专利名称：一种己烯雌酚抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及抗体的制备领域，具体涉及一种己烯雌酚抗体的制备方法。
背景技术：
己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)是一种人工合成雌激素。化学名为1，2_双 (4-羟苯基)-1，2_ 二乙基乙烯。其物理性质为无色结晶或白色结晶性粉末，在乙醇、乙醚、 氯仿、脂肪油或强碱溶液中溶解，在水中几乎不溶。化学结构见式(I)。 式(I)DES可以增加动物的体重和蛋白质沉积，而减少脂肪的沉积。在农业上曾经被用作 促生长剂。由于DES有致癌以及雌激素样作用等毒性，我国1999年制定的《中华人民共和 国动物及动物源食品残留监控计划》规定猪肉及畜禽中己烯雌酚为不得检出。DES残留的 检测方法主要包括理化方法和快速筛选检测方法。筛选方法的最好选择之一是基于DES抗 体的ELISA快速检测试剂盒。目前用于检测DES残留的试剂盒大多依赖进口，价格昂贵，检 测成本高。由于DES物质本身难溶于水、易氧化变质、代谢物与原形无交叉反应、存在顺反 异构等特点，这就使得DES快速检测ELISA试剂盒的研制存在一定困难，特别是对抗体的特 异性与亲和力要求高。因此，制备抗DES高亲和力的特异性抗体对于开发DES快速免疫学 检测试剂盒非常有意义。
发明内容
本发明的目的在于根据现有己烯雌酚检测中存在的检测难度大、检测成本高的问 题，提供一种己烯雌酚(DES)抗体的制备方法，通过该方法制得的己烯雌酚可用于制备己 烯雌酚快速检测ELISA试剂盒。本发明目的通过以下技术方案予以实现一种己烯雌酚抗体的制备方法，包括如下步骤(1)己烯雌酚与4-溴丁酸己酯反 应，在己烯雌酚的一二酚羟基上引入酯键，经皂化水解暴露羧基，合成己烯雌酚人工半抗 原；(2)用混合酸酐法通过己烯雌酚人工半抗原与牛血清蛋白(BSA)上的氨基反应，得到己 烯雌酚人工免疫原；(3)将己烯雌酚人工免疫原与佐剂乳化后对家兔进行皮下注射，当抗 体效价稳定时放血、分离血清，得到己烯雌酚抗体；其中，首次免疫时，所用佐剂为弗氏完全 佐剂，不是首次免疫时，所用佐剂为弗氏不完全佐剂。上述制备方法步骤(3)中所述皮下注射是对家兔背部脊椎两侧多点皮下注射，所述皮下注射己烯雌酚人工免疫原的量为50μ g，0. lmL，每4周注射一次。本发明制备方法制得的己烯雌酚抗体的评价方法为间接ELISA实验，其包被原的 制备方法是己烯雌酚与4-溴丁酸己酯反应，在己烯雌酚的一二酚羟基上引入酯键，经皂 化水解暴露羧基，合成己烯雌酚人工半抗原；(2)用混合酸酐法通过己烯雌酚人工半抗原 与鸡卵清白蛋白(OVA)，得到己烯雌酚包被原。实验中的二抗是辣根过氧化物酶(HRP)标记 的羊抗兔IgG，检测底物是过氧化氢和盐酸四甲基联苯胺(TMB · 2HC1)。动物机体对外源物质的免疫应答要求免疫抗原必须具备T细胞表位和B细胞表 位。而己烯雌酚是小分子物质只能作为抗原决定簇而不能直接用作免疫原，需将其与大分 子载体蛋白交联才能刺激机体产生特异性抗体。但己烯雌酚本身不溶于水而且易氧化同时 又没有能与蛋白交联的基团，因此需要首先合成能与蛋白交联但又能保持己烯雌酚抗原决 定簇的半抗原。蛋白质与半抗原的交联不仅大大增加了抗原的分子量，更重要的是利用其 强烈的免疫原性诱导动物产生免疫应答。通常蛋白质的结构越复杂，与被免疫的动物亲缘 性小，免疫原性越好。由于牛血清蛋白(BSA)免疫原性高、性质稳定、溶解性好、廉价易得应 用较多，因此本发明采用BSA作为免疫原的载体蛋白。本发明的基本原理是利用一系列化学反应将己烯雌酚与免疫原性好的BSA连接， 利用BSA的免疫原性引起机体的免疫应答。己烯雌酚作为抗原决定簇被抗原递呈细胞识别 与捕获，并提呈给T细胞并使之活化，活化的T细胞可协助B细胞克隆活化、分裂、增殖，从 而分泌针对己烯雌酚抗原决定簇的抗体。因此本发明己烯雌酚抗体可用于制备己烯雌酚的 ELISA试剂盒。在间接ELISA检测己烯雌酚时，用与BSA同源性远的OVA可屏蔽BSA本身产 生的抗体的影响，保证了检测的特异性。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)本发明己烯雌酚抗体的制备方法简便，成本低廉，制备得到的己烯雌酚抗体的 特异性强，抗体效价高，间接ELISA实验的效价达100万以上，用于己烯雌酚的免疫检测时， 易于推广应用；(2)本发明己烯雌酚抗体的制备方法先将己烯雌酚制备成能与蛋白交联又能保持 抗原决定簇的半抗原，再制备成抗原，解决了己烯雌酚本身不溶于水、易氧化，又没有能与 蛋白交联的基团的问题，合成了既能与蛋白交联又能保持己烯雌酚抗原决定簇的半抗原， 半抗原与蛋白质交联不仅大大增加了抗原的分子量，还利用其强烈的免疫原性诱导动物产 生免疫应答；(3)本发明制备方法使用牛血清蛋白(BSA)作为免疫原的载体蛋白，免疫原性高、 性质稳定、溶解性好、价廉易得，可降低制备己烯雌酚抗体的成本。
图1为己烯雌酚对照品的HPLC谱图；图2为反应液的HPLC谱图；图3为产物DES-MEBE的HPLC谱图；图4为水解产物DES-MEBE的HPLC谱图；
图5为己烯雌酚人工半抗原合成路线图；
图6为己烯雌酚人工抗原合成路线4
图7为己烯雌酚间接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1半抗原负载试剂的制备将无水碳酸钾和中性氧化铝加入蒸馏水中，使碳酸钾、中 性氧化铝与水分别为1 3(w/v)和1 2( 八)，60 701磁力搅拌111后在601烘箱烘 干，使用前于130 140°C活化3h。己烯雌酚-单-丁酸乙酯基-醚(DES-mono-ethylbutyrate-ether，DES-MEBE) 的制备依次将25mL色谱纯丙酮、0. 55g DES、1. 86g负载试剂、0. 15mL 4-溴丁酸乙酯加入 三口烧瓶，在避光、水浴、N2保护的条件下回流8h。用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法监控反应的进程。HPLC 条件BDS-C18 色谱柱，5 μ m， 4.6X250mm;流动相甲醇-水(75 25，ν/ν)；流速1. OmL/min ；柱温25°C ；进样量 10 μ L。DES半抗原合成有关的HPLC谱图，见图1 4。与DES对照品的HPLC谱图(图1)相 比较，反应液的HPLC谱图(图2)除了在5min、9min出现两个分别为trans_DES和cis_DES 的峰以外，在21min还有一个很明显的峰，经鉴定是trans-DES-MEBE，由于cis-DES-MEBE为 副产物切浓度低，所以未见其峰。反应完毕后将反应液过滤，滤液旋转蒸发浓缩至约5mL。 用薄层色谱(thin layer chromatography, TLC)法将浓缩滤液中的反应产物分离成上中 下3点。收集中点区域硅胶，用50mL甲醇提取3次，合并甲醇提取液，减压过滤，滤液旋 转蒸干，剩余的物质即为DES-MEBE。经过TLC分离甲醇提取后，HPLC谱图(图3)上出现 trans-DES-MEBE (15min)和cis-DES-MEBE (22min)两个峰(加大了流动相中甲醇的比例)。DES半抗原的制备将得到的DES-MEBE转入水中，然后向其中逐滴加入lmol/L的 NaOH溶液至固体全部溶解，过滤，滤液用lmol/L HCL沉淀，将过滤物烘干即得半抗原己烯 雌酚-单-羧基丙基-醚(DES-mono-carboxyproxyl-ether, DES-MCPE)(图 4)。人工半抗原的合成路线见图5。实施例2 采用混合酸酐法将DES-MCPE分别与载体蛋白BSA (免疫原)或OVA (包被原)交 联。首先将DES-MCPE活化精确称取35. Omg DES-MCPE溶于ImL无水二氧六环中，加2入 18 μ L三正丁胺，4°C搅拌反应20min后再加入13 μ L氯甲酸异丁酯4°C搅拌反应30min。蛋 白质溶液的制备将蛋白质(BSA IlOmg或0VA70mg)溶于3mL 二氧六环，加入3mL蒸馏水和 66 μ Llmol/L NaOH。DES-MCPE与载体蛋白交联将DES-MCPE活化液缓慢加入蛋白质溶液 中，用lmol/L NaOH控制pH值在8.0左右。滴加完毕后，4°C避光搅拌反应过夜。反应完毕， 将反应液装入经过处理的透析袋中，用IOOOmL透析液4°C透析，每12h更换一次透析液。收 集透析后的反应液，根据体积估算浓度后，按每只ImL分装在1. 5mL的塑料离心管中，-20°C 冻存。人工抗原的合成路线见图6。实施例3选体重为3. 5kg左右的健康雄性新西兰大白兔，观察一周。用无菌生理盐水将免 疫原稀释至0. 5mg · ml/1浓度，用0. IOmL (50 μ g免疫原)的剂量在免疫前将免疫原与等体积弗氏完全佐剂充分混勻乳化后，进行家兔背部脊椎两侧多点皮下注射。每4周进行一次 加强免疫，加强免疫时，免疫原用弗氏不完全佐剂进行乳化。分别于2次免疫后第10天于 耳缘静脉采血1 2ml，离心分离血清，用间接ELISA检测抗体效价。待血清效价稳定后，大 量采集抗血清。血清效价的计算方法阴性对照0D450值记为N，阳性对照OD45tl值记为P， 当P/N≥2且P-N > 0. 2时判为阳性，保持阳性的最大稀释比例为抗体效价。本发明制备 的抗体效价可达100万以上。实施例4己烯雌酚抗体评价方法为间接ELISA实验，其包被原首先利用DES与40溴丁酸 己酯反应，在DES的一个酚羟基上引入酯键，然后经皂化水解暴露羧基，从而合成人工半抗 原，再用混合酸酐法通过半抗原上的羧基与鸡卵清白蛋白(OVA)结合，二抗是辣根过氧化 物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，检测底物是过氧化氢和盐酸四甲基联苯胺，四参数模型标准 曲线的拟合是利用Bio-Tek公司的KCjimior软件完成的。精确称取DES标准对照品IOOmg置于IOOml棕色容量瓶中，以甲醇定容。临用前 用40体积％的甲醇水溶液配制成所需的0、0· 01、0· 05、0· 1、0· 5、1、5、50μ g · L-1 —系列标
准浓度。用碳酸缓冲液(pH 9.6,0. 05mol .L—1)将包被原稀释至50 μ g ^r1,按每孔100 μ 1 加到酶标板孔内，放入湿盒中置37°C水浴锅内孵育Ih后，移至4°C过夜，同时做空白对照； 用PBST (pH 7. 4)洗涤酶标板2次，再用PBS (pH 7. 4)洗涤1次，于吸水纸上拍干；将含10% 脱脂奶粉的封闭液按照每孔250μ 1加入到酶标板孔内，放入湿盒中37°C孵育Ih ；洗涤同 前；用含0. 2wt%明胶的PBS稀释抗血清后每孔加90 μ 1，间接竞争ELISA每孔加入10 μ 1 DES标准液，间接ELISA在每孔加入10 μ 1空白稀释液，37°C孵育lh，同时做空白对照及阴 性对照；洗涤同前；将酶标二抗按每孔100 μ 1加入到酶标板孔内，37°C孵育Ih ；洗涤同前； 按每孔100 μ 1加入新鲜配制的底物液后，室温孵育IOmin ；按每孔100 μ 1加入终止液，显 色反应即终止。终止后，以空白对照调零用酶标仪测0D450值。用KCjimior软件进行4 参数非线性回归，建立检测DES的间接竞争ELISA标准曲线(图7)。标准曲线的IC50在 0. 71 1. 0μ g/L，线性范围在0. 01 50μ g/L，R2在0. 9952 0. 9978。获得各标准浓度 下Β/Β0的批内变异系数在0.52% 22. 48%，批间变异系数在2. 64% 19.51%。交叉反 应实验表明，本发明制备的抗体对与DES结构相似的人工合成二苯乙烯类雌激素药物己烷 雌酚(HEX)和双烯雌酚(DIEN)的交叉反应率分别为8.5%和38.5%，与天然雌激素类药物 雌二醇(E2)和乙炔雌二醇(EE2)以及L-酪氨酸(Tyr)的交叉反应均小于0. 001 %。
权利要求
一种己烯雌酚抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)己烯雌酚与4 溴丁酸己酯反应，经皂化水解暴露羧基，合成己烯雌酚人工半抗原；(2)用混合酸酐法通过己烯雌酚人工半抗原与牛血清蛋白反应，得到己烯雌酚人工免疫原；(3)将己烯雌酚人工免疫原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后对家兔进行皮下注射，当抗体效价稳定时分离血清，得到己烯雌酚抗体。
2.根据权利要求1所述的己烯雌酚抗体的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述皮下 注射是对家兔背部脊椎两侧多点皮下注射。
3.根据权利要求2所述的己烯雌酚抗体的制备方法，其特征在于所述皮下注射己烯雌 酚人工免疫原的量为50μβ，0. lmL，每4周注射一次。
全文摘要
本发明公开了一种己烯雌酚抗体的制备方法。本发明己烯雌酚抗体的制备方法包括如下步骤(1)己烯雌酚与4-溴丁酸己酯反应，经皂化水解暴露羧基，合成己烯雌酚人工半抗原；(2)用混合酸酐法通过己烯雌酚人工半抗原与牛血清蛋白反应，得到己烯雌酚人工免疫原；(3)将己烯雌酚人工免疫原与弗氏完全佐剂(首次免疫)或弗氏不完全佐剂乳化后对家兔进行皮下注射，当抗体效价稳定时分离血清，得到己烯雌酚抗体。本发明己烯雌酚抗体的制备方法简便，成本低廉，制备得到的己烯雌酚抗体的特异性强，抗体效价高，间接ELISA实验的效价达100万以上，用于己烯雌酚的免疫检测时，可降低检测成本，易于推广应用。
文档编号C07K16/06GK101914157SQ20101021894
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者刘雅红, 单国强, 岳磊 申请人:华南农业大学