专利名称：一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测技术及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测技术。
背景技术：
基因芯片也叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)、寡核苷酸阵列(oligonucleotide array),该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量 序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting和NorthernBlotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。但是，通常基因芯片在检测之前，需要对从样品中获取的DNA/mRNA样品必须进行扩增提高阅读灵敏度。在PCR扩增过程中，必须同时进行样品标记，标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。而且，在扩增过程中由于DNA的序列差异，所掺入的荧光标记的dCTP不一致,在同样条件下，G/C含量高的DNA信号明显强于G/C含量低的DNA。在芯片检测之前，PCR产物与芯片上的探针进行杂交，所需时间长，不同分子所需杂交条件不一致，误差大，且由于杂交位于固相表面，所以有一定程度的空间阻碍作用。样品制备上，当前多数公司在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高检测的灵敏度，但仍有不少人在尝试绕过该问题，这包括Mosaic Technologies公司的固相PCR扩增体系以及Lynx Therapeutics公司提出的大量并行固相克隆方法,两种方法各有优缺点,但目前尚未取得实际应用。链置换等温扩增技术是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法，即，具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒定温度下用非热变性的方法解开DNA双链的，在延伸新链的同时将下游旧链剥离的一种新的扩增方式。分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。在长度为15-30 mer寡核苷酸探针的两端分别加上5-8 mer序列互补的茎杆区。在自由状态时由于茎杆区互补序列的结合使探针分子形成发夹状结构，所以又被称为发夹探针。探针的5’端及3’端分别标记荧光素分子及淬灭剂分子。自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与淬灭分子靠近(约为7-10 nm)，此时发生荧光共振能量转移，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和淬灭分子距离增大，荧光分子所产生的荧光不能被淬灭分子所吸收，发射荧光。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测技术 本发明所采用的技术方案是
一种采用分子信标链置换等温扩增基因芯片检测目标DNA/RNA的方法，包括如下步
骤
(O分子信标的设计分子信标包括环状区、5’茎杆区和3’茎杆区；其中，环状区能与目标DNA/RNA特异结合，5’茎杆区的序列比3’茎杆区长出8 25个碱基，标记为5’茎杆区延长段，5’茎杆区连接环状区部分的序列与3’茎杆区序列互补，使得形成发夹结构 ；分子信标3’端修饰有荧光分子；
(2)芯片点样与链置换等温扩增反应将分子信标5’端固定到固相支持物表面，形成分子信标微阵列芯片，然后将淬灭探针及样品DNA/RNA与芯片进行杂交，洗涤，然后将链置换等温扩增反应液、引物加到微阵列芯片上，等温扩增目的基因；
或者是将分子信标与淬灭探针混合，点样固定到固相支持物表面，形成分子信标微阵列芯片，然后将链置换等温扩增反应液、引物及样品DNA/RNA加到微阵列芯片上，等温扩增目的基因；
所述淬灭探针为5’端修饰有荧光淬灭基团的寡核苷酸序列，至少有8个碱基与5’茎杆区延长段互补，优选为12个碱基；所述引物与3’茎杆区互补；
(3)对扩增结果进行荧光数值分析，根据荧光值，确定样品DNA是否为目标DNA及其含量。分子信标的环状区为长度15 30个碱基的序列。5’茎杆区和3’茎杆区的互补序列长5 11个碱基。为了避免分子信标太接近芯片表面而产生空间位阻影响反应，可在分子信标的5’端连接10 30个胸腺嘧啶或腺嘌呤。为实现将分子信标固定在固相支持物上，需对分子信标的5’末端进行化学修饰，其修饰基团应与固相支持物表面修饰的化学基团发生共价化学反应，以便将分子信标DNA稳定牢固地连接在固相支持物表面，如分子信标5’末端修饰氨基，固相支持物表面修饰醛基，贝1J可形成Schiff base,使分子信标稳定牢固地连接在固相支持物表面。分子信标3’ 端标记的荧光分子为 FAM、HEX、TET、FITC、Cy3、Cy5、Cy5. 5、PE、TAMRA、ROX> Texas Red、AMCA> JOE、rhodamine、bodipy、Alexa dye 等有机突光染料或量子点等无机染料中的任一种；淬灭探针上的突光淬灭基团为P-苯二胺(Para-phenylene diamine,PPD)、η-丙基没食子酸盐(propyl gallate，NPG)、1，4-二偶氮双环(2，2，2)-辛烷(I,4-diazobicyelo (2, 2, 2) -octane, DABC0)、TAMRA、BHQ-l、BHQ_2、Eclipse、Iowa Black、纳米金颗粒中的任一种。固相支持物为玻片、塑料片、微球、磁珠中的任一种。优选的，在链置换等温扩增过程中，加入用荧光标记的dCTP，可以提高其检测的灵敏度。一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测试剂盒，包括固定在固相支持物表面的分子信 标、淬灭探针、引物、链置换等温扩增反应液，其中
所述分子信标包括环状区、5’茎杆区和3’茎杆区；其中环状区能与目标DNA/RNA特异结合，5’茎杆区的序列比3’茎杆区长出8 25个核苷酸，标记为5’茎杆区延长段，5’茎杆区靠近环状区部分的序列与3’茎杆区序列互补与3’茎杆区序列互补，使得形成发夹结构；分子信标的5’端修饰有-NH2, 3’端修饰有荧光分子；
所述淬灭探针为5’端修饰有荧光淬灭基团的寡核苷酸序列，至少8个碱基与5’茎杆区延长段互补；
所述引物与3’茎杆区互补。链置换等温扩增反应液的组成为50mM Tris-HCl pH 7. 0 8. 0，I. 5 mM MgSO4,10mM 二硫苏糖醇(DTT)，50 400 μ M 每种 dNTP，20 μ g/ml BSA, 25 100 U/ml DNA 聚合酶。本发明综合链置换等温扩增技术及分子信标技术的优点，使DNA在等温条件下进行扩增，且随着DNA的扩增，分子信标的荧光信号不断被释放，被释放的目标DNA又结合到新的分子信标上，从而进行下一轮的扩增及荧光信号释放。依靠DNA聚合酶的链置换反应达到扩增放大信号的目的，通过分子信标的开环和闭环达到信号检测的目的。由于DNA聚合酶的链置换反应，消除了淬灭基团由于荧光能量共振转移对荧光基团发光的影响。在没有外加和环互补的DNA时，分子信标处于闭合状态，荧光基团与淬灭基团相邻而不发光，而加入该DNA后环被打开，标记的基团之间距离增大，使淬灭基团不能有效淬灭荧光，从而发出检测信号。本发明的有益效果在于
本发明使DNA/RNA扩增与信号检测合为一体，且不需要额外标记、杂交及洗涤过程，既简化了操作步骤，提高效率，又可以将反应在恒温下进行，从而避免了 PCR仪的使用。也可基因边扩增边检测，实现了芯片的实时检测，使结果更加准确可靠。同时，样品中目标DNA与分子信标的杂交发生在分子信标的环上，避免了传统生物芯片由于杂交位于固相表面所产生的空间位阻的影响。因此，本发明分子信标链置换等温扩增实时检测基因芯片的研制，综合了链置换反应及分子信标的优点，克服了传统基因芯片的缺点，实现DNA及RNA生物表达水平的实时高通量的检测，为功能基因组学、蛋白质组学、临床诊断与药物筛选等领域中的DNA及RNA相关研究提供新方法。
图I是本发明分子信标的结构示意图(I :环状区，2 :3’茎杆区，3 :5’茎杆区，4 :5’茎杆区延长段);
图2是分子信标、通用淬灭探针及通用引物之间的关系示意 图3是技术原理及方案流程 图4是丙型肝炎病毒检测基因芯片实时荧光扫描结果(从左到右依次为丙型肝炎病毒RNA样品组、乙型肝炎病毒DNA样品组和HIV病毒RNA样品组)；图5是HIV病毒检测基因芯片实时荧光扫描结果(从左到右依次为HIV病毒RNA样品组I、HIV病毒RNA样品组2、乙型肝炎病毒DNA样品组、丙型肝炎病毒RNA样品组)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例I
本实施例仅以醛基玻片为固相支持物，检测丙型肝炎病毒RNA为例，说明本发明的研制及其应用。(I)探针的设计及合成
试验中所涉及的探针由上海生工生物技术有限公司合成， 针对丙型肝炎病毒RNA的检测，设计了 I条分子信标，序列如下
MB: NH-T2tlU TCA TCA TCA TCA TTCTTGGACACAkCT KkCQCCkTQQCT KQkCCTGTGTCCAAGA -FAM(SEQ ID N0:1)(T2CI为连接分子信标与固相支持物的20个T，下划线为环状区序列，斜体为茎杆区序列，加粗为5’茎杆区延长段)；
通用淬灭探针GTAGTAGTAGTA-TAMRA (SEQ ID N0:2)；
通用引物CTTTCTATCTTTCTATCTTGGAC (SEQ ID NO:3);
其中，分子信标结构见图1，分子信标结构和淬灭探针及引物之间的关系，如图2所示。通用淬灭探针与分子信标的5’茎杆区延长段特异互补，通用引物与分子信标的3’茎杆区特异性互补。(2)芯片的设计及点样
玻片醛基化玻片(购自博奥生物科技有限公司)
(i)将上述氨基修饰的分子信标，用4X SSC溶解，配置浓度为200 nM，并在95°C变性5分钟，之后缓慢降至室温，保持I小时，使分子信标复性，并折叠成正确的结构；
( )取上一步得到的产物和等量体积的DMSO混匀后，采用点样仪，按照预先设计的排列顺序，在上述醛基玻片上开始点样；
(iii)点样后，将芯片置于湿盒内，密封湿盒，于42°C反应过夜。然后用4XSSC清洗，去除没有结合上的分子信标。(3)样品DNA/RNA及淬灭探针与芯片的杂交
将样品DNA/RNA(1 nM)及淬灭探针(200 nM)混合液加入到已固定有分子信标的玻片上，用憎水硅烷处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内，42°C杂交反应I小时；杂交反应后玻片用4X SSC (含O. 1%SDS)溶液洗涤两次，最后用超纯灭菌水清洗2遍，置于离心管中离心，去掉表面液体并室温自然干燥。(4)芯片上的等温链置换反应及芯片的实时检测
将含通用引物(10 nM)的链置换等温扩增反应液(200 μ L)加到步骤(3)中的微阵列芯片上，用憎水硅烷处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，42°C等温扩增lh，并在芯片扫描仪下进行实时扫描，记录突光信号，根据Robust Multiple-array Average (RMA)方法进行数据分析。链置换等温扩增反应液(200 μ L)的组成为5 U polymerase Klenow fragmentexo- (Fermentas),50 μ M each dNTPs,40 mM Tris-HCl ρΗ7. 8,10 mM DTT,10 mM MgCl20
本次实验设三个实验组(丙型肝炎病毒RNA样品组、乙型肝炎病毒DNA样品组和HIV病毒RNA样品组)，各组均设一个空白对照(以去离子水替代分子信标)。实验结果如图4所示仅丙型肝炎病毒RNA样品组具有荧光信号，荧光强度为8. 27855，根据RMA分析，其核酸浓度为I. 0524nM,乙型肝炎病毒DNA样品组和HIV病毒RNA样品组、以及各空白对照组均没有荧光信号，说明本方法的检测结果准确可靠。实施例2
本实施例仅以醛基玻片为固相支持物，检测HIV病毒RNA为例，说明本发明的研制及其应用。(I)探针的设计及合成
试验中所涉及的探针由上海生工生物技术有限公司合成，
针对HIV病毒RNA的检测，设计了 I条分子信标，序列如下
MB: NH-To.-^TCATCATCATCATTCTTGGACACAQkkCCkkQQQQkkCTQkCTGTGTCCAAGA-FAMi SEQID N0:4) (T2tl为连接分子信标与固相支持物的20个T，下划线为环状区序列，斜体为茎杆区序列，加粗为5’茎杆区延长段)；
通用淬灭探针GTAGTAGTAGTA-TAMRA (SEQ ID N0:5)；
通用引物TCATCAATCAATCTTTCTTGGAC (SEQ ID N0:6)；
其中，分子信标结构和淬灭探针及引物之间的关系，如图2所示。通用淬灭探针与分子信标的5’茎杆区延长段特异互补，通用引物与分子信标的3’茎杆区特异性互补。(2)芯片的设计、淬灭探针杂交及点样
玻片醛基化玻片(购自博奥生物科技有限公司)
(i)将上述氨基修饰的分子信标和淬灭探针，用4X SSC混合溶解，配置浓度均为200nM，并在95°C变性5分钟，之后缓慢降至室温，保持I小时，使分子信标复性，并折叠成正确的结构，同时淬灭探针结合到分子信标上；
( )取上一步得到的产物和等量体积的DMSO混匀后，采用点样仪，按照预先设计的排列顺序，在上述醛基玻片上开始点样；
(iii)点样后，将芯片置于湿盒内，密封湿盒，于42°C反应过夜。然后用4XSSC清洗，去除没有结合上的分子信标和探针。(3)样品RNA与芯片的杂交
将样品RNA (I nM)加入到已固定有分子信标的玻片上，用憎水硅烷处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内，42°C杂交反应I小时；杂交反应后玻片用4 X SSC (含O. P/oSDS)溶液洗涤两次，最后用超纯灭菌水清洗2遍，置于离心管中离心，去掉表面液体并室温自然干燥。(4)芯片上的等温链置换反应及芯片的实时检测
将含通用引物(10 nM)的链置换等温扩增反应液(200 μ L)加到步骤(3)中的微阵列芯片上，用憎水硅烷处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，42°C等温扩增lh，并在芯片扫描仪下进行实时扫描，记录突光信号，根据Robust Multiple-array Average (RMA)方法进行数据分析。链置换等温扩增反应液(200 μ L)的组成为5 U polymerase Klenow fragmentexo- (Fermentas),50 μ M dNTPs, 40 mM Tris-HCl pH7. 8,10 mM DTT,10 mM MgCl20本次实验设四个实验组(HIV病毒RNA样品组1、HIV病毒RNA样品组2 (链置换等温扩增反应液中的dCTP以等浓度的FAM-11-dCTP代替))、乙型肝炎病毒DNA样品组、丙型肝炎病毒RNA样品组，各组均设一个空白对照(以去离子水替代分子信标)。实验结果如图5所示乙型肝炎病毒DNA样品组和丙型肝炎病毒RNA样品组、以及各空白对照组均没有荧光信号，仅HIV病毒RNA样品组及HIV病毒RNA样品组2具有荧光信号，HIV病毒RNA样品组荧光强度分别为7. 7218，根据RMA分析，其核酸浓度为O. 9986nM，HIV病毒RNA样品组2荧光强度为10. 63853，HIV病毒RNA样品组2的荧光值高于HIV病毒RNA样品组的荧光值，证明FAM-I Ι-dUTP对dCTP的替换能起到提高荧光信号的作用，说明本方法的检测结果准确可靠。以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本 发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
权利要求
1.一种采用分子信标链置换等温扩增基因芯片检测目标DNA/RNA的方法，包括如下步骤 (1)分子信标的设计分子信标包括环状区、5’茎杆区和3’茎杆区；其中，环状区能与目标DNA/RNA特异结合，5’茎杆区的序列比3’茎杆区长出8 25个碱基，标记为5’茎杆区延长段，5’茎杆区连接环状区部分的序列与3’茎杆区序列互补，使得形成发夹结构；分子信标3’端修饰有荧光分子； (2)芯片点样与链置换等温扩增反应将分子信标5’端固定到固相支持物表面，形成分子信标微阵列芯片，然后将淬灭探针及样品DNA/RNA与芯片进行杂交，洗涤，然后将链置换等温扩增反应液、引物加到微阵列芯片上，等温扩增目的基因； 或者是将分子信标与淬灭探针混合，点样固定到固相支持物表面，形成分子信标微阵列芯片，然后将链置换等温扩增反应液、引物及样品DNA/RNA加到微阵列芯片上，等温扩增目的基因； 所述淬灭探针为5’端修饰有荧光淬灭基团的寡核苷酸序列，至少有8个碱基与5’茎杆区延长段互补；所述引物与3’茎杆区互补； (3)对扩增结果进行荧光数值分析，根据荧光值，确定样品DNA是否为目标DNA及其含量。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，分子信标的环状区为长度15 30个碱基的序列；5’茎杆区和3’茎杆区的互补序列长5 11个碱基。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述分子信标的5’端连接有10 30个胸腺嘧啶或腺嘌呤。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述分子信标的5’末端修饰氨基，固相支持物表面修饰醛基。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，分子信标3’端标记的荧光分子为FAM、HEX、TET、FITC、Cy3、Cy5、Cy5. 5、PE、TAMRA、ROX、Texas RecUAMCA、JOE、rhodamine、bodipy、Alexa dye等有机荧光染料或量子点等无机染料中的任一种；淬灭探针上的荧光淬灭基团为 P-苯二胺(Para-phenylene diamine, PPD)、η-丙基没食子酸盐(propyl gallate,NPG)、1，4- 二偶氮双环(2，2,2)-辛烷(1，4-diazobicyelo (2,2,2)-octane,DABC0)、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、Iowa Black、纳米金颗粒中的任一种。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述固相支持物为玻片、塑料片、微球、磁珠中的任一种。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述链置换等温扩增反应液的组成为50mM Tris-HCl pH 7· 0 8· 0，I. 5 mM MgSO4,10 mM 二硫苏糖醇(DTT)，50 400 μ M 每种dNTP，20 μ g/ml BSA，25 100 U/ml DNA 聚合酶。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，可在链置换等温扩增过程中，所加入的dCTP用荧光标记。
9.一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测试剂盒，包括固定在固相支持物表面的分子信标、淬灭探针、引物、链置换等温扩增反应液，其中 所述分子信标包括环状区、5’茎杆区和3’茎杆区；其中环状区能与目标DNA/RNA特异结合，5’茎杆区的序列比3’茎杆区长出8 25个核苷酸，标记为5’茎杆区延长段，5’茎杆区靠近环状区部分的序列与3’茎杆区序列互补与3’茎杆区序列互补，使得形成发夹结构；分子信标的3’端修饰有荧光分子； 所述淬灭探针为5’端修饰有荧光淬灭基团的寡核苷酸序列，至少8个碱基与5’茎杆区延长段互补； 所述引物与3’茎杆区互补。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述链置换等温扩增反应液的组成为50mM Tris-HCl pH 7· 0 8· 0，1. 5 mM MgSO4,10 mM 二硫苏糖醇(DTT)，50 400 μ M 每种 dNTP，20 μ g/ml BSA，25 100 U/ml DNA 聚合酶。
全文摘要
本发明公开了一种分子信标链置换等温扩增基因芯片检测技术及试剂盒。本发明综合链置换等温扩增技术及分子信标技术的优点，使DNA在等温条件下进行扩增，且随着DNA的扩增，分子信标的荧光信号不断被释放，被释放的目标DNA又结合到新的分子信标上，从而进行下一轮的扩增及荧光信号释放。依靠DNA聚合酶的链置换反应达到扩增放大信号的目的，通过分子信标的开环和闭环达到信号检测的目的。本发明使DNA/RNA扩增与信号检测合为一体，且不需要额外标记、杂交及洗涤过程，既简化了操作步骤，提高效率，且实现了芯片的实时检测，使结果更加准确可靠。
文档编号C12Q1/68GK102888457SQ20121036182
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者龚桂香 申请人:江阴天瑞生物科技有限公司