专利名称：：一种粉虱座壳孢菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种粉虱座壳孢菌/^c力erwm》"/q'raJ/jWebber，及其用于防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、柑桔粉虱和蚜虫等害虫。
背景技术：
：在烟粉虱、柑桔粉虱、蚜虫等害虫的防治上，多采用传统的化学防治方法，在生物农药防治方面未发现用于防治上述害虫的粉虱座壳孢菌菌株。该菌是一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、对环境无污染、无残留的特征，可以作为防治某些对苏云金杆菌(Bt)产生抗药性的昆虫的替代防治药物。
发明内容为了防治烟粉虱、柑桔粉虱、蚜虫等害虫，本发明的首要目的在于提供一种粉虱座壳孢菌菌株。本发明的另一目的在于提供上述粉虱座壳孢菌菌株的应用。本发明的目的通过下述技术方案来实现一种粉虱座壳孢菌菌株，是从广州地区被虫生真菌自然侵染的柑桔粉虱虫体上分离获得，将野生菌株连续多次接于烟粉虱虫体上复壮获得粉虱座壳孢菌菌株，对该菌株采用单孢子分离获得纯化菌株。所述菌株为AA01-N8，菌株保藏号CCTCCNo:M207087，2007年6月27日在中国典型培养物保藏中心保藏。所述粉虱座壳孢^化/26^o"^"/^yra^faWebber属腔孢纲，座壳孢属。所述粉虱座壳孢菌菌株的粉虱座壳孢的子座扁垫状或盾状、微被毛，白色至亮黄色，直径1.01.5mm，高0.40.6mm，被基层包围，基层半透明，白色，宽0.20.5mm，由菌丝密织而成.菌丝有时膨胀，透明，壁光滑，宽厚0.26.4pm，壁厚，0.82.2pm，分生孢子器嵌入子座，卵形或扁球形不规则，120280xl50320^im，有开敞孔口，圆形，孔口被橙色的粘孢团覆盖。分生孢子纺锤形，有时弯曲，顶端尖，单孢，透明，壁光滑。分生孢子梗单生或二轮生，具25根管形轮生体。轮生体较细，纤弱，细圆柱形，未端平截，7.817.5(imxl.21.8(im，侧丝从分生孢子梗中生出，丝状，透明，长3010(Vm(少有350pm)，宽1.01.6(im。上述粉虱座壳孢菌菌株在制备防治烟粉虱、柑桔粉虱、蚜虫等药物中的应用。本发明的粉虱座壳孢菌对防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、柑桔粉虱、蚜虫等多种害虫有效。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本菌株从广东省广州地区被侵染的柑桔粉虱虫体上分离获得，为中国本土的菌株，并非从国外引进，能适应本地的自然环境。本发明粉虱座壳孢菌菌株是一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、对环境无污染、无残留的特征，适应了有机食品生产的要求。本发明的粉虱座壳孢菌对防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、柑桔粉虱、蚜虫等多种害虫有效。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一歩详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例11.1材料来源在广州地区的果树柑桔上采集到一种被虫真菌侵染的柑桔粉虱D/fl/owraJes虫尸。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将200g马铃薯煮熟取汁，然后在所取汁液中再加入20g葡萄糖+1720g琼脂粉，加入水使总体积为1000ml煮沸。后经高压灭锅灭菌(121°C，30min)。无菌操作条件所有器皿和用具均须经高压灭锅灭菌(12rC，30min)，接种等操作在超净工作台内进行。培养条件置于25。C光照(14L:10D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4"冰箱贮存。1.2病原菌的分离、鉴定(一)病原菌的分离与纯化(1)分离从采回的被虫生真菌感染的柑桔粉虱虫尸样品上分离病原菌。利用5%的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次，并放入PDA平板中，倒置于25t:恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4'C冰箱贮存。(2)复壮将分离到的菌株在PDA平板上培养15d，待形成菌落后加入0.3%吐温一80的灭菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，用小型手动喷雾器将稀释成lxio包子/ml的孢子悬浮液均匀地喷于带有烟粉虱的黄瓜叶片上，保温卯％以上。15d后挑取被感染的烟粉虱，按前面所述的方法分离到A分离株。(3)纯化将A分离株分别在PDA平板上培养15d，待形成橙色孢子座后，挑取分生孢子制成lxl()S孢子/ml浓度的孢子悬液，将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入PDA培养基上，放在培养箱中培养，获得B、C、D、E、F共5个分离株。(4)病原菌的鉴定根据病原菌的培养性状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行初步鉴定。1、菌落形态描述将获得的5个分离株接种到PDA平板上，在25'C条件下培养，35天可长出白色菌丝，第7天左右开始形成孢子，菌落颜色逐渐由白色变成橙黄色，并形成粘孢团，第15天左右呈橙黄色孢子座层；单菌落呈圆形，边缘整齐、呈一白圈，中间隆起，上有许多乳头状突起，为橙黄色。2、菌丝和孢子形态描述菌丝白色，有时膨胀、透明，壁光滑，宽厚3.26.4pm，壁厚，0.82.2pm，分生孢子器嵌入子座、卵形或扁球形、不规则，120280xl50320jum，有开敞孔口、圆形，孔口被橙色的粘孢团覆盖。分生孢子纺锤形，有时弯曲、顶端尖，单孢、透明、壁光滑。分生孢子梗单生或二轮生，具25根管形轮生体。轮生体较细，纤弱，细圆柱形，未端平截，7.817.5^imxl.2l.^im，侧丝从分生孢子梗中生出，丝状，透明，长30100pm，(少有350pm)，宽1.01.6|im。(二)粉虱座壳孢分离株的筛选虫生真菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性，又存在有准性生殖现象，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力差异显著，菌株不同，其LD,LT5。可相差数倍至数十倍。高产优质菌株的筛选与获得是取得较好防治效果的首要前提。菌株筛选常用的4个指标分别为致病力、产孢量、孢子萌发率、菌落生长速率。本发明以这些指标为依据，筛选优良的粉虱座壳孢菌株。(1)供试菌株的处理经纯化后获得的粉虱座壳孢菌B、C、D、E、F共5个分离株，采用PDA平板，于25土0.5"的恒温箱(14L:10D)中培养。(2)供试昆虫与寄主植物烟粉虱，将网室中伺养在黄瓜上的烟粉虱成虫，接种到无虫的黄瓜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将黄瓜幼苗置于25i0.5"C的光照培养箱中，待烟粉虱发育至2龄若虫时待用。黄瓜0^ww^^^vwL.，品种为万吉青瓜，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用23片展开叶的盆栽苗。(3)菌落生长速率和产孢量的测定将5个分离株分别配制成lxloq包子/ml浓度的分生孢子悬液，分别取lml悬液滴入PDA培养基上，用三角玻璃棒涂匀，待45d长出菌丝后用直径为13mm的打孔器取新鲜菌落，接种于PDA平板上，然后置于培养箱中培养(L:D=14:10)。每个菌株5次重复。第10d测定菌落直径并收集分生孢子用血球计数板测定产孢量。具体操作如下用直尺测量菌落直径，并用直径为5mm的灭菌打孔器在培养皿中菌丝生长相对均匀一致的位置取菌块，然后放入加有20ml0.3%吐温一80灭菌水中，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球记数板记数并测定产孢量。5个分离株的菌落扩展直径和产孢量见表1，各分离株之间菌落扩展直径差异不显著。生长10d后，分离株C、D与B、E的产孢量差异显著，其中D分离株的产孢量最高。表1粉虱座壳孢5个分离株生长速率和产孢量(10d)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。(4)孢子萌发率的测定将5个分离株分别培养10d后，用无菌水收集孢子并制成悬液，用载玻片萌发法试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，在皿内滴加34滴灭菌水保湿(100%,RH)，培养24h后镜检。每处理3个重复。5个分离株中，C、D分离株与其它分离株之间的分生孢子萌发率差异显著(见表2)。其中D分离株的孢子平均萌发率最高，B分离株的孢子萌发率最低。表2粉虱座壳孢5个分离株分生孢子萌发率(24h)<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。(5)分离株对烟粉虱2龄若虫的致病力测定将5个分离株培养10d后，用无菌水收集孢子，配制成浓度为5><106分生孢子/mL的孢子悬液。将带有2龄烟粉虱若虫的黄瓜叶片浸入悬液中，对照浸入含0.3%吐温一80的无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为34片叶，每叶50100头若虫，3次重复。摘下处理过的叶片，插入盛有无菌水的花泥中，置于透明的保鲜盒内。再置于25土0.5。C的光照培养箱中(L:D=14:10)。每日镜检并记录感染死亡率，连续观察8d。致病性研究结果表明，所有分离株的侵染率与对照相比差异显著。5个分离株在第4d开始表现出侵染症状，从第4d的侵染率可看出C、D、F分离株间的侵染率差异显著，第8d时E分离株与其它分离株的侵染率差异显著。从总体而言，分离株C的致病力较强，平均为95.57%(7d)，E分离株的侵染率较低，为86.14%(8d)(表3)。表3粉虱座壳孢5个分离株的致病性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。(6)粉虱座壳孢分离株的筛选在筛选优良分离株时，致病力和产孢量是重要的参考指标，孢子萌发率和菌落生长速率次之。在本发明中，各分离株之间的菌落扩展直径差异不显著。C、D与其它分离株之间分生孢子萌发率差异显著。从产孢量和致病力上看，分离株C和D较为优良，具有致病性强、产孢量高等特点(表l、表3)。综合比较各方面的因素，C分离株为最佳菌株，将其命名为AA01-N8菌株。经贵州大学刘爱英教授鉴定为粉虱座壳孢/^c/7e^ora》a/e_yracfeWebber，其菌株保藏号CCTCCNo:M207087，2007年6月27日在中国典型培养物保藏中心保藏。该粉虱座壳孢^sc/2eMow'aa/e)'ra^feWebber属腔孢纲，座壳孢属。该粉虱座壳孢菌菌株的粉虱座壳孢子座扁垫状或盾状、微被毛，白色到亮黄色，直径1.01.5mm，高0.40.6mm，被基层包围，基层半透明，白色，宽0.20.5mm，由菌丝密织而成.菌丝有时膨胀，透明，壁光滑，宽厚0.26.4(im，壁厚，0.82.2pm，分生孢子器嵌入子座，卵形或扁球形不规则，120280xl50320|im，有开敞孔口，圆形，孔口被橙色的粘孢团覆盖。分生孢子纺锤形，有时弯曲，顶端尖，单孢，透明，壁光滑。分生孢子梗单生或二轮生，具25根管形轮生体。轮生体较细，纤弱，细圆柱形，未端平截，7.817.5pmxl.21.8|im，侧丝从分生孢子梗中生出，丝状，透明，长30100|im(少有350pm)，宽1.01.6(im。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。实施例2粉虱座壳孢对烟粉虱的致病力测定生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，能为综合评价该真菌的生物防治潜力提供参考重要的依据。本发明就粉虱座壳孢AA01-N8菌株对烟粉虱的致病力进行测定，以筛选出在防治时所用的最佳浓度。供试昆虫与寄主植物烟粉虱，将温室中饲养在黄瓜上的烟粉虱成虫，接种到无虫的黄瓜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将黄瓜幼苗置于25i0.5'C的光照培养箱中，待烟粉虱发育至2龄若虫时待用。黄瓜Cwc,&m^wL.，品种为万吉青瓜，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用23片展开叶的盆栽苗。(1)供试菌株的处理经纯化后获得的粉虱座壳孢AA01-N8菌株，在PDA平板上于25士0.5。C的恒温箱(14L:10D)中培养10天，加入0.3%吐温一80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成lx103、lxio4、lxi05、lxio6、lxl()7孢子/ml5个浓度梯度待用。(2)AA01-N8菌株对烟粉虱若虫的致病力测定将带有烟粉虱2龄若虫的黄瓜叶片浸入5个梯度的孢子悬浮液中，对照(CK)浸入含0.3%吐温一80的灭菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为34片叶，每叶50100头若虫，3次重复。处理过的叶片连同黄瓜苗一起放置于25士0.5"C的光照培养箱中(L:D=14:10)。每日镜检并记录感染死亡率，连续观察14d。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。(3)粉虱座壳孢AA01-N8菌株对烟粉虱各龄若虫的累计死亡率接种后的第23d，各处理区的若虫开始表现出发病症状，如烟粉虱的体色由透明逐渐变为不透明的白色或橙黄色，虫体表面可见白色的菌丝和橙黄色子座。表4为粉虱座壳孢处理后若虫第10d的累计死亡率，结果表明随着浓度的增加烟粉虱2龄的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，烟粉虱2龄的死亡率也增加。其中1"06和1><107处理区，烟粉虱的累计死亡率差异不显著。表4粉虱座壳孢AA01-N8菌株对烟粉虱各龄若虫的累计死亡率(10d)(%)浓度lxl03lx104_lxl05_lxl06_lxl07l龄16.41士1.43b29.04士0.87a58.68士2.89a84.89士1.13a96.55士1.33a2龄18.06土0.73a32.31土0.76a62.59土1.08a87.27士1.98a97.34士0.95a3龄15.34士1.52b26.78士2.18b56.41士0.45a81.24士0.64a96.73士1.18a4龄13.06士1.03b25.86士1.15b51.13士0.67b56.63士0.85b68.81士2.86b"蛹"11.84土2.87c23.33士2.12b41.78土1.89b45.78士2.31c48.78士2.65cCK9.38士1.26d9.38士1.26c9.38土1.26c9.38士1.26d9.38士1.26d注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。实施例3粉虱座壳孢对蚜虫的致病力测定供试昆虫与寄主植物蚜虫，将网室中饲养在小白菜上的蚜虫，接种到无虫的小白菜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将小白菜幼苗置于25土0.5t:的光照培养箱中，待蚜虫发育至2龄幼虫时待用。小白菜Srow/cflc"wpeWn、L.ssp.chinensis，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用68片展开叶的盆栽苗。(1)供试菌株的处理经纯化后获得的粉虱座壳孢AA01-N8菌株，在PDA平板上于25i0.5'C的恒温箱(14L:10D)中培养10天，加入0.3%吐温一80的灭菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成lx103、lx104、lx105、lx106、lxl()7孢子/ml5个浓度梯度待用。(2)分离株对蚜虫的致病力测定将带有蚜虫的小白菜叶片浸入5个梯度的孢子悬浮液中，对照浸入含0.3%吐温一80的无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为34片叶，每叶IO头若虫，3次重复。处理过的叶片放入灭菌的托盘中(25cmx35cm)，并放置于25士0.5t:的光照培养箱中(L:D=14:10)。每日镜检并记录感染死亡率，并更换新鲜的白菜时片，连续观察10d。粉虱座壳孢AA01-N8菌株能侵染蚜虫，在第10d的累计死亡率为86%。说明粉虱座壳孢对蚜虫有好的效果。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种粉虱座壳孢菌菌株，其特征在于所述粉虱座壳孢菌菌株为AA01-N8，菌株保藏号CCTCCNoM207087，2007年6月27日在中国典型培养物保藏中心保藏。2、根据权利要求1所述的一种粉虱座壳孢菌菌株，其特征在于所述粉虱座壳孢菌菌株为属腔孢纲，座壳孢属。3、根据权利要求1所述的一种粉虱座壳孢菌菌株，其特征在于所述粉虱座壳孢菌菌株的子座扁垫状或盾状、微被毛，白色到亮黄色，直径1.01.5mm，高0.40.6mm，被基层包围，基层半透明，白色，宽0.20.5mm，由菌丝密织而成.菌丝有时膨胀，透明，壁光滑，宽厚0.26.4pm，壁厚，0.82.2)im，分生孢子器嵌入子座，卵形或扁球形不规则，120280xl50320nm，有开敞孔口，圆形，孔口被橙色的粘孢团覆盖；分生孢子纺锤形，有时弯曲，顶端尖，单孢，透明，壁光滑。分生孢子梗单生或二轮生，具25根管形轮生体。轮生体较细，纤弱，细圆柱形，未端平截，7.817.5)imxL21.8pim，侧丝从分生孢子梗中生出，丝状，透明，长30100(im，宽L01.6(im。4、权利要求l所述的粉虱座壳孢菌菌株在制备防治烟粉虱、柑桔粉虱或蚜虫药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种粉虱座壳孢菌菌株及其应用。该粉虱座壳孢菌菌株是从广州地区被虫生真菌自然侵染的烟粉虱虫体上分离获得的菌野生菌株，将野生菌株多次接于烟粉虱虫体上复壮获得粉虱座壳孢菌菌株，对该菌株采用单孢子分离获得纯化菌株。该粉虱座壳孢菌菌株为AA01-N8，菌株保藏号CCTCCNoM207087，2007年6月27日在中国典型培养物保藏中心保藏。经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，粉虱座壳孢对粉虱、蚜虫等多种刺吸式口器害虫具有很强的侵染杀虫效果。文档编号C12N1/14GK101182467SQ20071003151公开日2008年5月21日申请日期2007年11月20日优先权日2007年11月20日发明者任顺祥,振黄申请人:华南农业大学