专利名称：一种多球壳菌素衍生物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多球壳菌素衍生物，特别涉及一种氨基上引入 具有紫外特征吸收峰基团的多球壳菌素衍生物及其制备方法，还涉 及该衍生物在定量测定含多球壳菌素的生物制品中的应用。
背景技术：
多球壳菌素具有多种药理作用。Fujita等研究显示，多球壳菌 素具有显著的双向免疫调节作用，能阻断白介素-2受体以下的途径， 抑制丝氨酸棕榈酰转移酶活性，从而特异性抑制T细胞的增殖；多 球壳菌素对同种细胞障碍性T细胞的诱导均有很强的抑制活性，在 这些方面比环孢菌素A强10 100倍；同种混合淋巴球混合反应方 面，多球壳菌素也比临床广泛应用的环孢菌素显示更强的活性。另 外，Hojjati等报道多球壳菌素可抑制动脉粥样硬化形成，利用多球 壳菌素抑制鞘脂类合成的关键酶——丝氨酸棕榈酰转移酶的机理， 连续60天对8周龄的动脉粥样硬化的大鼠每隔一天注射浓度为0. 3 mg/kg多球壳菌素，结果显示多球壳菌素对鞘脂类的合成有明显的抑 制作用，该大鼠动脉硬化损伤面积明显减少，因此，多球壳菌素抑 制丝氨酸棕榈酰转移酶活性可能作为治疗动脉粥样硬化的一个选 择。肖朝华等利用高糖模拟糖尿病病人体内的高糖
3环境，探讨多球壳菌素在糖尿病肾病肾脏肥大和早期肾硬化过程中所起 的作用，结果表明多球壳菌素不但可有效抑制肾小球系膜细胞系肥大， 并能明显较少细胞外基质分泌，因此有望将其用于治疗糖尿病肾病、肾 小球硬化等肾脏疾病。基于多球壳菌素的药理价值及临床应用前景，建 立高灵敏度的测定方法对于开发多球壳菌素具有重要意义。
目前关于多球壳菌素含量测定方法的报道，在文献(固相萃取结合
HPLC测定蝉花菌丝体中多球壳菌素的含量，余佳文等，中国药学杂志， 43: 1191-1193， 2008年)和中国发明专利"冬虫夏草中多球壳菌素含 量的测定方法"提供了一种固相萃取结合高效液相色谱测定蝉花和冬虫 夏草中多球壳菌素的方法。该方法的不足之处在于多球壳菌素为不带 发色基团的化合物，检测波长需选择在紫外末端，选择紫外末端测定受 干扰多，灵敏度不高；样品化学成分复杂，多球壳菌素含量低，需经分 离纯化后方可通过HPLC分析，操作起来比较繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种氨基上引入具有紫外特征吸收峰基团的多
球壳菌素衍生物。
本发明的另一目的是提供该多球壳菌素衍生物的制备方法。 本发明的目的还在于提供该多球壳菌素衍生物在定量测定含多球壳
菌素的生物制品中的应用。
本发明所述多球壳菌素衍生物的化学式用下式(I)表示
4其制备方法如下取多球壳菌素和芴甲氧羰酰氯，分别溶于吡啶和 四氢呋喃，再将这两种溶液按体积比为1 2 : 1 100进行混合，反应温
度10 60"C，反应时间0.01 120min，得到含化学式(I)的反应物； 蒸干该反应物的溶剂，剩余物以硅胶为色谱介质纯化，用体积比是8:2 的氯仿、甲醇混合溶液进行洗脱，分部收集馏分，蒸干溶剂，用乙醇结 晶，干燥得化学式(I)化合物。
化学反应式是:
0
(I)在该化学反应中，在多球壳菌素的氨基上引入了具有紫外特征吸收峰的 基团，同时使分子内酯化。由于化学式(I)化合物具有紫外特征吸收峰 基团及分子内酯化，稳定性增加，通过紫外检测器测定灵敏度显著提高。
通过优化制备式(I)化合物的反应条件，Fmoc-Cl和多球壳菌素可定量 的形成式(I)化合物，因而通过测定式(I)化合物可定量表征多球壳 菌素。值得注意的是加入的Fmoc-Cl必须足量，否则多球壳菌素不能被 完全反应完，导致定量分析结果不准确。
采用高效液相色谱-质谱联用技术定性分析反应物中化学式(I)化 合物
取含式(I)化合物的反应物进行高效液相色谱-质谱联用定性分析， 采用色谱柱C8色谱柱；流动相乙腈与水体积比20 80 : 80 20;流 速0.7 1.2 mL/min;柱温20 45°C，检测采用质谱仪。
取含式(I)化合物的反应物注入高效液相色谱-电喷雾电离-质谱仪 (HPLC-ESI-MS)进行分析。在ESI正离子全扫描方式下，得总离子流图 (图l)，取保留时间约29 min进行质谱分析，可得[M + H]+为606. 4的 准分子离子峰(图2)，式(I)化合物分子量为605，与式(I)化合物 一致。选择m/z为606. 4的准分子离子进行二级质谱分析，得其二级质谱 (图2)，可观察到m/z为384. 3和410. 3的碎片峰，式(工)化合物在质谱 条件下也可裂解得m/z为384和410的碎片峰(图3)。而在空白反应物(反 应时未加多球壳菌素)中未出现相应峰及碎片峰。上述分析表明反应物
6中含有式(I)化合物，所分析的物质为式(I)化合物。
另取上述在制备式(I)化合物的过程中用乙醇结晶、干燥后的物质
溶于甲醇，然后取5叱注入质谱仪进行分析，可得[M + H]+为606.4的 准分子离子峰，其二级质谱也可观察到m/z为384. 3和410. 3的碎片峰。结 果与用高效液相色谱-质谱联用技术分析化学式(I)化合物的一级质谱 和二级质谱结果一致。表明所分析物质为式(I)化合物。
采用高效液相色谱定量分析式(I)化合物，从而可以定量测定多球 壳菌素的含量。该多球壳菌素衍生物可用于定量测定蝉花、冬虫夏草等 中药材中多球壳菌素含量及测定含蝉花或冬虫夏草及其提取物的制剂， 也可用于定量测定生物样品中的多球壳菌素含量。
高效液相色谱定量分析式(I)化合物的步骤包括(1)制备化学 式(I)化合物如前所述方法制备得到含有式(I)化合物的反应物， 所取多球壳菌素和FM0C-C1，两者摩尔比是1 : 300 1 : 3，分别溶于吡 啶和四氢呋喃，再将这两种溶液按体积比为1 2 : 1 100进行混合，反 应温度10 60 °C，反应时间0.01 120 min，得到含化学式(I)的反 应物。(2)高效液相色谱定量分析式(I)化合物定量移取含有式(I)
化合物的反应物进行高效液相色谱分析，采用色谱柱C8色谱柱；流动
相乙腈与水体积比20 80 : 80 20;流速0. 7 1. 2 mL/min;柱温20 45 °C，检测采用二极管阵列检测器(DAD)，选取波长250 270 nm; 测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，可绘制式(I)化合物的标准曲线。所绘标准曲线线性关系良好，该方法可定量分析式(I) 化合物。
无论待测样品是蝉花还是冬虫夏草还是其他的生物样品，只要其内 含有多球壳菌素就可以通过加入芴甲氧羰酰氯的方法发生化学反应生成 式(I)化合物，再通过高效液相色谱定量分析(I)化合物从而测定样 品中多球壳菌素的含量。具体来说样品中多球壳菌素的含量测定包括以 下步骤(1)待测样品中多球壳菌素的提取；(2)利用步骤(1)所得 的多球壳菌素提取液通过加入芴甲氧羰酰氯的方法制得含有式(I)化合 物的反应物；(3)高效液相色谱定量分析反应物中式(I)化合物从而测 定多球壳菌素的含量。
如果待测样品是蝉花时，其多球壳菌素的提取方法如下精密称定过60 目筛的蝉花菌丝体粉末l g，置50 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇10 mL， 超声提取2次，每次30 40 min，或者加热回流法提取2次，每次1 3 小吋；提取液过滤，滤液在60 °C真空下挥干，残渣精密加入吡啶lmL， 溶解，离心10min，取上清液即得蝉花提取液。按所述体积比将该蝉花 提取液与溶解有芴甲氧羰酰氯的四氢呋喃溶液进行混合，制得含有式(I) 化合物的反应物，再通过高效液相色谱定量分析反应物中化学式(I)化 合物。典型高效液相色谱图见图4: (a):空白(b):式(I)化合物 (c)蝉花样品峰l为式(I)化合物。
如果待测样品是冬虫夏草时，其多球壳菌素的提取方法如下精密 称定过60目筛的冬虫夏草菌丝体粉末5 g，置250 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，超声提取2次，每次30 40min，或者加热回流法提 取2次，每次1 3小时；提取液过滤，滤液在60'C真空下或空气流下 挥干，残渣精密加入吡啶0. 5 mL，溶解，离心10 min，取上清液即得 冬虫夏草提取液。同前述方法按所述体积比将该冬虫夏草提取液与溶解 有芴甲氧羰酰氯的四氢呋喃溶液进行混合，制得含有式(I)化合物的反 应物。
如果待测样品是血浆时，其多球壳菌素的提取方法如下精密量取 血浆样品2mL，置lOmL具塞离心试管中，加入甲醇6mL，混旋10min， 离心(3000 r/min)10 min。取上清液置50 60 。C水浴上通空气流挥干。 残渣用100 uL吡啶溶解，混旋10 min，离心(3000 r/min) 10 min， 得上清液即为待测样品。同前述方法按所述体积比将该待测样品与溶解 有芴甲氧羰酰氯的四氢呋喃溶液进行混合，制得含有式(I)化合物的反 应物。
本发明的有益效果是在多球壳菌素的氨基上引入具有紫外特征吸 收峰的基团，能定量获得多球壳菌素衍生物，该多球壳菌素衍生物可用 于测定蝉花、冬虫夏草等中药材中多球壳菌素含量及测定含蝉花或冬虫 夏草及其提取物的制剂，也可用于测定生物样品中的多球壳菌素含量。 测定结果可靠、精确。
图1 反应物总离子流2 化学式(I)化合物的一级质谱和二级质谱
图3化学式(I)化合物的可能裂解方式
图4化学式(I)化合物典型高效液相色谱图 具体实施例(共6例) 实施例l式(I)化合物的制备
配制芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)溶液精密称取Fmoc-Cl约5.0 mg， 溶解于50 mL四氢呋喃溶液中，制成每1 mL含Fmoc-Cl为0. 1 mg的 衍生剂溶液，4 °C冰箱保存备用。
配制多球壳菌素溶液精密称取多球壳菌素约2. 5 mg，置于50 mL 量瓶中，用吡啶溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含多球壳菌素 0.05 mg的溶液，4 °C冰箱保存备用。
分别量取上述Fmoc-Cl溶液100.0 W和多球壳菌素溶液50.0 W 置1.5 mL Eppendorf管中，混匀，反应温度40 。C，反应时间10 min， 得含有式(I)化合物的反应物，蒸干反应物中溶剂，剩余物以硅胶为色 谱介质纯化，用体积比是8 : 2的氯仿、甲醇混合溶液进行洗脱，分部收 集馏分，蒸干溶剂，用乙醇结晶，干燥得化学式(I)化合物。 实施例2式(I)化合物的制备
配制芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)溶液精密称取Fmoc-Cl约20. 0 mg， 溶解于100 mL四氢呋喃溶液中，制成每1 mL含Fmoc-Cl为0. 2 mg的 衍生剂溶液，4 °C冰箱保存备用。
10配制多球壳菌素溶液精密称取多球壳菌素约2. 0 mg，置于10 mL量 瓶中，用吡啶溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lmL含多球壳菌素0.2 mg的溶液，4 °C冰箱保存备用。
分别量取上述Fmoc-Cl溶液100.0 ml和多球壳菌素溶液10.0 ml 置500 mL圆底烧瓶中，混匀，反应温度50 °C，反应时间20 min，得 含有式(I)化合物的反应物，蒸干反应物中溶剂，剩余物以硅胶为色谱 介质纯化，用体积比是8 : 2的氯仿、甲醇混合溶液进行洗脱，分部收集 馏分，蒸干溶剂，用乙醇结晶，干燥得化学式(I)化合物。 实施例3高效液相色谱-质谱联用定性分析式(I)化合物
取10化实施例i所制得的反应物注入高效液相色谱-电喷雾电离-质
谱仪(HPLC-ESI-MS)分析。采用色谱柱C8色谱柱；流动相乙腈与水 体积比70 : 30;流速1.0 mL/min;柱温35°C，检测采用质谱仪。
在ESI正离子全扫描方式下，可得[M + H]+为606. 4的准分子离子峰， 式(I)化合物分子量为605，推测[M + H]+为606.4的准分子离子峰为 式(I)化合物的准分子离子峰。选择m/z 606. 4进行二级质谱分析，得 其二级质谱，可观察到m/z为384. 3和410. 3的碎片峰，式(I)化合物质 谱条件下也可裂解得m/z为384和410的碎片峰，进一步证实[M + H]+为 606.4的准分子离子峰为式(I)化合物的准分子离子峰。在空白反应物 (反应时未加多球壳菌素)中未出现相应峰及碎片峰。结果表明，反应 物中有式(I)化合物。
ii实施例4 式(I)化合物的用途测定不同发酵批次蝉花菌丝体中多 球壳菌素含量
所用仪器Agilent 1100型高效液相色谱仪(G1379A脱气机、G1311A 四元泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B DAD检测器， Chemstations工作站)。
分析条件色谱柱C8色谱柱；流动相乙腈与水体积比60 : 40;
流速1.0mL/min;柱温35 °C，检测采用DAD，选取波长262 nm。
测定步骤如下(用不同发酵批次的蝉花菌丝体分别做以下试验)
(1) 待测样品中多球壳菌素的提取
分别精密称定过60目筛的蝉花菌丝体粉末0.5 g，置50 mL具塞 锥形瓶中，加入甲醇10 mL，超声提取2次，每次30 40min，提取液 过滤，滤液在60 °C真空下挥干，剩余物精密加入吡啶1 mL，溶解， 离心10 min，取上清液即得蝉花提取液。
(2) 利用步骤(1)所得的蝉花提取液制备含有式(I)化合物的反
应物
取蝉花提取液IO叱，置1.5 mL Eppendorf管中，然后加入实施例l 所配制的Fmoc-Cl溶液50叱，密塞，旋涡混匀，离心，反应温度40'C， 反应时间IO min，放冷至室温，得含有式(I)化合物的反应物。
(3) 高效液相色谱定量分析反应物中式(I)化合物从而测定多球 壳菌素的含量。通过上述步骤取不同发酵批次蝉花菌丝体，按步骤(1)方法配制供试品溶 液，衍生化反应后按上述色谱条件进行测定，以外标法按峰面积计算含 量，结果见表l。
表1蝉花菌丝体中多球壳菌素含量测定结果(n = 3)
批号菌丝体(g)多球壳菌素(mg/g)RSD (/ %)
1200705015. 26780. 19161. 7
1200705023. 19830. 07531.6
1200806014. 93470. 37821.4
为了证实该测定方法的精确性，做了如下试验:
(A) 线性关系试验
多球壳菌素储备液的配制精密称取多球壳菌素对照品适量，置于
50mL量瓶中，用吡啶溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lmL含多球 壳菌素0.5 mg的对照品储备液，4°C冰箱保存备用。
分别精密量取多球壳菌素储备液O. 1， 0.4, 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0mL，置10mL量瓶中，用吡啶定容，分别经衍生化反应后按上述高效 液相色谱条件进行测定，衍生化反应条件同本实施例的步骤(2)。以化 学式(I)化合物峰面积(Y)对多球壳菌素浓度(X)进行线性回归，结果表 明多球壳菌素浓度在5.0 250.0 ug/mL范围内与(式(I)化合物) 的峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y = 35471.88 X - 9. 34 (r =0.9972)。
(B) 检出限和定量限取多球壳菌素储备液适量，用吡啶稀释成
1350 500 ng/mL的一系列溶液，衍生化反应后，分别进样5叱，记录 色谱图。按信噪比(S/N)为3: 1，测得化学式(I)化合物的检出限为60 ng/mL;按信噪比(S/N)为10: 1，测得化学式(I)化合物的定量限为200 ng/mL。
(C) 精密度试验精密吸取100化多球壳菌素溶液(500 ng/mL)， 衍生化反应后，连续进样5次，测定峰面积。结果化学式(I)化合物峰 面积的RSD(n = 5)为1.45%。试验结果表明，本法精密度良好。
(D) 稳定性试验取本实施例步骤(1)所得的待测样品蝉花提取 液，衍生化反应后室温下放置，分别于0， 1， 2， 4， 8， 12h测定，化 学式(I)化合物峰面积的RSD为2.0X。结果表明，化学式(I)化合物 在室温下放置12 h稳定。
(E) 重现性试验精密称取同一批号的菌丝体样品6份，按本实施 例步骤(1)项下方法配制供试品溶液，衍生化反应后进样分析，多球壳 菌素含量的RSD为2.2X。试验结果表明，本法重现性良好。
(F) 回收率试验精密称取已知含量的蝉花菌丝体(批号 120080601,含量0.3782 ug/g)细粉9份，每份约0. 5 g，分成3组， 每组3份，分别精密添加浓度为0.063 u g/mL的多球壳菌素对照品溶液 2、 3、 4mL，照实施例步骤(1)项下方法制备供试品溶液，分别衍生化 反应后按上述色谱条件测定，测得低、中、高3组浓度下的平均加样回收 率分别为98.2% ， 99.7%， 98.8%; RSD分别为2. 1%， 1.2%， 1.9%(n
14=3)。总平均加样回收率为98.9%， RSD为1.7X(n二9)。试验结果表明， 本法具有良好的回收率。
实施例5式(I)化合物的用途测定冬虫夏草中多球壳菌素含量
(1) 精密称定过60目筛的冬虫夏草菌丝体粉末5g，置250 mL具 塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，加热回流法提取2次，每次1 3小时； 提取液过滤，滤液在60'C真空下挥干，残渣精密加入吡啶0.5mL，溶 解，离心10 min，取上清液即得冬虫夏草提取液。
(2) 制备式(I)化合物称取Fmoc-Cl溶于四氢呋喃溶液，配成 Fmoc-Cl浓度为0. 15 mg/mL，分别取冬虫夏草提取液20 u L和Fmoc-Cl 溶液100 pL，混合反应，反应温度40 °C，反应时间10 min，得含式
(I)化合物的反应物。
(3) 高效液相色谱定量分析式(I)化合物取10 UL反应物进行
高效液相色谱分析，采用色谱柱C8色谱柱；流动相乙腈与水体积比
70 : 30;流速0.8 mL/min;柱温30 °C，检测采用DAD，选取波长262; 测定峰面积。根据式(I)化合物的标准曲线可计算冬虫夏草中多球壳菌 素含量。测得冬虫夏草菌丝体样品中多球壳菌素含量为0.012mg/g。 实施例6式(I)化合物的用途测定生物样品(血浆)中多球壳菌 素的含量
(1)血浆中多球壳菌素提取精密量取血浆样品2 mL，置10 mL 具塞离心试管中，加入甲醇6mL，混旋10min，离心(30Q0 r/min)10min。
15取上清液置75 80 "C水浴上通空气流挥干。残渣用200 uL吡啶溶解， 混旋IO min，离心(3000 r/min) 10 min，得上清液。
(2) 制备式(I)化合物称取Fmoc-Cl溶于四氢呋喃溶液，配成 Fmoc-Cl浓度为0. 15 mg/mL，分别取步骤(1)的上清液2 u L和Fmoc-Cl 溶液10yL，混合反应，反应温度40'C，反应时间10min，得含式(I) 化合物的反应物。
(3) 高效液相色谱定量分析式(I)化合物定量取反应物进行高
效液相色谱分析，采用色谱柱C8色谱柱；流动相乙腈与水体积比70 :
30;流速1.0 mL/min;柱温35 。C，检测采用DAD，选取波长262 nm; 测定峰面积。根据式(I)化合物的标准曲线可计算血浆中多球壳菌素含 量。测得所取血浆样品中多球壳菌素含量为0.0032 mg/mL。本方法可用
于测定多球壳菌素及其类似物的药代动力学。
权利要求
1、一种多球壳菌素衍生物，化学式是(I)
2、 如权利要求1所述的多球壳菌素衍生物，其制备方法如下 取多球壳菌素和芴甲氧羰酰氯，分别溶于吡啶和四氢呋喃，再将这 两种溶液按体积比为1 2 : 1 100进行混合，反应温度10 60 °C， 反应时间0.01 120 min，得到含化学式(I)的反应物；蒸干该反 应物的溶剂，剩余物以硅胶为色谱介质纯化，用体积比是8 : 2的氯 仿、甲醇混合溶液进行洗脱，分部收集馏分，蒸干溶剂，用乙醇结 晶，干燥得化学式(I)化合物。
3、 如权利要求1所述的多球壳菌素衍生物在定量测定含多球壳 菌素的生物制品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种多球壳菌素衍生物及其制备方法，是在吡啶和四氢呋喃溶液提供反应环境的条件下，向多球壳菌素中加入芴甲氧羰酰氯，两者反应后生成多球壳菌素衍生物，该衍生物在多球壳菌素的氨基上引入具有紫外特征吸收峰的基团，再通过高效液相色谱可以进行定量分析，从而进一步定量表征多球壳菌素。该方法测定结果可靠精确，可用于测定蝉花、冬虫夏草等中药材中多球壳菌素含量及测定含蝉花或冬虫夏草及其提取物的制剂，也可用于测定生物样品中的多球壳菌素含量。
文档编号C07D307/00GK101508686SQ20091010303
公开日2009年8月19日 申请日期2009年1月8日 优先权日2009年1月8日
发明者余佳文, 徐红娟, 朱华李, 毛先兵, 钟国跃, 陈仕江, 马开森 申请人:重庆市中药研究院