专利名称：恩夫韦肽的制备方法
技术领域：
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及恩夫韦肽的制备方法。
背景技术：
恩夫韦肽，英文名为Enfuvirtide，也称为T-20，恩夫韦肽由罗氏与Trimeris公司共同研制，结构式为Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-G Iu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-P he-NH2，或表示为NH2-FWNWLSAWKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY-Ac (SEQ ID NO 1)；分子量:4492. 01，分子式=C204H301N51O640恩夫韦肽是2003年3月首次在美国注册并上市的第一个HIV融合抑制剂，用于治疗成人及6岁以上儿童慢性人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。恩夫韦肽是合成多肽，由gp41 的HR2域中一段自然存在的氨基酸序列衍生而成，通过模拟HR2域的活性并且竞争结合 gp41的HRl域，阻止HRl和HR2的相互作用及gp41构型发生改变，进而阻止病毒与宿主细胞融合。与大多数多肽类药物相似，恩夫韦肽发生代谢性药物间相互作用的可能性很小。专利CN99806431报道的恩夫韦肽制备工艺的为固相和液相结合的片段缩合工艺，先使用羧基型2-Cl-Trt树脂制备每个片段肽树脂，经弱酸酸解、纯化后获得保护肽片段，再通过液相片段缩合、酸解、高效液相色谱纯化得到纯度为93-95%的产品。该方法生产周期长，每个片段中间体都须要经过纯化，使用的溶剂品种多，整个生产过程无法实现连续的自动化生产。该方法中使用的酸解溶剂为三氟醋酸混合溶剂，其具体物料配比为TFA 水二硫苏糖醇(DTT)，其中二硫苏糖醇价格昂贵，每Kg需要2万多元，不适合规模化生产需要，因此没有国产化上市产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供恩夫韦肽的制备方法，该制备方法步骤简单、
产品质量高。本发明恩夫韦肽(NH2-FffNWLSAffKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY-Ac,SEQ ID NO 1)的制备方法包括如下步骤(1) Fmoc-Phe和去Fmoc保护的氨基树脂偶联反应得到Fmoc-Phe-氨基树脂；(2) Fmoc-Phe-氨基树脂依次与恩夫韦肽第2至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸偶联反应，最后接入乙酰基，得到恩夫韦肽-氨基树脂；(3)恩夫韦肽-氨基树脂酸解反应得到恩夫韦肽。得到的恩夫韦肽为粗品，可以采用高效液相色谱法纯化后得到恩夫韦肽纯品。所述氨基树脂选自Rink Amide AM树脂、Rink Amide树脂、Rink MBHA树脂和 Sieber树脂中的一种，优选为Rink Amide AM树脂。
权利要求
1.恩夫韦肽的制备方法,所述恩夫韦肽为nh2-fwnwlsawkdlelleqenkeqqnqseeilshils ty-Ac seq id no :1，其特征在于包括如下步骤(1)Fmoc-Phe和去Fmoc保护的氨基树脂偶联反应得到Fmoc-Phe-氨基树脂；(2)Fmoc-Phe-氨基树脂依次与恩夫韦肽第2至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸偶联反应，最后接入乙酰基，得到恩夫韦肽-氨基树脂；(3)恩夫韦肽-氨基树脂酸解反应得到恩夫韦肽。
2.根据权利要求1所述的恩夫韦肽的制备方法，其特征在于步骤(1)、(2)的偶联反应需添加缩合试剂和活化试剂；缩合试剂选自n，n-二异丙基碳二亚胺、n，n-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2- (7-氮杂-IH-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-n，n，n' ,n'-四甲基脲六氟磷酸盐或o-苯并三氮唑-n，n，n'， n'-四甲基脲四氟硼酸酯；活化试剂选自1-羟基苯并三唑、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
3.根据权利要求1所述的恩夫韦肽的制备方法，其特征在于步骤⑴的Fmoc-Phe和步骤的Fmoc-氨基酸的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1. 2 6倍。
4.根据权利要求1所述的恩夫韦肽的制备方法，其特征在于步骤(2)第2至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸带有侧链保护基时，侧链保护基为叔丁基、三苯基甲烷、叔丁氧基、叔丁氧羰酰基的至少一种。
5.根据权利要求1所述的恩夫韦肽的制备方法，其特征在于Fmoc-氨基酸为 Fmoc-Ala、Fmoc-Asn (Trt)、Fmoc-Asp (OtBu)、Fmoc-Gln (Trt)、Fmoc-Glu (OtBu)、 Fmoc-His (Trt)、Fmoc-Ile、Fmoc-LeuΛ Fmoc-Lys (Boc)、Fmoc-Ser (tBu)、Fmoc-Thr (tBu)、 Fmoc-Trp(Boc)或 Fmoc-Tyr(tBu)。
6.根据权利要求1所述的恩夫韦肽的制备方法，其特征在于步骤(1)和步骤(2)偶联反应前去fmoc保护的试剂为哌啶/n，n- 二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液按体积比计含哌啶10 30%。
7.根据权利要求1所述的恩夫韦肽的制备方法，其特征在于步骤(3)酸解反应使用的酸解剂为三氟醋酸、1，2_乙二硫醇和水的混合溶剂，混合溶剂按体积比计配比为三氟醋酸80-95%，1，2-乙二硫醇1 10%，余量为水。
8.根据权利要求7所述的恩夫韦肽的制备方法，其特征在于酸解剂的用量为每克恩夫韦肽-氨基树脂采用4 15ml酸解剂。
9.根据权利要求1 8任一项所述的恩夫韦肽的制备方法，其特征在于所述氨基树脂选自Rink Amide树脂、Rink Amide AM树脂、Rink MBHA树脂和Sieber树脂中的一种。
10.根据权利要求9所述的恩夫韦肽的制备方法，其特征在于氨基树脂取代值为 0. 2 1. 2_l/g 树脂。
全文摘要
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及恩夫韦肽的制备方法。本发明所要解决的技术问题是提供恩夫韦肽的制备方法，所述恩夫韦肽为NH2-FWNWLSAWKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY-Ac SEQ ID NO1。本发明恩夫韦肽的制备方法包括如下步骤(1)Fmoc-Phe和去Fmoc保护的氨基树脂偶联反应得到Fmoc-Phe-氨基树脂；(2)Fmoc-Phe-氨基树脂依次与恩夫韦肽第2至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸偶联反应，最后接入乙酰基，得到恩夫韦肽-氨基树脂；(3)恩夫韦肽-氨基树脂酸解反应得到恩夫韦肽粗品；(4)恩夫韦肽粗品用高效液相色谱法纯化后得到恩夫韦肽纯品。本发明方法步骤简单、产品质量高，能够自动化生产。
文档编号C07K1/20GK102241746SQ20111014017
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者文永均, 曾得志, 郭德文, 韩玉 申请人:成都圣诺科技发展有限公司