专利名称：一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基及方法
技术领域：
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基及方法。
背景技术：
蛋白酶是一类可以催化蛋白质水解反应的酶，它广泛存在于各种生物体中，不仅对生物体蛋白质的新陈代谢起调节作用，从 细胞水平、器官水平和机体水平，呈现多种多样的功能。它们参与细胞的正常生理以及异常的病理条件下的诸如蛋白质水解、细胞生长和迁移、酶原激活、激素释放等各种复杂的过程(汪章勋等，2005)。蛋白酶在食品、化工、医疗、农业、环保等许多方面发挥重要的作用，例如可用做生物农药的虫生真菌，其蛋白酶活力与其毒力密切相关(Paoletti，200)。扁座壳孢(Aschersonia placenta)是一类重要的虫生真菌,隶属于子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科、座壳孢属，在对粉虱、介壳虫等一些刺吸式口器害虫的自然控制中发挥着重要作用，具有可持续大面积控制害虫，对环境影响小等优点，是一种很有潜力的资源菌(邱君志等，2004)。国外也有许多国家在用扁座壳孢防治粉虱均取得上成功，如荷兰、捷克斯洛伐克用芽生孢子通过液体发酵培养进行小规模试验生产，以防治白粉虱，也取得了成功(邱君志等，2005)。迄今为止，有些国家已经开发出粉虱扁座壳孢菌的制剂，并将其商业化，用于粉虱的防治(李增智等，1987)。扁座壳孢菌作为微生物农药具有对生态环境影响小、成本低、选择性强、对人畜安全等特点，具有光明的前景(邱君志等，2004)，但是它还具有杀虫效果慢、受外界条件影响大等缺点，因此必须对其作用于害虫的机理进行深入研究，进而取得能克服上述两个缺点的优良菌株以应用于生产运用中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基及方法。本发明首先提供了一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基，所述培养基的原料含麸皮或者甘油lw%，酵母粉或者酵母膏I w %，Mn2+或者Mg2+4X10_4mol/L，培养基初始pH=7. 0_9· O ο更优选地，所述培养基的原料按重量分数计，含有1%果糖，1%酵母粉，4X 10_4mol/L Mg2+，pH 8· O。其次，本发明还提供了一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的方法，所述方法包含以下步骤
(a)将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液；
(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为150mL，接种量8mL，于26°C，转速160 r/min下培养。所述种子培养基的原料含有按培养基重量计算，20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。本发明采用的座壳孢为扁座壳孢(何学友等，油茶黑胶粉虱及扁座壳孢对其自然控制作用，中国森林病虫，2011年7月)。采用本发明优化后的培养基，菌龄5d，发酵周期10d，发酵产生结果扁座壳孢产蛋白酶为80U/mL以上。本发明的有益效果本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基，具有蛋白酶产率高，蛋白酶活力高等优点。
图1不同浓度的酪氨酸标准溶液标准曲线。 图2不同碳源对产蛋白酶的影响。图3不同氮源对产蛋白酶的影响。图4不同金属离子对产蛋白酶的影响。图5不同维生素对产蛋白酶的影响。图6不同初始pH对产蛋白酶的影响。图7不同培养时间对产蛋白酶的影响。
具体实施例方式本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。实施例1
单因素实验确定培养基最优成分
(I)种子培养基和基础培养基配制
(a)20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含150mL。1. OlMPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。(b)基础培养基(液体诱导培养基，w/v) 0. 5%明胶、1. l%Na2HP04 · 12H20、1. 2%NaH2P04 · 2Η20、ρΗ6· 5。(2)发酵种子的制作将扁座壳孢接种于马铃薯琼脂培养基上，于27°C下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，26°C，转速160r/min下培养10d，即为发酵液。(3)酶液的制备取步骤(2)下的发酵液在4°C下，5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长275nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/
mLo(4)蛋白酶酶活测定取Iml酶液在60°C水浴5min，加入三氯乙酸摇匀，将其放入40°C水浴IOmin,再加酪素Iml静置IOmin过滤,定容至IOml,作为对照。再取Iml酶液加酪素Iml在40°C水浴IOmin,加入三氯乙酸2ml摇勻静置IOmin过滤,定容至IOml,在275nm波长下测紫外吸光度。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A为样品的吸光度；K为吸光常数为反应试剂的总体积；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间；m为酶液质量或体积，g或mL)。
(5)标准曲线的制作在0-10(^8/1^范围内，以27511111处的吸光值为横坐标(父)、酪氨酸的浓度为纵坐标(Y)制定标准曲线。具体步骤如下
a.用超纯水配置浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μ g/mL的酪氨酸。b.测定反应液在275nm处的吸光值，在上述反应体系中以超纯水取代酪氨酸为空白对照。试验设置3个重复，其平均值用于制作标准曲线。结果见图1。(6)不同碳源、氮源、金属离子、pH、培养时间对产蛋白酶的影响
(a)碳源对酶产量的影响，在基础液体培养基中分别加入1%蛋白胨和1%供筛选碳源葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、麦麸、玉米粉。进行接种摇瓶培养，于26°C，转速160 r/min下培养，10d，取发酵液检测酶活。以基础液体培养基的蛋白酶活力作为对照，根据实验数据选择 对产酶最有利的碳源。结果见图2。(b)氮源对酶产量的影响，在基础液体培养基中分别加入1%麸皮和1%的供筛选氮源硫酸铵、蛋白胨、氯化铵、酵母膏、明胶、牛肉浸膏、酵母浸粉、碳酸氢铵。进行接种摇瓶培养，于26°C，转速160 r/min下培养，10d，取发酵液检测酶活。以基础液体培养基的蛋白酶活力作为对照，根据实验数据选择对产酶最有利的氮源。结果见图3。(C)金属离子对产酶的影响,在基础液体培养基中分别加入4X 10_4mol/l的供筛选 Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+。进行接种摇瓶培养，于 26°C，转速 160 r/min 下培养，10d，取发酵液检测酶活。以基础液体培养基的蛋白酶活力作为对照，根据实验数据选择对产酶最有利的金属离子。结果见图4。(d)维生素对酶产量的影响，在基础液体培养基中分别加入O. 01%的供筛选的维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素E和维生素C。进行接种摇瓶培养，于26°C，转速160r/min下培养，10d，取发酵液检测酶活。以基础液体培养基的蛋白酶活力作为对照，根据实验数据选择对产酶最有利的维生素。结果见图5。(e)pH对酶产量的影响，把基础液体培养基的pH分别用用O. lmol/L NaOH或HCl调至5、6、7、8、9，0进行接种摇瓶培养，于26°C，转速160 r/min下培养，10d，取发酵液检测酶活。以基础液体培养基的蛋白酶活力作为对照，根据实验数据选择对产酶最有利的初始pH值。结果见图6。(f)培养时间对产酶的影响，将扁座壳孢菌丝接到基础液体培养基中，进行接种摇瓶培养，每天测一次发酵液中蛋白酶酶活至蛋白酶酶活连续两天出现下降为止，以确定最佳的发酵培养时间。结果见图7。实验结果
从图2可知，加入各种不同碳源的培养基均有助于扁座壳孢产蛋白酶，其中麦麸最利于产酶，其次是甘油，加入麦芽糖和葡萄糖对产酶的提高作用不明显。由图3可见，在培养基中加入不同的氮源对该菌产蛋白酶影响较大。有机氮都可以促进产酶，其中酵母膏的作用最强，其次是酵母粉和蛋白胨；然而，无机氮对该菌产酶有不同程度的抑制作用，其中硫酸铵的抑制作用最明显。从图4可以看出只有加入Mg2+的培养基有利于蛋白酶的活性增强，其余金属离子均在不同程度上抑制该菌产生蛋白酶，其中Zn2+的抑制作用最大。从图5可以看出，加入VB1、VB2、VB6、VE和^这5种不同维生素的培养基都不利于扁座壳孢产蛋白酶。其中，VB6对该菌产酶的抑制作用最强。
从图6可以看出，不同的初始pH对产酶存在不同程度的影响。当培养基的初始pH为8. O时，该菌所产的蛋白酶活性最高，pH为9. O时酶活急剧下降，因此该酶可能是碱性的。从图7可以看出，在前期试验基础上，结果表明扁座壳孢培养5d后，有一定的酶活力；在5-9d内酶活力缓慢升高，而在flOd是迅速升高，并且在培养至第IOd时酶的活力最高；此后随着时间的延长，酶的活力开始缓慢下降。随着时间的变化，其酶活力的变化如图7所示。实施例2 正交实验确定最优发酵条件 (O正交实验确定最佳培养基
根据以上的实验结果，选择蛋白酶活最高的两个碳源因素(麸皮和甘油)，选择蛋白酶活最高的两个氮源因素(酵母浸粉和酵母膏)以及两个蛋白酶活最高的金属离子(Mg2+和Mn2+)选择正交进行正交试验。以酶活力高低作为指标，通过正交设计确定最佳碳源、氮源和金属离子。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例I的方法相同。表I扁座壳孢蛋白酶四因子二水平(24)正交实验设计
水平1-源aMii B金■离子C I
1I 曾油鮮母浸粉
2I S酵母膏I
表2扁座壳孢蛋白酶四因子二水平(24)正交实验设计实验结果
--]-1--1--τ---)
辤旮；ABCSlSAiUinL I|
1III53'54;1ΠI
2I2213,10:121|
52I261.99=5.17|
422I56.38r4.09|
.................................................................................................................................................................................................-·...............................................................-.........................................................................................................................................................................-4
Kl 199.92 346.59 329.76|
-------------Better factors and level shown I
K2 355.11 20S..14 225.2^|
----as follows; A2. BLCl I
R 155.19 138,15 104.49|
注Kl为各因素水平I的所有酶活力之和，K2为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和，K4为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean) 土标准差(S. D)。由表I和表2可知，3个培养基条件(碳源、氮源和金属离子)对扁座壳孢蛋白酶的产生具有不同程度的影响。表2中的R值表明碳源(155. 19)是一个比其他培养基条件更重要的因素，其次是氮源(138. 15)，对产酶影响最小的培养基因素是金属离子(104.49)。正交分析表明最适合该酶产生的培养基条件为A2, B1, C1 (碳源为麸皮，氮源为酵母粉，金属离子为Mg2+)。(2)正交实验确定最优培养条件
分别选择三个蛋白酶活最高的菌龄、接种量、培养时间和通气量，并对其选择正交进行正交试验。以酶活力高低作为指标，通过正交设计确定最优的菌龄、接种量、培养时间和通气量。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。表3扁座壳孢蛋白酶四因子三水平(34)正交实验
权利要求
1.一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料含有麸皮或者甘油lwt%，酵母粉或者酵母膏I wt%，Mn2+或者Mg2+4X 10_4mOl/L，培养基初始pH=7. 0_9· O ο
2.根据权利要求1所述的扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料按重量分数计，含有1%果糖，1%酵母粉，4Χ 10_4mol/L Mg2+，pH 8. O。
3.一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤 Ca)将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液； (b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为150mL，接种量8mL，于26°C，转速160 r/min下培养。
4.根据权利要求3所述的扁座壳孢发酵生产蛋白酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料含有按培养基重量算，20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。
全文摘要
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有麸皮1wt%，酵母粉1wt%，Mg2+4×10-4mol/L，培养基初始pH=7.0-9.0。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为150mL，接种量8mL，于26℃，转速160r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基，具有蛋白酶产率高，蛋白酶活力高等优点。
文档编号C12N9/58GK103013962SQ201210543640
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者邱君志, 苏礼超, 李小霞, 涂洁, 宋飞飞, 邱云锋, 郭庆丰, 何肖云, 毛丽慧, 张伟 申请人:福建农林大学