专利名称：缺乏功能性ii组荚膜基因簇的大肠埃希氏菌bl21菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠埃希氏菌(fecAericAia coli, E. coli)基因组的操作，改进的非致病性五coli B菌株及其用于生产肽和蛋白质的用途。
背景技术：
细菌已经被用于生产很多商业产品。遗传工程化的细菌，如五C^i，作为宿主细胞，在实验室和产业中用于生产生物试剂如肽和核酸的用途在现有技术中是公知的。自然环境中的细菌暴露于很多在标准工业化或实验室生长正常情况下不会经历的条件，因此它们的基因组携带了大量条件依赖性、压力诱导的基因，或换言之，非必须的基因，这些基因在这些有机体的工业化或实验室用途中可能不需要，或者可能甚至是不想要的。细菌病原含有致病因子，例如细胞表面的荚膜多糖，介导细菌及其邻近环境的相互作用，并且具有一些与其致病性直接相关的功能。五coli中已经发现了超过80个血清学和化学性质上不同类型的多糖荚膜，并且称为K抗原。这些多糖荚膜分为4组，其中 II组荚膜多糖与流感嗜血杆菌GyaewoMiAz1S influenzae)和脑膜炎奈瑟氏菌(Afei^eria ffiwi/^iiii/M)的荚膜多糖类似。II组荚膜基因簇含有大部分与侵入性疾病相关的荚膜类型，并具有含有三个功能区域的保守的遗传组织。在Π组基因簇中，区域1和3为保守区域，编码将多糖从其合成的位点转运到细胞表面必需的肽，而区域2为血清型特异性，编码负责生物合成和单个单糖聚合的酶类，包含特定的多糖。区域1含有6个基因kpsFEDUCS, 组织在单个转录单元中。区域2为血清型特异性，在II组抗原不同。区域3含有2个基因如j和如S7，组织在单个转录单元中[Andreishcheva等人Gene (2006) 384: 113-119]。E. cWi菌株K-12和B为非包膜的细菌，为肽生产通常使用的菌株。五coli K-12基因组已经完全测序，不含任何荚膜基因。已经发现，高产量表达重组肽优选的菌株五 coli B BL21(DE3)，含有一簇编码II组荚膜多糖的基因，并且认为五coli B的祖先一定已经通过横向转移获得了这些荚膜基因。在含有基因功能形式的菌株中，位于五⑶Iil 膜的K抗原经常与致病性表型相关。已经证明在五coli B BL21中，II组荚膜基因簇的区域2通过插入元件(ISl)失活，阻止抗原产生，而支持野生型荚膜抗原转运和呈递的区域 1和3仍然完整[Andreishcheva等人Gene (2006) 384: 113-119]。但是，仍然存在重建功能性II组荚膜基因簇的理论可能性，例如，如果区域2的ISl丢失则II组基因簇就可以重建。或者，如果ISl突变的区域与外源野生型区域2交换，则II组基因簇也可以重建。本发明提供了永久性敲除(KO) II组荚膜基因簇的五coli B BL21 (DE3)菌株， 使该菌株达到其他商品化的重要菌株如五coli K-12同样的安全等级。
发明内容
本发明涉及具有不可逆失活的II组荚膜基因簇的五coli B BL21菌株。在一个实施方式中，五cWi B BL21菌株特征为具有II组荚膜基因簇的全部或部分缺失。在一个实施方式中，五cWi B BL21菌株特征为具有II组荚膜基因簇的全部缺失。在一个实施方式中，五coli B BL21菌株特征为具有II组荚膜基因簇的部分缺失。在另一个实施方式中，五C^i B BL21菌株特征为在II组荚膜基因簇中具有一个或多个点突变。在另一个实施方式中，五COli菌株特征为具有至少5%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。在另一个实施方式中，五coli菌株特征为具有至少25%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。在另一个实施方式中，五coli菌株特征为具有至少40%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。在另一个实施方式中，五coli菌株特征为具有至少55%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。在另一个实施方式中，E. coli菌株特征为具有75%到100%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。在另一个实施方式中，五coli菌株特征为具有至少85%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。在另一个实施方式中，五coli菌株特征为具有至少95%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。在一个实施方式中，30%的II组荚膜基因簇被缺失。在另一个实施方式中，50%的II组荚膜基因簇被缺失。在另一个实施方式中，70%的II组荚膜基因簇被缺失。在另一个实施方式中，80%的II组荚膜基因簇被缺失。在另一个实施方式中，90%的II组荚膜基因簇被缺失。在一个实施方式中，五cWi菌株为五cWi B BL21(DE3)，并且在另一个实施方式中五 coli 菌株为五 coli B {W ,)AdadX Aalr0本发明还涉及生产五coli B菌株的方法，其中II组荚膜基因簇采用包含下列步骤的方法被缺失
a.使用选择标记替换II组荚膜基因簇，
b.消除选择标记，并
c.通过PCR分析确认缺失。在一个实施方式中，选择标记为抗生素抗性基因。在另一个实施方式中，抗生素抗性基因选自氯霉素、四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、万古霉素和红霉素。在还另一个实施方式中，抗生素抗性基因是氯霉素。本发明还涉及通过在本发明的五coli菌株中引入包含编码肽的DNA序列的表达载体生产肽的方法。
在一个实施方式中，本发明还涉及生产肽的方法，包括在适当的培养基中，在用于编码所述肽的DNA表达的条件下，培养根据本发明的五coli B菌株。表达载体所要表达的肽可以是任何能够在五⑶中表达的肽。这些肽代表性的实例为hGH，胰高血糖素样肽，白细胞介素、胰岛素类似物，野生型脂联素、FGF-21、胰蛋白酶、抑肽酶、支链淀粉和瘦蛋白及其类似物，以及酶类如唾液酸酶、转谷氨酰胺酶(tfese)、HRV (人类鼻病毒)3C蛋白酶、 烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶及其变体。在一个实施方式中，本发明的五coli菌株含有包含编码肽的DNA序列的表达载体。在一个实施方式中，所要生产的肽为hGH。在另一个实施方式中，所要生产的肽为FGF-21。在另一个实施方式中，所要生产的肽为支链淀粉。在另一个实施方式中，所要生产的肽为瘦蛋白。在另一个实施方式中，所要生产的肽为唾液酸酶。
图1显示具有非编码侧翼区的五coli B BL21(DE3)荚膜基因簇的遗传组织结构 (orgnisation)。BBL21(DE3)荚膜基因簇的开放阅读框(ORFs)(大箭头)，转录方向(箭头指向)区域1基因(灰色箭头)；区域2 ORFs (黑色箭头)；区域3基因(白色箭头)；IS1元件 (白色盒子)[Andreishcheva等人Gene (2006) 384: 113-119]。小箭头表示非编码左臂 (LA)和右臂(RA)的位置。图2是II组荚膜基因簇敲除方法的工作流程示意图a)用抗生素抗性基因替换 II组荚膜基因簇和b)消除抗生素抗性基因。图3显示敲除候选的PCR筛选。在敲除候选(但不是其母体菌株(BL或D))中扩增出正确大小的1696bp (LA+部分cat，上图A1-A3，下图B1-B3)和1578bp (LA+部分cat，上图A1-A3，下图B1-B3)片段表示成功敲除II组基因簇。对于阴性对照，仅母体菌株具有约31Λ的条带，而II组敲除菌株没有。BL为BL21 (DE)菌株标准对照，D为 BL21 {mi)AdadXAalr菌株的标准对照。A1-A3为BL21 (DE3)敲除候选的不同的菌落编号， B1-B3 为 BL21 {Wi)AdadXAalr 的敲除候选。图4为摇瓶中宿主五cWi i 菌株生长比较。所用的符号指下列菌株 , BL21(DE3) ； □，BL21 (DE3)zl (kpsM~kpsF) ； ，BL21(DE3) AdadX Aalr; Δ, BL21 (Μ ,)AdadX AalrA (kpsM-kpsF)。图5显示不同五coli B菌株的发酵生长曲线。所用的符号指下列菌株 ，BL21(DE3) ； □，BL21 (DE3)zl (kpsM-kpsF) ；，BL21(DE3) pNNCl-g/ 〇，
BL21 (DE3)zl (kpsM-kpsF)/^Μ^Υ-黾。图6显示不同诱导时间hGH表达的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):a)A. coli B BL21 (DE3) /pNNC-lg 中的表达和 coli B BL21 (DE3)zl (kpsM-kpsF) /pNNCl-g 中的表达。在a)和b)中，泳道1-3表示不同浓度的hGH:分别为5yg、2. 5yg和1.25yg。泳道 4表示诱导前的hGH表达，泳道5-14表示1-10小时不同诱导时间每小时的hGH的表达。所有的样品都相对同样的上样OD进行标准化。
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图7显示了诱导hGH表达前后不同五coli B菌株的生长。所用的符号指下列菌株BL21(DE3)zli/ai/i21a/r/pNNCl-lh; □ WJlXAdadXAalrA (kpsM~kpsF)/pNNCl-lh； Δ, BL21(DE3)zli/ao^zla/r/pNNCl-lh 诱导的； ，BL21众 pNNCl-lh诱导的。图8显示SDS-PAGE分析的不同诱导时间的hGH表达a) Ε. coli B BL21 (M^)AdadXAalr /pNNCl-lh; b) Ε. coli B BL21 {W ,)AdadXAalrA (kpsM~kpsF) / pNNCl-lh。在a)和b)中，泳道1-3显示不同浓度的hGH的表达，分别为5 μ g，2. 5 μ g禾口 1. 25 μ g。泳道4表示诱导前的hGH表达，泳道5-13表示1_9小时的不同诱导时间每小时的hGH的表达。所有的样品都相对同样的上样OD进行标准化。图9显示在FDM1-2培养基中高细胞密度发酵中五coli B BL21 (M^)AdadXAalrA (kpsM-kpsF) /pNNCla. 23 的生长曲线。当细胞密度达到 70 OD600 时， 加入终浓度为0. 2mM的IPTG，诱导hGH突变体MEAE_hGH(LlOlC)的表达，并在25°C继续培养。8小时诱导后最终细胞密度达到大约100 OD6tltl。图10显示高细胞密度发酵期间MEAE-hGH (LlOlC)的表达。泳道1 标记；泳道2_4 作为标准品的纯化的hGH，浓度分别为5、2. 5,1. 25 yg ；泳道5_13 分别诱导0、1、2、3、4、5、 6、7和8小时后，不同时间间隔取样的样品。箭头表示目标蛋白MEAE-hGH(LlOlC)。图 11 显示五 coli B BL21(DE3)zl 众中表达产脲节杆菌 UriAro^cier rea/acie/^)唾液酸酶的发酵样品的SDS-PAGE分析。泳道1 标记；泳道2 诱导前，勻浆； 泳道3 诱导后，勻浆；泳道4 最终样品，勻浆；泳道5 诱导前，不溶组分；泳道6 诱导后， 不溶组分；泳道7 最终样品，不溶组分；泳道8 诱导前，可溶组分；泳道9 诱导后，可溶组分；泳道10 最终样品，可溶组分；泳道11-12 唾液酸酶标准品(150和300mg/l)。所有样品IOX稀释。图12显示来源于智人GXsa^ieas)的FGF21、支链淀粉和瘦蛋白在￡ coli B BL21 DE3 和五 coli B BL21 Ε3Α (kpsM-kpsF)中的表达。泳道 1 标记；泳道 3-8 :BL21 DE3 中的表达；泳道9-14 :BL21 Ε3Α (kpsM-kpsF)中的表达；泳道3和9 未诱导；泳道4和10 诱导的FGF21 ；泳道5和11 未诱导；泳道6和12 诱导的支链淀粉；泳道7和13 未诱导； 泳道8和14 诱导的瘦蛋白。
具体实施例方式本发明涉及具有不可逆失活的II组荚膜基因簇的五coli B BL21菌株，其提供了生产肽的永久性安全的菌株。野生型或任何其他五coli B BL21(DE3)菌株的II组荚膜基因簇的损伤或失活， 可以通过任何适当的技术包括缺失整个基因簇或其部分缺失或通过基因簇中一个或多个点突变来实现。相比在工业上通常使用的菌株例如五coli K-12，本发明的五coli菌株优点在于提供更耐久的(robust)和高产量的生产肽的方法。本发明使用的五cWi B BL21(DE3)可以是如TO2008/025744中所述的双敲除 (2XK0)菌株。此五coli B BL21(DE3)菌株缺失了 Wr和山说两个基因，这两个基因均编码D，L-丙氨酸消旋酶。不向生长培养基中加入D-丙氨酸或质粒上不存在消旋酶之一(可以提供必需的D-丙氨酸)，此双敲除菌株就不能生长。此2XKO的D-丙氨酸营养缺陷型五 coli菌株，本说明书中称为五coli B BL21(DE3) ΔWrAifeiZT,能够进行非抗生素的选择操作来保持细胞中的质粒。在本发明的一个实施方式中，野生型五coli B BL21(DE3)或五coli B BL21(DE3) t,alrt,dadX菌株的II组荚膜基因簇内一个或多个基因被缺失。Studier和 Moffat [J. Mol. Biol. (1986)遲113-130]，以及 Studier 等[Methods in Enzymology (1990) 185:60-89]描述了五 co/i 菌株 B BL21 (DE3)，可以从 Mratagene 和 Novagen 得到。在本发明的一个实施方式中，野生型五coli B BL21(DE3)菌株的II组荚膜基因簇内一个或多个基因被缺失。在本发明的另一个实施方式中，五coli B BL21(DE3) Aah Δ /Ζ菌株的II组荚膜基因簇内一个或多个基因被缺失。在另一个实施方式中，II组荚膜基因簇中缺失基因所选择的基因或多个基因是那些负责潜在病原性的基因。整个161Λ的II组荚膜基因的缺失提供了防止致病性荚膜表型潜在的重建。图1显示荚膜菌株的II组荚膜基因簇中涉及的基因，包括区域1基因 kpsFEDUCS，^M2 0RF1-4和区域故/？^和如·^。这些基因的任何一个或其组合都可以被缺失。II组荚膜基因簇的完全缺失意味着3个区域的缺失，即」(kpsM-kpsF)。所获得的五 coli B 菌株为五 coli B BL21 (DE3)」众禾口五 coli B BL21(DE3) Kalr KdadX Δ (kpsM-kpsF) 0在一个实施方式中，本发明涉及除了插入元件(ISl)之外，任何足以使II组基因簇失活的修饰。细菌是单倍体有机体，即它们仅有一个染色体，因此仅从环境中获得新的DNA例如通过转化时才发生重组。并且，细菌不容易被线性DNA转化，例如因为细胞内的外切核酸酶会降解线性DNA。但是，易重组的突变体缺少重组复合体的外切核酸酶，能够被线性DNA 转化。重组酶为催化天然重组反应的酶类，已经证明λ Red相比其他重组系统显示出增强的重组率。缺失本发明菌株的II组荚膜基因簇的方法可以基于Datsenko和Warmer开发的Red-介导的重组技术K2000) PNAS 97(12) 6640-6645]或其他传统方法。图2显示了如何缺失本发明菌株的161Λ的II组荚膜基因簇的示意图。在一个实施方式中，方法的第一步是通过PCR，通过使用具有核酸同源性延伸或同源性区域的引物 RA和LA(参见图1)，产生用选择标记替换161Λ的II组荚膜基因簇。这通过在这些侧翼同源延伸中进行Red介导的重组来实现。选择后，本方法的第二步是通过使用表达FLP重组酶的辅助质粒消除选择标记，所述重组酶作用于选择标记侧翼的直接重复的FRT (FLP识别目标)位点。Red和FLP辅助质粒通过在37°C生长后消除(cured)，因为它们是温度敏感的复制子。第三步包括用PCR分析验证缺失。细菌转化可以称为通过吸收DNA带来的稳定的遗传变化，感受态指能够吸收外源 DNA的状态。一些细菌在实验室条件下天然地能够吸收DNA，这些菌种携带负责使DNA通过细胞膜或多层膜的机制的基因集合，而其他细菌必须通过实验室操作被诱导，在所述实验室操作中使用自然界通常不发生的条件使细胞被动地变得可通透DNA。在存在二价阳离子， 例如Ca2+ (在CaCl2中)的条件下制备冷却的(chilling)细胞，使细胞壁变得可以通透质粒DNA。细胞在冰上与DNA共同孵育，然后短暂热激(例如42°C，30-120秒)，使DNA进入细胞，这是现有技术中公知的方法[Sambrook等人，A Laboratory Manual (1989) CSH]。电转化是在细菌(及其他)细胞上打孔的另一个方法，其通过用kV范围电场短暂电击这些细胞来进行。质粒DNA可以通过这些孔进入细胞。该方法可以用于大的质粒DNA。天然的膜修复机制将在电击后快速关闭这些孔。为了维持并在细胞内稳定保持，质粒DNA分子必须含有复制起始点，使其在细胞内独立于染色体进行复制。当使用任何本说明书描述的基因失活方法时，II组基因簇的部分或全部的任何靶向失活都通过选择标记检测，从而可以鉴定并分离被修饰的五coli B BL21菌株克隆。选择标记可以是任何适当的标记基因，例如抗生素抗性基因或营养缺陷型标记。适当的抗生素抗性基因为氯霉素、四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、万古霉素和红霉素、或者内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类或大环内酯类抗生素的任何其他代表。本说明书使用的术语“克隆”需要制造DNA序列的多个同样的拷贝。然后将目标 DNA序列插入克隆载体。因为此载体来源于自我复制的病毒、质粒或高等有机体细胞，当适当大小的DNA插入后，“目标和载体DNA片段随即连接”并产生重组的DNA分子。重组的DNA 分子随后导入细菌菌株(通常为五⑶7i)，在转化后产生多个同样的拷贝。转化是细菌进行的DNA吸收机制。但是，在单个细菌细胞内仅一个具有特定复制起始点的重组DNA分子能够确立，因此每个克隆仅含有一个DNA插入。本说明书所使用的术语“基因组”或“遗传组成”指整个遗传物质，包括结构性和功能性，其是可遗传的和/或可转移的，并且包含在鉴定的细胞或微生物中。微生物的基因组(遗传组成)从而理解为包括染色体DNA和染色体外DNA (例如，质粒、R因子等)。本说明书所使用的术语“约”意味着在所述的数值的合理范围内，例如加或减10%。本说明书所使用的术语“敲除”指遗传工程化的细菌菌株，其中一个或多个基因被缺失或失活(被从机体中“敲除”)。敲除有机体通常用作研究已经被测序但功能未知的基因功能的模型。敲除技术可以用于从感兴趣的有机体中移除不希望和/或潜在致病性的基因。本说明书所使用的术语“基因簇”意思是一组遗传上或功能上偶联的两个或多个基因。因为来自于共同祖先的群体倾向于具有相同基因簇的变体，因此它们可以用于回溯最近的进化历史。术语“母本菌株，，可以是任何基因组减少的菌株来源的细菌菌株。根据本发明的母本菌株的代表性例子包括但不限于五cWi菌株例如B或C，或与其基因组序列基本相同的菌株。本说明书所使用的术语在给定的细菌宿主细胞中产生的肽的“水平”或“量”可以指根据所选择的生产方法对细胞培养基中存在或可检测的肽的定量测量。例如，如果所选择的肽的生产方法造成肽在细胞自身内的累积，则所产生的肽的水平或量将为在细胞自身内存在的肽的定量测量。如果肽生产方法包括肽的分泌，则所产生的肽的水平将为生长培养基中存在的肽的定量测量。本说明书所使用的术语肽的“产量”指基本上纯的肽的定量的量，其中肽被回收和 /或纯化，基本上不含有宿主菌株相关的天然肽。为了确定细菌宿主细胞例如五coli B BL21菌株产生的定量的“产量”或“量”，可以使用常规的肽特异性的方法，例如免疫测定、高效液相色谱(HPLC)、酶活、分光光度计技术、SDS-PAGE等。本说明书所使用的术语“表达对照序列”指引导与其可操作连接的核酸的转录的启动子或转录因子结合位点的阵列。双链核酸所使用的术语“游离末端”可以指带有平游离末端或粘性游离末端的线性的核酸或其组合。本说明书所使用的术语“基因”指包含编码多肽或其前体的核酸序列的核酸(例如，DNA或RNA)。多肽可以由全长编码序列编码或通过编码序列的任何部分编码，只要保留全长或片段的所期望的活性或功能性质(例如酶活、配体结合、信号转导、抗原性等)。术语还包括位于临近5’和3’末端上的编码区的序列，其有助于基因转录成全长mRNA。术语 “基因”包含基因的cDNA和染色体形式。基因的染色体形式或克隆可以包含被所定义的非编码序列(例如内含子)打断的编码区域。当用于指将核酸加入菌株时，术语“导入”或“被导入”意思是在菌株内核酸可以整合到菌株的染色体或包含在载体上，例如质粒。本说明书所使用的术语“开放阅读框”或“0RF”指不含终止子的遗传序列。术语“肽”、“多肽”或“蛋白”在本说明书中可以互换使用，意思是无论天然还是重组的肽、多肽和蛋白，及其片段、衍生物、同源物、变体和融合蛋白等。II组敲除菌株的生长在摇瓶中和高密度发酵罐中评价，并与其母本菌株比较。实验显示在每种菌株背景下，II组基因敲除不影响细胞生长。将含有多个肽的表达载体转化到II组缺失的菌株中用于在高密度发酵罐中进行表达测试。在一个实施方式中，在本发明￡ cWi B菌株中生产的肽可以选自但不限于hGH、 胰高血糖素样肽、白细胞介素、胰岛素类似物、野生型脂联素、FGF-21、胰蛋白酶、抑肽酶、支链淀粉和瘦蛋白及其类似物。酶类例如唾液酸酶、转谷氨酰胺酶(tfese)、HRV (人类鼻病毒)3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶及其变体，以及任何其他肽或其表达系统可以在 E. coli中操作的肽。本发明还涉及制备如上所述人类的肽的方法。通常，将克隆的野生型肽的核酸序列修饰成编码所期望的蛋白。然后将该修饰的序列插入表达载体，之后转化或转染到宿主细胞中。可操作的表达系统一般包括Mudier和Moffat [J. Mol. Biol. (1986) 189:113-130]以及 Studier 等人[Methods in Enzymology (1990) 185:60-89]描述的常规的基因表达成分。宿主细胞中要生产的肽可以作为融合肽合成，分泌到培养基中或进入周质空间， 以游离形式产生在细胞质内，或累积在细胞内小体内，例如包涵体。肽的纯化类似地包括使用上述常规的、公开可获得的方法，其再次通过常规技术改造后用于感兴趣的肽。本发明适合生产任何类型的肽。在一个实施方式中，选择在II组敲除的五cWi B BL21宿主细胞中生产的肽为人生长激素(hGH)，以及在一个实施方式中，人生长激素(hGH)如EP217814中描述从前体肽生产，EP217814描述了如何从hGH前体制备hGH。在进一步的实施方式中，生长激素为MEAE (SEQ ID 16)-hGH(LlOlC)，其为hGH类似物的前体，其中hGH分子中第101位亮氨酸被半胱氨酸替换。在另一个实施方式中，胰高血糖素样肽为GLP-1、GLP_1和/或其衍生物。
本说明书所使用的术语“胰高血糖素样肽”意思是胰高血糖素家族的肽、各种胰高血糖素样肽的抑制剂(exendin)及其类似物。胰高血糖素家族的肽由前胰高血糖素基因编码并包含三个高度同源的小肽，即胰高血糖素(1-29)、GLP-I (1-37)和GLP-2 (1-33)。 Exendin是在蜥蜴中表达的肽，类似于GLP-I是促胰岛素的。Exendin的实例为exendin-3 禾口 exendin-4。本说明书所使用的术语“胰高血糖素样肽类似物”指修饰的胰高血糖素样肽，其中胰高血糖素样肽的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基替换，和/或其中一个或多个氨基酸残基从胰高血糖素样肽中缺失，和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加到胰高血糖素样肽。这种氨基酸残基的增加或缺失可以在肽的任何位置发生。实验部分
对于菌株的甘油原种(Stock)的制备，将单克隆转移到含有2ml具有适当抗生素的LB 培养基的12ml测试管中，在37°C下生长，并以220rpm振荡2小时。对于发酵接种物的制备，来自于甘油原种的细胞在加入和不加入氨苄青霉素的LB 平板上划线。过夜的细胞用LB培养基洗涤并接种到含IOOml每种发酵复合培养基具有适当的抗生素浓度的500ml摇瓶中，并在37°C下生长，并以220rpm振荡3_4小时。然后将细胞接种到反应器中，至浓度大约0.5 OD6000在51生物反应器内在有氧条件下进行发酵，发酵复合培养基初始体积为2. 51，并含有适当的抗生素。在零时间点，向反应器内接种至0D_大约0.5。用5N NHjPH2SO4保持 PH在7. 0，并在发酵期间，以6ml/min的恒定空气流速使空气通过培养物。温度保持37°C。 通过保持溶氧水平直至饱和A的20%对搅拌进行级联控制。进行分批补料试验来比较II组缺失菌株与其母本菌株在高密度发酵罐内的生长和肽表达情况。发酵罐加入添加27g/l甘油的复合培养基。在零时间点，向发酵罐内接种至0. 5的0D·。当基础甘油被消耗时，在补料步骤(increasing steps)中连续加入甘油和酵母提取物，通过溶氧增加指示甘油的消耗。从发酵罐中收集用于测定OD6tltl和蛋白表达的样品并用分光光度计和SDS-PAGE进行分析。在细菌中诱导蛋白表达是公知的现有技术。在本发明中，蛋白表达的诱导通过加入异丙基-β-D -硫代半乳糖苷(IPTG)来进行。在本发明的某些实施方式中使用的质粒和菌株分别列举在表1和2中。使用 Sambrook等人[A Laboratory Manual (1989) CSH]描述的标准分子生物学技术进行质粒的构建。表1实施例中使用的质粒
权利要求
1.一种大肠埃希氏菌(及COli )B BL21菌株，其特征在于具有不可逆失活的II组荚膜基因簇。
2.根据权利要求1的大肠埃希氏菌BBL21菌株，其特征在于具有II组荚膜基因簇的全部或部分缺失。
3.根据权利要求1的大肠埃希氏菌BBL21菌株，其特征在于具有II组荚膜基因簇的全部缺失。
4.根据任一前述权利要求的大肠埃希氏菌BBL21菌株，其中所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌B BL21 (DE3)。
5.根据权利要求1-3任一项的大肠埃希氏菌菌株，其中所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌 B BL21
6.根据任一前述权利要求的大肠埃希氏菌BBL21菌株，其中所述菌株进一步包含具有插入的编码肽的DNA序列的表达载体。
7.根据任一前述权利要求的大肠埃希氏菌BBL21菌株，其中所述肽选自hGH、胰高血糖素样肽、白细胞介素、胰岛素类似物、野生型脂联素、FGF-21、胰蛋白酶、抑肽酶、支链淀粉和瘦蛋白及其类似物以及酶类，如唾液酸酶、转谷氨酰胺酶(tfese)、HRV (人类鼻病毒)3C 蛋白酶、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶及其变体。
8.—种生产根据任一前述权利要求的大肠埃希氏菌B菌株的方法，其中所述II组荚膜基因簇采用包含下列步骤的方法被删除a.使用选择标记替换II组荚膜基因簇，b.消除所述选择标记，并c.通过PCR分析确认删除。
9.根据权利要求8的生产大肠埃希氏菌B菌株的方法，其中所述选择标记为抗生素抗性基因。
10.根据权利要求9的生产大肠埃希氏菌B菌株的方法，其中所述抗生素抗性基因选自氯霉素、四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、万古霉素和红霉素。
11.根据权利要求9的生产大肠埃希氏菌B菌株的方法，其中所述抗生素为氯霉素。
12.—种生产肽的方法，其包括在适当的培养基中培养根据权利要求1-7任一项的大肠埃希氏菌B菌株，然后通过公知技术分离并纯化表达的肽。
13.根据权利要求12的方法，其中所述肽为hGH。
14.根据权利要求12的方法，其中所述肽为FGF-21。
15.根据权利要求12的方法，其中所述肽为支链淀粉。
全文摘要
本发明涉及含有II组荚膜基因簇缺失的新的非致病性大肠埃希氏菌(E.coli)BBL21菌株，及其用于生产肽的用途。
文档编号C07K14/61GK102209725SQ200980144718
公开日2011年10月5日 申请日期2009年11月10日 优先权日2008年11月10日
发明者H·F·韦尔迪克, J·苏, J·邓, X·赵, Y·刘 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司