专利名称：一种蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基及方法
技术领域：
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种蜡蚧菌 Hecanicillium)发酵生产几丁质酶的培养基及方法。
背景技术：
腊阶菌Cl I Hum)隶属丝孢菌类(Hyphomyce tes),广泛分布于热带、亚热带和温带，能寄生蚧类、蚜虫类、螨类和粉虱，还可寄生鳞翅目的一些害虫及线虫、蓟马等。 20世纪70年代以来，欧洲一些国家及美国、日本等国对利用蜡蚧菌防治温室蔬菜害虫给予极大重视。目前蜡蚧菌、座壳孢菌、拟青霉菌、绿僵菌和白僵菌等都是研究较多的昆虫病原真菌，其中以绿僵菌和白僵菌几丁质酶在国内外研究应用最为广泛(肖燕等，2001 )，而对蜡蚧菌产几丁质酶的研究在国内外并不多见。用蜡蚧菌发酵生产几丁质酶可为将来真菌防治害虫的深入研究提供科学依据。发明内容
本发明的目的在于提供一种蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基及方法。
本发明首先提供了一种蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基，所述培养基的原料配方为5-15 g/L果糖或麦芽糖，5-15 g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2-8X10_4mol/L K+或 Ca2+，O. 05-0. 2 g/LVc 或者 VB6，其余为水，培养基初始 ρΗ=5· 5-7. O。更优选地，所述培养基的原料配方为10g/L麦芽糖，10g/L酵母浸膏，4X10_4mol/L Ca2+，O. lg/LVB6，，其余为水，培养基初始pH=5. 5。
本发明还提供了一种蜡蚧菌发酵产几丁质酶的方法，所述方法包含以下步骤 (a)将蜡蚧菌接种种子培养基，制得发酵种子液；(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为50-100 mL，接种量5-15mL，于26°C，转速160 r/min下培养。
所述种子培养基的原料配方为200g/L土豆,葡萄糖20g /L,其余为水，自然pH。
本发明采用的蜡蚧菌为蜡蚧菌Z.1ecanii FJ28 (邱君志等，金属离子对蜡蚧菌几丁质酶活力的影响，激光生物学报，2009年2月)。
采用本发明优化后的培养基，菌龄I ld，发酵周期4d，发酵产生结果蜡蚧菌FJ28产几丁质酶为25 U/mL以上。
本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基，具有几丁质酶产率高，几丁质酶活力高等优点。
图1 NAG标准曲线。
图2不同碳源对产酶的影响。
图3不同维生素对产酶的影响。
图4不同氮源对产酶活性的影响。
具体实施例方式本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。实施例1
单因素实验确定培养基最优成分 实施步骤
(I)种子培养和基础培养基的配制20% 土豆汁(土豆切片熬汁)1L，葡萄糖20g，自然pH。分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含150mL。1. OlMPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。基础培养基(液体诱导培养基)粉状几丁质2%、KH2PO4 O. 1%、MgSCV7H20 O. 05%、NaCl O. 02%、pH6. 5。(2)发酵种子的制作将蜡蚧菌FJ28接种于马铃薯琼脂培养基上，于26°C下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，26°C，转速160 r/min下培养4d，即为发酵液。(3)酶液的制备取步骤(2)下的发酵液在4°C下，5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定波长550nm处的吸光值。换算成酶活单位U/mL。(4)几丁质酶酶活测定取ImL发酵上清液加入ImL磷酸盐缓冲液(ρΗ7· O)和50mL5%胶体几丁质中(以不加胶体几丁质的上清液作为对照),37°C水浴lh，加入2mL DNS试剂终止反应，沸水浴IOmin后冷却，离心后取上清液在波长550nm下测紫外吸光度，计算出产生的N-乙酰氨基葡萄糖的含量。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A为样品的吸光度；K为吸光常数'N为反应试剂的总体积；η为酶液的稀释倍数；t为反应时间；m为酶液质量或体积，g或mL)。(5)标准曲线的制作NAG标准曲线的制定在O 100 μ g/mL范围内，以550nm处的吸光值为横坐标(X)、N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的浓度为纵坐标(Y)制定标准曲线。具体步骤如下
a.用超纯水配置浓度为 10、20、30、40、50、60、70、80、90 和 100 μ g/mL 的 NAG。b.取上述浓度的NAG溶液各ImL分别与2mL DNS显色剂混合并沸水浴IOmin。c.反应完毕后，测定反应液在550nm处的吸光值，在上述反应体系中以超纯水取代NAG为空白对照。试验设置3个重复，其平均值用于制作标准曲线。根据待测样的吸收值在标准曲线上找到相应NAG的量，便可计算出样品中几丁质酶的活性。结果见图1。(6)不同碳源、氮源、维生素对产几丁质酶的影响
(a)碳源对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加1%葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-山梨醇、可溶性淀粉，接入相同的蜡蚧菌液，在26°C、160r/min的摇床中培养，72h发酵液中几丁质酶活性。结果见图2。(b)在基础培养基中分别添加O. 01% VB1, VB2、VB6、Vc, Ve，接入相同的蜡蚧菌液，在26°C、160r/min的摇床中培养，72h检测发酵液中几丁质酶活性。结果见图3。(c)氮源对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加1%的牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、KNO3> NH4Cl, (NH4)2SO4,〇&_3)2，接入相同的蜡蚧菌液，在261、16017^11的摇床中培养，72h检测发酵液中几丁质酶活性。结果见图4。
实施结果添加不同碳源(葡萄糖、鹿糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉)均提高了酶活性。其中添加麦芽糖使杀虫蜡蚧菌FJ28产几丁质酶活性达到17. 92U/mL(图2);其次是添加果糖的处理， 产酶达到13. 17U/mL的高峰；添加可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖的处理相对前两者其产酶活性要低得多，仅2. 8-5 U/mL。因此，不同碳源对蜡蚧菌FJ28产酶量影响不同。由此可见，麦芽糖是促进蜡蚧菌FJ28产几丁质酶的最佳碳源。
在添加的不同维生素处理中，与CK相比，Vb6最有助于蜡蚧菌FJ28提高产酶水平 (图3)，Vc次之。添加其他维生素不利于提升蜡蚧菌FJ28所产几丁质酶活性。
在所添加的不同氮源中，添加酵母浸膏的处理最有助于提高产酶水平，产几丁质酶酶活性达到5. 34U/mL(图4)，而添加酵母浸粉、蛋白胨和KNO3的处理也提高产酶量，但较酵母浸膏处理的酶活低。此外，从提升几丁质酶活性总体上看有机氮优于无机氮。据此，酵母浸膏是提高蜡蚧菌FJ28产几丁质酶的最佳氮源。
实施例2正交实验确定最优发酵条件 (O正交实验确定最佳培养基从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分，和PH值，配置不同的培养基，方法同实施例1中步骤(1)、(2)。见表1，将相同量的接种量(10%)菌种接种于250mL，装有50mL 培养液，在26°C，转速160 r/min下培养培养4d。然后按实施例1步骤(3)、(4)测定酶活。 选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。
表I蜡蚧菌FJ28几丁质酶五因子四水平(45)正交实验设计
权利要求
1.一种蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料配方为 5-15 g/L果糖或麦芽糖，5-15 g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2-8X10_4mol/L K+或Ca2+， O. 05-0. 2 g/LVc或者VB6，其余为水，培养基初始pH=5. 5-7. O。
2.—种蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料配方为 10g/L麦芽糖，10g/L酵母浸膏，4X10_4mol/L Ca2+，O. lg/LVB6，，其余为水，培养基初始 pH=5. 5。
3.—种蜡蚧菌发酵产几丁质酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤(a)将蜡蚧菌接种种子培养基，制得发酵种子液；(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为50-100 mL，接种量5-15mL，于26°C，转速160 r/min下培养。
4.如权利3所述蜡蚧菌发酵产几丁质酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料配方为200g/L 土豆,葡萄糖20g /L,其余为水，自然pH。
全文摘要
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基及方法。所述培养基的原料配方为5-15g/L果糖或麦芽糖，5-15g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2-8×10-4mol/LK+或Ca2+，0.05-0.2g/LVc或者VB6，其余为水，培养基初始pH=5.5-7.0。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量15mL，于26℃，转速160r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基，具有几丁质酶产率高，几丁质酶活力高等优点。
文档编号C12R1/645GK102994483SQ20121054389
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者邱君志, 苏礼超, 蔡志雄, 涂洁, 宋飞飞, 邱云锋, 李小霞, 何肖云, 毛丽慧, 谢小聪 申请人:福建农林大学