专利名称：非伤寒类沙门氏菌疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于非伤寒类沙门氏菌(non-typhoidal salmonellae) (NTS)感染的疫苗，具体地，提供了此类将产生靶向外膜孔蛋白(OmpD)的抗体的免疫原的疫苗。优选地， 例如，这可以是OmpD本身，或保留了诱导有效针对NTS的抗体的能力的OmpD片段，尤其是肠沙门氏菌(Salmoella enterica)鼠伤寒(Typhimurium)血清型-下面称为STm。此多肽可以与佐剂载体分子一起提供。其可以作为具有一种或多种来源于沙门氏菌的其他抗原的多亚单位疫苗的一部分提供。
背景技术：
肠沙门氏菌伤寒(Typhi)血清型(伤寒沙门氏菌(S. typhi))、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphiA)和非伤寒类沙门氏菌(NTQ是主要的致病因素。伤寒仍然是全球性健康问题，而在一些地域诸如撒哈拉以南非洲，由肠沙门氏菌(Salmonella enterica)的非伤寒血清型(non-typhoidal serovars)引起的疾病，主要是鼠伤寒 (Typhimurium)并且还包括肠炎(Enteritidis)，作为患有HIV的婴儿和成人的死亡主要原因而受到特别的关注。这与西方国家的NTS感染形成鲜明对比，所述NTS感染主要导致自限性胃肠炎，其影响大部分仅仅是一种经济方面的问题。沙门氏菌定植巨噬细胞并且感染胞内期的消散(resolution)受与被感染的吞噬细胞相互作用的效应器⑶4T细胞控制。然而，公认，由NTS感染引起的死亡通常与菌血症(bacteraemia)有关，并且存在许多证据菌血症发生在缺少限制细胞外NTS播散和生长的特异性抗体的个体中(例如，MacLennan, J. Clin. Invest.(临床研究杂志) (2008)118. 1553)。因此，已有报道称NTS感染在HIV+成人和儿童中导致进行性菌血症，使约50%被感染的个体死亡。另外，在撒哈拉以南非洲中，NTS感染导致在非HIV+婴儿中发生致死性疾病，主要是6-M个月之间的婴儿，与肺炎球菌疾病(pneumococcal disease)的影响相当或超过其影响。此外，在此类NTS感染的婴儿中的疾病严重性与菌血症密切相关； 在来诊所检查的那些患者中，与此类儿童菌血症相关的死亡率约占25%。这些婴儿的敏感性与丧失母体抗体和缺少对沙门氏菌的主动获得性免疫相关。尽管使用疫苗来预防由伤寒沙门氏菌(S. typhi)引起的伤寒，但针对伤寒的疫苗接种似乎不诱导针对STm的交叉保护。在一些病例中，这显然是由于抗原的差别存在所引起的(例如，就使用Vi抗原而言)，但这种交叉保护的缺少也可以扩展至灭活细菌和减毒的疫苗。目前尚无针对NTS的疫苗或预防措施。抗生素诸如氟喹啉(fluoroquinolines)被广泛用于治疗沙门氏菌感染，但沙门氏菌的多药耐药(MDR)株的出现是不断增加的问题， 并且在发生多药耐药后其施用也太迟从而不能起作用。因此，对于对抗NTS感染的有效预防手段存在着实际的需求。本发明人以前曾报道STm在小鼠中诱导非典型的抗体应答且其特征是滤泡外浆细胞的快速和大量扩增。此应答的诱导是T细胞非依赖性的，尽管该应答转换为IgGh依赖于⑶4T细胞的辅助。这些研究还鉴定，早期转换的抗体应答靶向STm的外膜中的抗原 (Cunningham等Q007) J. Immunol.(免疫学杂志)178,6200-6207)。其他作者已经报道从
4伤寒类沙门氏菌菌株肠沙门氏菌伤寒血清型(伤寒沙门氏菌(S. Typhi)或ST)分离的孔蛋白(porin)制剂也在小鼠中诱导非典型的长时间存在的抗体应答(Secimdino等Q005) Immunology (免疫学),U7, 59-70)。此工作显示外膜孔蛋白OmpF和OmpC两者均对抗体应答有贡献，OmpC是主要负责的蛋白。然而，ST和STm的外膜的外膜蛋白(Omp)组成是不同的，并且关于ST的此工作不能直接应用于STm。事实上，kcimdio等报道抗伤寒沙门氏菌孔蛋白血清不与STm交叉反应。在STm而不是伤寒沙门氏菌的外膜中，除了 OmpF和OmpC以外存在有第三种孔蛋白OmpD。OmpD是三聚孔蛋白，其与OmpF和OmpC具有一定程度的同源性，主要处于筒状结构 (barrel structure)。尽管OmpF和OmpC表达受OmpR调节并且对摩尔渗透压浓度变化敏感， 缺氧增强OmpD表达且pH降低抑制其表达。Singh等以前曾观察针对STm孔蛋白的单克隆抗体在小鼠中提供针对STm的被动免疫保护的能力(Microbial Pathogenesis (微生物发病机理)(1996)红，249-263)。针对OmpC和OmpD的表面暴露表位的单克隆抗体显示不能保护免受STm感染。这些抗体的混合物仅发现能延长用纯化的STm外膜攻击的小鼠的生存时间。然而，这代表与体内针对STm的抗体应答极大不同的抗体谱(antibody repertoire), 并且没有提供关于任何单种STm孔蛋白对针对STm感染的抗体应答的贡献的信息。WO 2007/062795A(Stifung Tierarztkiche Hochschule Hannover), Selke 等( 〃 Immunization of pigs to prevent disease in humans !construction of a protective efficacy of salmonella enterica serovar typhimurium live negative-marker vaccine (对猪免疫接种以预防人类疾病肠沙门氏菌鼠伤寒血清型阴性标志物活疫苗的保护性功效的建立)〃 hfection Imrnun(感染免疫学)Vol 75 pp 2476-2483，2007)禾口 Can J Mircobiol (〃 OmpD but not OmpC is involved in adherence of salmonella enterica serovar typhimurium to human cells (OmpD M^ OmpC
沙门氏菌鼠伤寒血清型与人细胞的粘附)"Vol 50,719-727页，2004)对本发明的背景提供了有用的知识。出人意料地，我们现在已经显示针对STm中的OmpD的天然抗体应答足以获得STm 细菌细胞数目的显著减少。高度纯化的含有孔蛋白OmpD，OmpC和OmpF的STm Omp制剂显示在T细胞缺陷小鼠中诱导快速的孔蛋白特异性抗体应答，所述抗体应答与固有的Blb细胞群的诱导有关；用这些分离的Omp免疫显示产生与灭活STm相当的针对STm感染的保护性应答。然而，用0mpD_STm感染孔蛋白免疫小鼠消除了保护作用，并且来自孔蛋白免疫小鼠的抗体与缺少OmpD的细菌细胞壁制剂的结合削弱。此外，来自伤寒沙门氏菌的组合Omp 制剂显示不具有交叉保护性，尽管ST和STm的OmpC和OmpF孔蛋白之间具有高同源性。这与针对OmpD的抗体在对抗NTS感染中的重要作用相吻合。因此，我们现在显示OmpD是针对NTS的亚单位疫苗的主要候选物。发明概述在第一个方面，本发明因此提供了一种用于治疗(预防疗法或治疗)，更具体地用于治疗或预防NTS感染和/或疾病，尤其是STm或肠炎沙门氏菌(S. Enteritidis)感染和 /或疾病的免疫原性多肽，其包含下列各项或由下列各项组成(i)多肽，其是具有产生针对NTS，尤其是鼠伤寒沙门氏菌(STm)的抗体应答的能力的OmpD或其免疫原性片段；或
(ii)⑴中定义的多肽的变体，其具有所述能力。优选地，所述免疫原性多肽可以是非伤寒类沙门氏菌的天然OmpD，例如可源自 STm的OmpD，或其免疫原性片段。合适的变体包括天然变体和改造的类似物，其保持所需的抗体特异性。在另一个方面，现在还提供了免疫原性多肽在制备用于治疗或预防由含OmpD的沙门氏菌引起的感染和/或疾病，尤其是NTS感染和/或疾病诸如STm感染和/或疾病的疫苗组合物中的应用，所述免疫原性多肽包含下列各项或由下列各项组成(i)多肽，其是具有产生针对NTS，尤其是STm的抗体应答的能力的OmpD或其免疫原性片段；或(ii)⑴中定义的多肽的变体，其具有所述能力。优选，所述疫苗组合物将有效对抗STm和肠炎沙门氏菌二者。一种或多种附加的免疫原性多肽可以与如上面⑴或(ii)中所定义的多肽一起使用，其例如选自(i)NTS和 /或ST和/或副伤寒沙门氏菌(S. paratyphi)的外膜孔蛋白或其免疫原性片段。在另一个方面，提供了一种疫苗组合物，其提供免疫原性多肽并包含佐剂，所述免疫原性多肽包含上面(i)或(ii)中定义的多肽或由其组成。此疫苗的抗原性组分可以包含这种多肽抗原或由其组成。佐剂可以与此抗原分开或以与上面(i)或(ii)中定义的多肽缀合的融合蛋白的形式提供，例如，Omp D可以以与破伤风类毒素(tetanus toxoid)、铜绿{段单胞菌夕卜毒素 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A)、霍舌L毒素(cholera toxoid) 或另一佐剂载体多肽缀合的形式提供。如上面所指定，此疫苗组合物可以包含其他抗原以扩展其范围的广度，例如，从而提供针对NTS和引起伤寒的沙门氏菌两者的宽范围的疫苗。另外，在另一个方面，提供了一种治疗或预防由含OmpD的沙门氏菌引起的感染和 /或疾病，尤其是NTS感染和/或疾病诸如STm感染和/或疾病的方法，该方法包括施用免疫原性多肽，所述免疫原性多肽包含上面⑴或(ii)中定义的多肽或由其组成。Omp D也是副伤寒沙门氏菌外膜的一个特征。因此，目前推测副伤寒沙门氏菌的 OmpD，尤其是，例如，甲型副伤寒沙门氏菌的OmpD也可以获得在治疗或预防副伤寒沙门氏菌感染和/或疾病中的疫苗应用。因此，目前还提供了一种用于治疗(预防疗法或治疗)的免疫原性多肽，包含下列各项或由下列各项组成(a)多肽，其是具有产生针对副伤寒沙门氏菌的抗体应答的能力的副伤寒沙门氏菌的OmpD或其免疫原性片段；或(b) (i)中定义的多肽的变体，其具有所述能力。所述免疫原性多肽可以包含在如上所讨论的多亚单位疫苗中。从进一步的观点出发，提供了免疫原性多肽在制备用于治疗或预防由含OmpD的沙门氏菌引起的感染和/或疾病，尤其是副伤寒沙门氏菌感染和/或疾病的疫苗组合物中的应用，所述免疫原性多肽包含下列各项或由下列各项组成(a)多肽，其是具有产生针对副伤寒沙门氏菌的抗体应答的能力的副伤寒沙门氏菌的OmpD或其免疫原性片段；或(b) (i)中定义的多肽的变体，其具有所述能力。与上面讨论的用于NTS的疫苗组合物的情况一样，可以采用一种或多种附加的免疫原性多肽，例如，选自NTS的外膜孔蛋白(例如，优选NTS OmpD诸如STm的OmpD)，和/或 ST和/或副伤寒沙门氏菌的外膜孔蛋白，或它们的免疫原性片段。在另一个方面，提供了一种疫苗组合物，其提供免疫原性多肽并包含佐剂，所述免疫原性多肽包含上面(a)或(b)中定义的多肽或由其组成。所述佐剂可以是与(a)或(b) 中定义的多肽缀合的佐剂载体分子。其可以是融合蛋白，诸如本文所述的任一种。还在另一个方面，提供了一种治疗或预防由含OmpD的沙门氏菌，尤其是副伤寒沙门氏菌引起的感染和/或疾病的方法，该方法包括施用免疫原性多肽，所述免疫原性多肽包含上面(a)或(b)中定义的多肽或由其组成。本发明也可用于治疗且特别地预防菌血症。具体地，在由本发明的免疫原接种的患者中可以消除菌血症。由本发明的免疫原产生的抗体优选为IgG或IgM。OmpD的氨基酸序列是公知的。本发明提及的OmpD多肽还可以涵盖编码其的多核苷酸序列。详述根据本发明用于疫苗用途的OmpD可以分离自细菌细胞或通过重组产生。如上所述，也可以采用OmpD的截短形式，条件是它们保留了所需的免疫原性。可以通过蛋白工程的已知技术构建保留了引起所需(尤其是，例如，针对STm)的抗体应答的能力的所述OmpD 片段或整个OmpD的类似物。它们可以具有一个或多个置换和/或缺失和/或添加，例如一个或多个保守置换，它们在攻击研究，例如，在用STm攻击的小鼠中导致仍然可以观察到的所需免疫原性。可以设想OmpD的变体、片段或类似物，条件是它们引起本文所述的免疫应答。变体优选与在种属间高度保守的野生型OmpD氨基酸序列，或编码其的多核苷酸序列或其补体具有至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，更优选至少99%，更优选至少99. 5%和最优选至少99. 9%序列同源性(根据情况而定)。这样的判断可以使用例如BLAST程序来进行。如上面所定义的OmpD或其片段或类似物可以以融合蛋白的形式提供。如上所述， 发现通过此类融合蛋白提供佐剂组分可能是方便的或优选的。用于此目的的合适多肽可以选自用于此目的的疫苗领域中熟知的载体多肽，一些在上面列举。鞭毛蛋白(Flagellins) 和其他多肽载体也可以考虑用于此目的。然而，佐剂同样可以单独地提供。也如上所述，天然OmpD，其片段或保留了产生所需抗体的能力的此多肽的变体的使用可以合意地与多亚单位疫苗中一种或多种另外的免疫原性多肽的使用进行组合。因此，可以提供一种或多种附加的免疫原性多肽，其选自包含下列各项或由下列各项组成的多肽⑴可来源于NTS、ST或副伤寒沙门氏菌的外膜孔蛋白，例如，ST的OmpC或其免疫原性片段，和(ii)所述多肽的修饰形式，所述修饰形式保留了产生针对沙门氏菌的抗体应答的能力。所述多肽可以是，例如，与STm的OmpD相比的天然OmpD变体或其免疫原性片段。 如上所述，可以提供所述一种或多种附加的免疫原性多肽以扩展特异性，包括提供有效对抗NTS，尤其是Mm和另外对抗伤寒类沙门氏菌诸如伤寒沙门氏菌和/或副伤寒沙门氏菌的广谱疫苗。除了
图1-4中显示的研究以外，我们已经进行了另外的实验并且已经获得了许多其他的发现，如下所述。我们通过结构测定已经确定在这些研究中使用的分离的孔蛋白保留了它们的天然性质，显示这些抗体靶向功能性孔蛋白。本发明的免疫原目前还显示在感染后4天在小鼠的脾中诱导孔蛋白特异性的浆细胞。这显示快速地诱导了针对这些免疫原的应答，这对于疫苗来说是明显有益的。我们已经发现T细胞对于有效产生针对孔蛋白的转换的IgG抗体是需要的。然而， T细胞对于IgM的诱导不是必需的。因此，针对免疫原产生的抗体优选为IgM或IgG。在IgG 的情况下，优选的是，受疫苗接种者或患者具有足够的T细胞计数以促进IgG的诱导。如果他们没有足够的T细胞计数，则适合其他免疫球蛋白类型，诸如IgM。孔蛋白免疫作用已经显示足以消除菌血症，菌血症是疾病严重性的关键标志物。 因此，预防菌血症是特别优选的，尽管也设想进行治疗。事实上，我们还显示免疫患者或受疫苗接种者两次比单次免疫作用获得更好的益处。因此优选地，治疗包括至少两次以上，且优选3次以上，4次以上包含本发明的免疫原的疫苗接种。然而特别优选两次疫苗接种。这些疫苗接种可以在两天或更多天中适当地间隔开。我们已经证实使用缺少OmpF和OmpC(纯化孔蛋白制剂中存在的其他孔蛋白)但仍然表达OmpD的细菌对小鼠的感染在用本发明的免疫原免疫后减少并且菌血症消失。相反，用缺少OmpD但具有充足的OmpF和OmpC的细菌对孔蛋白免疫小鼠的感染未减少(参见图3)，菌血症减轻至更微量的水平。另外，仍然保留了抗体与细胞壁中孔蛋白的结合。最后，我们显示鼠模型也对疫苗诸如伤寒多糖(Typhim polysaccharide)(目前针对伤寒的疫苗)应答。这可能是很重要的，因为2-3岁以下的儿童对此疫苗无应答，并且此年龄的儿童对NTS易感。这就支持了这些Blb细胞的重要性。优选地，伤寒多糖也可以用作本发明中，特别是用于3岁或3岁以下的儿童的疫苗中的佐剂。尽管提及了具体用途，但要理解的是这包涵相应的治疗方法。换句话说，本发明还提供个体或群体的治疗方法和疫苗接种方法，所述方法例如包括向需要该方法的患者或待疫苗接种的个体或群体施用本发明的免疫原，任选地与佐剂一起施用。适合于递送免疫原的手段在本领域中是熟知的，但可以包括使用可溶性免疫原， 包封在脂质体内，或形成ISCOM(免疫刺激复合物(Immune Stimulating Complex)) 0递送还可以经由编码免疫原的多核苷酸，例如，经由包含所述多核苷酸的质粒或病毒(诸如逆转录病毒)载体递送。因此，该免疫原性多肽可以，优选地，由多核苷酸表达。基于明矾的佐剂和其他佐剂的应用也是优选的。 下面在结合下面附图的下列范例中进一步描述本发明附图简述1显示在缺少T细胞的情况下孔蛋白诱导快速、特异性抗体应答的研究结果。 (A)在用Mm ip感染后4天时，T细胞缺陷小鼠可以诱导针对STm的快速、滤泡外、脾浆细胞应答，其导致针对LPS和Omp的血清抗体显著增加，但针对鞭毛蛋白的血清抗体不显著增加。(B)来自STm-OmpC，OmpD和一些OmpF的高度纯化的Omp。(C)孔蛋白快速诱导T细胞非依赖性的对孔蛋白特异的IgM抗体。所有小鼠经ip免疫/感染。OT=未免疫的。Ml^结果显示针对STm孔蛋白的抗体可以保护免受STm伤害，如下面进一步讨论
8的那样。㈧与未免疫小鼠相比，用热灭活的STm或纯化的孔蛋白(图1B)免疫的小鼠在用STm感染后4-5天显示脾中细菌数目大约相当于下降100-1000倍。(B)用孔蛋白免疫所获得的保护作用是由B细胞介导的，因为感染缺少B细胞的孔蛋白免疫小鼠(IgH-/-小鼠)没有获得任何优势(左侧图板)。此外，在感染前用来自孔蛋白免疫的T细胞缺陷小鼠的抗体调理细菌与用来自未免疫小鼠的血清调理相比，获得显著更多的保护作用(右侧图板)。(C)在不能有效转换至IgGl或IgGh但仍然具有B细胞和IgM的CD^缺陷小鼠中， 则仍诱导针对孔蛋白的抗体并获得保护作用，但此保护作用不如诱导转换抗体时那么大。 ⑶用孔蛋白免疫可以减少在小鼠易感品系中高致病性STm菌株(SL1344)的感染。(E)尽管含有0mpD，0mpC和OmpF的STm孔蛋白可以获得对抗感染的益处，但以类似方式制备的并含有OmpF和OmpC的ST孔蛋白却不能。此外，此益处不是由LPS所引起的，因为用高度纯化的Mm LPS的商购制剂(Axxora)免疫也未能获得对抗感染的保护作用。1显示孔蛋白保护作用可以很大程度通过OmpD介导的结果。㈧小鼠用孔蛋白预激(prime) 35天，然后用STm或OmpD缺陷性Stm攻击，并且在5天后评估应答。脾和肝脏中的细菌数目在OmpD缺陷性STm组中相似，无论小鼠事先是否用孔蛋白免疫。(B)来自幼稚(Iiaive)T细胞缺陷小鼠或用孔蛋白免疫7天的T细胞缺陷小鼠的血清中IgM的反应性。该血清针对两组抗原进行测试来自STm或缺乏OmpD的STm的细胞壁级分。显示免疫血清与来自OmpD缺陷性STm的孔蛋白级分(加方框的)的结合减少。图4. Stm和纯化孔蛋白诱导可以保护免警感染的T细胞非依赖件Blb细胞群。 (A)在抗原之前或之后4天评估腹膜腔淋巴细胞。上排显示B220和⑶5表达。下方是对于 Blb，B220intCD5_群的CD21和CD23表达。(B)未免疫和孔蛋白免疫的T细胞缺陷小鼠中的 Blb细胞。NI =未免疫的。(C)转移至IgH-/-(B细胞缺陷)小鼠中并用孔蛋白免疫的Blb 细胞获得针对STm的保护作用。嵌合体和B细胞缺陷小鼠用孔蛋白预激21天，然后感染5 天。嵌合体被保护免受感染(左侧图板)并且产生抗孔蛋白IgM。无Blb细胞但用孔蛋白预激的B细胞缺陷动物没有得到保护。在我们最近的出版物中这些细胞的表征已经得到了改进Cunningham 等，(PNAS，2009 年 6 月 16 日，第 106 卷，第 M 号，第 9803-9808 页)。图5.用孔蛋白免疫减少STm感染后的菌血症。来自NI和孔蛋白免疫的WT小鼠的血液细菌计数，所述小鼠用hl06STm(左侧图板)或缺少OmpD的STm(中央图板)或缺少OmpR的STm(右侧图板)感染5天。NI-未免疫的。表示P < 0. 05。图6.用孔蛋白多次免疫与单次感染相比获得针对STm感染的更好的保护作用。来自WT小鼠的脾和肝脏细菌计数，所述小鼠用孔蛋白免疫一次(左侧图板)或免疫两次(右侧图板)并用3xl03STm SL1344株感染4天。NI-未免疫的。表示P < 0. 05广-表示P < 0. 01。B 7. OmpR缺陷性STm(缺少OmpF和OmpC但保留OmpD表达)引起的感染在孔蛋白免疫后减轻。未免疫的(Ni)或孔蛋白免疫的WT小鼠用hl06STm(实心圆圈)或切106 缺少OmpR的STm(STm0mpR-RAK83株；空心圆圈)感染5天并计算脾(左侧图板)和肝脏 (中央图板)细菌数目。来自NI或孔蛋白免疫的TCRbd-/-小鼠的IgM针对从STm或缺少 OmpR的STm分离的细胞壁的免疫印迹分析(右侧)。加方框的区域显示孔蛋白OmpD的近似Mr。应用Marm-Whitney检验以比较由条形连接的各组之间的统计学显著性。表示P < 0. 05。
MUgG的诱导增加了孔蛋白免疫的有益效果。诱导Blb细胞。NI或孔蛋白免疫的WT或TCRbd-/-小鼠用hlOeSTm感染5天，并计算脾细菌数目(左侧图板)。右侧图板显示来自SI^m感染5天的NI和孔蛋白免疫的WT和TCRbd-/-小鼠的血清IgM效价。NI-未免疫的。表示P < 0. Ol ;NS-不显著。
现在将在下面的非限制性实施例中描述本发明。实施例1材料和方法小鼠，细菌菌株和免疫原野生型(WT)小鼠获自家养群体。基因缺陷小鼠的来源已在他处进行了报道 (Cunningham 等，(2007) J. Immunol.(免疫学杂志)178,6200-7 和 Gaspal 等，(2008) J. Immunol.(免疫学杂志)1迎，观对_9)，而例外是β δ TCR缺陷小鼠，其获自Jax0所有小鼠和组在使用前进行年龄(6-12周)和性别匹配。肠沙门氏菌鼠伤寒血清型SL1344是WT 株，且SL3261是一个被充分描述的AroA缺陷性减毒株。在SL3261背景上生成OmpD缺陷性 SiTm15如以前所述通过2% (v/v) Triton X-100提取细胞被膜并通过离心收获而生成总Omp制剂。使用公认的方法从ST(9933株)和STm(ATCC 14028株)产生纯化孔蛋白 (Salazar-Gonzalez 等 O004) Immunol. Letts (免疫学通讯)93,115-22)。简言之，孔蛋白从核酸酶和MgCl2处理的超声处理细胞的上清液分离，然后用含有 Tris HCI与SDS的缓冲液反复处理，最后在聚丙烯酰胺葡聚糖(S印hacryl) S-200柱上通过 FPLC纯化。含孔蛋白的级分通过凝胶电泳评估，然后针对含有0. 1% SDS的PBS充分透析。 纯化后，孔蛋白保存在RT或_80°C。鲎变形细胞溶解物测定显示LPS污染为0. 06EU/480 μ g 孔蛋白。通过胰蛋白酶消化并在伯明翰大学的功能基因组学和蛋白质组学小组使用四级杆飞行时间质谱仪(Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometer)分析确认蛋白身份 (identity)。TLR级STm LPS购自(Axxora ；产品ALX-581-011-L002)并被高度纯化以消除与 TLR2的任何交叉反应性。鞭毛蛋白如他处所述产生，并且通过免疫沉淀纯化至同质。Imject 级 OVA 购自 Thermo Scientific。小鼠的免疫和感染以及调理实验除非另外说明，小鼠用处于PBS中的20yg蛋白或LPS/动物来i. p.免疫。如对每个实验所述的那样，小鼠用细菌的减毒株以每只动物IO5或IO6个生物体来感染。小鼠用 3xl03WT SL1344细菌i.p.感染。在感染后的规定时间，小鼠被处死并分离组织。如前所述通过组织的直接培养确定每个脾或肝脏的细菌数目。如前所述进行实验，包括在体外调理细菌后感染小鼠。在调理前，血清通过加热至56°C 20分钟补体-灭活，然后稀释并在室温下与细菌混合30分钟。在每个实验中，每只小鼠使用单一血清，并且通常每种血清样品使用多只小鼠。对于每个实验评估细菌生存力和不凝集。免疫组织学，ELISA，凝胶电泳和Western印迹用于检测浆细胞(⑶138+细胞，获自BD Pharmingen的抗体)和IgD+细胞的免疫组织学如前所述(Cunningham等(2007) J. Immunol (免疫学杂志)，178，6200-7)，例外是使用的抗IgD是绵羊多克隆抗体(Abeam ab9177-l ； 1 1000)，使用的链霉亲和素-APC复合物是获自Vector Laboratories的Vectastain ABC-AP试剂盒。使用以前描述的方法通过ELISA评估血清的抗体水平，其中对于蛋白抗原和LPS，抗原以5μ g/ml包被，或对于整个生物体以10 μ g/ml包被。使用与碱性磷酸酶连接的山羊抗鼠IgM抗体(Southern Biotechnology Associates)，并使用Sigma快速磷酸对硝基苯酯片剂显色。蛋白在4-20% 梯度凝胶(Thermo Scientific)或在12%或15%凝胶上使用标准方法分离。对于印迹，在电泳后蛋白转移至PVDF膜上并封闭膜。将膜封闭过夜并洗涤，然后使用SG底物(Vector Laboratories)去除内源性HRP。洗涤后，将膜与适当的血清温育过夜，然后用HRP-缀合的山羊抗鼠IgM(Southern Biotech)在室温下探测2小时。然后洗涤膜，之后使用 Supersignal 化学发光试剂(Supersignal Chemiluminescense) (Thermo Scientific)显色。FACS分析和细胞分诜腹膜渗出细胞(PEC)通过灌洗获得，并用这些抗鼠mAb-IgM FITC，⑶3 PerCPcy5, CD5 PEcy5, B220 APC, CD21FITC 和 CD23PE (全部获自 E-bioscience ；分别为克隆 eB121-15F9，145-2Cll，53-73，RA3-6B2，8D9，B3B4)中的一种或多种染色。细胞用 FACSCallibur流式细胞仪(BD Biosciences)分析，数据使用WinMDI 2. 9分析。为进行转移，从之前用孔蛋白和Blb细胞(B220intOT5_)免疫4天的小鼠中分离细胞，并使用MoFlo细胞分选仪分选。细胞(&105)转移至IgH-/-小鼠，且3天后用20yg孔蛋白i. p.免疫。在 5天后和用STm攻击前通过抗IgM和抗孔蛋白血清抗体确认转移成功。统计学使用非参数Mann-Whitney秩和检验(Mann-Whitney sum of ranks test)计算统计量。使用Analyze-It程序计算ρ值。MM1. Stm和STm总外膜蛋白制剂诱导快速的T细胞非依赖性的浆细胞应答。如上所述，以前已经确认STm可以诱导快速和广泛的B细胞应答，并且早期转换的应答(switched response)的主要靶标是外膜蛋白，而非LPS或FliC。为了更详细地剖析此应答，使用完全缺少T细胞的小鼠(β δ TCR缺陷小鼠)。用减毒沙门氏菌感染导致感染 4天时CD138+浆细胞大量增加，并且与此相平行的是针对沙门氏菌的血清IgM的快速诱导 (图1Α)。抗体应答的更具体分析显示存在对针对LPS和总外膜蛋白制剂的抗体的强诱导， 但对针对FliC的抗体的诱导不太明显(图1A)。2.用高度纯化的STm孔蛋白制剂免疫T细胞缺陷小鼠。为了扩展上述研究，在T细胞缺陷小鼠中研究对高度纯化的包含OmpC，OmpD和 OmpF的外膜孔蛋白制剂的应答(图1B)。来自免疫小鼠的血清的ELISA和Western印迹确认抗原特异性IgM的诱导(图1C)。因此在缺少T细胞辅助的条件下诱导了针对STm孔蛋白的抗体。3.孔蛋白诱导的针对STm感染的保护作用完全通过B细胞介导。然后评估用单剂量的纯化孔蛋白免疫后诱导的抗体是否能够减少STm引起的感染。WT小鼠用孔蛋白免疫并在35天后用减毒沙门氏菌攻击。作为初步比较，由孔蛋白提供的保护水平与由热灭活细菌提供的水平相比较。用纯化孔蛋白或灭活细菌进行免疫以中值 2-31ogs降低脾细菌负荷(图2A)。实际上，在免疫第4天时针对孔蛋白诱导的抗体可以减少感染大约50% (未显示的数据)。为了评估B细胞是否介导此保护作用，WT小鼠和缺少所有B细胞的小鼠(IgH缺陷小鼠)用孔蛋白免疫并在35天后感染。这显示在缺少B细胞的条件下由Omp提供的保护作用完全消失(图2B)。相反，用来自孔蛋白免疫的T细胞缺陷小鼠的血清调理细菌足以减少感染。由于已经显示B细胞是保护作用所必不可少的，并且单独IgM就可以提供有益效果，因此然后通过用Omp免疫⑶观缺陷动物并在35天后感染，确定是否存在来自转换抗体的超出和高于IgM的附加有益效果。尽管在CD^缺陷小鼠中针对IgM的孔蛋白的诱导未减少(图2C)，但这些小鼠不能诱导转换。这些研究显示在⑶观缺陷动物中细菌负荷大约 9倍更高，表明观察到的保护作用的90%由IgG介导(图2C)。这些结果与使用⑶40L缺陷小鼠的等价实验中所得到的结果相似，CD40L缺陷小鼠也具有缺陷性转换。下一步评估抗孔蛋白抗体是否能够减少用WT STm SL1344感染的小鼠中的细菌负荷。这显示感染后4天脾和肝脏中的细菌负荷的中值细菌数目与未免疫的小鼠相比，分别是20和40倍更低(图2D)。最后，检查任何残留的LPS污染是否能够解释这些发现并且来自ST的孔蛋白是否能够提供类似的有益效果。小鼠用商购的来自STm的TLR级LPS或来自ST的孔蛋白免疫，然后35天后进行感染。出人意料地，TLR级LPS不提供针对减毒细菌感染的保护作用 (图2E)。类似地，如上所述，ST孔蛋白不提供选择性保护。考虑到来自ST和STm的OmpF 和OmpC之间几乎完全同源，来自ST的孔蛋白不提供保护作用是出人意料的。4.孔蛋白提供的针对STm的保护作用由针对OmpD的抗体介导为了测试OmpD是否对由STm孔蛋白免疫提供的保护作用有贡献，小鼠用来自STm 的孔蛋白免疫，并在35天后用STm或缺少OmpD的STm感染。这显示免疫对用OmpD缺陷性 STm感染的小鼠不提供有益效果(图3)。然后评估在T细胞缺陷小鼠中针对Stm孔蛋白诱导的抗体如何与来自OmpD缺陷细菌的外膜制剂结合。抗体不与来自缺少OmpD的细菌的外膜蛋白制剂的孔蛋白级分结合。这表明针对OmpD的抗体是针对STm的抗体的重要靶标，并且可以提供对抗随后STm感染的保护作用。5.孔蛋白和STm，而非LPS或鞭毛蛋白，诱导腹膜⑶19+8220-005 细胞群为了评估在用STm和STm孔蛋白免疫后是否诱导固有B细胞群，WT小鼠被免疫并在免疫后第4天评估腹膜应答。孔蛋白诱导B细胞群，所述B细胞群通过具有Blb细胞特有的B220intOT5_表型来表征，所述表型特征是⑶19+和IgM+但具有⑶21和⑶23的低表达 (表4A和未显示的数据)。尽管此群体也被活STm诱导，但却不被处于0. 1 % SDS中的高度纯化的TLR级LPS或FliC或OVA诱导(图4A)。为了确认此B细胞群的T细胞非依赖性， ⑶观缺陷小鼠和β δ TCR缺陷小鼠用分离的蛋白或沙门氏菌免疫(图4Β ；对于β δ TCR缺陷小鼠显示的数据，而对于CD^缺陷小鼠的类似结果)。发现在缺少T细胞的条件下用STm 和孔蛋白免疫后诱导Blb群体。因此，STm和STm孔蛋白两者，而非LPS，诱导具有Blb细胞表型的腹膜B细胞群。还已经显示缺少OmpR的STm(0mpF和OmpC表达的调节物并且因此缺少这两种蛋白的表达)也诱导这样的B细胞(未显示的数据)。6.来自82201053113细胞的抗体足以提供保护作用为了确定由对STm孔蛋白应答而诱导的Blb细胞产生的抗体是否足以提供保护作用，生成嵌合小鼠。从4天前用孔蛋白免疫的幼稚(皿1卯)11~小鼠分离的腹膜8220+005_细
12胞，分选hl05B220+⑶5_细胞并转移至B细胞缺陷小鼠中。48小时后，Blb细胞受体和B细胞缺陷小鼠用STm孔蛋白免疫。21天后，通过测量来自免疫嵌合体和对照小鼠的抗孔蛋白 IgM确认成功转移。第二天，免疫小鼠和幼稚小鼠用IO6减毒沙门氏菌ip感染，并在5天后评估细菌负荷和血清抗体。这显示仅在感染时具有抗孔蛋白抗体和B细胞的那些小鼠能够减少细菌感染(图4C)。在缺少B细胞的条件下用孔蛋白免疫的小鼠具有的细菌数目与未免疫小鼠相当。因此，来自转移的Blb细胞的抗体能够限制保护作用。为了从这些研究中概括出关键点，已经显示1.对STm的T细胞非依赖性应答是选择性的，早期对LPS和Omp具有显著的应答而对鞭毛蛋白分子FliC则没有显著应答(图1A)。含有孔蛋白0mpD，0mpC和OmpF的高度纯化Omp制剂在T细胞缺陷小鼠中诱导快速的孔蛋白特异性抗体应答(图IB和1C)；2.用孔蛋白或灭活细菌免疫获得对抗STm的类似保护作用并且孔蛋白引起的保护作用是完全B细胞依赖性的。IgG提高IgM的效力大约10倍。最后，不诱导针对纯LPS 或鞭毛蛋白或来自缺少OmpD的伤寒沙门氏菌的孔蛋白的保护作用(参见图2和未显示的数据)；3.用OmpD缺陷性STm感染孔蛋白免疫小鼠消除了保护作用(图3A)，并且来自孔蛋白免疫小鼠的抗体与来自OmpD缺陷性STm的外膜制剂的结合减少(图3B)；4.孔蛋白和Sl^m，而非LPS、FliC或0VA，在WT和T细胞缺陷小鼠中诱导腹膜 B220int⑶5_Blb细胞(图4A和B)。Blb细胞转移至用孔蛋白免疫的B细胞缺陷小鼠中可以保护免受STm感染并且这依赖于抗体(图4C)；并且Blb细胞是自更新的并且令人感兴趣地已经被鉴定为在其他感染中也很重要，所述感染诸如由Borrelia hermensii和肺炎链球菌(Sti^ptooccus pneumoniae)导致的那些。事实上已有报道Blb细胞也可以对疏螺旋体属(Borrelia)的细菌蛋白(补体因子H 结合蛋白)应答。通过下面显示OmpD蛋白是针对STm孔蛋白诱导的抗体的主要靶标，并且LPS对此应答不重要(i)使用纯化的孔蛋白使得它们具有检测不到的水平的LPS污染 (< 0. 01EU/100yg 孔蛋白)；ii)用高度纯化的STm LPS免疫，作为显示此没有保护作用的对照；iii)显示用缺少OmpD但具有足够LPS的细菌感染后孔蛋白免疫的有益效果丧失；iv)来自孔蛋白免疫小鼠的抗体与OmpD缺陷细菌细胞壁的结合丧失；ν)如果在免疫期间B细胞不存在则所有细菌效价的减少均消除；vi)孔蛋白诱导B-Ib细胞群，该细胞群不能被足以提供对感染的保护作用的LPS 诱导。将这些综合在一起强烈地提示，针对孔蛋白且尤其是OmpD的抗体可以减少NTS感染的水平。Mrk因此表明对OmpD的抗体应答可以减少STm感染并且此应答通过B细胞来介导，并
13且至少部分地经由T细胞非依赖性Blb细胞群的诱导来介导，所述Blb细胞群本身足以减轻SI^m感染。实施例2当适合时，遵循实施例1中的实验方案进行下列的进一步工作1.在NTS中，菌血症经常反映疾病严重性。因此，我们研究了孔蛋白免疫对随后用 STm或缺少OmpR的SI^m(导致缺陷性OmpF和OmpC表达)或OmpD缺陷性SI^m感染所诱发的菌血症的作用。我们显示孔蛋白免疫可以消除STm感染的菌血症(图5，左侧图板)并且在用OmpR缺陷性STm感染孔蛋白预激小鼠后可以看到(图5，中央图板)，但在用OmpD缺陷性STm感染后则很少能看到(图5，右侧图板)。这表明针对孔蛋白，尤其是OmpD的抗体可以显著地减少菌血症。2.用孔蛋白单次免疫足以减轻STm引起的细菌负荷。为了评估免疫两次是否增加孔蛋白免疫的有益效果，小鼠用孔蛋白免疫两次并用STmSL1344株感染。这显示免疫两次比单次免疫提供更大的有益效果(图6)。3.用缺少OmpD的细菌感染孔蛋白免疫小鼠揭示孔蛋白免疫(缺少OmpD)就减少组织中的细菌数目而言不提供任何益处。相反，用缺少OmpF和OmpC但仍表达OmpD的细菌对小鼠的感染在孔蛋白免疫后减轻。这显示抗OmpF抗体或抗OmpC抗体在控制感染方面不如抗OmpD抗体有效。此外，来自孔蛋白免疫小鼠的抗体可以与缺少OmpF和OmpC，而非OmpD 的细菌细胞壁中的孔蛋白结合(图7)。4.由于在孔蛋白免疫后减少感染的作用是B细胞介导的和T细胞非依赖性的，我们评估了转换的Ab是否提供超过和高于IgM的附加有益效果。为了对此测试，野生型(WT) 和T细胞缺陷小鼠用孔蛋白免疫并在35天后感染。尽管在感染后所有组中诱导了孔蛋白特异性IgM(图8)，但在T细胞缺陷小鼠中孔蛋白特异性IgG在很大程度上检测不到。在T 细胞缺陷小鼠中细菌负荷为大约40倍更高。将孔蛋白免疫仅在B细胞存在时有效和所有幼稚动物组在感染后5天具有类似的细菌数目的发现综合在一起，这些数据提示> 90%的有益效果是IgG介导的(图2C)。本文引用的所有参考文献和出版物通过引用结合于本文中，以不与本发明冲突为度。
权利要求
1.一种用于治疗的免疫原性多肽，其包含下列各项或由下列各项组成(i)多肽，其是具有产生针对非伤寒类沙门氏菌(NTQ的抗体应答的能力的OmpD或其免疫原性片段；或(ii)(i)中定义的多肽的变体，所述变体具有所述能力。
2.权利要求1所述的免疫原性多肽，其用于治疗或预防NTS感染和/或疾病。
3.权利要求2所述的免疫原性多肽，其用于治疗或预防鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium, STm)感染和/或疾病。
4.权利要求1-3中任一项所述的免疫原性多肽，其包含可获自STm的OmpD或其免疫原性片段，或由可获自STm的OmpD或其免疫原性片段组成。
5.权利要求1所述的免疫原性多肽，其是融合蛋白，在所述融合蛋白中(i)或(ii)中定义的多肽序列与第二多肽序列连接。
6.权利要求5所述的免疫原性多肽，其中所述第二多肽序列是佐剂载体蛋白。
7.免疫原性多肽在制备用于治疗或预防由含OmpD的沙门氏菌引起的感染和/或疾病的疫苗组合物中的应用，所述免疫原性多肽包含下列各项或由下列各项组成(i)多肽，其是具有产生针对NTS的抗体应答的能力的OmpD或其免疫原性片段；或(ii)(i)中定义的多肽的变体，所述变体具有所述能力。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述疫苗组合物用于治疗或预防NTS感染和/或疾病。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述疫苗组合物用于治疗或预防STm感染和/或疾病。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的应用，其中所述免疫原性多肽包含可获自STm的 OmpD或其免疫原性片段，或由可获自STm的OmpD或其免疫原性片段组成。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的应用，其中所述免疫原性多肽是权利要求5或权利要求6所述的融合蛋白。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的应用，其中所述疫苗组合物包含一种或多种附加的免疫原性多肽。
13.权利要求12所述的应用，其中所述一种或多种附加的免疫原性多肽选自包含下列各项或由下列各项组成的多肽(i)NTS、伤寒沙门氏菌(S. typhi, ST)或副伤寒沙门氏菌 (S. paratyphi)的外膜孔蛋白或其免疫原性片段和(ii)其类似物，所述类似物保留了产生针对沙门氏菌的抗体应答的能力。
14.一种疫苗组合物，其提供根据权利要求1-4中任一项所述的免疫原性多肽并且包含佐剂。
15.权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述佐剂由处于权利要求5或权利要求6所述的融合蛋白形式的免疫原性多肽提供。
16.权利要求14或权利要求15所述的疫苗组合物，其包含一种或多种附加的免疫原性多肽。
17.权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述一种或多种附加的多肽选自包含下列各项或由下列各项组成的多肽(i)NTS、ST或副伤寒沙门氏菌的外膜孔蛋白或其免疫原性片段；和(ii)其类似物，所述类似物保留了产生针对沙门氏菌的抗体应答的能力。
18.权利要求14-17中任一项所述的疫苗组合物，其用于治疗或预防NTS感染，尤其是 STm感染，和由副伤寒沙门氏菌和/或ST引起的感染。
19.一种用于治疗的免疫原性多肽，其包含下列各项或由下列各项组成(a)多肽，其是具有产生针对副伤寒沙门氏菌的抗体应答的能力的副伤寒沙门氏菌的 OmpD或其免疫原性片段；或(b)(i)中定义的多肽的变体，所述变体具有所述能力。
20.权利要求19所述的免疫原性多肽，其用于治疗或预防副伤寒沙门氏菌感染和/或疾病。
21.免疫原性多肽在制备用于治疗或预防由含OmpD的沙门氏菌引起的感染和/或疾病的疫苗组合物中的应用，所述免疫原性多肽包含下列各项或由下列各项组成(a)多肽，其是具有产生针对副伤寒沙门氏菌的抗体应答的能力的副伤寒沙门氏菌的 OmpD或其免疫原性片段；或(b)(i)中定义的多肽的变体，所述变体具有所述能力。
22.权利要求21所述的应用，其中所述疫苗组合物用于治疗或预防副伤寒沙门氏菌感染和/或疾病。
23.一种疫苗组合物，其提供根据权利要求19或权利要求20所述的免疫原性多肽并包含佐剂。
24.根据权利要求23所述的疫苗，其中所述佐剂提供处于权利要求5或权利要求6所述的融合蛋白形式的免疫原性多肽，并且所述疫苗任选地包含一种或多种附加的免疫原性多肽，诸如权利要求17所述的那些。
25.根据权利要求14-18和权利要求23- 中任一项所述的疫苗，其中所述免疫原性多肽由多核苷酸表达。
全文摘要
提议非伤寒类沙门氏菌(NTS)的OmpD，例如可来自鼠伤寒沙门氏菌，和其免疫原性片段用于治疗或预防NTS感染和/或疾病。目前还有兴趣将副伤寒沙门氏菌的OmpD及其片段用于疫苗用途。
文档编号C07K14/255GK102209724SQ200980144536
公开日2011年10月5日 申请日期2009年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者亚当·坎宁安 申请人:伯明翰大学