His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 130<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>130His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 131<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>131His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 132<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>132His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 133<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa为瓜氨酸<400>133His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015[1394]Gly<210>SEQ ID No 134<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>134His Gln Cys His Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 135<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>135His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 136<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>136His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 137<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>137His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 138 [1432]<211>17[1433]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>138His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 139<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>139His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 140<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>140His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 141<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>141His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 142<211>17<212>PRT<213>人工合成 [1471]<223>Xaa 为瓜氨酸[1472]<400>142His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 143<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>143His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 144<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>144His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 145<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>145His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 146<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>146His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015[1511]Gly[1512]<210>SEQ ID No 147<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>147His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 148<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>148His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 149<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>149His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 150<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>150His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 151<211>17[1550]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>151 [1554]His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 152<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>152His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 153<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>153His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 154<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>154His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 155<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸[1589]<400>155His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys [1591]151015Gly<210>SEQ ID No 156<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>156His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 157<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>157His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 158<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>158His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 159<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>159His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015[1628]Gly<210>SEQ ID No 160<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>160His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 161<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>161His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 162<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>162His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 163<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>163His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 164<211>17[1667]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>164His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 165<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>165His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 166<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>166His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Met Arg His Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 167<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>167His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 168<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸[1706]<400>168His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 169<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>169His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 170<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸 [1724]<400>170His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 171<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>171His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 172<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>172His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015[1745]Gly<210>SEQ ID No 173<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>173His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 174<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>174His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 175<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>175His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ IDNo 176<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>176His Gln Cys His Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 177<211>17[1784]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>177His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 178<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 为瓜氨酸<400>178His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015 [1799]Gly
权利要求
一种与免疫抗体相结合的多肽包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Gly，其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为修饰的Arg；Xaa8为Ser或Arg；Xaa9为Arg或Leu；Xaa10为Ala或Ile；Xaa11为Ala或Arg。
2.根据权利要求1所述的与免疫抗体相结合的多肽，其特征在于所述修饰的Arg为侧 链修饰，侧链具有通式(I)所述的结构 <formula>formula see original document page 2</formula>其中 Gl 为 O、NH 或 CH2 ；G2 为 NH2、CH3、NHCH3 或 N(CH3) 2 ；G3 为 O、NH、NHCH3> NHCH3 ；η 为 2、3或4 ；当Gl为NH，G2为NH2时，G3不为ΝΗ。
3.根据权利要求2所述的与免疫抗体相结合的多肽，其特征在于所述的多肽包含如下 氨基酸序列:His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gl y，其中Xaa为瓜氨酸。
4.根据权利要求2所述的与免疫抗体相结合的多肽，其特征在于所述多肽包含的具体 氨基酸序列为SEQ ID No 2-178。
5.根据权利要求1-4之一所述的与免疫抗体相结合的多肽，其特征在于所述的多肽结 合有生物素标记。
6.根据权利要求5所述的与免疫抗体相结合的多肽，其特征在于所述的多肽N末端结 合有生物素标记。
7.根据权利要求6所述的与免疫抗体相结合的多肽，其特征在于所述的标记有生物素 的多肽与亲和素或链霉亲和素非共价结合。
8.根据权利要求1-4之一所述的多肽，其特征在于多肽在第三位Cys与第十六位Cys 之间形成二硫键。
9.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽在类风湿关节炎自身免疫抗体体 外检测中的应用。
10.根据权利要求8所述的多肽，其特征在于所述多肽在类风湿关节炎自身免疫抗体 体外ELISA检测中的应用。
全文摘要
一种与免疫抗体相结合的多肽，其序列中有三个精氨酸侧链被修饰为电中性或电负性氨基酸。这些多肽序列上两个不相邻的半胱氨酸侧链巯基形成二硫键而成环状。这类多肽不仅能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合，同时还能对HLA-DR具有高亲和力。经过实验验证，该类多肽与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于95％，对类风湿关节炎自身免疫抗体的检测灵敏度大于75％。与市场上销售的同类产品相比，其灵敏度得到显著提高，更有利于类风湿关节炎自身免疫抗体的体外检测。
文档编号C07K7/08GK101812119SQ20091004664
公开日2010年8月25日 申请日期2009年2月25日 优先权日2009年2月25日
发明者朱绍荣 申请人:上海荣盛生物药业有限公司