专利名称：新型抗肿瘤类化合物及其制造方法
技术领域：
本发明涉及到一类新型的化合物及其制造方法，具体地说，就是由属于壳二孢属的霉菌产生的具有抗肿瘤作用的一类化合物。
背景技术：
以前有报告说，蒽环类抗生素、丝裂霉素等很多的化合物可以用作抗肿瘤类抗生素。
发明内容
本发明是以提供新颖抗肿瘤物质及其制造方法作为研究课题的。
本发明者们发现了壳二孢属霉菌所产生的新型化合物类，并且发现这些化合物具有抗肿瘤活性，从而完成了本发明。
本发明所提供的化合物用下面的结构式表示。
上面的结构式所示的化合物存在数个互变异构体。这几个互变异构体中，第1个化合物命名为FE399-P1，它是具有下面物理化学性质的互变异构体平衡混合物作为主成分而形成的。
①干燥物的外观白色粉末②熔点260～265℃(分解)③溶解性易溶于吡啶、醋酸；可溶于二甲基亚砜、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙腈中；难溶于水。
④紫外吸收光谱在乙腈溶液中200nm附近有末端吸收。
⑤1H核磁共振光谱(600MHz，氘代吡啶)的化学位移值(δ,单位ppm):9.55(1H,s)、7.97(1H,d)、5.84(1H,t)、5.19(1H,brs)、4.88(1H,s)、4.04(2H,m)、3.65(1H,d)、3.47(1H,d)、2.56(1H,t)、2.37(1H,t)、2.12(1H,m)、1.11～1.51、0.83(1H,t)⑥13C核磁共振光谱(150MHz，溶剂氘代吡啶)的化学位移值(δ，单位ppm):176.001、174.731、171.733、75.383、55.235、55.114、47.820、45.354、36.572、35.866、32.780、26.992、26.932、25.349、22.492、19.208、14.109⑦13C核磁共振光谱(100MHz，溶剂氚代二甲基亚砜)的化学位移值(δ，单位ppm):174.8、173.1、170.3、74.2、53.5、52.6、47.4、44.1、36.0、34.9、32.3、26.9、26.6、26.6、24.8、21.6、18.3、13.7⑧呈色反应磷钼酸显色呈阳性茴香醛显色呈阳性⑨利用薄层层析色谱方法，用下面的展开条件分离。
吸附剂 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展开溶剂氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大约0.32本发明所提供的第2个化合物命名为FE399-P2，它与FE399-P1一起构成一种互变异构平衡混合物。利用薄层层析色谱法，用以下的展开条件分离得到。
吸附剂 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展开溶剂氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大约0.42本发明的第3个化合物命名为FE399-P3，它很可能与上述的FE399-P1及/或FE399-P2一起形成一种互变异构平衡混合物，但也不能排除它是FE399-P1或FE399-P2的部分分解产物的可能性。FE399-P3通过薄层层析色谱法，用以下的展开条件分离得到。
吸附剂 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展开溶剂氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大约0.54另外，本发明也提供含有上述FE399-P1、FE399-P2及FE399-P3中的2种或3种化合物的互变异构平衡混合物。
本发明还提供以在培养基中培养壳二孢属霉菌，然后从培养基中获取含有FE399-P1、FE399-P2或FE399-P3或它们的2种或3种的互变异构平衡混合物为特征的上述化合物或混合物的制造方法。
本发明还提供含有以上述FE399-P1、FE399-P2及FE399-P3中1种或2种以上的混合物作为有效成分的药物组合物。
以下的内容中把FE399-P1、FE399-P2或FE399-P3称为“FE399化合物”，把其中的含有2种或3种的互变异构平衡混合物称为“FE399化合物类”。
下面详细说明本发明。
本发明的FE399化合物类是从壳二孢属霉菌的培养物中获取的。作为壳二孢属霉菌，例如有本发明者分离得到的壳二孢属AJ117309菌株(FERM BP-5517)。AJ117309菌株是从红豆杉科植物紫杉的新鲜叶子中通过下面的方法而分离得到。
紫杉的健康叶子采集于神奈川县川崎市，用流水洗去表面的污垢后，用60％乙醇进行表面杀菌1分钟。立即用消毒水将叶子洗净后，用消毒刀细切成1平方厘米的切片。将2个这样的切片放在LCA培养基(葡萄糖1g/L、KH2PO4lg/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、KCl0.2g/L、NaNO32g/L、酵母浸膏0.2g/L、琼脂15g/L、PH6.5)中，间隔3～4cm，室温下培养。在第4天或第5天，用细针将培养基上伸长出来的菌丝的尖端挑出来，移植到新的培养基中纯化。下面记录了这样分离得到的AJ117309菌株的细菌学性质。
(a)在各种培养基中的生长形态在麦芽浸膏琼脂培养基中的生长旺盛且迅速，25℃条件下5天内菌落直径为45mm。菌落的表面呈白色绵毛状，内部先呈白色，后一部分呈暗绿色。没有发现培养基中有渗出色素和液滴的生成。
在马铃薯·葡萄糖琼脂培养基中的生长旺盛且迅速，25℃条件下5天内菌落直径为42mm。菌落的表面呈白色绵毛状，内部刚开始呈白色，后一部分呈暗绿色。没有发现色素和液滴的生成。
在玉米粉琼脂培养基中的生长良好，25℃条件下5天内菌落直径为43mm。菌落的表面呈白色绵毛状，具有一层比较薄的底层菌丝层。培养基中没有发现渗漏色素和液滴的生成。
在这些培养基中，没有发现分生孢子体的形成(但是，在琼脂中偶尔能见到分生孢子体的形成)。但是，如果在培养基中加入天然基质(灭菌植物叶)后再进行培养，在叶片上就能显著观察到分生孢子器的形成。另外，在上述各种培养条件下都无法观察到完整的世代。
(b)形态状况放置在麦芽浸膏琼脂培养基中的叶片上产生的分生孢子器呈暗绿色，球形或类球形，直径为0.3-0.5mm，中央有孔。发育成熟后由孔口渗漏出白色膏状孢子。分生孢子呈无色，椭圆-卵圆形，双细胞(中间有隔)，大小为(6.0～10.0)×(2.0～2.5)um。
生长温度为10～35℃，最佳生长温度为22～27℃。另外，生长pH值为3～10。
从以上的细菌学性质来看，根据“腔孢类细菌”(TheCoelomycetes；1980、Commonwealth Mycological Institute公司(英国)，B.C.Sutton著)，该菌可明确地归类为半知菌亚门、腔孢纲、壳二孢属，本菌株可命名为壳二孢属AJ117309。本菌株于1996年4月23日由工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305，日本茨城县筑波市东一条1段3号)根据布达佩斯条约向申请了国际保藏，并得到保藏号FERM BP-5517。
FE399化合物类是由上述AJ117309菌株等壳二孢属霉菌在培养基中培养后，从培养基中获取得到的。
壳二孢属霉菌的培养例如可按下面的方法进行。在麦芽浸膏琼脂培养基中接种壳二孢属霉菌，25℃条件下培养7天。将麦芽浸膏琼脂培养基切成小块，接种到含有下列组成的生产培养基的Roux型烧瓶中，25℃条件下静置培养3周左右。
表1(生产培养基组成/ROux型烧瓶)燕麦粉 20g液体培养基*28ml*液体培养基组成 葡萄糖 2g/l果糖 5蔗糖 8NZ胺 2MgSO4·7H2O0.5KCl 0.5ZnSO4·7H2O0.5KH2PO41(PH6.0)如上方法培养壳二孢属霉菌后，向每只Roux型烧瓶中添加100ml丙酮，室温下萃取30分钟。分出丙酮层后，减压浓缩，蒸去丙酮，向剩余物中加水成水溶液。然后再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得到的乙酸乙酯萃取液用饱和氯化钠水溶液洗净后，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。剩余物溶于甲醇中，向其中加入1.2倍体积的正己烷萃取，分出正己烷层后，浓缩甲醇层至干，剩余物溶于乙酸乙酯中，4℃条件下静置数天。待析出结晶后，通过离心操作除去乙酸乙酯溶液。这样得到的剩余物再用少量的甲醇洗涤，就得到以FE399-P2为主成分，含有少量FE399-P1和FE399-P3的粗提物。
然后，将上述方法得到的粗提物悬浮于乙腈中，室温放置一天左右后FE399-P1就成为主成分，含有少量FE399-P2和FE399-P3。
上述粗提物中的FE399化合物例如可以通过薄层层析色谱法来证明。作为吸附剂，可以使用Kieselgel60F254(厚度0.25MM,Merk公司生产)；作为展开溶剂，可以使用氯仿∶甲醇=93∶7，此时FE399-P1、FE399-P2及FE399-P3的Rf值分别为大约0.32,0.42,0.54。
FE399化合物类例如可通过反相高效液相色谱法来进行分离。用表2所示的条件进行反相高效液相色谱层析时，各个FE399化合物的保留时间如下。此时的色谱图如
图1所示。图1中，峰1,2,3分别对应于FE399-P1、FE399-P2、FE399-P3。
表2使用仪器紫外检测器Waters991(Waters公司生产)泵HITACHIL-6200(日立制造公司生产)层析柱分析用反相高效液相色谱层析柱(CAPCELLPAKC18UG1205um、4.6mmφ×250mm(资生堂(株)生产)洗脱溶剂50％乙腈流速0.8ml/分保留时间(单位分钟)FE399-P1 大约9.1FE399-P2 大约11.7FE399-P3 大约12.1FE399化合物在乙腈、氯仿、醋酸等有机溶剂中能够形成至少2种或3种互变异构平衡混合物，根据溶剂、温度等条件的不同，混合物的主成分亦变化。而且，在这些化合物中，FE399-P1比较稳定。前面所说的FE399化合物的物理化学性质(薄层层析色谱法的Rf值项除外)虽然是关于用高效液相色谱法分离得到的FE399-P1的性质，但所用的原料中也可能含有少量FE399-P2和FE399-P3。
FE399化合物中，至少FE399-P1和FE399-P2是可以用同一个平面结构式(前述的结构式)来表示的互变异构体。FE399-P3也很有可能是互变异构体，但也不能排除它是FE399-P1或FE399-P2的部分分解产物的可能性。
FE399化合物类及精制的FE399化合物的保存条件，例如可以采取干燥状态-20℃条件保存的方法。
本发明的FE399化合物具有抗肿瘤作用，可期望用作治疗实体癌症及白血病药品的有效成分。
附图的简要说明图1是FE399化合物类的反相高效液相色谱图。
图2是以FE399-P1作为主成分的互变异构平衡混合物的紫外吸收光谱。
图3是以FE399-P1作为主成分的互变异构平衡混合物的红外吸收光谱。
图4是以FE399-P1作为主成分的互变异构平衡混合物的1H核磁共振谱。
图5是以FE399-P1作为主成分的互变异构平衡混合物的13C核磁共振谱。
本发明的最佳实施方案下面通过实施例具体说明本发明。
实施例1FE399化合物的制备在麦芽浸膏琼脂培养基中接种壳二孢属AJ117309菌株，25℃条件下培养7天。另外配制前面表1所列的物质组成的生产培养基，把该培养基放入133只500ml Rroux型烧瓶中，120℃下加热灭菌20分钟。接着，如前所述，把已经培养好的麦芽浸膏琼脂培养基切成小块(直径8mm)，接种到上述生产培养基中，25℃下静置培养21天。
按照上面的步骤培养AJ117309菌株后，每只Roux型烧杯中加入100ml丙酮，室温下萃取30分钟。收集丙酮层后，减压浓缩，蒸去丙酮，向剩余物中加水配成2升水溶液。然后再用2升乙酸乙酯萃取该水溶液3次，所得到的乙酸乙酯萃取液用饱和氯化钠水溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。
剩余物溶解于500ml甲醇中，加入600ml正己烷萃取，除去正己烷层后，浓缩甲醇层至干。剩余物溶解于100ml乙酸乙酯中，4℃条件下静置2天。待析出结晶后，再通过离心操作除去乙酸乙酯溶液。这样得到的剩余物再用少量的甲醇洗涤，得到粗提物190mg。该粗提物用Kieselgel60F254(厚度0.25mm,Merk公司生产)作吸附剂进行薄层层析色谱法(展开溶剂氯仿∶甲醇=93∶7)分离后，5％磷钼酸乙醇溶液显色，得到Rf值分别为0.32、0.42、0.54的3个斑点。按次序分别命名为FE399-P1、FE399-P2、FE399-P3。上述粗提物的主成分是FE399-P2。若把该粗提物悬浮于乙腈中室温放置20小时后，主成分则变为FE399-P1。
将上述得到的以FE399-P1为主成分的混合物减压浓缩，浓缩液经反相高效液相色谱法(色谱柱Capeell pak C18 S6120、10mmφ×250mm、资生堂(株)公司生产，洗脱溶剂53％乙腈溶液(流速3.5ml/分钟)，紫外检测器Waters991(Waters公司生产)，泵HITACHI L-6200(日立制造公司生产))分离，得到FE399-P1及FE399-P2组分。FE399-P1的保留时间为7.5分钟，FE399-P2为9.7分钟。
实施例2FE399化合物的结构解析用实施例1的方法分离得到的FE399-P1溶解于氯仿中，室温放置数小时后，再用和上面相同的条件进行薄层层析展开，分离得到FE399-P1、FE399-P2、FE399-P33个斑点。将每个斑点分别从薄层板上刮下来，用溶剂(氯仿∶甲醇=50∶50)洗脱，得到的FE399化合物再分别在同一条件下进行薄层层析分离，就得到FE399-P1、FE399-P2和FE399-P33个斑点。另外，如前所述，溶解于氯仿中室温放置数小时后的FE399-P1可以采用前面表2所示的条件进行分析型反相高效液相色谱层析，就可以得到对应于各个FE399化合物的吸收峰。此时各个FE399化合物的保留时间见表2。
从这个结果及实施例1的结果可以判断，FE399-P1、FE399-P2、FE399-P3形成了互变异构平衡混合物。但是也不能排除FE399-P3是FE399-P1或FE399-P2的部分分解产物的可能性。
实施例1中得到的FE399-P1(以其为主成分的互变异构平衡混合物)的物理性质如前所述。图2表示的是它的紫外吸收光谱(用岛津公司生产的UV-160测定)，图3表示的是它的溴化钾压片红外吸收光谱(用日本分光生产的IR-810测定)，图4和图5分别表示的是它的1H核磁共振光谱(NMR)和13C核磁共振光谱(都是用Brucker公司生产的DMX600，在氚代吡啶中测定)。
根据上述各分析值及13C核磁共振光谱(100MHz，溶剂氘代二甲基亚砜)，可推断FE399-P1的结构式如下式。13C核磁共振光谱(100MHz，溶剂氘代二甲基亚砜)的归属见表3。
表3
实施例3FE399化合物对各种细胞的生长抑制作用精制而得的FE399化合物对各种细胞的增殖抑制作用可以通过以下的条件来测定。
在二氧化碳细胞孵箱中，37℃条件下于含有50IU/ml青霉素(FlowLaboratories公司生产，苏格兰)、50ug/ml链霉素(公司同前)、10％胎牛血清的100ul RPMI-1640培养基(Sigma公司生产)中培养表3所示浓度的各种细胞20小时。然后向其中加入适当浓度的FE399-P1或FE399-P2，继续培养3天。但是对P388和K562T来说，在配制完细胞培养液后直接向其中加入FE399化合物类。接着在每个培养基中都加入10ulMTT(溴化3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓)溶液(5mg/ml Dulbecco PBS(-)),37℃下于二氧化碳孵箱内培养4小时。再加入50ul0.01N盐酸/20％SDS，然后用微板读数仪(Microplate reader)在570nm处测其吸光度(对照波长630nm)。细胞增殖被抑制50％时的受试药物浓度(IC50)如表4所示。
表4
表4清楚地说明本发明的FE399化合物对各种癌细胞及肿瘤细胞增殖具有抑制作用。
实施例4FE399化合物类对实体癌的抑癌效果把用体内实验方法培养于CDF1小鼠皮下的小鼠大肠癌细胞colon-266由皮下取出，在培养皿中破碎，用套针将细胞皮下移植至CDFI小鼠(雌性，4周龄)，浓度为10mg/小鼠。以此为第0天，在第7天测定肿瘤大小和体重，然后将小鼠分组，n=4。肿瘤大小可以根据下面的方程式换算成肿瘤重量。
肿瘤重量(mg)=肿瘤体积(mm3)=1/2×长直径(mm)×短直径(mm)2把用实施例1的方法分离得到的FE399-P1的乙腈溶液减压干燥后所得的FE399按照下面的步骤给上面的小鼠用药。给药量为0.2ml/小鼠，腹腔给药。FE399溶解于二甲基亚砜中，配制成100mg/ml浓度，再用含有5％吐温80的生理盐水调节浓度，最终给药量为4mg/kg或8mg/kg。
若给药量为4mg/kg，则在第7天～第11天及第14天～第18天给药，共10次；若给药量为8mg/kg，则在第7天、第11天、第14天及第18天给药，共4次。
不给药的小鼠作为空白组。另外，作为对照组，在第7天、第11天及第15天给药顺氯氨铂。这里所用的FE399是FE399-P1和FE399-P2的混合物。
抑癌效果可以用由肿瘤重量换算成的肿瘤增殖抑制率(IR)来表示。IR可以通过下面的方程式换算。
IR(％)=(1-给药组的肿瘤重量/空白组的肿瘤重量)×100表5所示的是不同给药量的IR(第15天及第21天)。从该结果可以看出，FE399化合物在体内亦显示抗癌作用。
表5
工业上的应用领域本发明提供的是具有抗肿瘤作用的新型化合物。
权利要求
1．下面结构式所示的化合物。
2．权利要求1的化合物，其特征是，在如下的展开条件下进行薄层色谱分析，吸附剂 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展开溶剂 氯仿∶甲醇=93∶7Rf值 大约0.32。
3．权利要求1的化合物，其特征是，在如下的展开条件下进行薄层色谱分析，吸附剂 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展开溶剂氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大约0.42。
4．权利要求1的化合物，其特征是，在如下的展开条件下进行薄层色谱分析，吸附剂 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展开溶剂氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大约0.54。
5．一种变异构平衡混合物，含有选自权利要求2～4项所示的化合物的2种或3种。
6．上述化合物或混合物的制备方法，其特征在于，在培养基中培养壳二孢属霉菌，然后从培养基中获取含有权利要求1～4项记载的化合物的2种或3种的互变异构平衡混合物。
7．医药品组合物，含有以权利要求1～4项的化合物中的1种或1种以上的混合物作为有效成分。
全文摘要
在培养基中培养壳二孢属霉菌,从培养基中获取具有下式所示结构,有抗肿瘤作用,可形成互变异构平衡混合物的化合物或它们的混合物。
文档编号A61K38/00GK1225688SQ97196537
公开日1999年8月11日 申请日期1997年3月14日 优先权日1996年5月20日
发明者大林洋子, 吉村敏彦, 池上由佳, 不藤亮介, 村田正弘, 安东敏彦 申请人:味之素株式会社