专利名称：调控果实和种子发育的蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及调控果实和种子发育的蛋白及其应用。
背景技术：
茄科(Solanaceae)是双子叶植物纲菊亚纲有花植物中较为进化的一群，草本、灌木或小乔木；叶互生或在开花枝段上有大小不等的二叶双生，全缘或各式的分裂或为复叶， 无托叶；花两性或稀杂性，辐射对称，单生或排成聚伞花序或花束；萼5裂或截平形，常宿存；花冠合瓣，形状种种，裂片5，常折叠；雄蕊5，稀4枚，着生于冠管上；子房2室，或不完全的1-4室，2心皮不位于正中线上而偏斜，中轴胎座有胚珠极多数，很少为1枚；胚珠倒生、 弯生或横生；果为浆果或蒴果；种子圆盘形或肾形，有肉质而丰富的胚乳；胚弯曲成钩状、 环状或螺旋状卷曲，位于周边而埋藏于胚乳中，或直而位于中轴上。番茄为茄科茄属的草本植物，是世界上重要蔬菜作物之一，其味甘、酸，性微寒。除大家熟知的含有大量的维生素有美容的功效外，还对于许多疾病有缓解或治疗作用当前番茄品种繁多，不同番茄品种果实的特征特性相差悬殊，系统的研究报道不多。在实际生产中，番茄的种植往往缺乏有效管理，导致获得的果实大小不一、口味不稳定， 影响其市场价值。鉴于人们对于番茄的喜爱，培育出小果实或大果实品种的番茄是有很大的经济价值的，例如樱桃番茄是近年新兴发展起来的一种水果蔬菜，其果实圆整，大小均勻，果味浓郁，味甜爽口而深受人们的喜爱；其还适宜庭院栽种或盆栽，作为景观植物。此夕卜，培育出小型的番茄果实也可为包装和食用带来方便；并且，种子变小的番茄在口感上要优于一般的番茄。目前，番茄的主要选育方式还局限于传统方法，选育时间漫长且效率低，采用基因工程技术对番茄进行品种改良的报导还不多。因此，有必要研究调控番茄果实以及种子大小的基因，从而实现对番茄的品种改良，开发出具有经济价值或观赏价值的植物。
发明内容
本发明的目的在于提供调控果实或种子性状的蛋白及其应用。本发明的目的还在于提供一种调控茄科植物果实或种子的性状的方法以及由所述方法获得的植物。在本发明的第一方面，提供一种ENS基因(Enlarge Silique 1，果荚膨大基因1; 又称为Peapod (PPD)基因；或称为ENS-PPD基因)或ENS蛋白的用途，用于调控茄科植物果实或种子发育，改变果实和种子的性状或形态(如大小)。在一个优选例中，所述的ENS基因或ENS蛋白来源于十字花科植物。在另一优选例中，所述的十字花科植物是拟南芥。在另一优选例中，所述的茄科植物是茄科茄属植物。较佳地，所述的茄科茄属植物是番茄。在另一优选例中，所述的调控茄科植物果实或种子的性状包括调控果实的大小或重量；调控种子的大小或重量；或调控果实的心皮壁厚度。在另一优选例中，所述的ENS基因或ENS蛋白促进果实变小或降低果实重量；促进种子变小或降低种子重量；或降低果实的心皮壁厚度。在另一优选例中，所述的ENS蛋白是(a)SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白；或 (b)将SEQ ID NO 2氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；较佳地1_10个；更佳地1_5 个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由 (a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有90% (较佳地95% ；更佳地98% ；更佳地99%)以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。在另一优选例中，所述的ENS基因编码ENS蛋白；较佳地，所述的ENS基因编码SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白。更佳地，所述的ENS基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供一种调控茄科植物果实或种子的性状的方法，所述方法包括将ENS基因转入茄科植物中，获得果实或种子的性状发生改变的植物。在一个优选例中，所述的将ENS基因转入茄科植物中的方法包括(Si)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有ENS基因序列；(S2)将茄科植物的细胞或组织或器官与步骤(Si)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子。在另一优选例中，所述方法还包括(S3)选择出转入了所述的ENS基因的植物细胞、组织、器官或种子；和(S4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物，所述植物即是果实或种子的性状发生改变的植物。在另一优选例中，所述的调控茄科植物果实或种子的性状包括促进果实变小或降低果实重量；促进种子变小或降低种子重量；或降低果实的心皮壁厚度。另一方面，提供一种植物，所述的植物是转入了 ENS基因的转基因植物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是 显而易见的。
图1显示了拟南芥ENS基因在转基因番茄植株中的半定量RT-PCR检测。其中CK 为非转基因番茄的cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果，1-6为转基因番茄的cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图2A显示了转基因番茄植株与非转基因番茄植株果实鲜重比较。图2B和图2C显示转基因番茄植株与非转基因番茄植株的果实照片。其中CK为非 转基因番茄，OE-I和0E-3为过表达转基因番茄。图3A-C显示了转基因番茄植株与非转基因番茄植株果实心皮壁照片；图3D显示图3A-C植株果实心皮壁厚度比较。其中CK为非转基因番茄，OE-I和0E-3为过表达转基因番茄，白色线指示果实的
心皮壁。图4A显示了转基因番茄植株与非转基因番茄植株种子大小比较。图4B-E显示转基因番茄植株与非转基因番茄植株种子。其中CK为非转基因番茄植株的种子，OE-I和0E-3为过表达转基因番茄植株的种子。
具体实施例方式鉴于现有技术中对于茄科植物果实或种子大小调控方面了解甚少，本发明人进行了深入的研究，首次揭示了一种ENS基因或ENS蛋白在调控茄科植物果实或种子大小方面的用途，其可促进茄科植物的果实或种子变小，并使得其心皮壁厚度变小。因此，可利用该基因进行茄科植物的品种改良。如本文所用，所述的“植物”包括但不限于茄科植物。较佳的，所述的茄科植物是番爺。本发明的ENS蛋白(多肽)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如， 植物、细菌、酵母)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括ENS蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的ENS蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 任何一种ENS蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，ENS蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的ENS蛋白的全部或部分功能。 通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长ENS蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长ENS蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。 在本发明中，术语“ENS蛋白”指具有ENS蛋白活性的SEQ ID NO :2序列的多肽。该术语还包括具有与ENS蛋白相同功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10 个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括ENS蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与ENS蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗 ENS蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含ENS蛋白或其片段的融合蛋白。任何与所述的ENS蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO 2所示的序列的同源性为 70%或更高；优选的，同源性为80%或更高；更优选的，同源性为90%或更高，如同源性 95%，98%或99% )的、且具有ENS蛋白相同功能 的蛋白也包括在本发明内。发明还提供ENS蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然ENS蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“ENS蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表 权利要求
1.一种ENS基因或ENS蛋白的用途，用于调控茄科植物果实或种子发育，改变果实或种子的性状或形态。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ENS基因或ENS蛋白来源于十字花科植物。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的十字花科植物是拟南芥。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的茄科植物是茄科茄属植物。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的调控茄科植物果实或种子的性状包括调控果实的大小或重量； 调控种子的大小或重量；或调控果实的心皮壁厚度。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的ENS基因或ENS蛋白 促进果实变小或降低果实重量；促进种子变小或降低种子重量；或降低果实的心皮壁厚度。
7.—种调控茄科植物果实或种子的性状的方法，所述方法包括将ENS基因转入茄科植物中，获得果实或种子的性状发生改变的植物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的将ENS基因转入茄科植物中的方法包括(51)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有ENS基因序列；(52)将茄科植物的细胞或组织或器官与步骤(Si)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括(53)选择出转入了所述的ENS基因的植物细胞、组织、器官或种子；和(54)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物，所述植物即是果实或种子的性状发生改变的植物。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的调控茄科植物果实或种子的性状包括促进果实变小或降低果实重量； 促进种子变小或降低种子重量；或降低果实的心皮壁厚度。
全文摘要
本发明涉及调控果实和种子发育的蛋白及其应用。首次揭示了ENS基因在调控茄科植物果实或种子大小方面的用途。还揭示了利用ENS基因调控茄科植物果实或种子的性状的方法。通过本发明的方法能控制番茄果实和种子的大小，快速培育出果实和种子发生改变的农作物新品种。
文档编号C07K14/415GK102260679SQ20101018495
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者关媛, 沈琦, 王玉婷, 郭房庆 申请人:中国科学院上海生命科学研究院