专利名称：酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的高效表达纯化方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种可高效表达、纯化酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的方法。
背景技术：
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类低分子量、高半胱氨酸含量(约占氨基酸总量的30%)、不含芳香族氨基酸的小分子金属结合蛋白。它广泛存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌、细菌等中。1957年，Margoshes和Vallee在研究镉的生物学作用时，首次从马肾中发现含镉MT。迄今大量研究表明，MT能被多种因素诱导产生，在吸附重金属离子、调节微量元素(如Zn、Cu)代谢、清除自由基、拮抗电离辐射等方面发挥着十分重要的作用。同时，MT的产生还与老年性痴呆症、Wilson病、肿瘤发生发展等密切相关。因此，对MT 的理论和实际应用研究具有广阔的前景。酿酒酵母(5 CMcereWsiae)金属硫蛋白由61个氨基酸残基组成，相对分子质量为5700，在N端有一段由8个氨基酸组成的信号肽。酿酒酵母金属硫蛋白在体内经过加工去掉N端的信号肽，成为成熟肽后，才具有清除自由基、吸附重金属等生理功能。酿酒酵母 MT与人体MT结构相近，且酵母MT对自由基的清除能力比动物组织的MT更强。许多学者通过金属离子诱导的方法从酿酒酵母中获得MT，但产量不高，无法很好的应用于工业生产。 运用基因工程技术可以帮助人们获得高产量的目的蛋白，要获得具有生理活性的MT需要解决在工程菌中切除N端信号肽，简化产物纯化步骤等问题。目前关于使用基因工程技术在工程菌中高效表达酿酒酵母MT的报道很少。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的酿酒酵母金属硫蛋白的成熟肽产量不高，需要解决切除信号肽、简化产物纯化步骤等问题，提供一种简单高效的表达纯化酿酒酵母金属硫蛋白的成熟肽的方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明的技术思路是利用原核表达质粒PTWim便捷的产物纯化方法，将目的基因与 PTffINl载体相连，构建重组质粒后转入工程菌中，表达得到的融合蛋白中含有能与几丁质高效结合的CBD结构域，和能够在特定温度和PH条件下发生自剪切作用的内含肽intein。 将融合蛋白经几丁质柱高效亲和纯化，并经特定温度和PH诱导后发生独特的在柱自剪切作用，洗脱后即可获得纯化的目的蛋白。本发明酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法包括如下步骤
(1)根据酿酒酵母5cescerevisiae基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上、下游引物，序列如SEQ ID NO:广2所示；
(2)以酿酒酵母菌株的基因组为模板，用步骤(1)所述引物进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)PCR扩增所得的产物连接到质粒pTWim上，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌ER2566，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌；
(4)培养重组大肠杆菌至0D_值达到0.6时，加入IPTG诱导融合蛋白表达，收集菌液， 离心、取上清，得到以可溶形式表达的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白；
(5)将步骤(4)得到的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白过几丁质柱进行亲和纯化，洗脱后进行自切割反应，反应完毕后洗脱收集，得到酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。作为一种优选方案，上述方法中，步骤(2)中，所述PCR扩增的反应条件为95°C 3min，94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s 和 72°C lOmin，其中，94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s 循环W次。作为一种优选方案，上述方法中，步骤(5)中，所述自切割反应前/后的洗脱所用的缓冲液配方为20mmol/L的Na_HEPES、0. 5mol/L的NaCl和lmmol/L的EDTA ；更进一步地， 所述缓冲液体积为20ml，pH为7. 0。作为一种优选方案，上述方法中，步骤(5)中，所述自切割反应的温度为25°C，反应时间为25h。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
酿酒酵母金属硫蛋白在体内需要经过加工去掉信号肽，成为成熟肽后，才具有清除自由基、吸附重金属等生理功能。要获得具有生理活性的MT需要解决在工程菌中切除N端信号肽，简化产物纯化步骤等问题。本发明直接表达酿酒酵母金属硫蛋白的成熟肽，无需在工程菌中切除金属硫蛋白 N端的信号肽，表达产物已具有清除自由基、吸附重金属等生理功能。目前关于使用基因工程技术在工程菌中高效表达酿酒酵母MT的报道很少，且表达的MT蛋白通常带有蛋白纯化所需要的标签，如His标签、SUMO标签、GST标签等。在融合蛋白纯化之后，需要用特定的蛋白酶将标签切除，才能获得有活性的MT蛋白，而目前常用的蛋白酶普遍存在成本高昂、标签切割的特异性不强等缺点。本发明采用pTWim载体表达CBD-inteinl-MT融合蛋白，能利用内含肽的自剪切功能，一步达到将标签切除，同时获得高纯度MT蛋白的目的。本发明无需使用特定的蛋白酶，降低了纯化的成本；同时，避免了蛋白酶切割所带来的非特异性酶解，也无需进一步纯化以去除蛋白酶。因此本发明具有简化MT蛋白的纯化步骤、显著降低成本等优点。
图1为重组大肠杆菌融合蛋白表达情况的SDS-PAGE电泳分析，其中，M为蛋白 Marker，1为诱导6 h的重组菌，2为未诱导的重组菌，3为诱导6 h的转有空载的重组菌，4 为未诱导的非重组菌；
图2为重组大肠杆菌融合蛋白表达情况的Western印迹检测，其中，M为蛋白Marker， 1为诱导6 h的重组菌，2为未诱导的重组菌，3为诱导6 h的转有空载的重组菌，4为未诱导的非重组菌；
图3为用于检测融合蛋白可溶性的SDS-PAGE电泳分析，其中，M为蛋白Marker，1为重组菌破壁后上清，2为重组菌破壁后沉淀；
图4为纯化后的金属硫蛋白成熟肽的SDS-PAGE电泳分析，其中，M为蛋白Marker，1为纯化后的MT ；
4图5为重组大肠杆菌对铜离子的耐受能力检测，其中，a为重组大肠杆菌，b为未转入重组质粒的大肠杆菌，培养基中CuSO4浓度为3. 8 mmol/L。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化 1.编码序列的扩增引物设计
根据NCBI提供的酿酒酵母(5⑶scari^isiaiO基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上下游引物序列如SEQ ID NO:广2所示。酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽编码序列的扩增
以酿酒酵母AS2. 489菌株(购自中科院微生物所菌种保藏中心)的基因组为模板，用实施例1得到的金属硫蛋白成熟肽编码序列的特异性扩增引物，进行PCR扩增。PCR 反应条件为95 "C 3 min，94 V 30 s，56 V 30 s，72 V 30 s 和 72 V 10 min，其中，94 "C 30 s，56 "C 30 s，72 "C 30 s 循环洸次。重组大肠杆菌的构建
(1)将实施例2得到的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽编码序列的PCR扩增产物与质粒 PMD18-T连接，转化感受态大肠杆菌JM109，选取阳性克隆抽提质粒后进行BspQ I、Pst I 双酶切鉴定和测序鉴定确保序列的正确性。(2)对测序正确的质粒pMD18-T-MT进行BspQ I , Pst I双酶切，回收酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽编码序列片段，连接到同样双酶切过的质粒pTwmi上，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌ER2566，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌ER2566-pTWINl-MT。融合蛋白的表达鉴定 (1) SDS-PAGE电泳检测
挑取重组大肠杆菌ER2566-pTWINl-MT单菌落接种至50 ml含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 0C >220 rpm振荡培养至OD6tltl=O. 6，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG 用于诱导CBD-inteinl-MT融合蛋白的表达，30 ！振荡培养6小时后，收集部分菌液离心， 用12 %浓度的SDS-PAGE电泳检测融合蛋白CBDHnteinl-MT的表达情况。结果如图1所示，重组大肠杆菌ER2566-pTWINl-MT经IPTG诱导后有28. 7 kDa分子量大小的表达条带， 与CBD-inteinl-MT融合蛋白预期大小相符；含pTWim空载的重组菌诱导后有54. 2 kDa大小的表达条带，与CBD-inteinl-inteir^-CBD蛋白预期大小相符；未经诱导的原始出发菌株均没有相应表达条带出现(图1)。(2) Western 印迹检测
重组大肠杆菌经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜，进行Western印迹鉴定。第一抗体为小鼠Anti-CBD Antibody，第二抗体为羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的IgG，用DAB显色。具体操作步骤参照《分子克隆》(萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，黄培堂，等译.《分子克隆实验指南(第三版)》[M].北京.科学出版社.2002:1723 17 .)。结果如图2 所示，诱导后的重组大肠杆菌ER2566-pTWINl-MT有 . 7 kDa大小的蛋白质印迹条带，含 PTffINl空载的重组菌诱导后有54. 2 kDa大小的蛋白质印迹条带，两者均与预期大小相符(图 2)。(3 ) SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的可溶性
收集经IPTG诱导后的菌液于4 V 8000 rpm离心5 min,用50 ml ddH20洗涤2次，再用3 ml Buffer Bl (pH 8. 0)重悬，冰浴超声破菌，12000 rpm离心10 min，取上清和沉淀分别进行12 %浓度的SDS-PAGE电泳检测，用薄层扫描仪对聚丙烯酰胺凝胶进行扫描，以确定融合蛋白质的含量。电泳结果如图3所示，融合蛋白绝大部分出现在上清液中，以可溶形式表达，未出现包涵体，凝胶扫描显示融合蛋白含量占总上清蛋白的30. 3 % (图3)。Buffer Bl 配方如下
Na-HEPES20 mmol/L (ρΗ8· 5)
NaCl0. 5 mol/L
EDTA1 mmol/L
Tween 200. 1 %
PMSF20 μ mol/L
DTT1 mmol/L。的纯化和鉴定
按照实施例4中的方法培养并诱导重组大肠杆菌后，破菌、离心收集上清，加入Buffer Bl稀释至总体积为10 ml，上10 ml几丁质柱，用100 ml &Buffer Bl平衡几丁质柱，取破菌上清上柱，静置 10 min，用 100 ml Buffer Bl 洗柱；加入 20 ml Buffer B2 (pH7. 0)洗脱，置于25 ！进行自切割反应25小时。样品反应后置室温用Buffer B2洗脱收集，15 % 的SDS-PAGE电泳检测后用薄层扫描仪扫描确定目的蛋白的含量比例。纯化后的蛋白溶液经考马斯亮蓝染色，在595 nm测定吸光值，确定目的蛋白的浓度。SDS-PAGE电泳检测结果见图4，纯化后的MT分子质量5. 7 kDa，与预期值相符，约占洗脱所得总蛋白的95% (图4)。Buffer Bl配方同实施例1，但无需加入Tween 20、PMSF和DTT。Buffer B2 配方如下
Na-HEPES20 mmol/L (pH6. 0-7. 0)
NaCl0. 5 mol/L
EDTA1 mmol/L。实施例2重组大肠杆菌对重金属的耐受性和吸收能力检测 (1)重组大肠杆菌对铜离子耐受能力的检测
将重组大肠杆菌接种到3 ml含100 μ g/ml氨苄青霉素LB中37 °C培养到OD600=O. 6， 菌液经适当稀释后划线于含1 mmol/L的IPTG、CuS04浓度为分别为2. 6,2. 8,3. 0,3. 2,3. 4、 3.6,3.8,4.0 mmol/L的LB (100 μ g/ml)平板上培养，以没有转化重组质粒的大肠杆菌 ER2566做对照，30°C恒温培养过夜，观察生长情况。结果如图5所示，当Cu2+浓度达到3. 8 mmol/L时，重组大肠杆菌仍然生长良好，而没有转化重组质粒的大肠杆菌ER2566则无法生长。重组大肠杆菌生长的Cu2+浓度限制为4. 0 mmol/L，没有转化重组质粒的大肠杆菌的Cu2+ 浓度限制为2. 6 mmol/L。因此，金属硫蛋白明显增强了大肠杆菌对铜离子的耐受能力。(2)重组大肠杆菌对铜离子吸收能力的检测
取30 ml诱导后的重组大肠杆菌菌液(培养基中CuSO4浓度为1 ymol/L)于4 V 8000 rpm离心5 min,弃上清，菌体用ddH20重悬洗涤2次，最后用1 ml ddH20重悬，加入7 ml混酸(HNO3:HC104=4:1)，加热蒸干溶液，加入ddH20定容至50 ml。用火焰原子吸收分光光度法 (FAAS法)测溶液中的铜元素含量，以没有转化重组质粒的大肠杆菌ER2566做对照。结果显示，空白菌体内金属含量为0.062 mg/L菌液，重组大肠杆菌则为0.187 mg/L菌液，为空白菌的3倍，具有显著差异(p=0. 005)。结果证明，表达的金属硫蛋白明显地增加了重组菌体内的重金属积累(图5)。 实施例3酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽清除羟自由基能力的检测
将实施例5中纯化获得的酿酒酵母金属硫蛋白稀释后进行自由基清除能力的检验，测定步骤参照徐向荣等(徐向荣，王文华，李华斌，等.比色法测定i^nton反应产生的羟自由基.生物化学与生物物理进展，1999，沈(1):67 69.)的方法。清除率=(对照A420-样品A420) /对照A420。结果显示，随着金属硫蛋白浓度的增加，其自由基清除能力逐渐增强，当金属硫蛋白浓度为2. 8 μ g/ml时，自由基清除率为7. 1 %，当金属硫蛋白浓度为22. 3 口8/1111时，清除率达到53.6 %。该结果说明本发明生产的酿酒酵母金属硫蛋白具有良好的自由基清除能力。
权利要求
1.酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据酿酒酵母5cescerevisiae基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上、下游引物，序列如SEQ ID NO:广2所示；(2)以酿酒酵母菌株的基因组为模板，用步骤(1)所述引物进行PCR扩增；(3)将步骤(2)PCR扩增所得的产物连接到质粒pTWim上，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌ER2566，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌；(4)培养重组大肠杆菌至0D_值达到0.6时，加入IPTG诱导融合蛋白表达，收集菌液， 离心、取上清，得到以可溶形式表达的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白；(5)将步骤(4)得到的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白过几丁质柱进行亲和纯化，洗脱后进行自切割反应，反应完毕后洗脱收集，得到酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于步骤(2)中，所述PCR扩增的反应条件为95 V 3 min，94 V 30 s，56 V 30 s，72 V 30 s 和 72 "C 10 min，其中，94 "C 30 s，56 "C 30 s，72 "C 30 s 循环洸次。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于步骤(5)中，所述自切割反应前/后的洗脱所用的缓冲液配方为20 mmol/L的Na_HEPES、0. 5 mol/L 的 NaCl 禾口 1 mmol/L 的 EDTA0
4.根据权利要求3所述的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于所述缓冲液体积为20 ml，pH为7. 0。
5.根据权利要求1所述的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于步骤(5)中，所述自切割反应的温度为25 °C，反应时间为25 h。
全文摘要
本发明公开了酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的高效表达纯化方法。本发明方法是将酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的编码序列通过原核表达质粒pTWIN1转入到大肠杆菌中，构建得到的重组大肠杆菌可以通过IPTG诱导表达可溶性融合蛋白CBD-intrin1-MT。该融合蛋白中的CBD结构与能与几丁质柱结合，内含肽与金属硫蛋白成熟肽连接处发生自剪切作用，获得游离的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。本发明方法生产的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽与酿酒酵母的天然产物具有完全相同的氨基酸结构，安全可靠，具有清除自由基和吸附重金属的能力，在医药、食品、化妆品或重金属污染治理等领域有广阔的应用前景。
文档编号C07K14/395GK102181468SQ20111002834
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者刘泽寰, 李晶博, 梁晓峰, 肖文娟, 龚映雪 申请人:暨南大学