一种抗炭疽pa抗原的单克隆抗体及其应用的制作方法

专利名称：一种抗炭疽pa抗原的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗炭疽单抗的基因和基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备炭疽治疗药物中的应用。
背景技术：
炭疽是由炭疽芽胞杆菌(Bacillus Anthrax)引起的人畜共患重大烈性传染病。在世界范围内具有广泛的分布。根据感染途径不同，人类炭疽分为皮肤炭疽、胃肠炭疽和吸入性炭疽三种原发类型。在我国，肺炭疽因为病死率高而作为I类传染病进行管理。炭疽芽孢杆菌包含两个主要的毒力因子以Y键相联结的聚-D-谷氨酰荚膜(PGA)和由三种蛋白组分构成的炭疽毒素。其中荚膜能阻止细菌被宿主免疫细胞吞噬，而毒素是造成宿主损伤和死亡的主要原因。炭疽毒素由细菌质粒POXl编码，包括三种蛋白质成分保护性抗原(Protective antigen,PA)、致死因子(Lethal factor,LF)和水肿因子(Edema factor,EF)。其中PA能诱导机体的保护性免疫，是目前唯一获美国食品药品监督管理局批准的人用炭疽吸附疫苗(anthrax vaccine absorbed,AVA)的主要免疫活性成分。LF具有金属依赖的蛋白酶活性，能够分解MAPKK (mitogen-activated protein kinase kinase,有丝分裂原激活蛋白激酶激酶)并使巨噬细胞溶解；EF具有钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶活性，可使靶细胞内环磷酸腺苷浓度升。致宿主细胞内信号通路损伤，防御能力下降，打破体液平衡导致水肿。实验证实，炭疽毒素是一种AB (active-binding)的模式。PA是复合物中的“B”，与
细胞膜上的炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor, ATR)-肿瘤肉皮细胞标志8 (TEM8)
或2型毛细血管形成蛋白(CMG2)结合，由位于细胞膜上的Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20，余下的63kD片段(PA63)发生寡聚化，在膜上形成七聚体((PA63)7)。LF和EF是“A”，能够结合七聚体形成的复合物通过受体介导的内吞进入细胞。在内吞小体酸性pH的环境下，PA七聚体发生构象改变，形成一个管道，使EF和LF进入胞液，分别发挥毒性作用。这三个蛋白本身都是无毒的,但PA和LF的混合物称为致死毒素(Lethal toxin,LT),可以导致实验动物的致死性休克。PA和EF的混合物称为水肿毒素(Edema toxin, ET)，在注射处可引起水肿。炭疽的医学防护措施主要有预防和治疗二大方面。目前有效的预防措施主要是接种炭疽疫苗，接触前I 2个月进行预防性接种，能为人员提供免疫防护。有效的治疗措施主要有二大类一类是炭疽杆菌的抑菌剂和杀菌剂，其中包括抗菌素和噬菌体的溶菌成分；另一类是依据炭疽病理模型设计的毒素抑制剂，主要包括炭疽毒素中和抗体、可溶性受体、毒素突变体和小分子拮抗剂。目前炭疽的治疗主要依靠抗菌素，多种抗菌素对炭疽有效，但如出现以下情况，临床上往往不能奏效。I、未能及时服用抗菌素抗菌素一般需要在机体接触炭疽芽孢后的48小时内使用，即繁殖体阶段使用，可以有效治疗。但炭疽感染的潜伏期可以持续数小时甚至几天，这一阶段的症状表现类似流感，易误诊，错过最佳治疗时机；
2、人体产生耐药性抗菌素滥用是目前严重的世界公共卫生问题，一些个体对许多抗菌素已产生抗药性，使得抗菌素治疗无效；3、炭疽杆菌人为改构将抗菌素抗性基因导入炭疽杆菌，使外用抗菌素失效，这在现今基因操作技术上已完全可能。抗菌素对 吸入性炭疽的治疗虽然有效，但必须在感染初期立即使用，抗菌素只能杀死人体组织内的部分炭疽热孢子和细菌，却不能抵抗孢子和细菌在体内产生的大量毒素，而在感染晚期由于毒素的大量产生，仍会导致患者死亡。目前国外的研究主要集中在发现能抵抗炭疽毒素的药物方面，包括中和单抗、可溶性受体、PA突变体和小分子抑制剂等。中和单抗因为具有保护性高，半衰期长，性质稳定等优点，成为目前最有前景的炭疽毒素抑制剂。不管是抗菌素还是中和单抗，单独用药均存在不足，设想在特殊情况下，联合应用抗菌素和中和性单抗可以相互弥补，最大可能的发挥治疗作用。目前单抗和抗菌素联合用药处于临床研究阶段。Pharmathene公司2009年开展的环丙沙星和Valortim(单抗)以及Doxycycline和Valortim(单抗)联合用药的I期临床试验。国内外的研究发现，抗LF/EF抗体能阻断LT/ET发挥活性，保护动物抵抗炭疽毒素或者炭疽芽孢的攻击。但是无论是被动免疫还是治疗，效果均不及抗PA抗体。而抗PA中和性抗体的作用要比针对炭疽毒素其他组分的中和性抗体更加重要。①在感染初期，因荚膜表面有PA的存在，抗PA抗体能与芽孢结合，增强巨噬细胞的吞噬作用，抑制出芽或通过氧化杀死正在出芽的芽孢，因此，抗PA抗体具有抗芽孢的活性。②芽孢被巨噬细胞吞噬后，导致巨噬细胞裂解，释放繁殖体，并伴有一定量的PA，LF及EF的分泌表达，蛋白酶水解PA，装配成七聚体，结合LF和EF后内吞入细胞发挥毒素作用。抗PA抗体可以通过抑制PA装配或与细胞结合来发挥作用。国内外的研究表明，在暴露于炭疽芽孢之前使用抗PA抗体，能够起到预防炭疽感染保护机体的作用。而且，在攻毒后一定时间内给药(24 48h)仍能够起到保护作用，即使是在出现体征(如休克)后给药也可以起到一定的治疗作用。已经有多家公司或研究机构进行抗炭疽抗体的研究，其中有4家宣布完成I期临床研究(3家重组，I家为血液提取制品)，2家公司正在进行I期临床(I家重组，I家血液提取的)，(www. clinicaltrial. gov),多家公司正在进行临床前研究。中国专利200480017547. 7公开了一种抗炭疽PA抗原的单克隆抗体(5E8)，但是该单抗在动物实验中，未能表现出良好的保护效果，因此距离药物开发还具有较大的距离。中国专利200610165844. 7也公开了一种抗炭疽PA抗原的单克隆抗体(5E1)，但是发明人研究发现，在细胞水平上，5E1与PA的结合力偏弱，不能用于以后的药物代谢动力学研究。因此本发明的目的就是提供具有更高的亲合力和良好保护效果，人源化程度更高的抗炭疽PA毒素的单克隆抗体。

发明内容
本发明通过单克隆抗体技术筛选到了对炭疽PA抗原具有高度亲合力的单克隆抗体，并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸和核苷酸序列，并对所述抗体的重链和轻链恒定区以及可变区FR1-4区进行了人源化改造，最终获得了具有特异的抗原结合性、优异的毒素中和活性以及良好的动物保护功能。
本发明首先公开了一种抗炭疽PA抗原的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID N02第45_54、69_87、120-129位氨基酸序列所示，在本发明中，同时以SEQ ID N012、14和16分别表示重链可变区的⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列；轻链可变区的⑶R1XDR2和⑶R3区的氨基酸序列如SEQ ID N018第46-55、71-77、110-118位氨基酸序列所示，在本发明中，同时以SEQ ID N028、30、32分别表示轻链可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3区的氨基酸序列。在本发明的一个优选技术方案中，所述单克隆抗体重链可变区的FR1-FR4区氨基酸序列分别如SEQ ID N04、6、8、10所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID N034所示；轻链可变区的FR1-FR4区氨基酸序列分别如SEQ ID N020、22、24、26所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID N036所示。该抗体的重链可变区及轻链可变区的FR1-FR4区以及重链恒定区和轻链恒定区均是经过人源化改造的序列，而CDR区未进行人源化改造，故称之为人源化抗体。所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO 2第1_140位氨基酸序列所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO 34所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO18第1-128位氨基酸序列所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO 36所示。该抗体的重链恒定区和轻链恒定区是经过人源化改造的序列，而重链可变区及轻链可变区未进行人源化改造，故称之为嵌合抗体。在本发明的又一个优选技术方案中，所述单克隆抗体重链全长氨基酸序列如SEQID NO 2所示，轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO 18所示。该抗体的重链可变区和恒定区，轻链可变区和恒定区未进行人源化改造，故称之为鼠源抗体。本发明还提供了编码上述单克隆抗体重链和轻链的核酸，在一个优选的技术方案中，所述人源化抗体的重链的可变区的⑶R1XDR2和⑶R3区的碱基编码序列分别如SEQ IDNO I第133-162、184-255、358-387位核苷酸所示，在本发明中，同时以SEQ ID N011、13和15分别表示重链可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3区的碱基编码序列；FR1_FR4区碱基序列分别如SEQ ID N03、5、7、9所示，重链恒定区的碱基编码序列如SEQ ID N033所示；所述人源化抗体轻链的可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的碱基编码序列如SEQ ID N03第136-165、211-231、328-354所示，在本发明中，同时以SEQ ID N027、29和31分别表示轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的碱基编码序列；FR1_FR4区碱基序列分别如SEQ ID N019、21、23、25所示，轻链恒定区的碱基编码序列如SEQ ID N035所示。在另一个优选技术方案中，所述嵌合抗体的重链可变区的碱基编码序列如SEQ IDNOl第1-420位核苷酸所示，重链恒定区的碱基编码序列如SEQ ID N033所示；所述轻链可变区的碱基编码序列如SEQ ID N03第1-384位核苷酸所示，轻链恒定区的碱基编码序列如SEQ ID N035 所示。在又一个优选技术方案中，所述鼠源抗体重链的碱基编码序列如SEQ ID NOl所示，所述轻链的碱基编码序列如SEQ ID NO 17所示。本发明还提供了含有上述编码单克隆抗体重链或轻链的核苷酸编码的表达载体。在一个优选的技术方案中，所述载体为pMH3S分泌型真核表达载体。本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。在一个优选的技术方案中，所述细胞为CHO-S细胞。
本发明还提供了上述任一单克隆抗体在制备炭疽治疗药物中的应用。所述单克隆抗体可以作为药物分子特异性识别和结合炭疽PA抗原，从而抑制PA装配或与细胞结合来发挥作用，预防炭疽感染或者治疗炭疽感染性疾病。本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物含有上述任一单克隆抗体，以及可药用的载体。本发明还提供了一种含有上述任一单克隆抗体的免疫交联物，其特征在于，所述单克隆抗体与效应分子连接。所述单克隆抗体在免疫交联物中起靶向作用，可以将具有特殊生化效应的效应分子递送至炭疽病原体上，发挥治疗效应，细胞毒素、或者放射性同位素均可以作为效应分子与上述单克隆抗体形成免疫交联物。本发明提供的单克隆抗体由于在重链和轻链可变区具有独特的CDR1-3区序列，使所述抗体对炭疽杆菌具有特异的识别和结合能力。在ELISA检测PA与单抗的结合活性 的实验中，本发明的人源化单抗灵敏度为8ng/ml，可以用于药物代谢研究。而鼠源单抗的灵敏度为4-8ng/ml。显示本发明提供的抗炭疽PA抗原的单克隆抗体具有高度特异的PA结合活性。本发明提供的单克隆抗体也显示出了优异的毒素中和活性。人源化抗体的EC5tl为O. 063ug/ml，嵌合抗体的EC5tl为O. 070ug/ml，而中国专利200610165844. 7公开的抗炭疽PA抗原的单克隆抗体5E1的EC5tl为O. 167ug/ml (EC50值越低保护效果越好)。实验结果证明本发明的单抗较以前的5E1单抗在细胞水平显示更好的保护效果。本发明提供的单克隆抗体还显示了在制备炭疽治疗药物中的用途。在大鼠毒素模型上(PA+LF)抗体的保护效果评价实验中，本发明所提供的嵌合单抗存活达到83% (5/6)，人源化单抗的存活达到80% (4/5)，而中国专利200480017547. 7所公开的人源单抗组大鼠全部死亡。该实验显示了本发明提供的单克隆抗体具有良好的动物保护功能，可以应用于制备炭疽治疗药物。


图I人源化抗体重链可变区(Vh)和轻链可变区基因克隆的电泳鉴定图；图2人IgGl重链恒定区基因(Ch)和人Kappa轻链恒定区基因(Ck)克隆的电泳鉴定图；图3人源化抗体重链基因(H)和轻链基因(L)克隆的电泳鉴定图；图4pMD_H和pMD_L的酶切鉴定结果图；图5pMH3S的构建流程图；图6pMH3S_H酶切鉴定结果图；图7pMH3S_L酶切鉴定结果图；图8pMH3S_H的构建流程图；图9pMH3S_L的构建流程图；图10纯化的人源化抗体的SDS-PAGE检测结果图；图11单克隆抗体对PA抗原敏感性的ELISA检测图；图12体外细胞毒素模型上三种类型抗体的EC5tl曲线图；图13大鼠毒素模型上三种类型抗体的动物存活曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求所限定的范围构成进一步的限定。实施例I.鼠源单抗基因的克隆I. I鼠源单抗的制备以重组炭疽保护性抗原为免疫原，采用常规单克隆抗体制备方法获得的I株高亲和力、高特异性的鼠源性抗PA单抗5E11杂交瘤细胞株，分泌的抗体分子亚型为IgGl，轻链为Kappa亚型。I · 2单抗5E11轻重链基因的克隆单抗由可变区和恒定区构成，因为鼠单抗的可变区基因变异大，而恒定区的基因序列非常保守，因此采用5' -RACE方法进行克隆，其基本原理是在未知序列的5'端添加引物序列，与3'端的保守序列进行PCR扩增。获得的鼠源单抗基因可用于构建表达载体，然后转染哺乳动物细胞，获得稳定表达的细胞株，最终获得表达产物，以便与哺乳动物细胞表达的嵌合抗体和人源化抗体进行功能比较研究。操作步骤如下包括A :总RNA的提取；B RNA的去磷酸化；C :去帽子反应；D 5' -RACE适配子连接；E :反转录反应；F :外引物PCR反应；G :内引物反应；H :琼脂糖凝胶电泳:切胶回收特异性PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定J =BLAST检索分析序列的正确。具体参考说明书(TaKaRa，D315)。简单描述如下A总RNA的提取取处于对数生长期的5E11杂交瘤细胞(5 X IO6)，采用Trizol —步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及I %琼脂糖凝胶电泳检测。B RNA 的去磷酸化使用 CIAP (TaKaRa，D315)，反应体系 50ul，包括总 RNA2ul (lug/ul)，NRAse 抑制剂 Iul (40U/UL)，10 X 缓冲液 5ul，CIAPO. 6ul, (16U/ul)，50°C反应 I 小时。C去帽子反应CIAP处理过的RNA7ul，NRAse抑制剂Iul (40U/ul)，IOX缓冲液lul, TAPlul, (O. 5U/ul)，37°C反应 I 小时。05; -RACE适配子连接连接体系40ul，依次加入CIAP/TAP处理过的RNA5ul，51 RACE适配子(15uM) lul, NRAse的水4ul ;65°C反应5分钟后，冰上放置2分钟，然后依次加入 NRAse 抑制剂 lul(40U/UL)，5X 连接缓冲液 8ul，40% 的 PEG600020ul，T4RNA 连接酶lul，16°C反应I小时。E反转录反应反应体系包括连接后的RNA为6ul，随机引物O. 5ul，55X缓冲液2ul, dNTPlul, NRAse 抑制剂 O. 25ul (40U/UL)，MMLVO. 25ul (200U/ul)。混匀，3(TC IOmin,50°C 60min,5°C 5min。反应产物置于_20°C备用。F外引物PCR反应反应体系为Ex Taq聚合酶(5U/μ L) O. 25 μ L ; 10 XEx TaqBuffer5 μ L ；dNTP Mixture (各 2. 5mM)4 μ L ;模板 cDNA2. 5 μ L ；5/ RACE 外引物 2ul，特异性外引物2ul，加灭菌蒸馏水至50 μ L，混匀，瞬时离心后，置PCR仪上反应。反应条件94°C预变性3分钟，接着940C 30s, 520C 30s, 72°C lmin，35个循环，最后72°C延伸7min。G内引物反应除模板为外引物反应液，引物使用内引物外，其余反应液体同外引物PCR反应。
H琼脂糖凝胶电泳扩增产物H和L经琼脂糖凝胶(1% )电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒(BIO BASIC INC)回收纯化后，凝胶电泳鉴定。I切胶回收特异性PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定将回收后的PCR产物连入pMD18-T载体。连接反应体系为pMD18-T载体lul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水Iul，连接缓冲液5ul，混匀后16°C过夜，转化大肠杆菌DH5 α，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-mouse-H和pMD-mouse-L。测序后，对获得的基因序列用Vector NTI软件进行分析，鼠源单抗重链全长为1392个碱基，其中1-420位碱基编码可变区，421-1392位碱基编码恒定区。可变区包括4个框架区(Fragment region, FR)和 3 个 CDR(Complementary determinant region, CDR),其中1-57位碱基编码信号肽，58-129位碱基编码FRl，133-162碱基编码CDRl ; 163-183碱 基编码FR2，205-261碱基编码CDR2 ;256_357碱基编码FR3，358-387碱基编碱基码CDR3 ；388-420碱基编码FR4。鼠源单抗轻链全长为708个碱基，包括1-384位碱基编码可变区和385-708位碱基编码的恒定区。对可变区进行注释，1-66位碱基编码信号肽，67-135位碱基编码FR1，136-165碱基编码CDRl ; 166-210位碱基编码FR2，211-231位碱基编码CDR2 ;232_327碱基编码FR3 ; 328-354碱基编码CDR3 ; 355-384碱基编码FR4。实施例2.嵌合抗体基因的克隆鼠源抗体相对于人体，属于异源蛋白应用于人体具有明显的抗宿主抗体反应，因此常采用人源化改造的策略降低免疫原性，简单方便的方法是进行恒定区的人源化，用人的恒定区替换鼠的恒定区，即构建嵌合抗体。2. I人恒定区的密码子优化及全基因合成采用优化的密码子可以提高蛋白的表达，首先采用软件对人IgGl重链恒定区(GenBank登录号Z17370)和人Kappa轻链恒定区基因(GenBank登录号GI :341915149)按照鼠密码子偏好进行优化，优化后的两条基因序列(基因序列分别为SEQ ID N033和SEQID N035，委托博迈德进行全基因合成，并克隆到T载体上(分别命名为T-0PTI_hu-IgGl-CH和T-0PTI_hu-CKAPPA)进行序列测定。2. 2嵌合抗体基因全分子的克隆根据扩增获得基因序列和密码子优化后恒定区基因序列，设计引物，5Ell-VH_up 5' -GAATTCTGAGGTGAGGCTGGTGGAATCTGG-3' ; 5E11-Vh-lower 5-/ TTGGTGCTGGCGGCCAGGCTTGAGGAGACTGTGAGAGTGG-3' ；0p-IgGl-up 5-/ AGCCTGGCCGCCAGCACCAA-3' ；0p-IgGl-down 5-/ GCGGCCGCTTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG-3'。其中，5E1 I-Vh-UP 和 5E1 l-VH_lower 用于扩增可变区，Op-IgGl-up和Ορ-IgGl-down用于扩增人IgGl重链恒定区。5Ell_VH_up和Op-IgGl-down用于扩增嵌合抗体全长重链。轻链引物5EI l-VL-up 5/ -GAATTCTGAAATCGTTCTCACCCAGTCTCC-3' ；5E11-Vl-lower 5-' GATGAACACGCTGGGGGCGGCCACGGTTTTTATTTCCAACTTTGTCCCC-3' ；0p-kappa-up 5-1 ACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC-3' ；0p-kappa-down 5-/ GCGGCCGCTTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTCTTG-3'。其中，5E11_VL-up 和 5E11_VL-lower 用于扩增轻链可变区，Op-kappa-up和Op-kappa-down用于扩增人Kappa亚型轻链恒定区。5E11-Vl-Up和Op-kappa-down用于扩增轻链全长。GAATTC为Eco RI的酶切位点，GCGGCCGC为Not I的酶切位点。PCR 反应体系50μ I 反应体系中含有10Xbuffer5ul ；dNTP(O. 2mM)4ul ；Pyrobest Taq 酶 0. 25ul ;上下游引物各 O. 5ul (重链恒定区 Op-IgGl-up 和 Op-IgGl-down,轻链恒定区用Op-kappa-up和Op-kappa-down);轻重链可变区基因的扩增使用模板为pMD-mouse-H和pMD-mouse-L,恒定区的扩增使用模板为T-OPTI-hu-1gGI-Ch和T-0PTI-hu-CKappa，各取O. Iul质粒作为模板；用纯水补足到50 μ I。PCR反应参数预变性940C 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin20s ;25 循环。最后 72°C 5min。PCR产物回收纯化PCR反应产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，切胶并用BBI公司的回收试剂盒回收。
嵌合抗体L、H链基因的扩增将5E11Vh和人IgGl亚类Ch基因的PCR扩增产物50ul进行纯化，回收后备用。取纯化后产物各Iul为模板，以扩增嵌合抗体重链基因；将5E11Vl和人KAPPA型基因的PCR扩增产物50ul进行纯化，回收后备用进行嵌合抗体L链基因的扩增。PCR反应参数94°C预变性3min，接着扩增25个循环，每个循环包括94°C变性25s，50。。复性 25s，72。。延伸 60s，最后 72°C延伸 5min。嵌合抗体L、H链基因PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定将回收后的PCR产物连入PMD18-T载体。连接反应体系为pMD18-T载体lul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水Iul，连接缓冲液5ul，混匀后16°C过夜，转化大肠杆菌DH5 α，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-chimeric-H和pMD-chimeric-L。实施例3.人源化单抗基因的克隆3. I人源化单抗基因设计嵌合抗体即用人的恒定区基因替换掉鼠的恒定区基因，相比鼠源抗体人源化程度达到75%。进一步人源化的方法是对可变区进行人源化。基本的策略是保持互补决定区(CDR)氨基酸系列不变，将框架区氨基酸序列依次检索人源的抗体库，获得最大同源性的序列，将相应的位点进行突变。重链可变区的FRl，FR2 和 FR4 分别与 gb AAS85990. 1，gb ADW08153. I, emb CAK50646. I具有100%的同源性，不改变氨基酸序列。FR3与emb CAR62720. I具有88%的同源性，在4个氨基酸位置存在差异，进行定点突变。共改变4个氨基酸。轻链可变区的FRl与emb CAA80562. I具有74%的同源性，突变6个氨基酸。FR2与gb :ABB54406. I具有80%的同源性，有3个氨基酸的差异，改变其中的2个氨基酸，与⑶R相邻的I个氨基酸未进行改变。FR3与gb AAQ21830. I具有84%的同源性，对差异的3个氨基酸进行突变。共进行11个氨基酸突变。3. 2抗PA单抗人源化可变区基因的化学合成设计好的可变区人源化序列委托博迈德生物技术公司人工合成全基因，并克隆到T载体上，分别命名为pMD-humanized_VH和pMD-humaniZed-Vlj,测序正确后进行后续的研究。3. 3人源化全分子基因的克隆根据人源化后的轻重链可变区基因序列和密码子优化后人恒定区基因序列，设计引物，因为突变的氨基酸位于内部所以使用的引物同嵌合抗体的构建。重链引物5EIl-VH-up 5/ -GAATTCTGAGGTGAGGCTGGTGGAATCTGG-3'；5Ell-VH-lower 5-/ TTGGTGCTGGCGGCCAGGCTTGAGGAGACTGTGAGAGTGG-3'；Op-IgGl-up 5-/ AGCCTGGCCGCCAGCACCAA-3'；Op-IgGl-down 5-/ GCGGCCGCTTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG-3'。其中，5EII-Vh-UP和5EIl-VH_lower 用于扩增可变区，Op-IgGl-up 和 Op-IgGl-down用于扩增人IgGl重链恒定区,5EIl-VH-up和Op-IgGl-down用于扩增嵌合抗体全长重链。
轻链引物5EIl-VL-up 5/ -GAATTCTGAAATCGTTCTCACCCAGTCTCC-3;；5Ell-VL-lower 5- ' GATGAACACGCTGGGGGCGGCCACGGTTTTTATTTCCAACTTTGTCCCC-3/ ；Op-kappa-up :5-' ACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC-3'；Op-kappa-down 5-/ GCGGCCGCTTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTCTTG-3'。其φ, 5EIl-VL-up 和 5Ε1 l-VL-lower 用于扩增轻链可变区，Op-kappa-up 和Op-kappa-down用于扩增人Kappa亚型轻链恒定区，5Ell-VL-up和Op-kappa-down用于扩增轻链全长。GAATTC为ECo RI的酶切位点，GCGGCCGC为Not I的酶切位点。50 μ I PCR 反应体系含有10Xbuffer5ul ;dNTP(0. 2mM)4ul ;PyrobestTaq 酶0. 25ul ;上下游引物各0. 5ul (重链恒定区Op-IgGl-up和Op-IgGl-down,轻链恒定区用Op-kappa-up和Op-kappa-down);轻重链可变区基因的扩增使用模板为pMD-mouse-H和 pMD-mouse-L，恒定区的扩增使用模板为 T-OPTI_hu_IgGI-Ch 和 T-0PTI_hu-CKAPPA，各取
O.Iul质粒作为模板；用纯水补足到50 μ I。PCR反应参数预变性94°C 5min ；94°C 30s，58°C 30s, 72°C lmin20s ；25 循环。最后 72°C 5min。PCR产物回收纯化PCR反应产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，切胶并用BBI公司的回收试剂盒回收。电泳结果见(见附图1，图2)。图I中M泳道为分子量标记，I泳道和2泳道分别为人源化的Vh和人源化的Vk片段。图2中，M泳道为分子量标记，I泳道和2泳道分别SCi^PCk片段。人源化抗体L、H链基因的扩增将5E11Vh和人IgGl亚类Ch基因的PCR扩增产物50ul进行纯化，回收后备用。取纯化后产物各Iul为模板，以扩增人源化抗体重链基因；将5E11Vl和人KAPPA型基因的PCR扩增产物50ul进行纯化，回收后备用进行人源化抗体L链基因的扩增。PCR反应参数94°C预变性3min，接着扩增25个循环，每个循环包括94°C变性25s，50°C复性25s，72°C延伸60s，最后72°C延伸5min。PCR电泳结果(见附图3)。图3中，M泳道为分子量标记，I泳道和2泳道分别为人源化的L和人源化的H片段。人源化抗体L、H链基因PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定将回收后的PCR产物连入pMD18-T载体。连接反应体系为pMD18-T载体lul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水lul，连接缓冲液5ul，混匀后16°C过夜，转化大肠杆菌DH5 α ,筛选重组克隆,然后采用通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-humanized-H和pMD-humanized-L。酶切鉴定结果见图4，M泳道为分子量标记，I泳道和2泳道分别为pMD-humanized-H单酶切(Not I)和双酶切(EcoRI/Not I) ;3泳道和4泳道分别为pMD-humanized-L 单酶切(Not I)和双酶切(Eco RI/Not I)。实施例4.鼠单抗，人-鼠嵌合抗体和人源化抗体基因表达质粒的构建4. I构建策略不管是轻链还是重链，在5'端设计引物时引入Eco R I的酶切位点，在3'端引ANot I酶切位点，克隆到pMD-T载体上，经过DNA序列测定正确后，用Eco R I/Not I酶切 pMD-mouse-H(pMD-Chimeric-H 或 pMD-humanized-H)得到约 I. 4kb 的片段，亚克隆到PMH3S的相应位点，得到鼠源抗体的重链表达质粒pMH3S-mouSe-H(嵌合抗体重链表达质粒pMH3S-Chimeric-H或人源化抗体的重链表达质粒pMH3S-humanized_H)；同样的方法,用EcoRI/Notl 酶切 pMD-mouse-L (pMD-Chimeric-L 或 pMD-humanized-L)得到约 O. 7 片段，亚克隆到pMH3S的相应位点，得到鼠源抗体轻链的表达质粒pMH3S-mouse-L (嵌合抗体轻链的表达质粒pMH3S-Chimeric-L或人源化抗体轻链的表达质粒pMH3S-humanized_L)。4. 2pMH3S分泌型真核表达载体的构建以常用的真核表达载体pcDNA3. 1(+) (Invitrogen公司，产品目录号V790-20)为基本骨架，将Kozak序列(GCCGCCACCATGA/G)和修改后的人组织纤溶酶原信号肽序列融合基因(见SEQ ID N03)克隆到表达载体的多克隆位点区，构建成pMH3S分泌型真核表达载体。修改后的基因中，通过将融合基因核苷酸序列5'端第70-78位的TCGAACAGC(编码氨基酸S-N-S)，突变成TCGAATTCT (编码氨基酸S-N-S)，在保证氨基酸序列不改变的前提下引AEco RI的酶切位点(GAATTC)方便目的基因直接通过Eco RI位点连接到pMH3S载体上，信号肽与目的基因之间没有多余的氨基酸，目的蛋白可以分泌到上清中，方便下游的纯化。构建过程I)首先人工合成Kozak序列(CCACCATG (A/G))和修改后的人组织纤溶酶原信号肽序列的融合基因；2)将 PCDNA3. I (+)用 EcoRI 酶切后，用 Klenow 酶(TaKaRa，产品目录号D2140)补平，然后用小肠碱性磷酸酶CIP (NEB公司，产品目录号M0290V)去磷酸化避免自连；3)将合成的基因和酶切后的载体用T4DNA连接酶(NEB公司，产品目录号M0202V)进行连接；4)转化大肠杆菌DH5a感受态，挑选具有氨苄青霉素抗性的克隆；5)用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，并进行DNA序列测定，测序鉴定后获得预期的pMH3S载体(pMH3S的构建流程见图5。)4. 3重链表达质粒的构建用EcoRI 和 NotI(NEB 公司)双酶切 pMD-mouse-H(pMD-chimereic_H 或pMD-humanized-H),用胶回收试剂盒(中国,BBI公司)回收H片段(长度约I. 4kb)连接到用EcoRI和Not I双酶切的pMH3S上，转化大肠杆菌DH5 α感受态，在100 μ g/ml的氨苄青霉素LB平板上培养，挑选抗性克隆进行PCR检测(PCR条件同实施例I中的步骤(3))，PCR产物电泳检测阳性后，随机挑选阳性克隆接种到LB培养基中培养过夜，次日用质粒提取试剂盒(中国，OMEGA公司)提取质粒，对提取的质粒进行双酶切(EcoRI/Not I)鉴定，鉴定结果见图6。图6中，M泳道为分子量标记，I泳道为质粒PMH3S-H用Not I进行单酶切线性化后的结果，2泳道为EcoRI/Notl双酶切后的结果。表达载体构建流程见图8。
4. 4pMH3S-L 质粒的构建用EcoRI 和 Not I(NEB 公司)酶切 pMD-mouse-L(pMD-chimereic-L 或pMD-humanized-L),用胶回收试剂盒(中国,BBI公司)回收L片段(长度约O. 7kb)连接到用EcoRI和Not I双酶切的pMH3S上，转化大肠杆菌DH5 α感受态，在100 μ g/ml的氨苄青霉素LB平板上培养，挑选抗性克隆进行PCR检测(PCR条件同实施例I中的步骤(3))，PCR产物电泳检测阳性后，随机挑选阳性克隆接种到LB培养基中培养过夜，次日用质粒提取试剂盒(中国，OMEGA公司)提取质粒，对提取的质粒进行双酶切(Eco RI/Not I)鉴定，鉴定结果见图7。图7中，M泳道为分子量标记，I泳道为质粒pMH3S-L用NotI进行单酶切后线性化后的结果，2泳道为EcoRI/Not I双酶切后的结果。表达载体构建流程见图9。实施例5.电转及细胞克隆的筛选从液氮中取CHO-S细胞复苏，在T25方瓶中培养，培养基为DMEM/F12+10% FBS,置于37 °C、5% CO2细胞培养箱(Forma)中培养，长满后传入T75方瓶中。在T75方瓶 中长满后，加入3ml胰酶消化30s，吸弃胰酶，用PBS洗细胞两次离心后，取I. 5 X IO7细胞用0.5ml PBS (pH7. 2)重悬，取10 μ I鲑精，线性化的表达质粒IOyg(轻链质粒pMH3S-humanized-L3. 3 μ g 和的重链质粒 pMH3S-humanized_H6. 7 μ g 二者比例为 1:2)，加入到准备好的细胞当中，混匀后加入到预冷的2mm电转杯中冰浴，用电转仪160V电击。电转后的细胞分成两份置于直径IOcm的塑料培养皿中，分别加入IOml的含有10% FBS、无双抗的DMEM/F12培养基。置于37°C、5 % CO2细胞培养箱中培养。次日换新鲜的IOml的含有10% FBS、无双抗的DMEM/F12培养基。待细胞长至50 60%满时，加入
I.8mg/ml的G418,隔天换液,洗掉死细胞,G418浓度始终维持在I. 8mg/ml,直至细胞不再死亡，克隆形成。将形成的克隆转移至96孔板中，用含有10% FBS、无双抗的DMEM/F12培养基，G418浓度为O. 6mg/ml，置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养。检测表达量，筛选高表达的细胞克隆。实施例6.发酵和纯化从液氮中取出5Ell-hu_lF3工程细胞复苏，在T25方瓶中培养，培养基为DMEM/F12+10% FBS，长满后传入T75方瓶中，置于5% CO2细胞培养箱(Forma)中悬浮培养。在T75方瓶中长满后，用胰酶消化，换自制悬浮培养基重悬，开始悬浮培养，每天监测细胞密度及状态，根据细胞密度及状态补加培养基，不断增加培养体积。当培养体积达到30ml时，将其转入150ml摇瓶中，摇瓶置于37°C的培养箱内，转动速度为lOOrpm。继续增加培养体积，使细胞密度维持在2-3 X 106/ml。当培养体积达到150ml时，将其转入3L摇瓶中，摇瓶置于37°C的培养箱内，转动速度为lOOrpm。继续增加培养体积，使细胞密度维持在 2-4 XlOVml ο当培养体积达到4L，将其转入10L的Wave反应器中。温度控制在36. 5°C，10L的Wave反应器的摇速为10转/分。当Wave反应器中的培养体积达到7L，不再补加细胞基础培养液，根据葡萄糖消耗情况，细胞采用流加(Fed-batch)方式培养，每日添加浓缩培养基，根据PH值情况随时补充Na2CO3,使pH值维持在7. 2左右，并将温度降低至34°C，使细胞能够持续高密度生长。发酵完毕，使用Mab select sure介质进行纯化,装填的层析柱体积为40ml，结合容量为30 50mg/ml。平衡缓冲液20mM PBS, pH7. 2 ;洗涤缓冲液0. IM柠檬酸缓冲液PH4. 6 ;洗脱缓冲液0. IM柠檬酸缓冲液pH3. 8和0. IM柠檬酸缓冲液pH3. 6 ;再生缓冲液O. IM柠檬酸缓冲液PH3. O。纯化的5E11-人源化进行非还原SDS-PAGE检测见图10，泳道M显示低分子量蛋白标准，泳道I显示纯化后的人源化单抗，分子量与预期相符。实施例7. ELISA检测PA与单抗的结合活性重组PA稀释成2 μ g/ml，IOOul/孔包被酶联板，4°C过夜，次日用封闭液(20mM PB，O. 15M NaCl，5%的奶粉)37°C封闭Ih后洗板，加入样品后37°C孵育Ih洗板，加入I :1000稀释的HRP标记的羊抗人Fe (Sigma, A0170)(或HRP标记的羊抗鼠,用于检测鼠单抗，Sigma,A3673)，37°C孵育Ih后洗板，OPD显色，酶标仪测OD45tl。ELISA结果比较检测的灵敏度比较见图11 :5E1-人源化大于lug/ml (即使浓度为lug/ml时,不能显示是阳性结果,OD45tl值不 能达到阴性对照的2. I倍，图11未显示)，不能用于药物代谢动力学研究；5E11-人源化单抗灵敏度为4_8ng/ml，可以用于药物代谢研究。5E11-鼠源单抗的灵敏度为4_8ng/ml。实施例8.体外细胞保护试验检测抗体对致死毒素的中和活性J774A. I细胞以105/ml接种于96孔细胞培养板，37°C过夜培养。将用培养液梯度稀释的待检抗体与100ng/mL PA和100ng/ml LF—起于37°C孵育lh，细胞长至90%满时吸弃原细胞培养孔中培养液，将孵育Ih后的待测液体加入细胞培养孔中，100 μ I/孔，37°C孵育3h，加入20 μ I MTT (5mg/mL)，37°C孵育30min,吸弃上清，每孔加入100 μ I盐酸异丙醇，振荡至沉淀溶解。将无毒素对照孔记为细胞100%存活，无抗体对照孔(rPA和rLF浓度均为100ng/ml)记为细胞全部死亡。通过酶联仪测OD57c!,结果通过GraphPad Prism软件来测定 EC5tl(50% effective concentration 半数有效浓度)。结果见图12，对比中国专利200610165844. 7公开的人源化单抗5E1，本发明公开的鼠源单抗5E11，嵌合的5E11和人源化5E11进行毒素中和活性的EC5tl进行评价。不同单抗的EC5tl如下，值越低保护效果越好。5E1-人源化0. 167ug/ml ;5E11-嵌合0. 070ug/ml ；5E11-人源化0. 063ug/ml。结论5E11单抗较以前的5E1单抗在细胞水平显示更好的保护效果。实施例9.大鼠毒素模型上(PA+LF)抗体的保护效果评价使用体重200 250克的雄性Fisher344大鼠，其中5E11-嵌合单抗组6只大鼠，5E11-人源化和5E8-人源单抗组每组5只大鼠，攻毒剂量为40 μ gPA+10 μ gLF/大鼠，先尾静脉注射毒素(注射用生理盐水定容到300 μ I);攻毒后5分钟尾静脉注射5Ε11-嵌合单抗，5Ε11-人源化单抗和5Ε8-人源单抗，单抗的剂量为320ug (注射用生理盐水定容到300 μ I)，观察大鼠存活情况。结果见图13，5Ε11_嵌合单抗组的存活率为83% (5/6)，5Ε11-人源化单抗的存活达到80% (4/5)，而5Ε8-人源单抗组大鼠全部死亡。该实验显示了本发明提供的单克隆抗体具有良好的动物保护功能，可以应用于制备炭疽治疗药物。
权利要求
1.一种抗炭疽PA抗原的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO 2第45_54、69_87、120-129位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID N018第46_55、71_77、110-118位氨基酸序列所示。
2.根据权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区的FR1-FR4区氨基酸序列分别如SEQ ID N04、6、8、10所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDN034所示；轻链可变区的FR1-FR4区氨基酸序列分别如SEQ ID N020、22、24、26所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID N036所示。
3.根据权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID N02第1-140位氨基酸序列所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID N034所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N018第1-128位氨基酸序列所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID N036所示。
4.根据权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链全长氨基酸序列如SEQ ID N02所示,轻链全长氨基酸序列如SEQ ID N018所示。
5.一种编码权利要求2所述单克隆抗体重链或轻链的核酸，其特征在于，所述重链的可变区的CDRU CDR2和CDR3区的碱基编码序列分别如SEQ ID NOl第133-162、184-255、358-387位核苷酸所示，FR1-FR4区碱基序列分别如SEQ ID N03、5、7、9所示，重链恒定区的碱基编码序列如SEQ ID N033所示；所述轻链的可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3区的碱基编码序列如SEQ ID N03第136-165、211-231、328-354所示，FR1-FR4区碱基序列分别如SEQID N019、21、23、25所示，轻链恒定区的碱基编码序列如SEQ ID N035所示。
6.一种编码权利要求3所述单克隆抗体重链或轻链的核酸，其特征在于，所述重链可变区的碱基编码序列如SEQ ID NOl第1-420位核苷酸所示，重链恒定区的碱基编码序列如SEQ ID N033所示；所述轻链可变区的碱基编码序列如SEQ ID N03第1-384位核苷酸所示，轻链恒定区的碱基编码序列如SEQ ID N035所示。
7.一种编码权利要求4所述单克隆抗体重链或轻链的核酸，其特征在于，所述重链的核苷酸编码序列如SEQ ID NOl所示，所述轻链的核苷酸编码序列如SEQ ID N017所示。
8.一种含有权利要求5-7所述编码单克隆抗体重链或轻链的核苷酸编码的表达载体。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述载体为PMH3S分泌型真核表达载体。
10.一种含有权利要求9所述表达载体的宿主细胞。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为CHO-S细包。
12.权利要求1-4中任一所述的单克隆抗体在制备炭疽治疗药物中的应用。
13.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1-4中任一所述的单克隆抗体，以及可药用的载体。
14.一种含有权利要求1-4中任一所述的单克隆抗体的免疫交联物，其特征在于，所述单克隆抗体与效应分子连接。
全文摘要
本发明公开了一种具有人源化、嵌合和鼠源化形式的抗炭疽PA抗原的单克隆抗体，以及所述抗体在制备炭疽治疗药物中的应用。本发明公开的抗体具有特异的抗原结合性、优异的毒素中和活性以及良好的动物保护功能。
文档编号C12N15/63GK102936286SQ20121036184
公开日2013年2月20日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者陈薇, 李建民, 李冰, 张金龙, 侯利华, 宋小红, 于婷, 徐俊杰, 付玲, 张军, 刘树玲, 任军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所