专利名称：一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法
技术领域：
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法。
背景技术：
漆酶(Laccase)是一种含铜多酚氧化酶，它能催化一系列有机和无机化合物发生一个电子氧化，同时伴随有氧还原成水。目前已发现多种生物能产生漆酶，包括植物、真菌、 昆虫、细菌等。其中，以真菌中的白腐菌分布最多(钞亚鹏等，2001)。
漆酶具有广泛的底物作用范围，可催化多种酚类和芳香胺类化合物的氧化，降解多环芳烃。因此,在生物降解、制浆造纸中、废水处理、生物漂白、污染物脱毒、土壤修复等方面，漆酶具有重要的应用价值。目前，漆酶的研究己在多领域、多水平上展开。许多由真菌引起的植物病害中，漆酶被显示是一个重要的毒力因子[8]。揭示虫生真菌是否能产漆酶，可为虫生真菌生防作用的深入研究提供依据。对虫生真菌漆酶的研究结果若能应用在对害虫的生物防治，无疑能更大限度地开发利用生物资源。
扁座壳孢是一种重要的昆虫病原真菌,在农林害虫生物防治中具有广泛的应用前景。该菌属子囊菌门(Ascomycota)粪菌纲i^orchriomycetes) 肉座菌目(Hypocreales)麦角菌科ijOlsvicipitsceeie)座壳孢属(Aschersonia),而对扁座壳孢发酵生产漆酶国内鲜有报道，具有较大的发展前景。发明内容
本发明的目的在于提供一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法。
本发明首先提供了一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，所述培养基的原料含有葡萄糖 O. 5-2wt%, (NH4)2SO4 l-4wt%, Zn2+O. 5X 1(T4_4X l(T4mol/L，VB4 I X 10义1 X l(T3wt%， 培养基初始pH=3. 8-4. 4。
更优选地，所述培养基的原料按重量分数计，含有葡萄糖O. 5wt%, (NH4) 2S044wt%, Zn2+O. 5X 1(T4 mol/L, VB4 5Χ 1(Γ4 wt%,培养基初始 pH=4. 4。
其次，本发明还提供了一种扁座壳孢发酵生产漆酶的方法，所述方法包含以下步骤(a)将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液；(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为 50mL，接种量lmL，于25°C，转速160 r/min下培养。
所述种子培养基的原料含有按培养基重量计，20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏 1%，自然pH。
本发明采用的座壳孢为扁座壳孢(何学友等，油茶黑胶粉虱及扁座壳孢对其自然控制作用，中国森林病虫，2011年7月)。
采用本发明优化后的培养基，菌龄4d，发酵周期3d，玻璃珠O个，发酵产生结果扁座壳孢产漆酶为45U/mL以上。本发明的有益效果本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，具有漆酶产率高，漆酶活力高等优点。
图1不同碳源对产酶活性的影响。注图中Dex、D-Sor、Ma1、Fru、Sue、Myc、SS、Car、L-Ara, CK分别表示葡萄糖、D-山梨醇、麦芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、L-阿拉伯糖和对照组。图2不同氮源对产酶活性的影响。注图中YE、YEP、Try、PN、Cas, AS、SN、P印、Ure, CK分别表示酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO3、干酪素、(NH4) 2S04、NaNO3、蛋白胨、尿素和 对照组。图3不同维生素对产酶活性的影响。图4不同无机盐离子对产酶活性的影响。图5不同初始pH对产酶活性的影响。
具体实施例方式本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。实施例1
单因素实验确定培养基最优成分
(I)种子培养基和基础培养基配制
(a)种子培养基20%土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。1. OlMPa，灭菌20min。(b)基础培养基20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。l.OlMPa，灭菌20mino(2)发酵种子的制作将扁座壳孢接种于马铃薯琼脂培养基上，于25°C下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，25°C，转速160r/min下培养24h，即为发酵液。(3)酶液的制备取步骤(2)下的发酵液在4°C下，5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长465nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/
mLo(4)漆酶酶活测定取O. 2mL发酵上清液加入3. 3mL醋酸缓冲液(pH4. 4)和O. 5mL4. OmmoI/L愈创木酚中(以热灭活上清液作为对照)，25°C水浴5min，冰浴加入2mL 16. 5%三氯乙酸试剂终止反应，离心后取上清液在波长465nm下测吸光度。
IO6、V总....ΔΑ
酶活力(U/g或UML)= -
F 酶ε-- Δ
式中，X为样品的吸光度分别代表反应体系总体积及反应酶液的体积；ε为吸光系数(ε 465 =1. 21 X 10_4mol/L · cm)；以每分钟氧化底物1. O μ mo I来定义酶活。
(5)不同碳源、氮源、维生素、无机盐离子、初始pH对产漆酶的影响。
(a)碳源对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加2%葡萄糖、D-山梨醇、麦芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠和L-阿拉伯糖，接入相同的扁座壳孢菌液，在25°C、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。
(b)氮源对产酶的影响，在基础培养基中分别添加1%的酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO3、干酪素、(NH4) 2S04、NaNO3、蛋白胨和尿素，接入相同的扁座壳孢菌液，在25°C、160r/ min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。
(c)维生素对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加O. 01% VB1, VB2、Vb4、Vb6, Vc, VE、，接入等量的扁座壳孢菌液，在25°C、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。
(d)无机盐离子对酶产量的影响，在基础培养基中分别添加相同摩尔数的无机盐离子(O. 4mmol NaH2PO4 · 2H20、KH2PO4、CuSO4 · 5H20、ZnSO4 · 7H20、FeCl3 · 6H20、MgSO4 · 7H20、 FeSO4 WH2CKCoCI2 ·6Η20、Μη504)，接入相同的扁座壳孢菌液，在25°C、160r/min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。
(e)初始pH对酶产量的影响，用基础培养基分别提供不同酸碱度的培养环境(pH 值 3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5)，接入等量的扁座壳孢菌液，在 25°C、160r/ min的摇床中培养，设置对照组，每天检测发酵液中漆酶活性。
实验结果碳源对酶产量的影响如图1所示，添加葡萄糖大幅提高了漆酶活性。在接种后第3d 就出现漆酶活性高峰，酶活性达到43. 27U/mL。添加D-山梨醇、果糖、可溶性淀粉的处理，在接种后第3d酶活分别达到14. 40U/mL、14. 43U/mL、16. 60U/mL,与对照组酶活15. 43U/mL相近；添加海藻糖、麦芽糖、羧甲基纤维素钠、蔗糖和L-阿拉伯糖的处理都对供试菌产酶有不同程度的抑制作用。添加蔗糖和L-阿拉伯糖的处理检测不到酶活。
氮源对产酶的影响如图2所示，在所添加的不同氮源中，添加酵母膏、酵母浸粉和硫酸铵的处理有助于提高产酶水平，酶活性分别达到40. 55U/mL、39. 19U/mL、41. 62U/mL, 而添加干酪素、蛋白胨的处理较对照处理的酶活低，二者对供试菌产酶具有抑制作用。此夕卜，胰蛋白胨、硝酸钾、硝酸钠和尿素的处理对其有强烈的抑制作用。据此，硫酸铵是扁座壳孢菌产漆酶的最佳氮源。
维生素对酶产量的影响如图3所示，在所添加的不同维生素里，与CK相比，维生素B4最有助于扁座壳孢菌提高产酶水平(图5)，维生素C次之，然后是复合维生素，所测得酶活力分别为45. 22U/mL、37. 58U/mL、29. 06U/mL。实验结果表明添加维生素B1、维生素 B6均 能增加扁座壳孢菌产漆酶。而维生素B2与维生素E对产酶则有显著的抑制作用，测得酶活仅为6. 54U/mL、6. 06U/mL。
初始pH对酶产量的影响如图4所示，在所添加的相同摩尔数不同种无机盐离子中，添加Na+、Zn2+、Fe2+、C02+的处理均有助于提高该菌产漆酶能力，酶活性分别达到19. 87U/ mL、36. 18U/mL、35. 23U/mL、23. 66U/mL，而添加 K+、Fe3+、Mg2+、Mn2+ 的处理较对照处理的酶活低，对供试菌产酶具有抑制作用。此外，Cu2+对扁座壳孢菌产漆酶无明显的促进作用。据此，Zn2+最能提高扁座壳孢菌产漆酶。无机盐离子对酶产量的影响如图5所示，在不同初始pH的培养基中培养后，pH=4. O的处理有助于提高产漆酶能力，酶活性达到30. 93U/mL,初始pH=4. 5的处理，其酶活值也达23. 80 U/mL。据此，初始pH=4. 0-4. 5最能提高扁座壳孢菌产漆酶。实施例2
正交实验确定最优发酵条件 (O正交实验确定最佳培养基
从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，和PH值，配置不同的培养基，方法同实施例1中步骤(I)、(2)。见表1，将相同量的接种量(10%)菌种接种于250mL， 装有50mL培养液，在25°C，转速160 r/min下培养培养3d。然后按实施例1步骤(3)、(4)测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。表I扁座壳孢漆酶五因子四水平(45)正交实验设计
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表2扁座壳孢漆酶五因子四水平(45)正交实验设计实验结果
权利要求
1.一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料中含有葡萄糖 O. 5-2wt%, (NH4)2SO4 l-4wt%, Zn2+O. 5X 1(T4_4X l(T4mol/L，VB4 I X 10义1 X l(T3wt%，培养基初始 pH=3. 8-4. 4。
2.根据权利要求1所述的扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料按重量分数计，含有葡萄糖 O. 5%，(NH4) 2S04 4%，Zn2+O. 5 X 10_4 mol/L, VB4 5 X 10_4%，培养基初始pH=4. 4。
3.一种扁座壳孢发酵生产漆酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤Ca)将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液；(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量lmL，玻璃珠O个，于25°C，转速160 r/min下培养。
4.根据权利要求3所述的扁座壳孢发酵生产漆酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料含有按培养基的重量计算，含有20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。
全文摘要
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有葡萄糖1-4wt%，(NH4)2SO41-4wt%，Zn2+0.5×10-4-4×10-4mol/L，VB41×10-4-1×10-3wt%，培养基初始pH=3.8-4.4。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量1mL，玻璃珠0个，于25℃，转速160r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产漆酶的培养基，具有漆酶产率高，漆酶活力高等优点。
文档编号C12N9/02GK102994464SQ20121054368
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者邱君志, 苏礼超, 吴宝杰, 李小霞, 涂洁, 宋飞飞, 邱云锋, 郭庆丰, 何肖云, 毛丽慧 申请人:福建农林大学