专利名称：一种适合双向电泳的野山参蛋白质提取方法
技术领域：
本发明属于一种蛋白质的提取方法，具体涉及一种适合于双向电泳的野山参蛋白 提取方法。
背景技术：
野山参自然生长在原始森林中，隶属于五加科人参属的草本植物。早在2000年 前，《神农本草经》中对野山参的药用价值就有了详细的记载，李时珍在《本草纲目》中称野 山参为神草。随着医学的发展，野山参所具有的神奇疗效越来越被人们所认识，在中医治疗 高血压病、冠状动脉硬化、心绞痛、糖尿病、癌症等重大疾病的处方中都少不了这位珍贵人 参，然而其药用机制却尚不明确。双向电泳技术是在蛋白水平研究基因表达产物的最有效 方法之一，有利于在分子水平上探索野山参的作用机制。同时蛋白质样品的制备是双向电 泳的关键步骤，直接影响到分离结果的有效性、可靠性及可重复性。2002年John Hon-Kei Lum等人将同属植物高丽参、西洋参采用裂解液(6mol/L尿 素、2mol/L硫脲、0. 02g/ml CHAPS,20mmol DTT)溶解样品并用冻融裂解法对蛋白进行提取， 随后利用17cm，线性pH3-10胶条对所提蛋白进行双向电泳分离，经灵敏度较高的银染后得 到高丽参、西洋参2-DE图谱中分别有382、212个点。2003年Seung II Kim等人将高丽参 采用裂解液(8mol/L尿素、0.02g/ml CHAPS,20mmol DTT)溶解样品同样应用冻融裂解法对 蛋白进行提取，随后采用18cm，线性pH3-10胶条进行了双向电泳分离，经银染后得到高丽 参发根2-DE图谱中有280个点。但是野山参中含有大量的核酸、多糖、多酚等干扰物质，应 用文献报道的蛋白提取方法不能有效的去除这些物质，因此本发明在此基础上，对蛋白提 取方法的裂解液配方进行了优化，对细胞进行了有效的破碎，从而建立了一套适合双向电 泳的野山参蛋白质提取方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合双向电泳的野山参蛋白质提取方法，为野山参的蛋 白质组学研究提供技术保障。本发明的技术方案包括以下步骤(1)取新鲜野山参，在液氮中充分研磨后，称取液氮研磨后粉末0. 15g，转移到离 心管中。(2)加入_20°C预冷的含有0.07% (ν/ν) β -巯基乙醇的丙酮溶液1ml，混勻后 于-15°C —25°C静置 l-2h，2°C _8°C、8000rpm 离心 15min，弃上清，取沉淀(3)重复步骤(2)3次，直至上清无色，室温干燥沉淀20-30min，得到蛋白粗提物。(4)将野山参蛋白提取物溶解于含有7mol/L尿素、2mol/L硫脲、0. 02g/ml CHAPS、 20mmol DTTUmmol/L PMSFU% (v/v)蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，并且野山参蛋白提取 物与裂解缓冲液的质量体积比为100mg/300l·! l-100mg/400l·! 1。(5)将加入蛋白粗提物的裂解缓冲液置于冰水混合物中，超声探头浸入样品溶液中心部，100W-200W超声20min-40min，然后在摇床上室温下震荡lh，15000rpm离心15min，
收集上清液，即可得到适合于双向电泳的野山参蛋白样品液。所述步骤⑷中野山参蛋白提取物与裂解缓冲液的质量体积比优选为 100mg/300 μ I。所述超声细胞破碎的优化条件为功率100W，时间40min。本发明的方法采用丙酮多次抽提去除色素、苯酚等干扰双向电泳杂质，裂解缓冲 液中尿素与硫脲联合应用防止了由氢键引起的蛋白质聚集及蛋白迁移中二级结构的形成， 提高了蛋白质在固相PH梯度胶条上的溶解度。要获得尽可能多的蛋白，除要实现蛋白的有 效溶解外，还要对细胞进行有效破碎。本发明的方法使用超声对细胞进行破碎，有效地提高 了人参蛋白含量，省去了沉淀、透析、冻干等蛋白浓缩步骤，减少了蛋白质的变性沉淀，能够 得到纯度较好的样品蛋白。本发明的优点在于方法快速有效，简单易行，可获得重复性好，分辨率高的电泳图 谱，有利于后续的质谱分析鉴定蛋白，为野山参的蛋白质组学研究提供了技术支撑。
图1为二十年生野山参蛋白质双向电泳图谱；图2为三十年生野山参蛋白质双向电泳图谱；图3为四十年生野山参蛋白质双向电泳图谱。具体实施方法实施例1、提取二十年生野山参蛋白质并进行双向电泳分析(1)取新鲜二十年生野山参，在液氮中充分研磨后，称取液氮研磨后粉末0. 15g， 转移到离心管中。(2)加_20°C预冷的含有0. 07% β -巯基乙醇的丙酮溶液1ml，混勻后于_15°C静 置l-2h，2°C、8000rpm离心15min，弃上清，取沉淀(3)重复步骤(2)3次，直至上清无色，室温干燥沉淀20-30min，得到蛋白粗提物。(4)将野山参蛋白提取物溶解于含有7mol尿素、2mol硫脲、0.02g/ml CHAPS、 2011111101/0)1"1\1% 10\1%植物蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液45(^1中，将样品置于冰水 混合物中，超声探头浸入样品溶液中心部，IOOff超声40min，然后在摇床上室温下震荡lh， 15000rpm离心15min，收集上清液，即可得到适合于双向电泳的野山参蛋白样品溶液。(5)通过上述方法提取的蛋白质溶液，用Bradford法定量蛋白，蛋白浓度在 3-5μδ/μ L·水化及第一向等电聚焦电泳参考GE Healthcare公司的双向电泳说明进行。 取上清液(含蛋白250 μ g)，加入再水化缓冲液(5M尿素、2M硫脲、2% CHAPS,2% SB3-10、 20mM DTT、5mM TCEP.O. 5% IPG buffer pH3_10、0. 25% IPG buffer pH4_7)，至终体积为 125μ L·选用7cm线性pH3-10的IPG干胶条，置于Erran IPGphor等电聚焦仪中，重泡胀 和等电聚焦。电泳条件为水化30V 12h ；200V电泳Ih ；500V电泳Ih ； 1000V电泳Ih ；5000V 电泳 4000Vhr。(6)将聚焦后胶条置于平衡缓冲液I(50mmol/L Tris-HCl pH8. 8，6mol/L尿素， 30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚蓝，0.01g/ml DTT)中平衡15min，然后再置于平衡缓冲液 II(50mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 8，6mol/L 尿素，30%甘油，2% SDS, 0. 002%溴酚蓝，0. 25g/ml碘乙酰胺)中平衡15min，取出后吸去表面多余的液体。放置于已聚合的12. 5%聚丙稀酰 胺凝胶胶面上，用5%的琼脂糖封顶液封闭排除气泡。进行第2向SDS-PAGE，电流IOmA/ strip, 3h。直至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘0. 5cm时停止电泳。(7)凝胶用考马斯亮蓝R-250染色后，结果如图1所示，结果表明二十年生野山参 蛋白质分离效果较好，可得到324个蛋白点。实施例2、提取三十年生野山参蛋白质并进行双向电泳分析(1)取新鲜三十年生野山参，在液氮中充分研磨后，称取液氮研磨后粉末0. 15g， 转移到离心管中。(2)加_20°C预冷的含有0. 07% β -巯基乙醇的丙酮溶液1ml，混勻后于_20°C静 置l-2h，4°C、8000rpm离心15min，弃上清，取沉淀(3)重复步骤(2)3次，直至上清无色，室温干燥沉淀20-30min，得到蛋白粗提物。(4)将野山参蛋白提取物溶解于含有7mol尿素、2mol硫脲、0.02g/ml CHAPS、 2011111101/0)1"1\1% 10\1%植物蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液45(^1中，将样品置于冰水 混合物中，超声探头浸入样品溶液中心部，IOOff超声40min，然后在摇床上室温下震荡lh， 15000rpm离心15min，收集上清液，即可得到适合于双向电泳的野山参蛋白样品溶液。(5)通过上述方法提取的蛋白质溶液，用Bradford法定量蛋白，蛋白浓度在 3-5μδ/μ L·水化及第一向等电聚焦电泳参考GE Healthcare公司的双向电泳说明进行。 取上清液(含蛋白250 μ g)，加入再水化缓冲液(5M尿素、2M硫脲、2% CHAPS,2% SB3-10、 20mM DTT、5mM TCEP.O. 5% IPG buffer pH3_10、0. 25% IPG buffer pH4_7) [18]，至终体 积为125μ1。选用7cm线性pH3-10的IPG干胶条，置于Erran IPGphor等电聚焦仪中，重 泡胀和等电聚焦。电泳条件为水化30V 12h ；200V电泳Ih ；500V电泳Ih ； 1000V电泳Ih ； 5000V 电泳 4000Vhr。(6)将聚焦后胶条置于平衡缓冲液I(50mmol/L Tris-HCl pH8. 8，6mol/L尿素， 30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚蓝，0.01g/ml DTT)中平衡15min，然后再置于平衡缓冲液 II(50mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 8，6mol/L 尿素，30%甘油，2% SDS, 0. 002%溴酚蓝，0. 25g/ml 碘乙酰胺)中平衡15min，取出后吸去表面多余的液体。放置于已聚合的12. 5%聚丙稀酰 胺凝胶胶面上，用5%的琼脂糖封顶液封闭排除气泡。进行第2向SDS-PAGE，电流IOmA/ strip, 3h。直至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘0. 5cm时停止电泳。(7)凝胶用考马斯亮蓝R-250染色后，结果如图2所示，结果表明三十年生野山参 蛋白质分离效果较好，可得到407个蛋白点。实施例3、提取四十年生野山参蛋白质并进行双向电泳分析(1)取新鲜四十年生野山参，在液氮中充分研磨后，称取液氮研磨后粉末0. 15g， 转移到离心管中。(2)加_20°C预冷的含有0. 07% β -巯基乙醇的丙酮溶液1ml，混勻后于_25°C静 置l-2h，8°C、8000rpm离心15min，弃上清，取沉淀(3)重复步骤(2)3次，直至上清无色，室温干燥沉淀20-30min，得到蛋白粗提物。(4)将野山参蛋白提取物溶解于含有7mol尿素、2mol硫脲、0.02g/ml CHAPS、 2011111101/0)1"1\1% 10\1%植物蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液45(^1中，将样品置于冰水 混合物中，超声探头浸入样品溶液中心部，100W超声40min，然后在摇床上室温下震荡lh，
515000rpm离心15min，收集上清液，即可得到适合于双向电泳的野山参蛋白样品溶液。(5)通过上述方法提取的蛋白质溶液，用Bradford法定量蛋白，蛋白浓度在 3-5μδ/μ L·水化及第一向等电聚焦电泳参考GE Healthcare公司的双向电泳说明进行。 取上清液(含蛋白250 μ g)，加入再水化缓冲液(5M尿素、2M硫脲、2% CHAPS,2% SB3-10、 20mM DTT、5mM TCEP.O. 5% IPG buffer pH3_10、0. 25% IPG buffer pH4_7) [18]，至终体 积为125μ1。选用7cm线性pH3-10的IPG干胶条，置于Erran IPGphor等电聚焦仪中，重 泡胀和等电聚焦。电泳条件为水化30V 12h ；200V电泳Ih ；500V电泳Ih ； 1000V电泳Ih ； 5000V 电泳 4000Vhr。(6)将聚焦后胶条置于平衡缓冲液I(50mmol/LTriS-HCl pHS. 8，6mol/L尿素， 30%甘油，2% SDS，0. 002%溴酚蓝，0.01g/ml DTT)中平衡15min，然后再置于平衡缓冲液 II(50mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 8，6mol/L 尿素，30%甘油，2% SDS, 0. 002%溴酚蓝，0. 25g/ml 碘乙酰胺)中平衡15min，取出后吸去表面多余的液体。放置于已聚合的12. 5%聚丙稀酰 胺凝胶胶面上，用5%的琼脂糖封顶液封闭排除气泡。进行第2向SDS-PAGE，电流IOmA/ strip, 3h。直至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘0. 5cm时停止电泳。(7)凝胶用考马斯亮蓝R-250染色后，结果如图3所示，结果表明四十年生野山参 蛋白质分离效果较好，可得到433个蛋白点。
权利要求
一种适合双向电泳的野山参蛋白质提取方法，其特征是具体步骤如下(1)取新鲜野山参，在液氮中充分研磨后，称取液氮研磨后粉末0.15g，转移到离心管中；(2)加入 20℃预冷的含有0.07％(v/v)β 巯基乙醇的丙酮溶液1ml，混匀后于 15℃ 25℃静置1 2h，2℃ 8℃、8000rpm离心15min，弃上清，取沉淀；(3)重复步骤(2)3次，直至上清无色，室温干燥沉淀20 30min，得到蛋白粗提物；(4)将野山参蛋白粗提物溶解于含有7mol/L尿素、2mol/L硫脲、0.02g/ml CHAPS、20mmol DTT、1mmol/L PMSF、1％(v/v)蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，并且野山参蛋白提取物与裂解缓冲液的质量体积比为100mg/300μl 100mg/400μl；(5)将加入蛋白粗提物的裂解缓冲液置于冰水混合物中，超声探头浸入样品溶液中心部，100W 200W超声20min 40min，然后在摇床上室温下震荡1h，15000rpm离心15min，收集上清液，即得到适合于双向电泳的野山参蛋白样品液。
2.按照权利要求1所述的提取方法，其特征是所述步骤(4)中野山参蛋白提取物与裂 解缓冲液的质量体积比为100mg/300l·! 1，超声细胞破碎的条件为功率100W，时间40min。
全文摘要
本发明公开了一种适合双向电泳的野山参蛋白质提取方法。以野山参为试材，在液氮中充分研磨后，转移到离心管中。加-20℃预冷的丙酮溶液，洗涤样品粉末3次，离心收集沉淀，在室温干燥20min，得到野山参蛋白粗提物。再将野山参蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液中，进行超声细胞破碎，离心取上清，即可获得高质量的野山参蛋白溶液。本发明提取的野山参蛋白用于双向电泳的方法简单、快速，可获得重复性好，分辨率高的电泳图谱，有利于后续的质谱分析鉴定蛋白，为野山参的蛋白质组学研究提供了技术支撑。
文档编号C07K1/14GK101906130SQ201010219048
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者冯凯, 姜锐, 孙立伟, 麻锐 申请人:北华大学