专利名称：一种扁座壳孢菌发酵生产壳聚糖酶的培养基及方法
技术领域：
本发明涉及真菌的发酵培养基及其工艺。确切的讲，本发明涉及一种扁座壳孢菌发酵生产壳聚糖酶的培养基及方法。
背景技术：
壳聚糖酶(Chitosanse EC3. 2. I. 132)又称壳聚糖-N乙酰-氨基葡糖苷水解酶，是一种分解壳聚糖的专一性酶，广泛分布在细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中，其大部分为碱性蛋白，等电点PI为7. 0-8. 5，最适pH为4. 5-8. O。在pH为6. 0-8. 0，37°C时壳聚糖酶非常稳定，超过40°C后酶很快失活。壳聚糖酶能够水解含有壳聚糖的细胞壁，在室温下可稳定存在几个小时，冷冻和干燥情况下则可数月保存，酶粉可溶于水和一系列缓冲溶剂，活性PH和温度范围很广。70年代初期，Monaghant在研究细菌和真菌过程中，首先提出壳聚 糖酶是一种不同于几丁质酶的新酶，这种酶对胶态几丁质不水解，但是能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖，被认为是对线性壳聚糖具有水解专一性的一种酶，1992年壳聚糖酶被系统命名。2004年，国际酶委员会对壳聚糖酶的定义作了修改，重新定义为以内切方式催化水解部分乙酰化壳聚糖中的β_1，4氨基葡萄糖苷键的酶。壳聚糖酶主要存在于真菌和细菌细胞中，在单子叶和双子叶植物的不同组织中也发现有该酶活性。在壳聚糖等在壳聚糖酶的作用下产生的壳寡糖具有重要的价值，能提高机体的免疫能力和抗癌能力，改善肠道微生物的区系分布等医学作用。农业上其可以刺激有益苗的生长，还可作为植物功能调节剂，刺激植物生长口，增强农作物对病虫害的防御能力。在食品上对乳酸的后酸化起到了极为明显的抑制作用等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种扁座壳孢菌发酵生产壳聚糖酶的培养基及方法。首先本发明提供了一种扁座壳孢菌发酵生产壳聚糖酶的培养基，所述培养基的原料由A液和B液组成，A液为胶体壳聚糖，质量浓度为O. 3 1%，ρΗ=5 6. 2，B液按重量分数由以下组成=NaH2PO4 O. 3-0. 5%, (NH4)2SO4 2-4%, Na2HPO4 O. 1-0. 3%, NaNO3 O. 1-0. 3%, MgSO4'7Η20 O. 05-0. 2%, CaCL2 O. 002-0. 003%，KCl O. 3-0. 5%，L-阿拉伯糖 3_4%，叶酸 O. 04-0. 05%，余量为水；将A液与B液分开高压灭菌，待各自冷却到60°C时等体积混合。优选地，所述胶体壳聚糖，质量浓度为O. 375%，pH=5。优选地，所述B液按重量分数由以下组成NaH2PO4 O. 41%, (NH4)2SO4 3%, Na2HPO4O. 2%, NaNO3 O. 2%, MgSO4。7H20 O. 1%，CaCL2 O. 002%, KCl O. 4%, L-阿拉伯糖 3%,叶酸 O. 04%,
余量为水。本发明还提供了一种扁座壳孢菌发酵产壳聚糖酶的方法，所述方法包含以下步骤
(I)菌种种子培养菌种活化后接种于种子培养基，在26土TC, 160rpm的条件下培养2 3d，制得发酵种子液；(2)将步骤(I)中制得的发酵种子液按接种于权利要求1、2或3所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为75mL，接种量2mL/50 mL，在转速160rpm，26± 1°C下培养。所述种子培养基的原料含有20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，琼脂20g，pH5. O。所述的扁座壳孢菌(何学友等，油茶黑胶粉虱及扁座壳孢对其自然控制作用，中国森林病虫，2011年7月)。胶体壳聚糖的制备方法如下壳聚糖3g溶解于O. 2mol/L的HCl 200mL中，溶液放在韦林氏搅拌器中搅拌，开始用lmol/L NaOH，最后用O. I mol/L NaOH，溶液被中和至碱性(pH9. O)。得到的沉淀在1000r/min下离 心20min，，并用水重复洗涤，直到上清液的PH呈中性。洗涤后的沉淀悬浮于蒸馏水中，且悬浮液的pH用醋酸钠调整至5 6. 2，最后的浓度为0. 3 1% ( w/ V ) ο本培养基与现有培养基相比有以下突出特点
(I)产酶高效
对于现有的培养基一般产酶周期要72小时，但本培养基只需48小时酶活就能够达到最闻。其广酶效率大大提闻了。(2)酶活大幅度提高
现有的培养基(L-阿拉伯糖 0. 375w%, (NH4)2SO4 3 w %，KCl 0. 4 w%,叶酸 O. 04 w%)酶活是20. 37 U/ mL。min.(用DNS法测定)，而优化的培养基酶活是其2. 153倍，达到43. 86U/ mL°min
(3)培养基的配方更切合实际
现有培养基中的A液要求通过乙酸钠调pH达到6. 2，由于A液壳聚糖胶体是利用1%的醋酸钠配制而成，其酸性较强，需要较多的乙酸钠去调试pH，而优化后的培养基pH只需要求达到5. O,促使调pH的乙酸钠的量大大降低。
图I为氨基葡萄糖的标准曲线。
具体实施例方式本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。实施例I
单因素实验确定培养基最优成分
(I)菌种种子培养将菌从斜面到250ml锥形瓶的扩大培养，接种量为Icm2菌落，在26°C左右，160rpm条件下的种子培养基中培育48小时。斜面培养基为PDA培养基。种子培养基20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，琼脂20g，pH5. O。(2)将(I)所得的种子液接种到优化前培养基(发酵)
A液1%胶体壳聚糖(pH6. 2)(制备方法参考王艳等，假单胞菌产壳聚糖酶突变菌株的筛选.中国海洋药物杂志，2004，23 (5): 38-40)。B 液=KH2PO4 0. 44%, Na2HPO4 0. 2%, (NH4)2SO4 0. 16%, NaNO3 0. 2%, MgSO4' 7H200. 1%，CaCL2 0. 002，KCL 0. 3%，蛋白胨 0. 1%，酵母膏 0. 1% (pH 正常)待A液、B液冷却至60摄氏度时等体积混合，在条件装液量30mL，转速135rpm，接种量ImL/ 50mL，温度26°C下培养，分别测24、48、72、96小时的酶活。发现72小时酶活达到最闻。(3)壳聚糖酶活力的测定
取稀释后的粗酶液ImL与2mL pH5. O的2. 5%的胶体壳聚糖混合，60°C水浴30min，沸水浴IOmin灭活流水冷却。用2mol/L NaOH调节反应液的pH超过8. 0，在15000rpm下离心IOmin,除去未反应的底物。取O. 5mL的上述酶液与胶体壳聚糖反映后离心的上清液，加O. 5mL DNS试剂，混合均匀后，沸水浴加热5min后，迅速加入冷水中冷却，加蒸馏水至IOmL混匀，以蒸馏水作对 照，于540nm波长处读取吸光度值，查标准曲线转化为还原糖的微克数。同样以灭活的酶液加DNS试剂反应为对照来扣除发酵液中的残糖。在上述反应条件下，每小时释放出Iyg氨基葡萄糖或相当于氨基葡萄糖的还原糖所需要的酶量为I个酶活力单位
(4)氨基葡萄糖标准曲线的制定
氨基葡萄糖标准溶液的配置在105°C下烘干至衡重后，称取O. 863g氨基葡萄糖盐酸盐，蒸懼水定容至500mL,配置成8 μ mol/mL的标准溶液；
表I氨基葡萄糖系列溶液取若干支干净的试管，按表I将8 μ moL / mL的氨基葡萄糖盐酸盐配成各浓度的氨基葡萄糖溶液，震荡均匀。表I氨基葡萄糖系列溶度
权利要求
1.一种扁座壳孢菌发酵生产壳聚糖酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料由A液和B液组成，A液为胶体壳聚糖，质量浓度为0. 3 l%，pH=5 6. 2，B液按重量分数由以下组成=NaH2PO4 0. 3-0. 5%, (NH4)2SO4 2-4%, Na2HPO4 0. 1-0. 3%, NaNO3 0. 1-0. 3%, MgSO4' 7H200. 05-0. 2%, CaCL2 0. 002-0. 003%, KCl 0. 3-0. 5%, L-阿拉伯糖 3-4%,叶酸 0. 04-0. 05%,余量为水；将A液与B液分开高压灭菌，待各自冷却到60°C时等体积混合。
2.根据权利要求I所述的扁座壳孢菌发酵生产壳聚糖酶的培养基，其特征在于，所述胶体壳聚糖，质量浓度为0. 375%，pH=5。
3.根据权利要求I所述的扁座壳孢菌发酵生产壳聚糖酶的培养基，其特征在于，所述B液按重量分数由以下组成NaH2P04 0 . 41%，(NH4)2SO4 3%，Na2HPO4 0. 2%，NaNO3 0. 2%，MgSO4-7H20 0. 1%，CaCL2 0. 002%, KCl 0. 4%, L-阿拉伯糖 3%,叶酸 0. 04%，余量为水。
4.一种扁座壳孢菌发酵产壳聚糖酶的方法，其特征在于所述方法包含以下步骤 菌种种子培养菌种活化后接种于种子培养基，在26±1°C, 160rpm的条件下培养2 3d，制得发酵种子液； 将步骤(I)中制得的发酵种子液按接种于权利要求1、2或3所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为75mL，接种量2mL/50 mL，在转速160rpm，26± 1°C下培养。
5.如权利4所述扁座壳孢菌发酵产壳聚糖酶的方法,其特征在于,所述种子培养基的原料含有20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，琼脂20g，pH5. O。
全文摘要
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种扁座壳孢发酵生产壳聚糖酶的培养基及方法。所述培养基的原料含0.3～1w%胶体壳聚糖，pH=5～6.2，NaH2PO4 0.3-0.5%，(NH4)2SO4 2-4%，Na2HPO4 0.1-0.3%，NaNO3 0.1-0.3%，MgSO4·7H2O 0.05-0.2%，CaCl2 0.002-0.003%，KCl 0.3-0.5%，L-阿拉伯糖3-4%，叶酸0.04-0.05%。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，接种量2mL，于26℃，转速160r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；培养基具有蛋白酶产率高，蛋白酶活力高等优点。
文档编号C12R1/645GK102978190SQ201210543898
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者邱君志, 吴国辉, 涂洁, 宋飞飞, 邱云锋, 苏礼超, 李小霞, 何肖云, 郭庆丰, 毛丽慧 申请人:福建农林大学