专利名称：一种棘孢木霉菌的筛选方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及真菌的筛选方法及其应用，尤其涉及棘孢木霉菌(Trichodermaasperellum)的筛选方法及其应用。
背景技术：
砷是一种在自然界广泛存在的有毒并且致癌的非金属元素，砷污染已成为全球危害十分严重的环境问题之一。据报道,全球至少5000多万人口正面临着地方性砷中毒的威胁，其中大多数为亚洲国家，中国是受砷中毒危害最为严重的国家之一，在1956-1984年 二十多年间，中国曾发生过30余起地砷中毒事件。我国是砷矿大国，砷矿广泛分布在我国的中南和西南的湖南、云南、广西、广东等省区，砷矿开采或冶炼，含砷农药、化肥等农资产品的过量投入等，可造成土壤在砷的累积，进而影响着植物、动物的生长和发育，且可以通过食物链进入人体，对人类的生存和健康构成威胁。目前常用的砷污染土壤修复方法包括土壤改良剂法、客土法、化学冲洗法以及生物修复方法等。生物修复方法是利用生物(主要是植物、微生物)的作用来消减、净化土壤中的砷或改变砷的结合形态和价态，被普遍认为是砷污染环境治理中最具应用前景的技术。其中，利用超富集植物去除土壤中砷的植物修复技术在最近几年中取得了突破性的进展，蜈蚣草(Brakefern,Pteris vitta)和大叶井口边草(Pteris nervosa)等砷超富集植物相继被发现，并可用于砷污染地区的土壤修复。在重金属污染土壤的生物修复技术中，除应用超富集植物吸收和富集重金属外，利用植物、微生物将土壤中的重金属转化为难溶态或气态化合物形式挥发到大气中，从而达到钝化甚至去除土壤中重金属的目的，也逐渐引起了人们的重视。如Terry等利用微生物和植物的作用，将环境中的硒(Se)转化为生物毒性较低的气态形式(二甲基硒和二甲基二硒)，将其直接或通过植物的组织挥发到大气中。Meagher等将细菌体内的汞(Hg)还原酶基因转入芥子科植物Arabidopsis后，得到的转基因植物能耐受、吸收土壤环境中的Hg，并将Hg2+还原成Hg°使其挥发进入大气。土壤中的砷化合物也可以转变为气态的甲基砷等物质，在多个圈层中迁移和转化。因此，利用某些微生物的对砷的富集、利用和转化等功能，将砷累积到生物体内或使其转化为易挥发态的砷化合物，已成为潜在的砷污染土壤修复技术之一。目前，国内还没有对砷具有生物累积与挥发能力真菌的报道，国外的相关报道也屈指可数，且大多数还局限于实验室研究阶段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种棘孢木霉菌的筛选方法，将棘孢木霉菌应用于治理砷污染土壤以及减少砷在作物和农产品中的累积。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种棘孢木霉菌的筛选方法，包括采集砷污染土壤样品，在实验室内从该土壤样品中分离出真菌，将该真菌纯化后转接于木霉菌属的选择性的培养基上；以该选择性培养基上生长状况最好的真菌菌株为对象，将该真菌在不同砷浓度下培养，并观察菌落的生长状况及其对砷的耐性，由此筛选出棘抱木霉囷。该棘孢木霉菌Trichoderma asperellum已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址标注在后)保存，保存编号为CGMCC No. 3186，保存日期为2009年7月09臼。优选地，该方法具体包括将该土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400 600mg/L的马丁培养基上分离出该真菌；将分离出的真菌经多次纯化后，分别挑取少量菌丝，于不含砷的PGP培养基上用划线法纯化培养3-5天，该过程重复2次；然后接种于木霉菌属的选择性培养基上，于24 26°C下培养5-7天后，以生长状况最好的真菌菌株作为接种目标，取直径zDDY为8 IOmm的圆形真菌菌块或边长为8 IOmm的方形真菌菌块,置于含砷1000mg/kg的PGP培养基上，比较该菌块的生长状况，从中筛选出具有较高抗砷能力的棘孢木霉菌菌株。优选地，马丁培养基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04 · 7H20、琼脂以及水，各成分的重量比为 20 : 10 : 2 : I : 80 : 4000 ；PGP培养基的成分包括马铃薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比为40 4 I 400 ；木霉菌属的选择性培养基成分包括葡萄糖、NH4NO3^ KH2PO4,MgSO4, KCl、ZnSO4, FeSO4, MnSO4,氯霉素、链霉素以及水，各成分的重量比为500 90 20 15 2 I 2 20 5 100000。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种棘孢木霉菌对砷的抗性的鉴定方法，包括在室内培养条件下测定棘孢木霉菌对砷的生物累积与挥发能力，以及在含有不同浓度砷溶液的培养条件下棘孢木霉菌生物量的变化，由此鉴定棘孢木霉菌对砷的抗性。优选地，在室内培养条件下测定棘孢木霉菌对砷的生物累积与挥发能力，具体包括配制总砷含量为50mg/L的PGP培养基，在120 125°C下灭菌14 17分钟后，接入O. Iml棘孢木霉菌生物量为104cfu/ml的菌悬液，培养温度为24 27°C，转速为138 142rmp,培养5天后，以3800 4200rmp进行离心处理8 12分钟,用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基，将菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后对菌质称重，用11 13ml体积比为4 6 I的HN03、HC104混合液在158 162°C条件下将菌质消煮10小时，采用原子荧光测定菌质中的总砷含量；将离心出的培养液及清洗菌质的超纯水混合后作为上清液采用原子荧光测定总砷含量；菌质中的总砷含量作为棘孢木霉菌对砷的生物累积量，棘孢木霉菌对砷的挥发量=配置的总砷含量-该菌质中的总砷含量-上清液中的总砷含量。优选地，参照在总砷含量为50mg/L的PGP培养基中接入棘孢木霉菌的处理，分别以在总砷含量为50mg/L的PGP培养基中不接入棘孢木霉菌处理以及在PGP培养基中接入棘孢木霉菌而不添加砷的处理作为对照，对每项处理均重复多次。优选地，在室内条件下测定在含有不同浓度砷溶液的培养条件下棘孢木霉菌生物量的变化，具体包括配制总砷含量范围为O 200mg/L的PGP培养基，在120 122°C温度下灭菌14 16分钟后，将生长速率相同的8 IOmm棘孢木霉菌菌块分别加入以上处理中，于摇床上温度为23 27°C，转速为138 142rmp振荡培养；培养5天后，培养液以3800 4200rmp离心8 12分钟，并采用稀释梯度法对悬液中的孢子数目进行计数；用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基后，将该菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后称量该菌质重量，即棘孢木霉菌生物量。优选地，将不同砷含量下的相应处理均重复多次。
优选地，该方法还包括观察随着该培养液中总砷含量的增加棘孢木霉菌生物量的变化趋势，并观察棘孢木霉菌生物量达到最高时所述培养液的砷含量，由此确定棘孢木霉菌表现出的对砷抗性的含量范围。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种棘孢木霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及农产品中累积方面的应用。利用本发明筛选出的棘孢木霉菌，可以制成相应的微生物制剂，将制得的微生物制剂应用在污染土壤或环境中后，通过该棘孢木霉菌的富集和挥发作用，能够在一定程度上降低土壤中砷的含量，特别是降低土壤有效砷的含量，从而保证作物正常生长，并使作物和农产品中砷的含量达到无公害农产品要求。
图I为棘孢木霉菌在不同砷浓度水平下的生长曲线图。
具体实施例方式本发明提供的棘孢木霉菌的筛选和培养方法，包括从砷污染的土壤中分离出真菌，经纯化后，于木霉菌属的选择性的培养基上培养，以生长状况佳的菌株为对象，观察该真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出棘孢木霉菌；在室内培养条件下观察分离出的棘孢木霉菌对砷的挥发能力。对筛选出的棘孢木霉菌接种于含有不同浓度砷的液态PGP培养基中，观察棘孢木霉菌生物量的变化，结果表明该木霉菌在0-50mg/L的砷浓度范围内表现出较强的对砷的抗性，且当含砷浓度为50mg/L时显著性地刺激了该木霉菌株的生长；随后进行的棘孢木霉菌对砷的生物累积量与挥发量测定实验表明，当对该棘孢木霉菌培养时间为5天，且在培养基中加入的砷浓度为50mg/L时，该棘孢木霉菌对砷的生物累积量为11. 21 μ g，生物挥发量为111. 99 μ g。实验说明该棘孢木霉菌对砷具有一定的生物累积与挥发能力，能应用于砷污染土壤的生物修复过程中，从而降低土壤中有效态砷含量、减少作物及农产品中砷的累积。以下结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
在以下所有实施例中，砷均以Na3AsO4 · 12H20的形式加入培养基中。实施例I棘孢木霉菌的分离、筛选从砷污染区采集砷污染土壤样品，在实验室内从该土壤样品中分离出真菌，经纯化培养后，接种于木霉菌属的选择性培养基上，以着生状况最好的菌株为目标菌株，将其接种在固态且含有一定浓度砷的PGP培养基(土豆-葡萄糖-蛋白胨培养基)上培养，并观察其在不同砷浓度下的菌落生长状况，同时结合显微镜镜检结果，筛选出健壮、耐砷能力强的棘孢木霉菌。具体包括步骤上述砷污染土壤样品来自湖南石门地区雄黄矿附近的矿渣堆积处，将该土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400 600mg/L的马丁培养基上分离出真菌，该 马丁培养基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4, MgSO4 · 7H20、琼脂及水，其重量比为20 10 2 I 80 4000。将分离出的真菌挑取少量菌丝，于不含砷的PGP培养基上利用划线法纯化培养3-5天，该过程重复2次。然后接种于木霉菌属的选择性培养基上，于24 26°C下培养5_7天后，以着生情况最好的菌株作为接种目标，取直径为8 10_的圆形菌块或边长为8 IOmm的方形菌块置于含砷1000mg/kg的PGP培养基上，比较其生长状况。同时，将该菌株进行显微镜镜检，以菌丝体形态、分生/厚垣孢子萌发等为指标，筛选出具有较高抗砷能力的棘孢木霉菌株。该木霉菌属的选择性培养基成分包括葡萄糖5g、NH4N03lg、KH2P040. 9g, MgSO4O. 2、KC10. 15g、ZnS040 . 02g,FeSO4O. Olg^MnSO4O. 02g、氯霉素 0. 2g、链霉素 0. 05g 以及水 IOOOmL0该棘孢木霉菌Trichoderma asperellum已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保存编号为CGMCC No. 3186，保存日期为2009年7月09日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，电话为010-64807355，电子由II件为 cRmccisun. im. ac. cn。实施例2棘孢木霉菌在不同含砷量溶液中生长量的变化实验配制含砷量分别为0，10，30，50，80，100，200mg/L的PGP培养基，在120 122 °C下灭菌14 16分钟后，将生长速率相同的8 IOmm棘孢木霉菌菌块分别加入以上处理中，于摇床上温度为23 27°C、转速138 142rmp振荡培养；培养5天后，培养液以3800 4200rmp离心8 12分钟，并采用稀释梯度法对悬液中的孢子数量进行计数；之后用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基后，将该菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后称量所述菌质重量，即棘孢木霉菌的生物量。如图I所示为棘孢木霉菌在上述不同砷浓度(即含砷量)水平下的生物量。图I表示，随着砷浓度的增加，该棘孢木霉菌的生物量表现出一定的增加趋势；当砷含量为50ppm时，其生物量达到最大，之后则随砷含量的增加表现出缓慢的下降趋势。这一结果说明，该棘孢木霉菌在O 50ppm的含砷范围内其生物量随含砷量的提高而增加。实施例3棘孢木霉菌对砷的生物累积与挥发功能的测定实验配制总砷含量为50mg/L的PGP培养基，在120 125°C下灭菌14 17分钟后，接入O. Iml棘孢木霉菌含量为104cfu/ml的菌悬液，培养温度为24 27°C，转速为138 142rmp，培养5天后，以3800 4200rmp的转速进行离心处理8 12分钟，用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基，将该菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后对该菌质称重，用11 13ml体积比为4 6 I的HN03、HClO4混合液在158 162°C条件下将该菌质消煮10小时，采用原子荧光测定该菌质中的总砷含量；将离心出的培养液及清洗该菌质的超纯水混合后作为上清液也采用原子荧光测定其内总砷含量。以菌质中的总砷含量作为微生物棘孢木霉菌对砷的生物累积量，棘孢木霉菌对砷的挥发量=配置的总砷含量-菌质中的总砷含量-上清液中总砷含量。本实验以加入50mg/ L砷不加棘孢木霉菌,加棘孢木霉菌不加砷的处理,对照上述加入50mg/L砷且加棘孢木霉菌的处理，各处理均重复3次。该棘孢木霉菌表现出了较强的抗砷性能，当培养时间为5天时，其对砷的生物累积量为11. 21 μ g,生物挥发量为111. 99 μ g,如表I所示。表I棘孢木霉菌对砷的生物累积与生物挥发量(平均值土S. D)
棘孢木霉菌I菌质T重I生物累积量&g)| ,效I生物挥发量__(g)___(累积f/干重)__(Mg)
T. asperellum 0.163±0.009 11.210±0.214 68.802±2.387 111.990±8.915目前，国内还没有关于对砷具有生物累积与挥发能力的真菌的报道，国外有一些这方面的报道，但大多是基于理论上和实验室的研究，现将本发明分离、筛选出的棘孢木霉菌与国外报道的抗砷真菌相比较，如表2所示。表2本发明与国外报道的抗砷真菌的情况比较
报道人报道期刊 ^ 菌株名称私量、生,挥， , -]、
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VisoottivisethScience Asia ^ .vn … 严
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=nce2007等共 3 114 25-321 30
Pollution and
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Cernansky^ BioresourceAspergillus不同砷浓度下棘孢木霉菌孢子产生情况如表3所示。表3.砷浓度对棘孢木霉菌孢子产生的影响
培养基棘抱木霉菌(T. asperellum)
权利要求
1.一种棘孢木霉菌的筛选方法,包括 采集砷污染土壤样品，在实验室内从所述土壤样品中分离出真菌，将所述真菌纯化后转接于木霉菌属的选择性的培养基上；以该选择性培养基上生长状况最好的真菌菌株为对象，将所述真菌在不同砷浓度下培养，并观察菌落的生长状况及其对砷的耐性，由此筛选出所述棘孢木霉菌。
2.按照权利要求I所述的方法，其特征在于，具体包括 将所述土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400 600mg/L的马丁培养基上分离出所述真菌； 将分离出的真菌经多次纯化后，分别挑取少量菌丝，于不含砷的PGP培养基上用划线法纯化培养3-5天，该过程重复2次；然后接种于所述木霉菌属的选择性培养基上，于24 26°C下培养5-7天后，以生长状况最好的真菌菌株作为接种目标，取直径为8 IOmm的圆形真菌菌块或边长为8 IOmm的方形真菌菌块，置于含砷1000mg/kg的PGP培养基上，比较所述菌块的生长状况，从中筛选出具有较高抗砷能力的棘孢木霉菌菌株。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于， 所述马丁培养基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04 ·7Η20、琼脂以及水，各成分的重量比为 20 : 10 : 2 : I : 80 : 4000 ； 所述PGP培养基的成分包括马铃薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比为40 4 I 400 ； 所述木霉菌属的选择性培养基成分包括葡萄糖、NH4NO3^ KH2PO4,MgSO4, KCl、ZnSO4, FeSO4, MnSO4,氯霉素、链霉素以及水，各成分的重量比为500 90 20 15 2 I 2 20 5 100000。
4.一种棘孢木霉菌对砷的抗性的鉴定方法，包括 在室内培养条件下测定棘孢木霉菌对砷的生物累积与挥发能力，以及在含有不同浓度砷溶液的培养条件下棘孢木霉菌生物量的变化，由此鉴定所述棘孢木霉菌对砷的抗性。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室内培养条件下测定棘孢木霉菌对砷的生物累积与挥发能力，具体包括 配制总砷含量为50mg/L的PGP培养基，在120 125 °C下灭菌14 17分钟后，接入O. Iml棘孢木霉菌生物量为104cfu/ml的菌悬液，培养温度为24 27°C，转速为138 142rmp,培养5天后，以3800 4200rmp进行离心处理8 12分钟,用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基，将菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后对菌质称重，用11 13ml体积比为4 6 I的HN03、HC104混合液在158 162°C条件下将菌质消煮10小时，采用原子荧光测定菌质中的总砷含量；将离心出的培养液及清洗菌质的超纯水混合后作为上清液采用所述原子荧光测定总砷含量； 所述菌质中的总砷含量作为棘孢木霉菌对砷的生物累积量，棘孢木霉菌对砷的挥发量=配置的总砷含量-所述菌质中的总砷含量-所述上清液中的总砷含量。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于， 参照在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中接入棘孢木霉菌的处理，分别以在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中不接入棘孢木霉菌处理以及在PGP培养基中接入棘孢木霉菌而不添加砷的处理作为对照，对每项处理均重复多次。
7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，在室内条件下测定在含有不同浓度砷溶液的培养条件下棘孢木霉菌生物量的变化，具体包括 配制总砷含量范围为O 200mg/L的PGP培养基，在120 122°C温度下灭菌14 16分钟后，将生长速率相同的8 IOmm棘孢木霉菌菌块分别加入以上处理中，于摇床上温度为23 27°C，转速为138 142rmp振荡培养；培养5天后，培养液以3800 4200rmp离心8 12分钟，并采用稀释梯度法对悬液中的孢子数目进行计数； 用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基后，将所述菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后称量所述菌质重量，即所述棘孢木霉菌生物量。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，将不同砷含量下的相应处理均重复多次。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括 观察随着所述培养液中总砷含量的增加所述棘孢木霉菌生物量的变化趋势，并观察所述棘孢木霉菌生物量达到最高时所述培养液的砷含量，由此确定所述棘孢木霉菌表现出的对砷抗性的含量范围。
10.一种棘孢木霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及农产品中累积方面的应用。
全文摘要
本发明披露了一种棘孢木霉菌的筛选方法及其应用，其中方法包括采集砷污染土壤样品，在实验室内从该土壤样品中分离出真菌，将该真菌纯化后转接于木霉菌属的选择性的培养基上；以该选择性培养基上生长状况最好的真菌菌株为对象，将该真菌在不同砷浓度下培养，并观察菌落的生长状况及其对砷的耐性，由此筛选出棘孢木霉菌。
文档编号C12N1/14GK102876586SQ20121036186
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者曾西柏, 苏世鸣, 蒋细良, 白玲玉, 李莲芳 申请人:中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所